(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) T3 (1) Int. Cl. A61K39/21 C07K14/16 ( ) ( ) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej Europejski Biuletyn Patentowy 2009/42 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Wirus zakaźnego zapalenia oskrzeli ze zmienionym genem wypustek (30) Pierwszeństwo: EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2006/01 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 0/20 (73) Uprawniony z patentu: Intervet International B.V., Boxmeer, NL Institute for Animal Health, Compton, GB (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 CAVANAGH David, Compton, GB BRITTON Paul, Compton, GB TARPEY Ian, St. Ives, GB (74) Pełnomocnik: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o. rzecz. pat. Tagowska Magdalena Warszawa 130 skr. poczt. 37 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy szczepionki stosowanej do ochrony drobiu przed zakaźnym zapaleniem oskrzeli (ang. infectious bronchitis, IB) obejmującej atenuowanego wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV), farmaceutycznie dopuszczony nośnik lub rozcieńczalnik, sposobu przygotowania takiej szczepionki oraz zastosowania IBV do wytwarzania szczepionki podawanej in ovo w celu ochrony drobiu przed IB. [0002] IBV jest przedstawicielem rodzaju koronawirusów, rodziny Coronaviridae. Posiada genom w postaci pojedynczej nici RNA o polarności dodatniej, o długości w przybliżeniu nukleotydów, związany z białkiem nukleokapsydu, N, otoczonego lipidową błoną/otoczką. Trzy inne białka wirusowe związane są z otoczką: duża glikoproteina wypustek, S, mniejsze integralne białko błonowe M oraz białko E, najmniejsze z białek związanych z otoczką. [0003] Białko S koronawirusa jest glikoproteiną typu I, która oligomeryzuje w retikulum endoplazmatycznym do formy trimerów, tworzących wypustki wirionu koronawirusa widoczne pod mikroskopem elektronowym. Białko S jest gromadzone w błonach wirionu, możliwe, że za pomocą niekowalencyjnych oddziaływań z białkiem M, lecz nie jest wymagane do tworzenia cząsteczek wirusowych typu koronawirusa. Po inkorporacji do cząsteczek koronawirusa, określonej za pomocą domeny na końcu karboksylowym, glikoproteina S jest odpowiedzialna za wiązanie z receptorem komórki docelowej i fuzję błon wirusowych i komórkowych, spełniając główną rolę w zakażeniu podatnych komórek. Ponadto, białko wypustek IBV jest wymagane przy indukcji ochronnej odpowiedzi odpornościowej zaszczepieniu kurczaków (patrz artykuł poglądowy Cavanagh, w: The Coronaviridae; wyd: S.G. Siddell, Plenum Press, , 199). [0004] Wszystkie glikoproteiny koronawirusów składają się z czterech domen: sekwencji sygnałowej, która jest cięta w czasie syntezy, ektodomeny, która jest obecna na zewnątrz cząsteczki wirionu, regionu transbłonowego odpowiedzialnego za kotwiczenie białka S w podwójnej warstwie lipidowej cząsteczki wirionu oraz ogona cytoplazmatycznego, który prawdopodobnie oddziałuje z innymi białkami IBV, takimi jak białko błonowe (E) i zintegrowane z błoną białko (M). Glikoproteina S z IBV (1162 aminokwasów) jest rozcinana na dwie podjednostki, S1 (3 aminokwasów, 90-kDa) i S2 (627 aminokwasów, 84-kDa). Koniec C podjednostki S2 jest powiązany niekonwalencyjnie z końcem N podjednostki S1 i zawiera domeny transbłonową i ogona cytoplazmatycznego na końcu C. Podjednostka S1 posiada aktywność wiązania z receptorem białka S. [000] We wcześniejszych badaniach z innymi koronawirusami, mysim wirusem zapalenia wątroby (MHV) i wirusem zapalenia jelit i żołądka (TGEV), w celu zbadania determinant patogenezy i tropizmu komórkowego, gen wypustek szczepu (wirulentnego) wirusa dawcy stosowano do zastąpienia genu wypustek szczepu wirusa biorcy. Badania te pokazały, że zarówno właściwości in vitro (tropizm komórkowy), jak i in vivo, (wirulencja) szczepu wirusa dawcy, były nabywane przez szczep wirusa biorcy. Stwierdzono, że gen wypustek jest determinantą tropizmu komórkowego i wirulencji (Phillips i wsp., J. Virol. 73, , 1999; Sanchez i wsp., J. Virol. 73, , 1999; Das Sarma i wsp., J. Virol. 74, , 2000; Navas i wsp., J. Virol. 7, , 2001 oraz Kuo i wsp., J. Virol. 74, , 2000; międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 01/39797). Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 98/4919 ujawnia koronawirusa (np. MHV), w którym część genu białka wypustek została zastąpiona przez odpowiadającą mu część genu białka wypustek z niespokrewnionego koronawirusa (np. FIPV), skutkiem czego było nabycie innej specyficzności substratowej wobec komórki, co pozwalało zrekombinowanemu wirusowi wykorzystywać inne rodzaje komórek jako docelowe. 1

3 [0006] Zakaźne zapaleni oskrzeli jest ostrą, zakaźną chorobą dróg oddechowych ptactwa domowego (kur), wywoływaną przez wirusa IB. Objawy kliniczne IB obejmują kichanie/prychanie, rzężenia tchawicze, wysięk z nosa i świszczący oddech. Objawy kliniczne są znacznie bardziej oczywiste w kurczaków niż u dorosłych ptaków. Ptaki mogą być w depresji i znacznie mniej jeść. Ptaki typu mięsnego mają zredukowany przyrost wagi, podczas gdy nioski znoszą mniej jaj. Zakażenie dróg oddechowych predysponuje kurczaki do wtórnych zakażeń bakteryjnych, które mogą być dla nich śmiertelne. Wirus może także powodować stałe uszkodzenie jajowodu, szczególnie u kur, prowadzące do redukcji produkcji jaj i ich jakości oraz nerek, prowadzące czasami do choroby nerek, która może być śmiertelna. [0007] Do szczepienia przeciw IB stosowane są szczepionki z wirusów zarówno żywych jak inaktywowanych. Do tej pory najskuteczniejszymi szczepionkami są te zawierające żywe wirusy atenuowane, wytwarzane doświadczalnie, po ślepo powtarzanych pasażach na zalęgniętych jajach, do osiągnięcia pożądanego stopnia zrównoważenia atenuacji i immunogenności. Szczepionki takie są źle zdefiniowane genetycznie a molekularne podstawy atenuacji są nieznane. Po serii pasaży immunogenność wirusa