Katedra hemii Nieorganicznej i Analitycznej Uniwersytet Łódzki ul.tamka 12, 91-403 Łódź Dr Paweł Krzyczmonik Łódź, kwiecień 2014
Plan wykładu Biosensory wstęp Metody immobilizacji enzymów i białek Kinetyka reakcji enzymatycznych Wdrukowywanie molekularne (molecular imprinting) 2
Biosensory wstęp Biosensor to sensor zawierający w warstwie receptorowej materiał biologiczny, który w wyniku reakcji z analitem przetwarza energię chemiczną na formę energii z której w części przetwornikowej uzyskujemy sygnał analityczny. Materiały stosowane w warstwach receptorowych biosensorów: Sygnał analityczny Enzymy Białka Przeciwciała DNA, RNA Organelle, mitochondria Bakterie, komórki Tkanki zęść przetwornikowa Zamiana informacji chemicznej na formę energii zęść receptorowa Bio Próbka analityczna 3
Biosensory wstęp Typ Zasada działania Specyficzność Limit detekcji Detekcja analitu na podstawie specyficznych Duża względem Immunosensor interakcji przeciwciało-antygen. Możliwość analizowanego 50-100 detekcji komórek bakteryjnych a także białek składnika w w komórek/ml i cukrowców. próbce hemoreceptosensor Sensor enzymatyczny Sensor DNA Sensor tkankowy Sensor bakteryjny Detekcja sygnału na podstawie specyficznych oddziaływań między cząsteczką analitu a cząsteczką specjalnie zaprojektowanego chemoreceptora. Możliwość detekcji białek, receptorów i kanałów błonowych. W działaniu wykorzystuje katalizę enzymatyczną określonego substratu przez dany enzym. Działanie opiera się na oddziaływaniach pomiędzy sondami molekularnymi a DNA zawartym w analizowanej próbce. Detekcja komórkowego DNA. Zawiera w części sensorycznej fragment tkanki. Działanie oparte na specyficznych interakcjach między tkanką a analitem. Jako komponent sensoryczny służą komórki bakteryjne, których genom koduje enzymy katalizujące tworzenie się fluorescencyjnych związków. Głównie rozpoznawane są duże rodziny białek o podobnej strukturze. Ograniczona przez specyficzność wykorzystanego enzymu. 10 nmol/ml 100 nmol/ml Wysoka w względem poszukiwanej próbki. >pmol/ml Niska względem wykrywanych molekuł lub komórek. Wysoka względem wykrywanych molekuł. 100 nmol/ml 10-100 n 4
Biosensory wstęp Porównanie parametrów biosensorów glutaminy wykorzystujących różne materiały biologiczne w warstwach receptorowych. Enzymatyczny mitochondrialny bakteryjny tkankowy zułość [mv/dekadę] Dolny limit detekcji[mol/l] 33-41 53 49 50 6.0x10-5 2.2x10-5 5.6x10-5 2.0x10-5 Zakres liniowy [mmol/l] zas odpowiedzi [min] zas życia [dni] 0.15-3.3 0.1-5.5 0.1-10 0.06-5.2 4-5 6-7 5 5-7 1 10 20 30 5
Metody immobilizacji enzymów i białek Adsorpcja Sieciowana adsorpcja Wiązanie kowalencyjne Sieciowanie Pułapkowanie Enkapsulacja 6
Immobilizacja enzymów - przykłady kolagen-nh 2 + OH-(H 2 ) 3 -OH + H 2 N-enzym kolagen-n=h-(h 2 ) 3 -H=N-enzym kolagen-n=h-(h 2 ) 3 -H=N-enzym + LiBH 4 kolagen-n-h-(h 2 ) 3 -H-N-enzym O H 3 H 3 H 2 O N + N H 2 E H 2 NH E O O O H 3 H 3 H 2 H + O NH 2 H 2 O NH * H 2 H O NH 2 H 2 n * n O NH E E OH OH OH l O + l Si (H 2 ) H 2 X O Si (H 2 ) H 2 X + 3Hl l O X grupy NH 2, SH epoxy 7
Immobilizacja enzymów - przykłady Koenzym FAD - Dinukleotyd flawinoadeninowy 8
Kinetyka reakcji enzymatycznych Warunki badania szybkości reakcji: 1. Substraty i bufory odpowiedniej jakości i czystości 2. Aktywny preparat enzymatyczny 3. Enzym powinien być stabilny w warunkach prowadzenia pomiarów 4. Optymalna temperatura oraz ph prowadzenia reakcji 5. Odpowiednia metoda zatrzymywania reakcji enzymatycznej: - temperatura 100-1% roztwór SDS - w przypadku metaloenzymów dodatek EDTA - dodanie silnego kwasu np.: trichlorooctowego (2-3%) 6. Podczas oznaczenia zapewnione warunki stanu ustalonego reakcji enzymatycznej
Kinetyka reakcji enzymatycznych Określanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznej
Kinetyka reakcji enzymatycznych E + S k 1 k-1 [E:S] k 2 E + P Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkach stanu stacjonarnego i równowagi 11
