RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 198981 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 338773 (22) Data zgłoszenia: 03.03.2000 (51) Int.Cl. C12N 7/01 (2006.01) A61K 39/12 (2006.01) A61P 37/00 (2006.01) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Sposób wytwarzania zakaźnego mutanta IBDV, zakaźny mutant IBDV uzyskany metodami inżynierii genetycznej oraz szczepionka do stosowania do ochrony drobiu przed chorobą wynikającą z zakażenia IBDV (30) Pierwszeństwo: 05.03.1999,EP,99200647.8 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 11.09.2000 BUP 19/00 (73) Uprawniony z patentu: INTERVET INTERNATIONAL B.V.,Boxmeer,NL (72) Twórca(y) wynalazku: Adriaan Antonius Wilhelmus Maria Loon,Sambeek,NL Egbert Mundt,Millienhagen,DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 29.08.2008 WUP 08/08 (74) Pełnomocnik: Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o. PL 198981 B1 (57) Sposób wytworzenia zakaźnego mutanta IBDV zdolnego do replikacji w hodowli komórek CEF jest złożony z etapów: (i) oddzielnego przygotowania konstruktu cdna odcinków genomowych A i B IBDV niezdolnego do replikacji w hodowli komórek CEF, (ii) wprowadzanie mutacji w: a) jednym lub więcej kodonów dla reszt aminokwasów 253 i 284 genu VP2 szczepów IBDV Wariantu-E lub Klasycznego lub w b) kodonie dla reszt aminokwasu 284 genu VP2 szczepu GLS IBDV, w cdna zawierającym odcinek A tak, że kodony dla reszt aminokwasów 253 i 284 zmutowanego genu VP2 kodują odpowiednio resztę histydyny i treoniny, w przypadku szczepu wariantu-e lub Klasycznego IBDV lub tak, że kodon dla reszty aminokwasu 284 zmutowanego genu VP2 koduje treoninę w przypadku szczepu GLS IBDV, (iii) pozwolenie transkryptom RNA cdna obejmującego odcinek A i odcinek B na inicjację replikacji mutanta IBDV w komórkach gospodarza w pożywce hodowlanej i (iv) izolację mutanta IBDV z hodowli.
2 PL 198 981 B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zakaźnego mutanta IBDV, zakaźny mutant IBDV uzyskany metodami inżynierii genetycznej oraz szczepionka do stosowania do ochrony drobiu przed chorobą wynikającą z zakażenia IBDV. Wirus choroby zakaźnej torebki (Infectious bursal disease virus IBDV) jest członkiem rodziny Birnaviridae. Wirusy tej rodziny mają bardzo podobną genomową organizację i podobny cykl replikacji. Genomy tych wirusów składają się z 2 odcinków (A i B) dwuniciowego (ds) RNA. Większy odcinek A koduje polibiałko, które jest cięte przez autoproteolizę, z wytworzeniem dojrzałych białek wirusowych VP2, VP3 i VP4. VP2 i VP3 są głównymi białkami strukturalnymi wirionu. VP2 jest głównym chroniącym przed gospodarzem immunogenem birnawirusów, i zawiera regiony antygenowe odpowiedzialne za indukcję neutralizujących przeciwciał. Białko VP4 wydaje się być kodowaną przez wirus proteazą, która bierze udział w obróbce polibiałka prekursora białek VP2, VP3 i VP4. Większy odcinek A zawiera także drugą otwartą ramkę odczytu (ORF), przed genem polibiałka i częściowo zachodzącą na ten gen. Ta druga otwarta ramka odczytu koduje białko VP5 o nieznanej funkcji, które jest obecne w komórkach zakażonych IBDV. Mniejszy odcinek B koduje VP1, wielofunkcyjne białko 90 kda o aktywności polimerazy i enzymu przyłączającego czapeczkę. Dla IBDV istnieją dwa serotypy, serotyp 1 i serotyp 2. Dwa serotypy mogą być odróżnione przez testy neutralizacji wirusa (VN). Co więcej, wyizolowano podtypy serotypu 1. Te tak zwane "warianty" wirusów o serotypie 1 można zidentyfikować za pomocą testów neutralizacji krzyżowej, panelu monoklonalnych przeciwciał lub RT-PCR. Te podtypy serotypu 1 IBDV opisano również w literaturze, na przykład, szczepy klasyczny, wariant-e, GLS, RS593 i DS326 (Van Loon i wsp., Proceedings of the International symposium on infectious bursal disease and chicken infectious anaemia, Rauischholzhausen, Niemcy, 179-187, 1994). Zakaźna choroba torebki (IBD), zwana też chorobą Gumboro, jest ostrą, wysoce zakaźną chorobą wirusową u kurcząt, dla której głównym celem jest tkanka limfatyczna z wybiórczym tropizmem do komórek torebki Fabrycjusza. Częstość występowania choroby w podatnych stadach jest wysoka, z szybką utratą wagi i umiarkowanym tempem śmiertelności. Kurczęta, które zdrowieją, mogą mieć niedobory odporności ze względu na zniszczenie torebki Fabrycjusza, która jest niezbędna dla mechanizmów obronnych kurcząt. Wirus IBD powoduje ostrą immunosupresję u kurcząt młodszych niż 3 tygodnie i indukuje uszkodzenia torebki u kurcząt w wieku do 3 miesięcy. Przez wiele lat chorobie można było zapobiegać przez indukowanie wysokich poziomów przeciwciał w stadach rozpłodowych przez podanie inaktywowanej szczepionki kurczętom stymulowanym atenuowaną żywą szczepionką IBDV. To redukowało straty ekonomiczne powodowane przez IBD do minimum. Matczyne przeciwciała u kurcząt pochodzących od szczepionych niosek zapobiegają wczesnym zakażeniom przez IBDV i zmniejszają problemy związane z immunosupresją. Dodatkowo, żywe atenuowane szczepionki były też z powodzeniem stosowane w handlowych stadach kurcząt po spadku poziomu przeciwciał matczynych. Ostatnio bardzo wirulentne szczepy IBDV spowodowały wybuchy choroby z wysoką śmiertelnością w Europie. Obecny program szczepień niedostatecznie chronił kurczęta. Załamania szczepień były przede wszystkim powodowane przez niezdolność żywych szczepionek do zakażenia ptaków przed prowokacją przez wirulentny terenowy szczep wirusa. Tak więc istnieje ciągła potrzeba poprawy istniejących szczepionek i opracowania nowych typów szczepionek. Do rozwinięcia żywych szczepionek wymagane są wirusy IBD w postaci atenuowanej. Konwencjonalnie może to być osiągnięte przez seryjne pasażowanie izolatów terenowych (dzikich) IBDV na odpowiednim substracie. Do opracowania inaktywowanych szczepionek IBDV potrzebny jest odpowiedni substrat do generacji wysokich ilości masy antygenowej IBDV wynikającej z namnażania wirusów IBD na substracie. Wiadomo, że terenowe IBDV mogą być z łatwością namnażane in vivo w torebce zakażonych ptaków lub w jajach z zarodkami. Jednak choć opisano udane przystosowanie namnażania pewnych szczepów IBDV do hodowli komórek pochodzących od zarodków kurczęcia in vitro, na ogół uznaje się, że większość szczepów IBDV izolowanych z zakażonej torebki w terenie, w szczególności tak zwane wirulentne lub bardzo wirulentne szczepy IBDV, nie mogą być przystosowane do komórek pochodzących z zarodków kurczęcia, takich jak fibroblasty z zarodków kurczęcia (CEF) lub komórki z innych narządów, takich jak nerka i wątroba (Brown i wsp., J. Gen. Virology 75, 675-680, 1994; van Loon i wsp., 1994, powyżej).