niekorzystnie spada, co często prowadzi do uzyskania bezpiecznych, lecz mniej wydajnych wirusów szczepionkowych. Osiągnięcie zrównoważonego stopnia atenuacji wystarczającego, aby wirus nie był patogenny, lecz nie na tyle dużego, aby osiągnąć punkt, w którym by nie zdołał zaindukować silnych odpowiedzi odpornościowych jest podejściem typu prób i błędów, które sprawia, że wynik tradycyjnego podejścia atenuacji jest wątpliwy. [0008] Jak wykazano powyżej, jedną z cech biologicznych IBV jest taka, że staje się on niewirulentny i mniej immunogenny w miarę przeprowadzania kolejnych pasaży wirusa w zarodku. Szczep IBV Beaudette jest jednym z tak długo pasażowanych w zarodkach, (nad-) atenuowanych, wirusów, że nie można go uważać za immunogenny (Geithausen i wsp., Arch Gesamte Virusforsch 40, , 1973). [0009] W opublikowanym ostatnio zgłoszeniu patentowym (WO 02/092827) ujawniony jest uzyskanie żywych, atenuowanych koronawirusów za pomocą technik rekombinacji DNA. Sugeruje się tam, że wprowadzenie delecji w genach nie należących do niezbędnych w genomach koronawirusów prowadzi do atenuacji tych wirusów. [00] IBV wykazuje duże zróżnicowanie antygeniczne, początkowo rozpoznawane jako różne serotypy. Klasyfikacja serotypowa szczepów IBV jest oparta na zdolności jednego szczepu do indukcji przeciwciał neutralizujących wirusa skutecznych wobec innego szczepu (Cook i wsp., Avian Pathol. 13, , 1984). Najbardziej zmiennym białkiem IBV jest białko wypustek. Definiuje ono serotypy i jest głównym induktorem ochronnych odpowiedzi odpornościowych. Szczepionkowy wirus IBV jednego serotypu indukuje odpowiedzi odpornościowe, które często słabo chronią przed IBV innych serotypów, ze względu na różnice w białkach S. W konsekwencji stworzono szczepionki przeciw IB wobec wielu serotypów. Niemniej jednak, stale pojawiają się nieznane wcześniej serotypy, co stwarza zapotrzebowanie na nowe, homologiczne wirusy szczepionkowe. [0011] Szczepionki z żywych wirusów IBV są zazwyczaj podawane wyklutym kurczakom. Podawać je można indywidualnie w formie kropli do oczu lub donosowo, lecz te drogi podawania są drogie ze względu na pracę potrzebną do ich podania, w szczególności w dużych stadach broilerów. Często stosowane są też metody podawania masowego, włączając podawanie w postaci rozpylanej lub wody do picia, lecz obserwowano problemy z uzyskaniem jednolitego sposobu podawania szczepionki i inaktywacją wirusa szczepionkowego. [0012] Wcześniej sugerowano szczepionki w postaci szczepionek podawanych do zarodków (tak zwane szczepionki in ovo) (Sharma i wsp.; Avian diseases 29, , 198). 2

4 [0013] Szczepienie in ovo, w zasadzie, powinno być korzystne ze względu na uzyskanie w młodym wieku odporności na konkretną chorobę i podawanie jednolitej dawki szczepionki do każdego jaja przy użyciu półautomatycznych urządzeń z głowicami umożliwiającymi wiele wstrzyknięć. [0014] Zazwyczaj tradycyjne szczepionki do szczepienia ptaków po wykluciu nie mogą być stosowane do szczepienia in ovo, ponieważ zarodki w późnym okresie rozwoju są bardzo podatne na zakażenie większością badanych wirusów szczepionkowych. Przykładowo, szczepionkowe szczepy IBV i wirusa choroby Newcastle (NDV), które są rutynowo stosowane jako szczepionki u nowo wyklutych kurczaków są letalne dla zarodków po zaszczepieniu in ovo. Przykładowymi komercyjnie dostępnymi szczepionkami do podawania po wykluciu, których nie można stosować do szczepienia in ovo, ze względu na ich działanie niepożądane na zdolność do wykluwania zapłodnionych jaj są Poulvac IB, Nobilis IB Ma i Nobilis IB 4/91. [001] Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 01/64244 ujawnia, że szczepionkę Poulvac IB można stosować do podawania in ovo pod warunkiem, że jest podawana w bardzo niskiej dawce ( -1,0-2,0 EID 0 /jajo). Wakenell i wsp. (J. Vet. Res., 47, , 1986) ujawnił, że pasażowanie wirusa szczepionki IB w hodowli tkankowej powoduje, iż wirus przestaje być patogenny dla zarodka. Chociaż, wirusa użytego do wzbudzania odpowiedzi odpornościowej można nadal izolować ze szczepionych komercyjnych kurczaków. [0016] Zważywszy na powyższe, jest jasne, że istnieje zapotrzebowanie na szczepionki przeciw IBV, zarówno bezpieczne, jak i dostarczające odpowiedniej ochrony wobec wirulentnych szczepów, w szczególności o pojawiających się serotypach, oraz które można wytwarzać bez użycia tradycyjnego doświadczalnego podejścia stosowanego do przygotowywania szczepionek przeciw IBV. [0017] Ponadto, istnieje potrzeba bezpiecznej i skutecznej szczepionki przeciw IBV, którą można podawać drogą in ovo, bez negatywnego wpływu na zdolność do wykluwania z zaszczepionych zalęgniętych jaj. [0018] Opisywany tu wynalazek wychodzi naprzeciw jednej lub większej liczbie tych potrzeb przez dostarczenie szczepionki przeciw IBV, opartej na szczepie Beaudette atenuowanego IBV, który jest zdolny do wyrażania białka wypustek pochodzącego ze szczepu IBV, przykładowo szczepu polowego, który ma białko wypustek inne niż szczep Beaudette. Ten nowy, atenuowany szczep szczepionki IBV jest lepiej przygotowany do zwalczania zakażeń IBV niż atenuowany szczep IBV uzyskany metodami tradycyjnymi, ponieważ może wyrażać białko wypustek, które jest homologiczne do tego z (wirulentnego) wirusa polowego. [0019] Zatem, niniejszy wynalazek dostarcza szczepionkę do stosowania do ochrony drobiu przed zakaźnym zapaleniem oskrzeli obejmującą atenuowanego wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV) i farmaceutycznie dopuszczony nośnik lub rozcieńczalnik, charakteryzującą się tym, że atenuowany IBV jest szczepem IBV Beaudette, który obejmuje heterologiczny gen wypustek z IBV, przy czym fragment genu wypustek z IBV, kodujący ogon cytoplazmatyczny pochodzi ze szczepu odbiorcy IBV Beaudette. [0020] W Przykładach wykazano, że szczep IBV Beaudette, o którym wiadomo, że jest atenuowany, ale jest słaby w nadawaniu ochrony, staje się silny w nadawaniu ochrony dzięki insercji genu wypustek z wirulentnego wirusa (IBV M41), podczas gdy poziom atenuacji atenuowanego szczepu IBV nie jest zaburzony (Przykłady 3 i 4). W szczególności, ta ostatnia właściwość zrekombinowanego IBV była nieoczekiwana jako, że wcześniej pokazywano u innych koronawirusów, iż gen S jest determinantą wirulencji i zamiana genu S u umiarkowanych koronawirusów przez gen S z wirulentnego koronawirusa prowadzi do wirulencji u rekombinowanego koronawirusa. Brak wzrostu wirulencji u zrekombinowanego IBV po zamianie genów S jest jeszcze bardziej zaskakująca, jeśli weźmie się pod uwagę, że zrekombinowany, atenuowany IBV nie nabywa tropizmu komórkowego wirulentnego IBV in vitro (Przykład 2). 3