Kinetyka reakcji enzymatycznych Kinetyka reakcji monosubstratowych założenie stanu równowagi k 1 k 2 E + S [ E][ S] wprowadzając K, v = k [ E : S] 2 [E:S], oraz zakładając k 2 <<k 1 v k-1 k2 [ Ec][ S] K [ S] [E:S] [ Ec ][ S] K [ S] Jeśli enzym działa z maksymalną szybkością V max, to wszystkie jego cząsteczki tworzą kompleks z substratem, czyli gdy [E:S] = [E c ], to: V max = k kat [E c ] v E + P Przyjmując całkowite stężenie enzymu jako [E c ] = [E] + [E:S], Otrzymamy: lub k kat gdzie k kat = k 2 - stała katalityczna Stała równowagi K we wzorze wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu r-gi nosi nazwę stałej substratowej i jest określana symbolem Ks. 12
Założenie stanu ustalonego Kinetyka reakcji enzymatycznych Kinetyka reakcji monosubstratowych założenie stanu ustalonego k 1 k 2 E + S k-1 d[ E : S] dt k [E:S] E + P d[ E : S] 0 dt ES k E : S k E : S 1 1 2 wprowadzając stałą K m K m -stała Michaelisa k 1 k k 1 2 v i przekształcając równanie otrzymuje się: V K [ max m S] [ S] K K Warto zauważyć, że 2 czyli K M = K s, jeżeli k 2 <<k m s 1 k1 k 13
Kinetyka reakcji enzymatycznych Model Michaelisa-Menten E + S k 1 k-1 [E:S] k 2 E + P v V K [ max m S] [ S] 14
Kinetyka reakcji enzymatycznych GRAFIZNE WYZNAZANIE STAŁYH KINETYZNYH v V K [ max m S] [ S] 1_ v 1 K 1 m 1 [ S] V V max max 1_ V K m /V Równanie Lineweavera-Burka _ 1_ K M 0 1_ [S] 15
Kinetyka reakcji enzymatycznych K m (stała Michaelisa) opisuje tworzenie i rozpad kompleksu ES K m jest miarą powinowactwa enzymu do substratu niska wartość K m silne powinowactwo enzymu do substratu wysoka wartość K m słabe powinowactwo enzymu do substratu Wartość stałej K m jest to stężenie substratu (mol/dm 3 ) przy, którym szybkość reakcji enzymatycznej jest równa połowie jej szybkości maksymalnej. Kiedy [S]=K m wtedy V=V max /2. Inaczej stężenie o wartości równej Km, to stężenie przy którym obsadzona jest połowa aktywnych miejsc. Jednostka aktywności enzymatycznej katal; 1katal (kat) wywołuje w określonych warunkach reakcji przemianę 1 mola substancji w ciągu jednej sekundy. Jednostka enzymu (jednostka enzymatyczna), U (ang. unit, w pol. także J)- Jeden U to ilość enzymu katalizująca przemianę 1 μmola substratu w czasie 1 minuty. Zwykle przyjmuje się określone warunki: temperaturę 30, dane ph i maksymalne wysycenie enzymu substratem. 1 U = 1μmol/min = 1/60 μkatala = 16,67 nanokatala 16
Kinetyka reakcji enzymatycznych rodzaje biosensorów Sensory biocatalytic to głównie enzymy unieruchomione na powierzchni elektrody działające jako selektywne katalizatory. Enzymy katalizują powolne reakcje. Szybkość reakcji, w odpowiednich warunkach, jest ilościową miarą stężenia substratu. Jeśli próbka jest jednym z reagentów, np. jeśli jest sama próbka Podłoże, po czym czujniki chemiczne mogą być tworzone na tej podstawie. Szybkość reakcji może być mierzona jako prąd elektrolizy w biosensorach amperometrycznych. Druga grupa to bioaffinity sensors. W tym przypadku analit tworzy trwałe kompleksy z cząsteczkami w warstwie receptorowej czujnika. Ilość cząsteczek powstającego kompleksu jest ilościową miarą stężenia analitu w próbce. Może być mierzona pośrednio, od wielu właściwości. W sensorach bioaffinity wykorzystuje się głównie reakcje przeciwciałoantygen. 17
Wdrukowywanie molekularne (molecular imprinting) Wdrukowywanie molekularne (molecular imprinting) chemiczna metoda tworzenia warstw o wysokiej selektywności względem oznaczanego składnika. 18
Wdrukowywanie molekularne IhF PAN Warszawa 19
Literatura 1. Z. Brzózka, W. Wróblewski, Sensory chemiczne, Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej,W-wa 1999. 2. Pr. zbiorowa pod red Z.Brzózki Miniaruryzacjia w analityce, Oficyna Wydawnicza Politechniki Warszawskiej, W-wa 2005 2. J. Janata, Principles of hemical Sensors, Springer, wyd. 2, 2009 3. P. Gründler, hemical Sensors, An Introduction for Scientists and Engineers, Springer, 2007 4. P. N. Bartlett (ed.), Bioelectrochemietry, fundamentals, experimental techniques and applications, Willey & Sons, 2008. 5. W. Szczepaniak, Metody Instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, W-wa 2010. 6. A.J.Bard, G.Inzelt, F.Scholz, Electrochemical Dictionary Springer,2008 20
Dziękuje za uwagę 21