PL 198 981 B1 3 Wady substratów hodowli in vivo są oczywiste. Takie metody hodowli są nieprzyjazne w stosunku do zwierząt, potrzebują wielu zwierząt, są czasochłonne i nie można ich przeprowadzić w warunkach standaryzowanych i surowych. W dodatku ograniczona liczba szczepów IBDV, które nie są oporne na adaptację do substratów hodowli komórkowej in vitro wykazuje taką wadę, że w wyniku seryjnego procesu pasażowania prowadzącego do adaptacji szczepów IBDV, w genomie wirusa są indukowane losowe mutacje w sposób niekontrolowany. Takie mutacje mogą wpływać na właściwości wirusa inne niż związane z adaptacją wirusa do hodowli komórkowej np. właściwości związane z immunogennością wirusa. Takie dodatkowe losowe mutacje nie są pożądane. Adaptacja IBDV przez pasażowanie wirusa in vitro w hodowlach komórkowych CEF była związana z atenuacją wirulencji, jak wykazano przez obniżenie zdolności wirusa do powodowania uszkodzeń w torebce zakażonego ptaka. Yamaguchi i wsp. (Virology 223, 219-223, 1996) badali molekularne podstawy wirulencji wirusów IBD i atenuację tych wirusów w wyniku adaptacji IBDV z torebki do hodowli komórkowej CEF. Wywnioskowano, że na podstawie badań Yamaguchi i wsp. nie jest możliwe dokładne zidentyfikowanie mutacji związanych z atenuacją dzikiego typu IBDV. Zasugerowano, że reszty aminokwasów w pozycji 279 (Asp/Asn) i 284 (Ala/Thr) polibiałka kodowanego przez długą otwartą ramkę odczytu odcinka A są ważne dla wirulencji lub namnażania IBDV w komórkach CEF. Namnażanie IBDV potwierdził Lim, B-L (Proceeddings of the 4 th Asia Pacific Poultry Health Conference, 22-26 listopada, 1998, Melbourne, Australia, Abst. 79). W publikacji ujawniono, że podstawienie reszt aminokwasów 279 (Asp->Asn) i 284 (Ala->Thr) w białku VP2 IBDV daje w efekcie mutanta IBDV, który może być namnażany w hodowli komórek CEF. Jednak w stanie techniki nie ujawniono alternatywnego typu i minimalnej liczby mutacji aminokwasów, które są wymagane i wystarczające, aby możliwa była adaptacja IBDV z torebki do hodowli komórek CEF. Jest celem tego wynalazku dostarczenie ogólnie możliwej do stosowania metody adaptacji izolatów IBDV, które tylko rosną in vivo w torebce zakażonych ptaków do wzrostu w hodowli komórek. Dalszym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu wytwarzania atenuowanych mutantów IBDV przez wprowadzenie mutacji w genomie IBDV w sposób kontrolowany. Co więcej, celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie mutanta IBDV uzyskanego metodami inżynierii genetycznej zawierającego odpowiednie reszty aminokwasów, które umożliwiają mutantowi wzrost w hodowli komórkowej. Sposób wytwarzania zakaźnego mutanta IBDV zdolnego do replikacji w hodowli komórek CEF według wynalazku, obejmuje etapy: (i) oddzielnego przygotowania konstruktu obejmującego cdna odcinków genomowych A i B IBDV niezdolnego do replikacji w hodowli komórek CEF, (ii) wprowadzenia mutacji w: a) jednym lub więcej kodonach dla reszt aminokwasów 253 i 284 genu VP2 szczepów IBDV Wariantu-E lub Klasycznego, lub w b) kodonie dla reszty aminokwasu 284 genu VP2 szczepu GLS IBDV, w cdna zawierającym odcinek A, tak że kodony dla reszt aminokwasów 253 i 284 zmutowanego genu VP2 kodują odpowiednio resztę histydyny i treoniny, w przypadku szczepu Wariantu-E lub Klasycznego IBDV lub tak, że kodon dla reszty aminokwasu 284 zmutowanego genu VP2 koduje treoninę w przypadku szczepu GLS IBDV (iii) umożliwienie transkryptom RNA cdna obejmującego odcinek A i odcinek B inicjacji replikacji mutanta IBDV w komórkach gospodarza w pożywce hodowlanej, i (iv) izolacji mutanta IBDV z hodowli. Niniejszy wynalazek po raz pierwszy określa, które reszty aminokwasów są wymagane i wystarczające do umożliwienia replikacji IBVD w hodowli komórek CEF. Podczas gdy większość izolatów IBDV z torebki zawiera reszty aminokwasów 253 (Gln), 284 (Ala) i 330 (Ser) białka VP2, mutanty Wariantu-E lub Klasycznego IBDV, których kodony w pozycjach 253 i 284 zostały zmienione tak, że obecnie kodują reszty aminokwasów 253 (His) i 284 (Thr) są zdolne do wzrostu w hodowli CEF. Dla mutantów GLS IBDV stwierdzono, że jest wystarczająca zmiana kodonu w pozycji 284 tak, że obecnie koduje resztę aminokwasu 284 (Thr). Stwierdzono także, że aminokwas w pozycji 330 nie jest krytyczny dla replikacji mutantów IBDV Klasycznego lub Wariantu-E w CEF.
4 PL 198 981 B1 Jednak w sposobie według wynalazku korzystnie mutant IBDV przystosowany do hodowli komórek CEF zawiera serynę, argininę lub lizynę, korzystnie argininę, jako resztę aminokwasu w pozycji 330 białka VP2. Korzystniej, mutacja jest wprowadzana we wszystkich kodonach 253, 284 i 330 genu VP2 IBDV Klasycznego lub Wariantu-E. A szczególnie korzystnie, mutacje są wprowadzane w kodonach 253 (Gln), 284 (Ala) i 330 (Ser). Dodatkowo stwierdzono, że aminokwas w pozycji 253 dla GLS IBDV nie jest krytyczny dla replikacji i zazwyczaj jest resztą glutaminy. T a b e l a 1 IBDV Zmiany aminokwasów Wzrost na CEF 253 284 330 D78/Wariant-E/ rodzicielski Gln Ala Ser mutant His Ala Ser - mutant Gln Thr Ser - mutant Gln Ala Arg - mutant His Thr Ser + mutant Gln Thr Arg - mutant His Ala Arg - mutant His Thr Arg + Stwierdzono, że w genomie (hybrydowego) Wariantu-E IBDV, który był zdolny do replikacji tylko w torebce zakażonych kurcząt (D78/Wariant-E), potrzebne są dwie zmiany do przystosowania izolatów IBDV do hodowli w komórkach CEF. Te pozycje dotyczą reszt aminokwasów 253 i 284. Reszty aminokwasów histydyny i treoniny w tych pozycjach, odpowiednio, pozwalają mutantowi IBDV na replikację w hodowli komórek CEF (Tabela 1 i Przykład 1). Co więcej, stwierdzono, że mutanty IBDV przystosowane do hodowli w komórkach CEF sposobem według wynalazku też są atenuowane (Przykład 2). Aby dalej udowodnić, że o adaptacji klasycznych szczepów IBDV z komórek torebki do komórek CEF decydują też dwa aminokwasy, kodony szczepu IBDV D78, który jest zdolny do replikacji w komórkach CEF zmieniono w pozycjach 253, 284 i 330. Wyniki przedstawiono w Tabeli 2A. T a b e l a 2A IBDV Zmiany aminokwasów Wzrost na CEF 253 284 330 D78 rodzicielski His Thr Arg + mutant Gln Thr Arg - mutant His Ala Arg - mutant His Thr Ser + mutant Gln Ala Ser - Klasyczny "bardzo wirulentny" (VV) europejski izolat UK661 (Brown i wsp., J. Gen. Virology, 75, 675-680 (1994); Brown i Skinner, Virus Res. 40, 1-15, 1996) nie może być namnażany in vitro i musi więc być namnażany in vivo w kurczętach. Kurczęta muszą być zakażone szczepem VV i kilka dni po infekcji ptaki, które przeżyły zabija się i usuwa torebkę. Następnie z homogenatu torebki można wyizolować wirusy do dalszego stosowania. W eksperymentach stanowiących podstawę niniejszego wynalazku wykazano, że zmiany aminokwasów w pozycjach 253 i 284 jak określono powyżej umożliwiają wzrost szczepu VV UK661 w hodowli komórek. Wyniki doświadczeń z mutagenezą i transfekcją z tym Klasycznym szczepem IBDV są podsumowane w Tabeli 2B.