5 [0021] Szczep IBV Beaudette był pierwotnie wyizolowany przez Beaudette i Hudson (J. Am. Vet. Med. A. 90, 1-60, 1937) i pasażowany kilkaset razy w zarodkach kurzych; jest powszechnie określany jako szczep przystosowany do zarodka kurzego lub przystosowany do warunków jaja. Niezwykle przystosowany do warunków jaja szczep Beaudette jest niepatogenny przy podawaniu po wykluciu, wywołuje mało wykrywalne zmiany nabłonka migawkowego tchawicy i replikuje się głównie w komórkach podnabłonkowych, lecz jest znany jako niezwykle patogenny dla 9-12 dniowych zarodków. Ponadto, IBV Beaudette jest znany jako szczep słabo immunogenny (Arch Gesamte Virusforsch 40, , 1973). Szczep IBV Beaudette jest dostępny w ATCC (nr dostępu VR-22) i jest powszechnie używany w laboratoriach na całym świecie, chociaż wirusy te mogą posiadać niewielkie różnice w sekwencji, ze względu na ich indywidualne historie pasażowania. Przykładowo, sekwencje nukleotydowe genów wypustek różnych izolatów IBV Beaudette wykazują 99% identyczność lub większą. Region genomu szczepu IBV Beaudette, który umożliwia odróżnienie tego szczepu IBV od innych szczepów IBV jest regionem (nukleotydy ; numeracja zgodna z Casais i wsp., 2001, powyżej, nr dostępu AJ311317) położonym na końcu 3 genomu, który zaczyna się w genie nukleoproteiny i kończy w regionie 3 niepodlegającym translacji (UTR). Szczep IBV Beaudette do zastosowania według niniejszego wynalazku jest IBV, który wykazuje 99% lub większą identyczność w tym regionie z odpowiadającym regionem szczepu IBV Beaudette specyficznie tu zastosowanym (BeauR, nr dostępu AJ311317). Sekwencje nukleotydowe odpowiadającego regionu w innych szczepach IBV różnią się znacząco (63-9%) od tej w szczepie IBV Beaudette. Identyczności sekwencji nukleotydowych są tu określane za pomocą przyrównania przy użyciu programu ClustalX, stosującego moduł wielokrotnego przyrównania, Thomson i wsp., NAR 24, , 1997, analizowane przez Genedoc, wersja , dostępnego na stronie [0022] W szczególnie korzystnym wykonaniu według niniejszego wynalazku dostarczana jest szczepionka, która charakteryzuje się dalej tym, że atenuowany IBV jest szczepem Beaudette Beau-CK lub BeauR (zdeponowanym w CNCM w Instytucie Pasteura, Paryż, Francja dnia pod numerem dostępu I- 3167). BeauR jest zrekombinowanym IBV wytworzonym z infekcyjnego RNA uzyskanym przez transkrypcję z cdna Beau-CK o pełnej długości. Określono pełną sekwencję genomową Beau-CK (Boursnell i wsp., J. Gen. Virol. 68, 7-77, 1987, nr dostępu M9169) i BeauR i (Casais i wsp., 2001, powyżej; nr dostępu AJ311317). [0023] Zrekombinowanego, atenuowanego wirusa IBV, obejmującego heterologiczny gen wypustek, do zastosowania w szczepionce według wynalazku można wytworzyć metodą w układzie odwrotnej genetyki, opisanymi w Casais i wsp., (2001, powyżej). Układ ten pozwala na wytworzenie zrekombinowanego IBV (ribv) przez złożenie in vitro (zmutowanego) cdna IBV o pełnej długości, a następnie bezpośrednie sklonowanie do genomu wirusa krowianki, i odzyskanie ribv po syntezie in situ infekcyjnego RNA dla IBV przy użyciu polimerazy RNA bakteriofaga T7 wyrażonej na matrycy zrekombinowanego wirusa ospy ptasiej. [0024] Heterologiczny gen wypustek (S) oznacza gen S pochodzący ze szczepu IBV (szczep dawcy), który jest różny od specyficznego atenuowanego szczepu IBV Beaudette, który otrzymuje ten gen S (szczep biorcy) i który koduje białko S o sekwencji aminokwasowej, która różni się w porównaniu z białkiem S kodowanym przez gen S szczepu IBV Beaudette. Szczep dawcy i biorcy może mieć takie same lub różne serotypy IBV. Taki zrekombinowany wirus IBV jest oparty na genomie pojedynczego szczepu IBV (biorcy); jedyną różnicą, w istocie, jest gen S, pochodzący z różniącego się szczepu IBV (dawca). [002] Szczepionka według niniejszego wynalazku opiera się na szczepie IBV Beaudette, który obejmuje gen wypustek, którego fragment kodujący ektodomenę, lub jej funkcjonalny fragment, w szczególności 4

6 polipeptyd S1, pochodzi z różniącego się szczepu dawcy IBV, podczas gdy fragment kodujący cytoplazmatyczny ogon pochodzi ze szczepu biorcy IBV Beaudette. Zaletą takiego chimerycznego genu wypustek jest uniknięcie jakichkolwiek potencjalnych problemów wynikających z oddziaływania domeny ogona cytoplazmatycznego białka wypustek z innymi białkami IBV, jako że oba są natywnymi dla biorcy IBV. [0026] Zasadniczo, sekwencja sygnałowa, ektodomena, region transbłonowy i domena ogona cytoplazmatycznego białek wypustek IBV pokrywają odpowiednio fragmenty aminokwasowe 1-18, 19-91, i (numeracja odwołuje się do Beaudette-CK, Casais i wsp., J. Virol. 