PCR Łańcuchowa reakcja polimerazy (Polymerase Chain Reaction) amplifikacja (namnożenie wielu kopii cząsteczki kwasu nukleinowego) w pierwotnej wersji wykorzystująca model replikacji semikonserwatywnej występującej in vivo w komórkach Eucaryota służy do powielania wybranych fragmentów kwasów nukleinowych in vitro Model replikacji semikonserwatywnej zakłada, że obie nici macierzystej cząsteczki DNA są matrycą dla nowych, dosyntetyzowywanych nici REPLIKACJA każda z dwóch cząsteczek DNA powstałych po replikacji zawiera jedną nić starą oraz jedną nić nową PCR 1950 opisanie pierwszej polimerazy (Kornberg) 1960 synteza pierwszych oligonukleotydów (Khorana) 1970 odkrycie termostabilnej polimerazy Taq otrzymanie pierwszej polimerazy, która nie ma właściwości nukleazy (buduje lecz nie niszczy)- (Klenow) 1980 opracowanie reakcji PCR (1984) i rozpowszechnienie jej przydatności 1993 Nagroda Nobla Brock & Freeze, 1969 1
Nazewnictwo Matryca: (matrix) DNA/RNA/ssDNA, który ma zostać powielony Starter (primer) sens/antysens; forvard/reverse Denaturacja matrycy (denaturation) Hybrydyzacja starterów/ przyłączanie starterów do matrycy (annealing/ primer hybrydisation) Wydłużanie starterów- (extension) Synteza nowej nici- (amplification) Uzyskany produkt- amplikon (amplicon) PCR matryca DNA startery MgCl 2 Taq polimeraza DNA bufor dttp datp dgtp dctp -trifosforany deoksyrybonukleozydów Helikaza rozplata podwójną strukturę DNA 2
Widełki replikacyjne CYKL 1 denaturacja 94 C jednoniciowa matryca DNA Replikacja na nici wiodącej Polimerazy DNA przyłączają deoksynukleozydotrójfosforany zawsze od końca do Uwalnia się energia 3
Replikacja na nici opóźnionej Poszczególne fragmenty łączone są ze sobą przy pomocy ligazy Fragmenty Okazaki CYKL 1 przyłączenie startera do matrycy 40-65 C starter F starter R CYKL 1 wydłużanie startera 72 C starter 1 starter 2 powstają cząsteczki dłuższe od sekwencji docelowej 4
CYKL 2 denaturacja matrycy 94 C matryca DNA, który powstał w cyklu 1 CYKL 2 przyłączenie startera do matrycy 40-65 C CYKL 2 wydłużanie starterów 72 C powstają cząsteczki dłuższe od sekwencji docelowej powstają cząsteczki o długości sekwencji docelowej 5
Długość amplifikowanego fragmentu będzie zależna od miejsca przyłączenia starterów do matrycy W reakcji PCR amplifikuje się fragment ograniczony położeniem starterów na obu niciach Forward Reverse Długość amplifikowanego fragmentu= długość amplikonu 94 C 94 C 94 C 94 C 72 C 72 C 72 C TEMPERATURA 55 C 55 C 55 C JEDEN CYKL CZAS 6
Wydajność reakcji PCR http://www.calabriadna.com/ NUMER CYKLU LICZBA KOPII DNA 0 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1 024 11 2 048 12 4 096 13 8 192 14 16 384 15 32 768 16 65 536 17 131 072 18 262 144 19 524 288 20 1 048 576 21 2 097 152 22 4 194 304 23 8 388 608 24 16 777 216 25 33 554 432 26 67 108 864 27 134 217 728 28 268 435 456 29 536 870 912 30 1 073 741 824 31 1 400 000 000 32 1 500 000 000 33 1 550 000 000 34 1 580 000 000 AMOUNT OF DNA 1600000000 1400000000 1200000000 1000000000 800000000 600000000 400000000 200000000 0 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR CYCLE NUMBER