PL 198 981 B1 5 T a b e l a 2B IBDV Zmiany aminokwasów Wzrost na CEF 253 279 2840 D78/661 rodzicielski Gln Asp Ala mutant Gln Asn Thr + * mutant His Asp Ala - mutant Gln Asp Thr - mutant His Asp Thr + *replikuje się bardzo wolno Te dane dalej dowodzą, że zmiany aminokwasów w pozycjach 253 i 284 są wystarczające by możliwy był wzrost Klasycznych szczepów IBDV z torebki w hodowli komórkowej. Wszystkie inne mutacje dają mutanty, które albo nie replikują się w hodowli komórkowej albo replikują się bardzo słabo (patrz też Lim i wsp., J. Virol. 73, 2854-62, 1999). Dodatkowo, stwierdzono, że w GLS IBDV pojedyncza zmiana reszty aminokwasu w pozycji 284 była wystarczająca, aby umożliwić pozwolić IBDV przystosowanemu do torebki replikację w komórkach CEF (Tabela 3). T a b e l a 3 IBDV Zmiany aminokwasów Wzrost na CEF 253 284 330 D78/GLS-BU Gln Ala Ser - D78/GL-CEF Gln Thr Ser + Tak więc sposób według wynalazku pozwala na przystosowanie izolatów IBDV z torebki do wzrostu w hodowli komórkowej za pomocą technik zrekombinowanego DNA. Zaletą niniejszego sposobu jest to, że w wyniku procesu adaptacji do genomu IBDV wprowadzane są tylko mutacje w jednym lub więcej kodonach w pozycjach 253 i 284. Liczby wskazują pozycje kodonów i aminokwasów polibiałka i dużej otwartej ramki odczytu na odcinku A genomu IBDV, odpowiednio (Mundt i Mueller, J. Gen. Virol. 77, 437-443, 1995; numer dostępu NCBI X 84034). Większość, ale nie wszystkie szczepy IBDV, które nie rosną na hodowli komórek CEF, zawierają kodony 253 (Gln), 284 (Ala) i 330 (Ser) w genie VP2. Niektóre szczepy Wariantu-E lub Klasycznego IBVD, które nie rosną na hodowli komórek CEF, mogą już mieć jeden z wymaganych kodonów 253 (His) i 284 (Thr). Tak więc sposób według wynalazku obejmuje wprowadzenie mutacji w jednym lub dwóch z wymaganych kodonów wymienionych powyżej, tak że powstający mutant IBDV zawiera kodony w genie VP2 kodujące reszty aminokwasów 253 (His) i 284 (Thr). Bardziej korzystnie, sposób wynalazku jest stosowany do IBDV, który nie jest zdolny do replikacji w komórkach CEF i który zawiera kodony dla reszt aminokwasów 253 (Gln) i 284 (Ala), a jeszcze bardziej korzystnie 330 (Ser). W przypadku szczepów Klasycznego i Wariantu-E, mutacje są wprowadzane w dwóch z trzech kodonów genu VP2, dając w efekcie kodony 253 (His) i 284 (Thr) i ewentualnie 330 (Arg). Nowymi kodonami dla aminokwasów w tych pozycjach mogą być: kodony dla His (CAT lub CAC), dla Thr (ACT, ACC, ACA, ACG) i dla Arg (CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG). Jeszcze bardziej korzystnie, sposób według wynalazku jest stosowany do IBDV, który nie jest zdolny do replikacji w komórkach CEF i który zawiera kodony Gln 253 (CAA), Ala 284 (GCC) i ewentualnie Ser 330 (AGT) lub dowolną ich kombinację. Sposób wytwarzania mutanta IBDV według niniejszego wynalazku obejmuje ostatnio ustalony system "genetyki odwrotnej" dla birnawirusów (Mundt i Vakharia, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11131-11136, 1996 i WO 98/09646). Ten system genetyki odwrotnej otworzył możliwość wprowadzania mutacji w genomie RNA wirusa IBD. Zasadą metody genetyki odwrotnej według wynalazku jest, że odcinki genomowego RNA A i B izoluje się z wirusa, następnie za pomocą odwrotnej transkrypcji przepisuje RNA na cdna, po czym cdna są transkrybowane do RNA. Wprowadzanie wymaganej (wymaganych) mutacji do odcinka wirusa A (lub B) zachodzi na poziomie cdna. Ważnym etapem tego systemu genetyki odwrotnej jest dostarczenie oddzielnych konstruktów DNA obejmujących czą-
6 PL 198 981 B1 steczkę DNA wektora (np. plazmid) i klony cdna pełnej długości odcinków A lub B IBDV. Konstrukty DNA zawierające cdna odcinka A lub B wraz z nukleotydami na końcach 5' i 3' obu tych odcinków mogą być wygenerowane według metody opisanej przez Mundt i Vakharia (1996, powyżej). Kolejnym etapem w metodzie genetyki odwrotnej jest transfekcja komórek odpowiedniego gospodarza materiałem genetycznym odpowiedniego odcinka A lub B tak, że w transfekowanych komórkach gospodarza transkrypty RNA z cdna odcinków A i B mogą inicjować replikację wirusa, dając w wyniku zakaźny IBDV, który może być wyizolowany z pożywki, w której hodowane są komórki gospodarza. Do ostatniego etapu systemu genetyki odwrotnej może być stosowanych kilka metod. Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje przygotowanie syntetycznych transkryptów RNA z cdna zawierającego zmutowany odcinek A i odcinek B in vitro, a następnie transfekowanie komórek gospodarza syntetycznymi transkryptami RNA. W tym przypadku konstrukty DNA zawierają promotor polimerazy RNA funkcjonalnie połączony z jednym z odcinków. Promotor może być promotorem dla polimerazy T7, SP6 lub T3; korzystny jest promotor T7. Syntetyczne transkrypty odcinka A i B izoluje się i stosuje do transfekcji odpowiednich komórek gospodarza. Alternatywny jest sposób, w którym dostarczona jest linia komórkowa obejmująca komórki gospodarza zdolne do ekspresji polimerazy RNA, i które są transformowane konstruktem DNA zawierającym cdna odcinka B i promotor polimerazy RNA, tak że transkrypty RNA odcinka B są wyrażane konstytutywnie. Po transfekcji takich komórek syntetycznym transkryptem RNA z cdna zawierającego zmutowany odcinek A, inicjowana jest replikacja mutanta IBDV w komórkach gospodarza. W szczególności, mogą być stosowane komórki gospodarza, które są zdolne do ekspresji polimerazy RNA zależnej od DNA bakteriofaga T7, wyrażanej na przykład cytoplazmatycznie ze zrekombinowanego wirusa krowianki. Żądane mutacje mogą być wprowadzane do genu VP2 za pomocą metod ogólnie znanych do tego celu w dziedzinie. W szczególności mutacja (mutacje) jest wprowadzana za pomocą mutagenezy ukierunkowanej. Sposoby wprowadzania mutacji do genomu IBDV są tu opisane, ale są one też ogólnie stosowane w dziedzinie (Mundt i Vakharia, 1996, powyżej; Yao i wsp., J. Virology 72, 2647-2654, 1998; Mundt i wsp. Europejskie zgłoszenie patentowe nr 0887,412 i Current Protocols in Molecular Biology, red. F.M. Ausubel i wsp., Wiley N.Y., wydanie 1995, strony 8.5.1.