7, , 2001; białka S z innych szczepów IBV mogą różnić się liczbą aminokwasów ze względu na małe delecje i insercje). Ponadto, także dobrze jest znana sekwencja aminokwasowa w miejscu cięcia S1/S2 IBV; w szczepie Beaudette polipeptydy S1 i S2 obejmują odpowiednio aminokwasy 1 (19)-3 i [0027] Korzystnie, gen wypustek do zastosowania według niniejszego wynalazku pochodzi z (wirulentnego) IBV z dziedziny. [0028] Geny wypustek mogą być wyizolowane z dowolnego dostępnego szczepu IBV, niezależnie od serotypu, za pomocą standardowych technik stosowanych powszechnie do tego celu w dziedzinie. Sekwencje nukleotydowe genów wypustek pochodzące ze szczepów IBV o tym samym serotypie są stosunkowo konserwowane. Maksymalna różnica sekwencji nukleotydowej pomiędzy genami wypustek w obrębie tego samego serotypu wynosi % w części S1. [0029] Zatem, gen wypustek z IBV o pewnym serotypie oznacza gen wypustek pochodzący ze szczepu posiadającego właściwości tego serotypu i posiadający sekwencję nukleotydową, która wykazuje maksymalnie % różnicę sekwencji nukleotydowej (w części S1) z pochodzącą ze szczepu referencyjnego dla tego serotypu. Przykładami typowych szczepów referencyjnych, z numerami dostępu sekwencji ich genów wypustek w bazie danych sekwencji nukleotydowych, są M41 (serotyp Massachusetts; X04722), NL/D274/78 (serotyp D274; X1832), USA/Arkansas 99 (serotyp Ark 99; L384), Belgium/B1648 (serotyp B1648; X87238), USA (DE)/072/92 (serotyp DE072; U77298), US (GA)/0470/98 (serotyp Georgia 98; AF274437), UK/4/91 (serotyp 793B1; AF093794), USA/Connecticut (serotyp Connecticut; L18990) and NL/D1466 (serotyp D1466; M21971). [0030] Klonowanie rożnych genów wypustek IBV opisano w Adzhar i wsp., Avian Path. 26, , 1997; Shaw i wsp., Avian Pathol. 2, , 1996; Binns i wsp., J. Gen. Virol. 67, , 1986 oraz Binns i wsp., J. Gen Virol. 66, , 198). [0031] Korzystne wykonanie według niniejszego wynalazku dotyczy szczepionki, jak opisano powyżej, która jest oparta na atenuowanym IBV, który obejmuje gen wypustek kodujący białko wypustek IBV serotypu Massachusetts, w szczególności szczepu IBV M41. [0032] W dalszym korzystnym wykonaniu, szczepionka jest oparta na atenuowanym IBV, który obejmuje gen wypustek kodujący białko wypustek IBV serotypu 793B, w szczególności szczepu IBV 4/91. [0033] Konkretnie, szczep IBV Beaudette obejmujący heterologiczny gen wypustek może posiadać ten gen w postaci wprowadzonego w genom, dodatkowo do genu wypustek naturalnie obecnego w genomie. Chociaż, w korzystnym wykonaniu według niniejszego wynalazku szczepionka obejmuje szczep, IBV Beaudette, w którym heterologiczny gen wypustek zastępuje oryginalny gen wypustek w jego naturalnej pozycji pomiędzy genem replikazy i genem 3. (Fig. ). [0034] Do dzisiaj nie jest handlowo dostępna szczepionka przeciw IBV, która byłaby bezpieczna i skuteczna. Niniejszy wynalazek, w szczególności, pokazuje, że szczepionkę według wynalazku, opartą na szczepie IBV BeaudetteR (BeauR), można bezpiecznie podawać drogą in ovo jak również wyklutym kurczakom i, że w

7 takim samym czasie indukuje ochronną odpowiedź odpornościową. W Przykładzie 4 pokazano, że szczep IBV BeauR nie jest letalny dla 18-dniowych (SPF) zarodków i, że zdolność do wykluwania z zaszczepionych jaj jest bardzo wysoka. Właściwości te sprawiają, że szczep IBV BeauR jest stosowny jako biorca heterologicznego genu wypustek i do podawania szczepionki według wynalazku opartej na tym zrekombinowanym szczepie IBV kurom drogą in ovo. [003] Szczepionka według niniejszego wynalazku może obejmować atenuowanego IBV w formie żywej lub inaktywowanej; korzystna jest forma żywa ze względu na to, że nie wymaga adiuwanta. [0036] Niniejszy wynalazek dostarcza także rozwiązanie problemu zakłócenia, który często występuje kiedy podawana jest kombinacja różnych żywych wirusów szczepionkowych. Podawanie skojarzone jednego lub większej liczby wirusów szczepionkowych, które w istocie są takie same, lecz wyrażają białka wypustek pochodzące z różnych (sero)typów IBV, jest teraz możliwe, bez zakłócenia replikacji jednego wirusa szczepionkowego przez inny wirus szczepionkowy. [0037] Zatem, niniejszy wynalazek dostarcza także szczepionkę, jak określono powyżej, która obejmuje dwa lub większą liczbę szczepów IBV Beaudette obejmujących heterologiczne geny wypustek z różnych szczepów IBV, korzystnie szczepów IBV o różnych serotypach. [0038] Szczepionka według wynalazku może być wytworzona klasycznymi metodami, takimi jak powszechnie stosowane do wytwarzania dostępnych handlowo szczepionek z żywych lub inaktywowanych IBV. [0039] Streszczając, wrażliwy substrat jest zaszczepiany atenuowanym IBV, namnażany dopóki nie zostanie osiągnięte pożądane miano wirusa, dzięki jego replikacji i zbierany jest materiał zawierający IBV. Następnie, zebrany materiał jest przetwarzany w preparat farmaceutyczny o immunizujących własnościach. [0040] Według wynalazku można zastosować każdy substrat zdolny do podtrzymania replikacji IBV, włączając hodowle pierwotnych komórek (ptasich), takie jak komórki fibroblastów zarodków kurczaka (CEF), komórki nerki kur (CK), hodowle narządowe tchawicy lub linie komórek ssaczych, takie jak linia komórkowa VERO. [0041] Szczególnie korzystnymi substratami, na których można namnażać atenuowanego IBV, są zalęgnięte jaja SPF. Zalęgnięte jaja 9-12-dniowe można zaszczepiać, przykładowo, 0,1 ml płynu omoczniowego zawierającego IBV obejmującego co najmniej 2,0 EID 0 na jajo. Korzystnie, Zalęgnięte jaja 9-12-dniowe są zaszczepiane około,0 EID 0 i następnie inkubowane w 37 C przez godz. IBV można korzystnie zbierać przez zebranie płynu omoczniowego. [0042] Szczepionka według wynalazku obejmuje atenuowanego IBV wraz z farmaceutycznie dopuszczonym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem, stosowanym zazwyczaj w takich kompozycjach. [0043] Szczepionkę zawierającą żywego wirusa można wytwarzać i wprowadzać na rynek w postaci zawiesiny lub postaci liofilizatu. Nośniki obejmują środki stabilizujące, konserwujące i bufory. Rozcieńczalniki obejmują wodę, roztwory wodne i poliole. [0044] Jeśli jest to pożądane, żywa szczepionka według wynalazku może zawierać adiuwant. Przykłady stosownych związków i kompozycji o aktywności adiuwanta są takie same jak te wspomniane poniżej dla szczepionek z inaktywowanym IBV. [004] Chociaż możliwe jest podawanie żywej szczepionki według niniejszego wynalazku przez wstrzyknięcie, np. domięśniowo, podskórnie, szczepionka korzystnie jest podawana przy użyciu niedrogich technik podawania masowego, powszechnie stosowanych przy szczepieniach IBV. W szczepieniach IBV, techniki te obejmują szczepienie przy użyciu wody do picia, aerosolu lub w formie rozpylonej. Alternatywnie, 6