Startery- Oligonukleotydy Długość: 16-30 zasad Procent zasad G/C: 20-80 (optimum- 50) Temperatura topnienia (Tm) Melting Temperature to temperatura dysocjacji dupleksu starter-matryca- powinna być identyczna lub bardzo zbliżona Temperaturę topnienia oligonukleotydu można obliczyć wg różnych reguł: reguła 2+4 Tm=2 o C(A+T)+4 o C(G+C) -ATA GGT CTA ACC TGG TTC CAG- A+T=11; G+C=10 Tm= 2*11+4*10=22+40=66 o C reguła fizyczna (termodynamiczna), uwzględniająca zjawiska entalpii i entropii oraz stężenie soli poszczególnych jonów (Na+) oraz % poszczególnych zasad -ATA GGT CTA ACC TGG TTC CAG- Tm=59,5 o C 7
Startery Dopasowanie do matrycy (maximum complementarity) Mamy 4 możliwe nukleotydy A,C,G,T Prawdopodobieństwo przyłączenia do matrycy każdego z nich wynosi tyle samo:0.25 (1/4) zdarzenie Prawdopodobieństwo A 0.25 = 0.25 AT 0.25 x 0.25 = 0.0625 ATA 0.25 x 0.25 x 0.25 = 0.015625 ATAGG (0.25) 5 = 0.0009765 ATAGGTCTAAC (0.25) 11 = 0.000002384 ATAGGTCTAACCTGGT (0.25) 16 =0.0000000002384 Wraz z wydłużaniem się sekwencji startera spada prawdopodobieństwo jego przyłączenia w miejscu innym, niż zaplanowane Startery Dopasowanie do matrycy (maximum complementarity) -AGCGCTTCATCCTAAGAAGC- -TCGCGAAGTAGGATTCTTCGTAGGCATAGCAC- oligonukleotyd matryca -AGCACTTCATCCTACGAAGC- -TCGCGAAGT-GGATTCTTCGTAGGCATAGCAC- -AGCRCTTCATCCTAAGAAGC- -TCGCGAAGT-GGATTCTTCGTAGGCATAGCAC- oligonukleotyd matryca oligonukleotyd zdegenerowany matryca -AGCRCTTCATCCTAAGAAGC- -AGCACTTCATCCTAAGAAGC- -AGCGCTTCATCCTAAGAAGC- Startery Komplementarność końców (-maximum complementarity)- startery muszą wykazywać dopasowanie na końcu do matrycy, ale nie mogą wykazywać dopasowania do drugiego startera z pary! Tworzą wtedy struktury dimeryczne (primer dimer) -AGCGCTTCATCCTAAGAAGC- -TCGCGAAGTAGGATTCTTCTTAGGCATAGCAC- Starter F: -GCTTAGCTTTGCATG- Starter R: -AGCATGCAAAGCTTC- Starter R: -AGCATGCAAAGCTTC- Starter F: -GCTTAGCTTTGCATG- 8
Startery Stabilność końców (-terminal stability)- dotyczy pięciu ostatnich zasad od końca, które determinują dopasowanie startera do matrycy. Stabilność określa parametr δg (kcal/mol)- tabela parametrów termodynamicznych i pokazuje siłę wiązania się startera z matrycą. Koniec (GCGCG) będzie wykazywał zawsze ok 6x większą stabilność od końca (TATAT) i może wiązać się z matrycą niespecyficznie! Dlatego należy unikać nagromadzenia zasad G/C na końcach starterów Startery nie mogą tworzyć struktur spinki do włosów (hairpin) -AGCGCTTCCCCCCCCCAGCGCT- -AGCGCT CCCC C C -TCGCGA CCC C PCR Song Lyrics The PCR Song by Scientists for Better PCR There was a time when to amplify DNA, You had to grow tons and tons of tiny cells. (Oooh) Then along came a guy named Dr. Kary Mullis, Said you can amplify in vitro just as well. Just mix your template with a buffer and some primers, Nucleotides and polymerases too. Denaturing, annealing, and extending, Well it s amazing what heating and cooling and heating will do. [Chorus] PCR when you need to detect mutation (detect mutation) PCR when you need to recombine (recombine) PCR when you need to find out who the daddy is (who s your daddy?) PCR when you need to solve a crime (solve a crime) 9