-8.5.9.). Sposób według wynalazku może być stosowany do wszystkich szczepów IBDV, które są niezdolne do replikacji w hodowlach komórek CEF, i które są antygenowymi podtypami IBDV Klasycznym, Wariantem-E, lub GLS. Ponadto, sposób według wynalazku może być stosowany do wszystkich szczepów IBDV, które nie są zdolne do replikacji w hodowli komórek CEF, niezależnie od wirulencji szczepów, i obejmuje bardzo wirulentne szczepy (takie jak CS89 i UK661), wirulentne szczepy (takie jak F52/70 i STC) i szczepy szczepionkowe (takie jak 228E i 2512). Mutanty IBDV, które są przystosowane do replikacji w hodowli komórek, pochodzące ze szczepów wirulentnych i bardzo wirulentnych, będą mniej wirulentne i mogą być stosowane jako szczepy do żywych szczepionek. Alternatywnie, takie mutanty IBDV mogą być namnażane w dogodny sposób w hodowli komórkowej i formułowane jako szczepionki inaktywowane. Sposób według wynalazku może być też korzystnie stosowany do atenuowanych szczepów IB- DV, które nie są zdolne do replikacji w hodowli komórek CEF. Mutanty pochodzące z takich atenuowanych wirusów mogą być stosowane w systemie hodowli komórek do produkcji szczepionek zamiast systemu wytwarzania in vivo. Korzystny sposób według wynalazku obejmuje dodatkowe etapy przygotowania hybrydowego IBDV, zdolnego do replikacji w hodowli komórek CEF. Sposób obejmuje dodatkowy etap wprowadzania mutacji do genu odcinka A, korzystnie genu VP2, pierwszego IBDV, w wyniku czego białko wyrażane przez ten gen zawiera determinantę epitopu drugiego IBDV. Hybrydowy IBDV jest to wirus, który zawiera jako szkielet genetyczny odcinek A lub gen VP2 pierwszego podtypu antygenowego i dodatkowo zawiera informację genetyczną kodującą determinantę epitopu drugiego podtypu antygenowego IBDV. W szczególności, takie hybrydowe IBDV wyrażają jedną lub więcej epitopowych determinant białka VP2 IBDV pierwszego podtypu antygenowego. Zaletą takiego hybrydowego IBDV jest to, że może być stosowany jako pojedynczy immunogen, który indukuje oporność na przynajmniej dwa podtypy antygenowe IBDV. W szczególności przygotowuje się mutanty IBDV, które zawierają jako szkielet odcinek A lub gen VP2 Klasycznego IBDV, GLS lub Wariantu-E. Klony cdna zawierające cały region kodujący odcinka A różnych szczepów IBDV można przygotować stosując standardowe procedury klonowania
PL 198 981 B1 7 i metody opisane w stanie techniki (Vakharia i wsp., Avian Diseases 36, 736-742, 1992; J. Gen. Virology 74, 1201-1206, 1993). Sekwencje aminokwasów i sekwencje nukleotydów odcinka A różnych szczepów IBDV są ujawnione w stanie techniki (np. WO 95/26196 i Vakharia i wsp., Avian Diseases 36, 736-742, 1992). Co więcej, WO 95/26196 ujawnia sekwencje aminokwasów kilku determinant epitopowych podtypów antygenowych IBDV, które są charakterystyczne dla każdego podtypu. Dodatkowo, w WO 95/26196 ujawniono antygenową charakterystykę różnych szczepów IBDV przez ich reaktywność z panelem neutralizujących monoklonalnych przeciwciał. Co jest istotne, epitopowe determinanty reagujące z takimi neutralizującymi Moab są determinantami epitopowymi B69 (podtyp klasyczny), R63 i 67 (wariant-e) i 57 (GLS). Region białka VP2 zawierający sekwencje aminokwasów dla tych determinant epitopowych jest opisany w Vakharia i wsp. (Virus Res. 31, 265-273, 1994). Korzystnie, w sposobie według niniejszego wynalazku przygotowywany jest hybrydowy mutant IBDV zdolny do replikacji w hodowli komórek CEF zawierający klasyczny szkielet odcinka A i sekwencję nukleotydów kodującą wariantową determinantę epitopu 67, lub determinantę epitopu GLS 57. Alternatywnie, hybrydowy mutant IBDV zawiera szkielet GLS i sekwencje nukleotydowe kodujące determinanty epitopowe B69, R63 lub 67. W szczególności, sposób według wynalazku obejmuje przygotowanie hybrydowego szczepu IBDV (D78/Wariant E) pochodzącego od szczepu D78 (handlowo dostępny od Intervet International B.V., Niderlandy), w którym (i) gen VP2 jest zastąpiony przez gen VP2 szczepu Wariantu-E, i (ii) kodony w pozycjach 253, 284 i 330 są zmienione jak zdefiniowano powyżej (Przykład 1). Etapy wprowadzania sekwencji nukleotydowych kodujących epitopowe determinanty w odcinku szkieletowym A pierwszego IBDV są zasadniczo takie same jak etapy wprowadzania mutacji określone powyżej. Najłatwiej można tego dokonać przez dostarczenie cdna odcinków genomowych A i B i (i) zastąpienie sekwencji kodującej dla determinanty epitopowej pierwszego IBDV przez sekwencję drugiego IBDV, lub (ii) zamianę specyficznego kodonu w pierwszym IBDV za pomocą mutagenezy ukierunkowanej. Takie metody są też opisane w WO 95/26196. W końcu transkrypty RNA tych cząsteczek cdna inicjują replikację w transfekowanym gospodarzu i uzyskuje się zakaźny, hybrydowy IBDV. Powstały mutant IBDV zawiera również inne mutacje, które atenuują wirus. Przykładem takiej mutacji jest mutacja w genie VP5 odcinka A genomu IBDV dająca w efekcie mutant IBDV, który nie jest zdolny do wyrażania natywnego biała VP5. Przygotowanie mutanta VP5 - IBDV opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym nr EP 887,412. W zakres wynalazku wchodzi też zakaźny mutant IBDV, uzyskany metodami inżynierii genetycznej, zdolny do replikacji w hodowli komórek CEF, zawierający kodony dla aminokwasów 253 (His) i 284 (Thr) i ewentualnie 330 (Arg) w genie VP2 IBDV Klasycznego lub Wariantu-E, lub kodon dla aminokwasu 284 (Thr) w genie VP2 GLS IBDV. Korzystnie mutant jest hybrydowym mutantem IBDV. Korzystnie mutant jest D78/Wariantem-E (przystosowanym do CEF). Takie mutanty IBDV nadal zawierają informację genetyczną IBDV z torebki, które nie są zdolne do replikacji w hodowli komórek CEF, z wyjątkiem nowych kodonów wspomnianych powyżej, które zostały wprowadzone w sposób kontrolowany za pomocą technik inżynierii genetycznej. W szczególności dostarczony jest mutant Wariantu-E IBDV jak zdefiniowano powyżej, który nie ma glicyny i/lub waliny odpowiednio w pozycjach 318 i 325. Mutanty Wariantu-E uzyskane za pomocą technik inżynierii genetycznej, zawierające kwas asparaginowy i/lub metioninę w tych pozycjach, są najbardziej korzystne. W korzystnej postaci, uzyskany za pomocą inżynierii genetycznej mutant IBDV według wynalazku jest hybrydowym mutantem IBDV pochodzącym od szczepu D78, zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą gen VP2 szczepu Wariantu-E i mającym trzy nowe kodony wymienione powyżej. Niniejszy wynalazek dotyczy również szczepionki do stosowania do ochrony drobiu przed chorobą wynikającą z zakażenia IBDV, obejmującej uzyskany technikami inżynierii genetycznej mutant IBDV wytworzony sposobem określonym powyżej, wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Dodatkową zaletą niniejszego wynalazku jest możliwość (dalszego) atenuowania w kontrolowany sposób, sposobem opisanym powyżej. Takie atenuowane mutanty IBDV mogą być stosowane jako czynne składniki w żywych szczepionkach IBDV. Mutant IBDV może być włączony do szczepionki jako żywy atenuowany lub inaktywowany wirus.