8 podawanie żywej szczepionki może być także indywidualne w postaci kropli do oczu, dotchawicze lub donosowe. [0046] Jak przedstawiono powyżej, niniejszy wynalazek dostarcza także szczepionkę IBV, którą można bezpiecznie podawać drogą in ovo i w tym samym czasie indukować ochronną odpowiedź odpornościową. Podawanie szczepionki in ovo wymaga podawania szczepionki do zarodka ptasiego znajdującego się w jaju (praca przeglądowa o szczepieniu in ovo, patrz: Ricks i wsp., Advances in Vet. Med. 41, 49-1, 1999). Szczepionkę można podawać do dowolnego stosownego kompartmentu jaja (np. płynu omoczniowego, pęcherzyka żółtkowego, owodni, komory powietrznej lub do zarodka) jak opisano w dziedzinie (Sharma; Am. J. Vet. Res. 4, , 1984). Korzystnie szczepionka jest podawana do błony pod skorupką (komory powietrznej) i błony kosmówkowo-owodniowej. [0047] Zazwyczaj szczepionka jest wstrzykiwana do zalęgniętych jaj w późnym stadium zarodka, zazwyczaj w ostatniej kwadrze okresu inkubacji, korzystnie 3-4 dni przed wykluciem. W przypadku kur, szczepionka jest korzystnie podawana pomiędzy dniem 1-19 z 21-dniowego okresu inkubacji, w szczególności dnia 17 lub 18, korzystniej dnia 18 okresu inkubacji. [0048] Następnie zaszczepione zalęgnięte jaja są przenoszone do inkubatora do wylęgu (patent USA nr , WO 98/6413 i WO ). Korzystnie, cały proces szczepienia zarodków jest przeprowadzany przy użyciu szybkich zautomatyzowanych systemów do szczepień, takich jak handlowo dostępny INOVOJECT. Urządzenia takie są ujawnione w patentach USA nr i , , i [0049] W innym aspekcie według niniejszego wynalazku dostarczana jest szczepionka obejmująca atenuowanego IBV w formie inaktywowanej. Zaletami szczepionki inaktywowanej są bezpieczeństwo i możliwość indukowania wysokich poziomów ochronnych przeciwciał o długim okresie trwania. [000] Celem inaktywacji wirusów zbieranych po etapie namnażania jest wyeliminowanie ich replikacji. Zasadniczo, można to osiągnąć dobrze znanymi metodami chemicznymi i fizycznymi. [001] Inaktywowana szczepionka według wynalazku może, przykładowo, zawierać jeden lub większą liczbę wspomnianych powyżej farmaceutycznie dopuszczonych nośników lub rozcieńczalników odpowiednich do tego celu. [002] Korzystnie, inaktywowana szczepionka według wynalazku obejmuje jeden lub większą liczbę związków o aktywności adiuwantów. Stosowne do tego celu związki lub kompozycje obejmują wodorotlenek, fosforan lub tlenek glinu, emulsję olej w wodzie i woda w oleju na bazie, przykładowo, oleju mineralnego, takiego jak Bayol F lub Marcol 2 lub oleju roślinnego, takiego jak octan witaminy E i saponiny. [003] Inaktywowane szczepionki są zazwyczaj podawane przez wstrzyknięcie domięśniowe lub podskórne. [004] Szczepionka według wynalazku obejmuje skuteczną dawkę atenuowanego IBV jako składnika aktywnego, tzn. taką ilość immunizującego IBV, który będzie indukował odporność u szczepionych ptaków po ekspozycji na wirulentnego wirusa. Odporność jest tu zdefiniowana jako indukcja znacząco wyższego poziomu ochronnego w populacji ptaków chroniącego przed śmiertelnością i objawami klinicznymi po szczepieniu w porównaniu z grupą nieszczepioną. [00] Zwykle, żywe szczepionki do podawania po wykluciu obejmują atenuowanego IBV w stężeniu 2,0-8,0 dawki zakażającej dla zarodka (EID 0 ) na jednostkę dawki, korzystnie w stężeniu 3,0-7,0 EID 0 na jednostkę dawki. Objętość dawki na ptaka zależy od drogi podawania szczepionki i wieku ptaka. Zwykle, szczepionki w postaci kropli do oczu są podawane w objętości 20-0 µl na dawkę dla dowolnego wieku. Szczepionki w postaci rozpylanej zawierają dawkę w objętości 0-00 µl dla ptaków jednodniowych i 7

9 jedna dawka szczepionki w postaci wody do picia zazwyczaj jest rozcieńczana w objętości około 1 ml na każdy dzień życia. Szczepionki inaktywowane mogą zawierać antygenowy równoważnik 4,0-9,0 EID 0 na jednostkę dawki. [006] Żywa szczepionka do podawania in ovo zwykle obejmuje atenuowanego IBV w ilości 2,0-8,0 EID 0, korzystnie 3,0-7,0 EID 0 w objętości 0-0 µl, korzystnie 0 µl. [007] Chociaż, szczepionkę IBV według niniejszego wynalazku można skutecznie stosować u kur, także inne gatunki drobiu, takie jak indyki, gołębie, przepiórki, bażanty, perliczki i kuropatwy można pomyślnie szczepić tą szczepionką. Kury obejmują brojlery, stada reprodukcyjne i stada niosek. [008] Wiek ptaków otrzymujących po wykluciu szczepionkę żywą lub inaktywowaną według wynalazku może być taki sam jak ptaków otrzymujących klasyczne dostępne handlowo żywe lub inaktywowane szczepionki IBV. Przykładowo, brojlery mogą być szczepione w wieku jednego dnia lub w wieku 1-3 tygodni, szczególnie brojlery z wysokimi poziomami MDA. Stada niosek lub stada reprodukcyjne mogą być szczepione wstępnie w wieku 1- dni i otrzymywać żywą lub inaktywowaną szczepionkę przypominającą w wieku 7-12 lub16-18 tygodnia. [009] Wynalazek obejmuje także szczepionki skojarzone obejmujące dodatkowo do atenuowanego IBV, szczep szczepionkowy zdolny do indukcji ochrony wobec szczepów IBV o innych serotypach lub wobec innych ptasich patogenów. [0060] Korzystnie, szczepionka skojarzona obejmuje dodatkowo jeden lub większą liczbę szczepów spośród: wirusa choroby Marek a (MDV), wirusa choroby Newcastle (NDV), wirusa zakaźnego zapalenia torby Fabrycjusza (IBDV), wirusa syndromu spadku nieśności kur (EDS), wirusa zapalenia krtani i tchawicy indyków (TRTV) lub reowirusa. PRZYKŁADY [0061] Przykład 1 Przygotowanie zrekombinowanego IBV Beaudette z heterologicznymi genami wypustek Techniki rekombinacji DNA [0062] Techniki rekombinacji DNA stosowano według standardowych procedur (Ausubel i wsp., w: Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons Inc, NY, 1987; Sambrook