8 PL 198 981 B1 Szczepionka według wynalazku może być przygotowana konwencjonalnymi metodami, takimi jak, na przykład, stosowanie do handlowo dostępnych żywych i inaktywowanych szczepionek IBDV. Pokrótce, wrażliwy substrat zaszczepia się mutantem IBDV według wynalazku i namnaża, aż wirus zreplikuje się do żądanego miana zakaźnego, poczym zbiera się materiał zawierający IBDV. Każdy substrat, który jest zdolny do podtrzymywania replikacji mutantów IBDV, może być stosowany do przygotowania szczepionki według niniejszego wynalazku, w tym hodowle pierwotnych linii komórkowych (ptasich), takie jak fibroblasty zarodka kurczęcia (CEF) lub komórki wątroby zarodka kurczęcia (CEL), linie ssacze takie jak linia komórkowa VERO lub linia komórkowa BGM-70, lub linie komórek ptasich, takie jak QT-35, QM-7 lub LMH. Zazwyczaj, po zaszczepieniu komórek wirus jest namnażany przez 3-10 dni, po czym zbiera się supernatant hodowli komórek, i jeśli jest to pożądane sączy się go lub wiruje, aby usunąć szczątki komórek. Alternatywnie, mutant IBDV namnaża się w jajach z zarodkami kurcząt. W szczególności, substratem na którym namnaża się IBDV, są jaja SPF z zarodkami. Jaja z zarodkami można zaszczepić na przykład 0,2 ml zawiesiny lub homogenatu, który zawiera mutanta IBDV w ilościo przynajmniej 10 2 TCID 50 na jajo i następnie inkubuje się je w 37 C. Po około 2-5 dniach można zebrać IBDV przez zebranie zarodków i/lub błon i/lub płynu omoczniowego, a następnie odpowiednią homogenizację materiału. Homogenat może być następnie wirowany przez 10 minut przy 2500 x g z późniejszym sączeniem supernatantu przez filtr (100 Mm). Szczepionka według wynalazku zawierająca żywy wirus może być przygotowana i sprzedawana w postaci zawiesiny lub w postaci liofilizowanej i zawiera farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub rozcieńczalnik zwyczajowo stosowany w takich kompozycjach. Nośniki obejmują stabilizatory, konserwanty i bufory. Odpowiednimi stabilizatorami są na przykład, SPGA, węglowodany (takie jak sorbitol, manitol, skrobia, sacharoza, dekstran, glutaminian lub glukoza), białka (takie jak wysuszona serwatka mleka, albumina lub kazeina) lub produkty ich degradacji. Odpowiednimi buforami są, na przykład, fosforany metali alkalicznych. Odpowiednimi konserwantami są timerosal, mertiolat i gentamycyna. Rozcieńczalniki obejmują wodę, wodne bufory (takie jak buforowany roztwór soli fizjologicznej), alkohole i poliole (takie jak glicerol). Jeśli jest to pożądane, żywe szczepionki według wynalazku mogą zawierać adiuwant. Przykłady odpowiednich związków i kompozycji z aktywnością adiuwantów są te same, jak wymienione poniżej. Choć podanie przez wstrzyknięcie, na przykład domięśniowe, podskórne, żywej szczepionki według niniejszego wynalazku jest możliwe, szczepionka jest korzystnie podawana za pomocą niedrogich technik masowego podawania powszechnie stosowanych do szczepień IBDV. Dla szczepień IBDV te techniki obejmują podawanie w wodzie pitnej i stosowanie szczepionki w postaci spreju. Alternatywne metody podawania żywej szczepionki obejmują in ovo, krople do oczu i zanurzanie dzioba. Szczepionka według wynalazku może zawierać mutant IBDV w postaci inaktywowanej. Główną zaletą inaktywowanej szczepionki jest wysoki poziom ochronnych przeciwciał o długim okresie trwania, który może być uzyskany. Celem inaktywacji wirusów zebranych po etapie namnażania jest eliminacja rozmnażania się wirusów. Na ogół można ją uzyskać za pomocą środków chemicznych lub fizycznych. Chemiczną inaktywację można osiągnąć przez działanie na wirusy na przykład enzymami, formaldehydem, β-propionolaktonem, etylenoiminą lub ich pochodną. Jeśli jest to konieczne, związek inaktywujący można potem zneutralizować. Materiał inaktywowany formaldehydem może być na przykład neutralizowany tiosiarczanem. Inaktywacja fizyczna może być korzystnie przeprowadzona przez poddanie wirusów promieniowaniu bogatemu w energię, takiemu jak światło UV lub promieniowanie γ. Jeśli trzeba, ph po traktowaniu może być doprowadzone do wartości około 7. Szczepionka zawierająca zinaktywowanego mutanta IBDV może, na przykład, zawierać jeden lub więcej z powyżej wymienionych farmaceutycznie dopuszczalnych nośników lub rozcieńczalników odpowiednich do tego celu. Korzystnie zinaktywowana szczepionka według wynalazku zawiera jeden lub więcej związków o aktywności adiuwanta. Odpowiednie związki lub kompozycje dla tego celu obejmują wodorotlenek, fosforan lub tlenek glinu, emulsję olej w wodzie lub woda w oleju opartą, na przykład, na oleju mineralnym, takim jak Bayol F lub Marcol 52 lub oleju roślinnym, takim jak octan witaminy E i saponiny. Szczepionka według wynalazku zawiera jako składnik czynny skuteczną dawkę mutanta IBDV, tzn. ilość immunizującego materiału IBDV, który zaindukuje u zaszczepionych ptaków oporność przeciwko prowokacji przez wirulentny wirus. Oporność jest tu definiowana jako indukcja znacząco wyższego poziomu ochrony w populacji ptaków po szczepieniu w porównaniu z nieszczepioną grupą.
PL 198 981 B1 9 Typowo, żywa szczepionka według wynalazku może być podana w dawce 10 2-10 9 TCID 50 (zakaźna dawka 50 (TCID 50 ) ) na zwierzę, korzystnie w dawce w zakresie od 10 5,0-10 7,0 TCID 50, a zinaktywowane szczepionki mogą zawierać antygenowy równoważnik 10 5-10 9 TCID 50 na zwierzę. Inaktywowane szczepionki są na ogół podawane pozajelitowo, np. domięśniowo lub podskórnie. Choć szczepionka IBDV według niniejszego wynalazku może być skutecznie stosowana u kurcząt, również inny drób, taki jak indyki, perliczki i kuropatwy, może być skutecznie szczepiony szczepionką. Kurczęta obejmują brojlery, reproduktory i nioski. Wiek zwierząt otrzymujących żywą lub inaktywowaną szczepionkę według wynalazku jest taki sam jak zwierząt otrzymujących konwencjonalne żywe lub inaktywowane szczepionki IBDV. Na przykład jednodniowe brojlery (wolne od pochodzących od matki przeciwciał-mda) mogą być szczepione, podczas gdy brojlery z wysokimi poziomami MDA są korzystnie szczepione w wieku 2-3 tygodni. Nioski lub reproduktory z niskimi poziomami MDA mogą być szczepione w wieku 1-10 dni, a następnie z późniejszym doszczepianiem przypominającym w wieku 6-8 i 16-20 tygodni inaktywowaną szczepionką. Może być stosowana szczepionka skojarzona dodatkowo zawierająca jeden lub więcej szczepów szczepionkowych zakaźnego wirusa zapalenia oskrzeli (IBV), wirusa choroby Newcastle, wirusa syndromu spadku nośności (EDS), wirusa nieżytu nosa i tchawicy