i wsp., w: Molecular Cloning: A laboratory Manual wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) lub według zaleceń producentów. Numery wszystkich sekwencje nukleotydowych i reszt aminokwasowych odnoszą się do pozycji w IBV Beau- R (Casais, 2001, powyżej, nr dostępu AJ311317). Komórki, wirusy, plazmidy i szczepy bakterii stosowane w przygotowywaniu chimerycznego genu S, składaniu IBV cdna o pełnej długości w wirusa krowianki, generowanie zrekombinowanego wirusa krowianki i wytwarzanie zakaźnego zrekombinowanego IBV opisano w Casais i wsp. (2001, powyżej). Konstrukcja chimerycznego genu S, składanie/modyfikacja cdna IBV o pełnej długości w wirusie krowianki i wywarzanie zrekombinowanego wirusa krowianki. Zrekombinowany gen wypustek z IBV Beaudette-M41 [0063] Analiza sekwencji genu M41-CK S ujawniła różnice w 72 nukleotydach, w porównaniu z sekwencją genu BeauR S, z których 0 stanowiło podstawienia niesynonimiczne a 22 synonimiczne, co dało w sumie różnicę w 47 aminokwasach pomiędzy dwiema glikoproteinami S. W wyniku ostatniego podstawienia niesynonimicznego powstał przedwczesny kodon stop w genie M41 S, w związku z czym glikoproteina M41- CK S jest o dziewięć aminokwasów krótsza od białka Beaudette. Oprócz utraty dziewięciu aminokwasów nie było innych różnic aminokwasowych pomiędzy domenami cytoplazmatycznymi obu wirusów. Ogólnie rzecz biorąc, pierwotne produkty translacji dwóch genów S wynoszą 113 i 1162 aminokwasów, odpowiednio, dla 8

10 M41-CK i BeauR, dając identyczność pomiędzy dwoma białkami S wynoszącą 9,2%. Porównanie sekwencji replikazy, która zachodzi na sekwencję genu S wykazało tylko jedną mutację synonimiczną, bez mutacji pomiędzy sekwencją związaną z transkrypcją genu S (TAS) i kodonem inicjacyjnym genu S (Fig. 1). Zatem, region genu S zawierający zachodzący region genu replikazy do wytwarzania sekwencji genu ribv S pochodził z M41-CK. Jednakże, ze względu na różnice na końcach C, genów S z Beaudette i M41, i to, że są one potencjalnie zaangażowane w oddziaływanie z innymi białkami wirionu w ribv zachowano 137 nukleotydów sekwencji genu Beaudette S. Pozwoliło to na utrzymanie oddziaływania domeny końca C białka S z innymi białkami pochodzącymi z Beaudette. [0064] Plazmid pacnr-nhel-notl-ibv (Fig. 2) trawiono PacI i SalI, oczyszczano i zachowywano fragment zawierający wektor. Plazmid pacnr-nhel-notl-ibv także trawiono BspHI i SalI, oczyszczano i zachowywano fragment BspHI-SalI. Plazmid pm4lstruct zawierał sekwencję cdna pochodzącą z IBV, odpowiadającą regionowi od genu replikazy do ogona poli (A), pochodzącemu z M41-CK grna, w pbluescript SK(+). pm41struct trawiono PacI i BspHI, oczyszczano i zachowywano fragment PacI-BspHI (Fig. 3). Wytworzono chimeryczny gen Beaudette-CK/M41-CK S, składający się z sekwencji sygnałowej, ektodomeny i regionów transbłonowych pochodzących z M41-CK oraz domeny ogona cytoplazmatycznego z Beau-R. Fragment PacI-BspHI pochodzący z M41-CK z pm41 Struct użyto do wymiany odpowiadającej sekwencji cdna PacI-BspHI pochodzącej z Beaudette-CK w pfrag-3. Przeprowadzono potrójną reakcję ligacji pomiędzy fragmentem PacI-SalI zawierającym wektor (z pfrag-3), fragmentem PacI-BspHI genu S pochodzącym z M41-CK i fragmentem BspHI-Sall odpowiadającym reszcie genomu Beaudette położonej poniżej genu S, uzyskując pacnr-nhel-notl-ibv-m41-s (Fig 4 i podsumowany na Fig A). Analiza sekwencji pfrag3-m41s potwierdziła obecność ciągłej sekwencji chimerycznego genu S, wraz z obecnością dwóch mutacji markerowych, U19668 i G27087, obecnych pierwotnie w pfrag3. [006] Do wytworzenia, przy użyciu ligacji in vitro, cdna IBV o pełnej długości wykorzystano fragmenty cdna pochodzące z IBV z pfrag-3-m41s zawierające sekwencję chimerycznego genu S, oraz pfrag-1 i pfrag-2. cdna o pełnej długości wytworzono stosując procedurę dwuetapowej ligacji in vitro opisanej przez Casais i wsp. (2001, powyżej). W pierwszym etapie ligowano SacI-NheI cdna (FRAG-2) z pfrag-2 i NheI-BspHI cdna (FRAG-3-M41S) z p FRAG-3-M41S i uzyskano 21, kb fragment SacI-Bsp120I, który oczyszczono w żelu. W drugim etapie, 21, kb fragment SacI-Bsp120I ligowano z BspHI-SacI cdna (FRAG-1) z pfrag-1 i uzyskano 27,9 kb cdna IBV o pełnej długości (Fig. B). Ten pełnej długości cdna, zawierający chimeryczny gen S, znajdował się pod kontrolą promotora polimerazy RNA T7 i był terminowany przez sekwencję terminacyjną HδR-T7 dystalną do poly (A). Promotor T7 i sekwencja terminacyjna HδR-T7 były wymagane do wytwarzania infekcyjnego IBV RNA przez polimerazę T7 RNA in situ. Produkty z drugiej ligacji in vitro, zawierające IBV cdna o pełnej długości z defosforylowanymi końcami Bsp120I, były bezpośrednio ligowane z ramionami pochodzącymi z vnotl/tk Notl w obecności Notl. Produkty ligacji stosowano bez dalszego oczyszczania do uzyskiwania zrekombinowanych wirusów krowianki przy użyciu wirusa pomocniczego ospy ptasiej, FP9, w komórkach CV-1. Uzyskano 22 zrekombinowane wirusy krowianki i analiza restrykcyjna DNA wyizolowanego z zinfekowanych komórek wykazała, że osiem zawierało wstawkę o spodziewanej wielkości, z których vnotl/ibv FL -M41S został wybrany do dalszej analizy. Zrekombinowany gen wypustek IBV Beaudette-4/91 [0066] Analiza sekwencji genu 4/91 S wykazała różnice w 62 nukleotydach w porównaniu z sekwencją genu BeauR S z których 24 stanowiło podstawienia niesynonimiczne a 317 synonimiczne, co dało w sumie różnicę w 201 aminokwasach pomiędzy dwiema glikoproteinami, których dwie wynikały z insercji sześciu 9