indyka (TRTV) lub reowirusa. P r z y k ł a d 1 Konstrukcja mutantów IBDV i ich właściwości replikacji w komórkach hodowli CEF Materiał i metody Konstrukcja (międzyrodzajowych) plazmidów IBDV zawierających region zmienny VP2 szczepów IBDV Klasycznego, Wariantu-E lub GLS. (i) VP2 klasycznego szczepu IBDV D78 Wymaganiem wstępnym dla następującej mutagenezy ukierunkowanej była modyfikacja plazmidu puc 18. W tym celu puc 18 przecięto Ndel i BamHI, poddano elektroelucji, stępiono końce za pomocą enzymu Klenowa i ponownie zligowano, aby uzyskać puc18 ΔNdel- BamHI (puc18/δnb). Plazmid pad78/ek (Mundt i wsp., J. Virology 71, 5647-51, 1997) strawiono EcoRI i Kpn I, aby uzyskać sekwencję pełnej długości odcinka A serotypu I szczepu D78 wraz z miejscem promotora polimerazy RNA T7. W celu uzyskania pd78/δnb (Fig. 1A) fragment wligowano do puc18/δnb strawionego EcoRI i KpnI. Plazmidu pd78a/δndb użyto jako szkieletu do klonowania i w procedurach mutagenezy ukierunkowanej. UK661 Plazmidu pd78-e/del (patrz poniżej) użyto do konstrukcji hybrydowych plazmidów zawierających sekwencje odcinka A szczepu UK 661. Po strąceniu wirusowego RNA przeprowadzono odwrotną transkrypcję i PCR według standardowych procedur stosując oligonukleotydy UK661AFor1 i UK661ARev1 (Brown i Skinner, Virus Res. 40, 1-15, 1996, numery nukleotydów 621-644 sens i 1201-1223 antysens, odpowiednio). Powstałe fragmenty PCR sklonowano na tępe końce do wektora puc 18 strawionego Smal (Pharmacia, Szwecja) w celu uzyskania p661apart. Po zsekwencjonowaniu p661apart strawiono enzymami restrykcyjnymi Nde I i Spe I w nukleotydach 647 i 1182, odpowiednio (numeracja jest zgodna z sekwencją pełnej długości szczepu P2: numer dostępu NCBI X 84034), aby uzyskać fragment 535 bp obejmujący sekwencje kodujące regionu zmiennego VP2 szczepu UK661. Po ligacji z pd78-e/del strawionym Nde I i Spe I, uzyskano hybrydowy plazmid pd78a-e661 o pełnej długości zawierający sekwencje odcinka A szczepu D78, E/Del i UK661 (Fig. 4). (ii) VP2 Wariantu-E IBDV W celu substytucji specyficznych sekwencji IBDV wzięto plazmid zawierający całkowitą sekwencję kodującą region Wariantu E szczepu E/Del (pedel22bacii, Vakharia, Biotechnology annual review 3, 151-168, 1997). pedelbacii (Fig. 1A) przecięto enzymami restrykcyjnymi Nde I i Sal I, odpowiednio nukleotydy 647 i 1725, zgodnie z sekwencją pełnej długości szczepu P2 (numer dostępu NCBI X 84034), celu uzyskania fragmentu 1078 bp obejmującego sekwencje kodujące regionu zmiennego VP2 i sekwencje VP4 szczepu E/Del. Po ligacji z pd78a/δnb strawionym Nde I i Sall uzyskano hybrydowy plazmid pełnej długości pd78/δnb-e/del (Fig. 1 A) zawierający sekwencje odcinka A szczepu D78 jak i E/del. Plazmidów pad78/dnb i pd78a/dnb -E/Del użyto do mutagenezy ukierunkowanej. (iii) VP2 IBDV GLS Dalej skonstruowano parę plazmidów zawierających odpowiednio region zmienny GLS-B i GLS- TC. Do sklonowania regionów hiperzmiennych, GLS-TC namnożono w CEF i oczyszczono za pomocą ultrawirowania. Homogenat GLS-B z torebki oczyszczono za pomocą wirowania przy niskiej szybkości
10 PL 198 981 B1 i supernatant użyto do następujących procedur. Po trawieniu proteinazą K (0,5 mg/ml)/siarczanem dodecylu sodu (SDS, 0,5%) wirusowy RNA oczyszczono, poddano odwrotnej transkrypcji do cdna, i amplifikowano za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) stosując standardowe procedury i oligonukleotydy A14 i A44 (Tabela 4). Produkt amplifikacji sklonowano na tępe końce i zsekwencjonowano plazmidy zawierające odpowiednie fragmenty PCR zawierające plazmidy. Plazmidy zawierające każdy wstawkę albo GLS-TC (pgls-tc) albo GLS-B (pgls-b) stosowano w następujących eksperymentach. Do konstrukcji międzyrodzajowego odcinka A użyto klonu pełnej długości pd78a/vnb- E/Del. pgls-tc i pgls-b, odpowiednio, strawiono Sac I i Spe I. Po elektroelucji fragmenty wligowano następnie do pd78a/vnb-e/del uprzednio strawionego Sac I i Spe I, aby uzyskać pd78a/vnb -E/Del- GLS - TC i pd78a/vnb -E/Del - GLS - B, odpowiednio. Mapy plazmidowe obu plazmidów przedstawiono na Figurze 1B. Mutageneza ukierunkowana Mutagenezę ukierunkowaną przeprowadzono za pomocą PCR. Oligonukleotydy zawierały mutacje prowadzące do zmian aminokwasów i dodatkowe miejsca cięcia przez enzymy restrykcyjne (Tabela 4). Po amplifikacji PCR stosując plazmidy pad78/vnb, pd78a/vnb -E/Del i pd78a-e-661, odpowiednio, fragmenty klonowano na tępe końce i sekwencjonowano (pfrag). Klony zawierające zmutowane kodony ligowano do uprzednio ciętych plazmidów w następujący sposób: (i) IBDV Wariant-E W celu uzyskania klonów pełnej długości odcinka A plazmidu pd78a/vnb -E/Del zawierającego zmutowane kodony otrzymano następujące fragmenty PCR: użyto starterów E/Del-MutQH i A14 (pfragqh), E/Del-MutAT i A14 (pfragat), E/Del-MutSR i P21F (pfragsr) do otrzymania fragmentów z odpowiednimi zamianami pojedynczych aminokwasów Q253H, A284T i S330R, odpowiednio, sekwencji E-Del. PfragQH i pfragsr strawiono Sac I i Spe I i zligowano z uprzednio strawionym Sac I i Spe I pd78a/δnb-e/del, aby uzyskać pd78a/dnb-e/delqh (Fig. 1C) i pd78a/δnb-e/delsr (Fig. 1C) odpowiednio. W celu skonstruowania pd78a/δnb-e/delat (Fig. 1C) pfragat strawiono Nar I - Spe I, a następnie zligowano z uprzednio strawionym pd78a/dnb-e/del. Aby uzyskać plazmidy zawierające dwa zmutowane kodony przeprowadzono następujący PCR: do amplifikacji odpowiednio fragqh-sr i fragat-sr na pd78a/δnb-e/del użyto starterów E/Del-MutQH i E/Del-MutSR, i E/Del- MutAT, i E/Del-MutSR. Po sklonowaniu i zsekwencjonowaniu pfragqh-sr strawiono Sac I - Spe I, a następnie zligowano z uprzednio strawionym pd78a/δnb-e/del, aby uzyskać pd78a/δnb-e/del- QH-SR (Fig. 1D). Do konstrukcji pd78a/δnb-e/del-at-sr (Fig. 1D) plazmid pfragat-sr strawiono Nar I i Spe I i zligowano z tak samo strawionym pd78a/δnb-e/del. Do konstrukcji plazmidu zawierającego dwa zmutowane kodony dla dwóch wymian aminokwasów (Q253H; A284T) PCR przeprowadzono stosując plazmid pd78a/δnb-e/delat i startery E/Del-MutQH, A14. Uzyskany fragment plazmidu pfragqh-at strawiono Sac I -Spe I i zligowano z pd78a/δnb-e-del, aby uzyskać pd78a/δnb- E/DelQH-AT (Fig. 1D). Do sklonowania plazmidu zawierającego zmutowane kodony dla wszystkich trzech wymian aminokwasów (Q253H, A284T, i S330R) startery E/Del-MutQH i E/DelMutSR zastosowano do amplifikacji fragqh-at SR na pd78a/δnb-e/del-at. Po strawieniu pfragqh-at SR Sac I i Spe I wyeluowany fragment zligowano z pd78a/anb-e/del strawionym Sac I i Spe I aby uzyskać pd78a/δnb-e/delqh-at-sr (Fig. 1E). (ii) Klasyczny IBDV D78 Dla uzyskania klonów pełnej długości odcinka A plazmidu pd78a/δnb zawierającego zmutowane kodony fragment Nde I -Hind III pd78a/δnb subklonowano do uprzednio strawionego Nde I - Hind III puc19, aby otrzymać pojedyncze miejsca restrykcyjne dla następujących procedur (puc19/nh-d78a). Oligonukleotydy D78-MutHQ i A14 (pfraghq), D78-MutTA i A14 (pfragta), D78- MutRS i P21F (pfragrs) zastosowano do amplifikacji PCR w celu uzyskania fragmentów z odpowiednimi zmianami pojedynczych aminokwasów H253Q, T284A, i R330S, odpowiednio, sekwencji D78. Fragment. PfragHQ trawiono Sac I i Sty I, pfragta strawiono Nar I i Sty I, pfragrs strawiono Sac I i Sty I, i zligowano ponownie z odpowiednio strawionym puc19/nh-d78a. Plazmid puc19/nh-d78a zawierający zmutowany kodon strawiono Nde I i Sac II, odpowiednie fragmenty elektroeluowano i ligowano z pd78a/δnb uprzednio strawionym Nde I i Sac II, aby uzyskać pd78a/δnb-hq, pd78a/dnb-ta i pd78a/dnb-rs, odpowiednio. W celu skonstruowania klonu pełnej długości zawierającego podstawienia nukleotydów prowadzące do wymiany wszystkich trzech aminokwasów (H253Q, A284T, E330S) przeprowadzono PCR stosując oligonukleotydy D78-MutHQ, D78-MutRS i plazmid pd78a/dnb-ta. Uzyskany fragment PCR wklonowano na tępe końce, aby uzyskać
PL 198 981 B1 11 pfraghq-ta-rs. Po strawieniu pfraghq-ta-rs Sac I i Sty I elektroeluowany fragment sklonowano w puc19/nh-d78a strawionym Sac I i Sty I. Uzyskany plazmid strawiono Nde I i Sac II, odpowiedni fragment elektroeluowano i w końcu ligowano z pd78a/dnb, uprzednio strawionym Nde I i Sac II, aby uzyskać pd78a/dnb-hq-ta-rs. Sekwencje nukleotydowe otrzymanych zmutowanych plazmidów potwierdzano za pomocą sekwencjonowania. Sekwencje analizowano za pomocą Wisconsin Package, wersja 8 (Genetics Computer Group, Madison, Wis.). Plazmidy pd78a/δnb-hq, pd78a/δnb-ta, pd78a/δnb-rs i pd78a/δnb-hq-ta-rs przedstawiono na Fig. 2. UK661 Dla mutagenezy ukierunkowanej plazmid pd78a-e-uk661 strawiono EcoR I /Kpn I i sekwencję pełnej długości fragmentu zawierającego odcinek A następnie zligowano z trawionym EcoR I /Kpn I wektorem plazmidowym pbs - (Stratagene). Powstały plazmid pbsd78a-e-661 użyto do doświadczeń z mutagenezą ukierunkowaną według wcześniej opisanej metody (Kunkel i wsp., Methods Enzymol. 154, 367-382, 1987). W oparciu o wyniki Lim i wsp. (1999, powyżej) sekwencję nukleotydową dla aminokwasu 279 i 284 plazmidu pbsd78a-e-661 wymieniono (D279N, A284T) stosując oligonukleotyd Mut1 w kierunku antysensownym (Brown i Skinner, powyżej; nukleotydem nr. 947-1001, 946-966 jest AAC, a 979-981 jest ACG dając w efekcie podstawienia aminokwasów D279N i A284T). Odpowiednią część powstałego plazmidu pbsd78a-e-661-dn-at zsekwencjonowano. Po strawieniu pbsd78a-e-661-dn-at Nde I/ Spe I fragment 535 bp wligowano do odpowiednio strawionego pd78a-e-661, aby uzyskać pd78a-e-661-dn-at. Ponadto, sekwencję nukleotydową aminokwasu Q253 zamieniono na sekwencję nukleotydową kodującą H253 przez zastosowanie skierowanego antysensownie oligonukleotydu Mut 2 (Brown i Skinner powyżej, nukleotydem nr 874-900, 868-888 jest CAT dając podstawienie aminokwasu Q253H). Powstały plazmid pd78a-e-661-qh zawierał wymianę aminokwasu Q253H. Wymianę aminokwasu 284 (A284T) przeprowadzono stosując skierowany w kierunku antysensownym oligonukleotyd Mut3 (Brown i wsp., powyżej, nukleotydem numer 966-993, 979-981 jest ACC dając podstawienie aminokwasu A284T) uzyskując plazmid p78a-e-661-at. Czwarty plazmid pd78a-e-661-qh-at zawierał wymianę obu aminokwasów (Q253H, A284T) przez zastosowanie obu oligonukleotydów (Mut 2, Mut3) w jednej reakcji ukierunkowanej mutagenezy. Plazmidy p661apart, pd78a-e-661, pd78a-e- 661-DN-AT, pd78a-e-661-qh, pd78a-e-661-at, i pd78a-e-661-qh-at przedstawiono na Figurze 4.
12 PL 198 981 B1
PL 198 981 B1 13 Konstrukcja pełnej długości klonu cdna odcinka B Szczep 78 W celu sklonowania pełnej długości cdna odcinka B serotypu I szczepu D78, wirus namnożono w CEF i oczyszczono przez ultrawirowanie. Genomowy wirusowy RNA szczepu D78 oczyszczono, poddano odwrotnej transkrypcji do cdna i zamplifikowano za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) według procedur -standardowych stosując oligonukleotydy tak jak opisano (Mundt i Vakharia, 1996). Produkt amplifikacji sklonowano na tępe końce i zsekwencjonowano plazmidy zawierające odpowiednie fragmenty PCR. Procedura klonowania do uzyskania plazmidu zawierającego pełnej długości cdna odcinka B (puc18bd78) pod kontrolą promotora polimerazy RNA T7 odpowiadała procedurze, którą opisali Mundt i Vakharia (1996 powyżej) dla odcinka B szczepu P2 (Figura 3). Szczep UK661 Zastosowano trzy pary oligonukleotydów pochodzących z informacji o sekwencji podanej w Brown i Skinner (1996 powyżej): i) UK661BFor1 (sekwencja zgodnie z oligonukleotydem B5'-P2, Mundt i Vakharia, 1996 powyżej), skierowany w kierunku antysensownym UK661BRev1 (nukleotyd nr 708-736). Koniec 5' oligonukleotydu UK661Rev1 zawiera oprócz sekwencji odcinka B szczepu UK-661 miejsce restrykcyjne enzymu Xba I zawierające sekwencję dziewięcionukleotydową 5'-CTCTAGAGG. ii) UK661Bfor2 (nukleotyd 751-677), skierowany w kierunku antysensownym UK661Brev2 (nukleotyd nr 2089-2133). Koniec 5' oligonukleotydu UK661Brev2 zawiera oprócz sekwencji odcinka B szczepu UK-661 miejsce restrykcyjne enzymu Xba I zawierające sekwencję dziewięcionukleotydową 5'-CTCTAGAGG. iii) UK661BFor3 (nukleotyd 2011-2035), skierowany w kierunku antysensownym UK661BRev3 (Mundi i Mueller, 1996 powyżej, nukleotyd nr 2804-2827). Koniec 5' oligonukleotydu UK661BRev3 zawiera oprócz sekwencji odcinka B szczepu UK-661 miejsca restrykcyjne enzymu Xba I zawierające sekwencję dziewięcionukleotydową 5'-TCTAGAGCCC Tam trójka CCC stworzyła miejsce cięcia dla Sma I wraz z ostatnimi trzema nukleotydami wirusowej genomowej sekwencji odcinka B (nukleotyd 2825-2827). Przez użycie tych trzech par oligonukleotydów UK661BFor1; UK661BRev1, UK661BFor2; UK661BRev2, i UK661BFor3, UK661BRev3 w czasie RT-PCR zamplifikowano trzy fragmenty cdna i sklonowano na tępe końce w strawionym Smal wektorze puc18, aby uzyskać odpowiednio puk661b1, puk661b2 i puk661b3. Po zsekwencjonowaniu trzech wstawionych fragmentów, puk661b2 strawiono Age I i Xba I, aby uzyskać fragment 1441 bp, który następnie zligowano ze strawionym Age I/Xba I puk661b1 w celu uzyskania puk661b12. Dla konstrukcji klonu cdna pełnej długości odcinka B puk661b3 