11 nukleotydów w sekwencji genu 4/91 S. Pomiędzy domenami cytoplazmatycznymi obu wirusów występowały dwie różnice aminokwasowe. Ogólnie rzecz biorąc, pierwotne produkty translacji dwóch genów S wynoszą 1162 i 1164 aminokwasów, odpowiednio, dla Beau-R i 4-91, dając identyczność pomiędzy dwoma białkami S 83%. Region genu S, do wytworzenia sekwencji genu ribv S, zawierający zachodzący region genu replikazy pochodził z 4/91. Dodatkowo, ze względu na podobieństwo końców na końcu C z genów Beaudette i 4/91 S, zachowano ostatnie 137 nukleotydów z genu Beaudette S, identyczne z sekwencją 4/91 dla złożenia chimerycznego genu S. Uzyskane białko S z sekwencji genu S składa się z 4/91, domeny transbłonowej 4/91 oraz domeny ogona cytoplazmatycznego z Beaudette-CK i jest analogiczne z chimerycznym białkiem M41 S opisanym powyżej. [0067] Sekwencję genu 4/91 S uzyskano z RNA pochodzącego z wirusa wyizolowanego ze szczepu wirulentnego 4/91 IBV przy użyciu dwóch reakcji PCR. Dwa produkty PCR, 2042 bp i 2300 bp, wytworzono przy użyciu zestawów oligonukleotydów (Fig. 6). Produkt 2042 bp wytworzono przy użyciu oligonukleotydu BG42 (odpowiadający nukleotydom w genomie Beau-R) i specyficznego oligonukleotydu 4/91, 4/91d (odwrócony, komplementarny do odpowiednich nukleotydów w genomie Beau-R). Produkt 2300 bp wytworzono przy użyciu specyficznego nukleotydu 4/91, 4/91c (odpowiadający równoważnym nukleotydom z genomu Beau-R) i oligonukleotydu BG141 (odwrócony, komplementarny do odpowiednich nukleotydów w genomie Beau-R). Oba fragmenty wprowadzono do pgem-t a uzyskany plazmid wykorzystano jako źródło sekwencji genu 4/91 S (Fig. 6). [0068] Sekwencję chimerycznego genu 4/91 S skonstruowano przez modyfikację pgpt-m41s (Fig. 7A) przy użyciu dwóch produktów PCR pochodzących z 4/91. Produkt 2042 bp pochodzący z 4/91 w pgem-t wycięto jako 180 bp fragment, reprezentujący połowę genu 4/91 S, przy użyciu Pacl i AlwNI, który oczyszczono i zachowano (Fig. 6). Produkt 2300 bp pochodzący z 4/91 w pgem-t wycięto jako 1804 bp fragment, reprezentujący połowę 3 genu 4/91 S, przy użyciu, przy użyciu AlwNI i BspHI, który oczyszczono i zachowano (Fig. 6). Plazmid pgpt-m41s strawiono PacI i BamHI, oczyszczono i zachowano fragment 018 bp reprezentujący sekwencję plazmidową (Fig. 7A). Dodatkowo, pgptm41s strawiono BspHI i BamHI, oczyszczono i zachowano fragment 80 bp pochodzący z Beau-R. (Fig. 3A). Przeprowadzono poczwórną reakcję ligacji pomiędzy 018 bp fragmentem PacI-BamHI zawierającym plazmid, 80 bp fragmentem BspHI-Bam- HI pochodzącym z Beau-R, 180 bp fragmentem PacI-AIwNI pochodzącym z 4/91 i 1804 bp fragmentem pochodzącym z AlwNI-BspHI 4/91, w wyniku której uzyskano pgpt-4/91s (Fig. 7B). Uzyskano konstrukcję sekwencji genu chimerycznego 4/91-Beau-CK S, składającą się z sekwencji sygnałowej, ektodomeny i regionów transbłonowych pochodzących z 4/91 domeny ogona cytoplazmatycznego pochodzącej z Beau-R (Fig. 7B). Analiza sekwencji pgpt-4/91s potwierdziła obecność ciągłej sekwencji chimerycznego genu S. [0069] W celu zmodyfikowania cdna Beaudette o pełnej długości pochodzący z CK w zrekombinowanym wirusie krowianki vnoti/ibv FL użyto metody przejściowej selekcji dominującej, TDS, (Falkner and Moss, Journal of Virology 64, ,1990) w celu zastąpienia sekwencji genu Beaudette S sekwencją chimerycznego genu S 4/91-Beau-CK. System TDS składał się z dwuetapowego procesu (Fig. 8 i 9). W pierwszym etapie metodę TDS zastosowano w celu usunięcia sekwencji genu Beaudette S z cdna o pełnej długości w zrekombinowanym wirusie krowianki vnoti/ibv FL. Plazmidem pgpt-ibv-δs, zawierającym sekwencję Beau-CK, odpowiadającą genowi replikazy i genowi 3 z częścią genu M, lecz bez sekwencji genu S transfekowano komórki zainfekowane vnoti/ibv FL. Po homologicznej rekombinacji pomiędzy sekwencją pochodzącą z IBV w pgpt-ibv-δs i sekwencją IBV w vnoti/ibv FL izolowano i identyfikowano

12 zrekombinowanego wirusa krowianki, vnoti/ibv-δs FL, zawierającego IBV cdna bez sekwencji genu S (rekombinant bezwypustkowy ) (Fig. 8). W drugim etapie metodę TDS zastosowano w celu wprowadzenia sekwencji chimerycznego genu S 4/91-Beau-CK do bezwypustkowego zrekombinowanego wirusa krowianki vnoti/ibv-δs FL. Plazmidem pgpt-4/91s transfekowno komórki zainfekowane vnoti/ibv-δs FL i po rekombinacji sekwencji pochodzącej z IBV w pgpt-4/91s i sekwencji IBV w vnoti/ibv-δs FL izolowano i identyfikowano zrekombinowanego wirusa krowianki, vnoti/ibv FL -4/91S zawierającego IBV cdna o pełnej długości z wprowadzoną sekwencją chimerycznego genu S 4/91-Beau-CK (Fig. 9). Odzyskiwanie zakaźnych wirusów IBV wyrażających chimeryczne białko wypustek Beaudette-M41 i Beaudette-4/91. [0070] Infekcyjnego ribv odzyskiwano z vnoti/ibv FL -M41S lub vnoti/ibv FL -4/91S przy użyciu komórek CK, zainfekowanych wcześniej rfpv/t7 (Britton i wsp., J. Gen. Virol. 77, , 1996), dla wprowadzenia polimerazy T7 RNA, i kotransfekowanych trawionym AscI vnoti/ibv FL -M41S DNA lub vnoti/ibv FL -4/91S i pci-nuc (Hiscox i wsp., J. Virol. 7, 06-12, 2001). vnoti/ibv FL -M41S lub vnoti/ibv FL -4/91S DNA przygotowywano z częściowo czyszczonych wirusów krowianki i pci-nuc, plazmid wyrażający białko IBV N, pod kontrolą dwóch promotorów T7 i CMV był wymagany do pomyślnego uzyskania ribv. [0071] Transfekowane komórki CK (P 0 ) inkubowano aż wykazywały efekt cytopatyczny (CPE), pożywkę filtrowano w celu usunięcia jakichkolwiek rfpv/t7 i potencjalnego IBV pasażowano na świeżych komórkach CK (P 1 ). Z komórek P1 izolowano ribv, BeauR-M41(S), i określano genotyp ribv za pomocą analizy sekwencji. Potwierdziła ona obecność dwóch mutacji markerowych oraz, że ektodomena chimerycznego genu białka S pochodziła z sekwencji genu M41-CK S. Do dalszej charakterystyki użyto BeauR-M41(S), pochodzący z komórek P CK. Przykład 2 Charakterystyka biologiczna in vitro zrekombinowanych wypustek IBV BeaudetteR - M41 Krzywe wzrostu wirusa. [0072] Konfluentne, pojedyncze warstwy komórek CK, Vero, CEF i BHK-21 w płytkach 60 mm infekowano 1, x 6 PFU wirusa IBV. Po adsorpcji komórki płukano trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS), przez 1 godz. w temp. 37 C, w celu usunięcia resztek wirusa i inkubowano w temp. 37 C w ml odpowiedniej pożywki. Próbki hodowli pobierano przez okres 96 godz. i analizowano namnażanie wirusa w teście tworzenia