strawiono BstB I/Xba I i uzyskany fragment 694 bp zligowano ze strawionym BstB I/Xba I puk661b12. Powstały plazmid pb661 zawierał pełnej długości sekwencję cdna odcinka B szczepu UK661 pod kontrolą promotora T7. pb661 jest przedstawiony na Figurze 5 (numeracja zgodna z sekwencją szczepu P2 w Mundt i Mueller, 1995, powyżej). Odzyskanie wirusa z crna w hodowli tkankowej Do transkrypcji in vitro plazmidów RNA pad78/dnb, pad78/δnb-hq, pad78/δnb-ta, pad78/δnb-rs, pad78/δnb-hq-ta-rs, pd78a/δnb-e/del, pd78a/δnb-e/del-qh, pd78a/δnb- E/Del-AT, pd78a/δnb-e/del-sr, pd78a/δnb-e/del-qh-at, pd78a/δnb-e/del-at-sr, pd78a/δnb- E/Del-QH-SR, pd78a/δnb-e/del-qh-at-sr i pd78 linearyzowano przez trawienie BsrGI albo Pst I. Dalszą obróbkę linearyzowanego DNA i transkrypcję przeprowadzono jak opisali Mundt i Vakharia (1996), z dwoma wyjątkami: i) mieszaniny transkrypcyjne nie były oczyszczane za pomocą fenolu/chloroformu, i ii) stosowano komórki QM-7 do doświadczeń z transfekcją. Dwa dni po transfekcji komórki zamrożono/rozmrożono, odwirowano przy 700 x g, aby wyeliminować szczątki komórek i powstałe supernatanty dalej klarowano przez przesączenie przez filtry 0,45 mm i przechowywano w -70 C. Do badań immunofluorescencji komórki QM-7 hodowano na sterylnych szkiełkach przykrywkowych. Do transkrypcji RNA in vitro plazmidy zawierające odcinek A UK661 (Figura 5) linearyzowano za pomocą trawienia BsrGI. Odcinek B szczepu D78 linearyzowano Pst I podczas, gdy odcinek B szczepu UK661 linearyzowano Sma I. Dalszą obróbkę linearyzowanego DNA i transkrypcję przeprowadzono, jak opisano powyżej. Detekcja antygenu IBDV Antygen IBDV wykrywano za pomocą oznaczenia pośredniej immunofluorescencji (IFA) i techniką typu Western stosując króliczą surowicę anty-ibdv. Dla wzrostu IFA CEF hodowano na szkiełkach przykrywkowych inkubowano z supernatantami transfekowanych komórek QM-7, CEF i CAM, odpowiednio, użytych do pasażowania. Po 16 godzinach inkubacji CEF utrwalano w acetonie i obra-
14 PL 198 981 B1 biano do IFA. Do badania replikacji IBDV po transfekcji, komórki QM-7 hodowane na szkiełkach przykrywkowych przez 24 godziny lub 48 godzin, utrwalano w acetonie i obrabiano do IFA. Doświadczenia transfekcji międzyrodzajowym crna Do doświadczeń nad transfekcją klon cdna pełnej długości odcinka A szczepu D78 (pd78/δnb) i międzyrodzajowy odcinek A pd78a/δnb-e/del transkrybowano na syntetyczny crna i kotransfekowano z odcinkiem B (pd78b) crna pełnej długości do komórek QM-7 jak również równolegle do komórek CEF. Dwa dni po transfekcji komórki zamrażano i rozmrażano, a uzyskane supernatanty pasażowano dwukrotnie na CEF. W każdym pasażu CEF inkubowano do pięciu dni po zakażeniu. Po zamrożeniu/rozmrożeniu każdy supernatant transfekcyjny jak i supernatant każdego pasażu każdej transfekcji badano na antygen IBDV za pomocą IFA stosując CEF. Doświadczenia z transfekcją powtórzono trzykrotnie. Wirus generowano po transfekcji crna z plazmidu pdb78 w kombinacji z pad78/δnb prowadząc do wytworzenia szczepu D78r. Przeciwnie, po doświadczeniach z transfekcją stosując crna z pd78a/δnb-e/del i pd78b nie można było wyizolować wirusa zakażającego hodowle tkankowe. W celu analizowania czy po transkrypcji zachodzi replikacja, przeprowadzono transfekcję stosując komórki QM-7 rosnące na szkiełkach przykrywkowych. Tu w obu przypadkach antygen wirusa wykrywano 24 godziny po transfekcji stosując IFA. Tak więc udowodniliśmy, że replikacja wirusa zachodziła w obu przypadkach ale tylko w przypadku D78r było możliwe wygenerowanie IBDV zakażającego hodowle tkankowe. Doświadczenie z transfekcją ze zmutowanym crna Opierając się na wynikach porównania sekwencji uzyskano za pomocą mutagenezy ukierunkowanej pewną ilość zmutowanych pełnej długości klonów cdna. (i) IBDV Wariant-E Wygenerowano zmutowane plazmidy pd78a/δnb-e/del zawierające podstawienia aminokwasów w pozycjach 253, 284 i 330 we wszystkich siedmiu możliwych kombinacjach (Tabela 5). Doświadczenia z transfekcją i pasażowanie przeprowadzono równolegle trzy razy na komórkach CEF i QM-7. Infekcyjność supernatantów analizowano za pomocą IFA. Po transfekcji crna plazmidów pd78a/δnb-e/del, pd78a/δnb-e/del-qh, pd78a/δnb-e/del-at, pd78a/δnb-e/del-sr, pd78a/δnb- E/Del-AT-SR i pd78a/δnb-e/del-qh-sr w kombinacji z crna pd78b nie można było wyizolować wirusa zakażającego komórki QM-7 lub CEF. Transfekcja crna uzyskanego z pd78a/δnb-e/del-qh-at lub pd78a/δnb-e/del-qh-at-sr doprowadziła do powstania zakaźnego wirusa (D78A/Del-QH-AT i D78- E/Del-QH-AT-SR). Swoistość tego wirusa potwierdzono za pomocą IFA na komórkach CEF jak i QM- 7. To wskazywało, że VP2 IBDV odgrywa decydującą rolę w zakażaniu hodowli tkankowych. Podstawienia aminokwasów (BU) Q-253-H (TC) i (BU) A-284-T (TC) były konieczne i wystarczające, aby wygenerować IBDV zakaźny dla stosowanych hodowli tkankowych. Mutant IBDV mający trzy podstawienia aminokwasów (D78/Wariant-E przystosowany do CEF) był stosowany do dalszych badań (Przykład 2). (ii) Klasyczny IBDV D78 W celu potwierdzenia tych wyników skonstruowano drugi zestaw plazmidów stosując pad78/δnb do mutagenezy ukierunkowanej do otrzymania plazmidów z podstawieniem pojedynczego aminokwasu (pad78/δnb-hq, pad78/δnb-ta, pad78/δnb-rs) lub wszystkich trzech aminokwasów (pad78/δnb-hq-ta-rs). Te cztery plazmidy zastosowano do doświadczeń z transfekcją w kombinacji z pd78b jak opisano powyżej. Zakaźny IBDV mógł być wygenerowany po transfekcji crna z pad78/δnb-rs, co wykryto za pomocą IFA. Ponownie, aminokwas 330 nie miał żadnego wpływu na zdolność do infekcji hodowli tkankowej przez wygenerowany wirus. Po transfekcji dla wszystkich konstruktów badano replikację za pomocą IFA. Antygen IBDV mógł być wykryty specyficznie 24 godziny i 48 godzin po transfekcji, wykazując typowe duże intensywnie barwiące się agregaty w obrębie cytoplazmy. UK661 Do doświadczeń z transfekcją klon pełnej długości cdna hybrydowych odcinków A pd78a-e-661, pd78a-e-661-dn-at, pd78a-e-661-qh, pd78a-e-661-at i pd78a-e-661-qh-at transkrybowano na syntetyczny crna i kotransfekowano z odcinkiem B szczepu D78 albo odcinkiem B szczepu UK661 crna pełnej długości do komórek QM-7 jak również równolegle do komórek CEF. Dwa dni po transfekcji komórki zamrażano i rozmrażano, a powstałe supernatanty pasażowano dwukrotnie na CEC. CEC inkubowano 24 lub 48 godzin po zakażeniu, utrwalano i obrabiano pod kątem immunofluorescencji. Wirus zakaźny na CEC wygenerowano po transfekcji crna z plazmidu pd78a-e-