łysinek, w trzech powtórzeniach. Replikacja BeauR-M41(S) w różnych liniach komórkowych. [0073] Szczepy wirusa IBV, Beau-CK i M41-CK, posiadały różniący się tropizm komórkowy. Wiadomo, że oba wirusy replikują się do podobnych mian w komórkach CK lecz tylko Beau-CK wytwarza wirusy infekcyjne na komórkach Vero. Zatem stosując zrekombinowane, izogeniczne wirusy, BeauR i BeauR-M41(S), które różnią się tylko ektodomeną białka S, starano się ustalić czy glikoproteina S IBV była odpowiedzialna za obserwowane różnice zdolności różnych szczepów IBV infekowania i replikowania się w różnych liniach komórkowych. [0074] BeauR, M41-CK i BeauR-M41(S), wykazały podobne profile wzrostu na komórkach CK (Fig. A). Ponadto, wszystkie trzy wirusy dawały CPE w ciągu 24 godz. Analiza profili wzrostowych trzech wirusów w komórkach Vero, CEF i BHK-21 (Fig. B-D) wykazała, że tylko Beau-R replikuje się do znacznych ilości w różnych komórkach, zazwyczaj z mianem maksymalnym w 24 godz. po infekcji. Wyniki te wykazały, że BeauR-M41 (S) posiada taki sam tropizm wobec komórek wszystkich czterech rodzajów jak M41-CK, pokazując, że zastąpienie ektodomeny z glikoproteiny S Beaudette odpowiednią sekwencją z glikoproteiny S M41-CK daje ribv ze zmienionym tropizmem komórkowym w porównaniu z BeauR. 11

13 [007] Wyniki analizy produktów RT-PCR z RNA izolowanego z komórek zainfekowanych tymi wirusami i pośredniej analizy immunofluorescencyjnej komórek zainfekowanych IBV potwierdziły wyniki z doświadczeń dotyczących wzrostu wirusów. Przykład 3 Charakterystyka biologiczna in vivo zrekombinowanych wypustek IBV BeaudetteR - M41 (podawanie po wykluciu) A. Bezpieczeństwo zrekombinowanych wirusów IBV (wirusów ribv) BeauR i BeauR-M41(S) Materiał i metody Wirusy i komórki [0076] Stosowano szczep IBV Massachusetts M41-CK, wirulentny dla wyklutych kurczaków, po 11 pasażach w pierwotnych komórkach nerek kur (CK) i trzech pasażach w -dniowych zarodkach kurczaków Rhode Island Red (RIR), wolnych od specyficznego patogenu (SPF). Wirusy ribv BeauR i BeauR-M41(S) namnażano w komórkach CK. Wirusy miareczkowano w hodowlach narządowych tchawicy z zarodków kurczaka. Miana wyrażano w log dawki hamującej ruch rzęsek w 0 % (CD 0 ). Kurczaki [0077] Ośmiodniowe kurczaki RIR zaszczepiano za pomocą wkroplenia do oczu i nosa 0,1 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanem, zawierającego 3,0 log CD 0 lub samym PBS (grupa kontrolna, infekowana mock (ślepa próba)). Kurczaki trzymano w grupach. Badania na zwierzętach [0078] W celu określenia czy oba z wirusów ribv były patogenne dla wyklutych kurczaków, zapisywano trzy objawy kliniczne: prychanie, wysięk z nosa i rzężenia. Prychanie zapisywano dla grup w czasie 2- minutowych okresów i przedstawiano jako prychanie/ptaka/min. Wysięk z nosa (klarowny lub mętny) oraz rzężenia (umiarkowane i silne) zapisywano dla każdego ptaka indywidualnie, obserwacje przedstawiono poniżej w postaci procentu dla grupy. Aktywność rzęsek określano przez zabicie ptaków, usunięcie tchawicy, poprzeczne pocięcie tchawicy na skrawki w kształcie pierścieni o grubości 1 mm i obserwowanie ich w mikroskopie pod niskim powiększeniem. Dla każdej tchawicy obserwowano pierścieni. Aktywność rzęsek zapisywano w przybliżeniu jako 0%, 7%, 0%, 2% lub 0%. W dniach kiedy zapisywano dane grupy obejmowały nie mniej niż 20 ptaków. Wyniki [0079] Prychanie było maksymalne 6 dnia po infekcji. Nie wykazano znaczących różnic w poziomach prychania u ptaków infekowanych BeauR i BeauR-M41(S) i ptaków infekowanych mock. Szczep M41-CK indukował prychanie wyższe o rząd wielkości (Tab. 1). Tabela 1 Zaszczepienie Prychnięcie/ptaka/min. 6 dnia po zaszczepieniu Mock 0,07 BeauR 0,14 BeauR-M41 (S) 0,24 M41-CK 2,1 3 [0080] Wysięk z nosa był maksymalny dnia po infekcji. Wysięk z nosa wykazywała większość ptaków infekowanych M41-CK, podczas gdy wykazywało go tylko niewiele ptaków infekowanych dwoma zrekombinowanymi wirusami. Nie wykazano istotnych statystycznie różnic pomiędzy liczbą ptaków wykazujących wysięk z nosa w grupach infekowanych mock i ribv (Tab. 2). 12

14 Tabela 2 Zaszczepienie Ptaki z wysiękiem z nosa dnia po zaszczepieniu (%) Mock 0 BeauR 4 BeauR-M41 (S) 12 M41-CK 7 [0081] Rzężenia były maksymalne 4 dnia po infekcji w grupie infekowanej M41-CK. BeauR-M41(S) i BeauR nie wywoływały umiarkowanych lub silnych rzężeń (Tab. 3). Tabela 3 Zaszczepienie Ptaki wykazujące umiarkowane i ciężkie rzężenia 4 dnia po zaszczepieniu (%) Mock 0 BeauR 0 BeauR-M41 (S) 0 M41-CK [0082] Żaden z wirusów ribv nie zmniejszał aktywności rzęsek, podczas gdy wirulentny M41-CK powodował całkowite zahamowanie ruchu rzęsek (Tab. 4). Tabela 4 Zaszczepienie Średnia aktywność rzęsek w pierścieniach tchawic y dnia po zaszczepieniu (%) Mock >90 BeauR >90 BeauR-M41 (S) >90 M41-CK 0 [0083] Wyniki przedstawione w Tabelach powyżej pokazują, że rodzicielski IBV BeauR i zmieniony mutant BeauR-M41 (S) nie były patogenne dla świeżo wyklutych kurczaków. B. Skuteczność indukcji odporności ochronnej przez BeauR i BeauR-M41 (S) Materiał i metody Badania na zwierzętach [0084] Ptaki w tym doświadczeniu, które były szczepione wirusami BeauR, BeauR-M41(S), M41-CK lub nie były szczepione w wieku ośmiu dni, eksponowano 21 dni później na 3 log dawki hamującej ruch rzęsek w 0 % wirulentnego IBV M41-CK. Piątą grupę ptaków infekowano mock. Grupa ta pozostawała jako grupa nieprowokowana. Cztery dni po ekspozycji kurczaków, usuwano tchawice, zeskrobywano nabłonek i zawieszano w 1 ml pożywki. Wirusy miareczkowano w hodowlach narządowych tchawicy z zarodków kurczaka i miano wyrażano w log dawki hamującej ruch rzęsek w 0 % (CD 0 ). Wyniki [008] Ekspozycja, wirulentnym M41-CK, ptaków, które były szczepione BeauR-M41(S) wywoływała niski poziom prychania, podobny do tego dla ptaków, które były szczepione i eksponowane wirusem M41-CK. Dla kontrastu, ptaki szczepione BeauR wykazywały wysoki poziom prychania, chociaż mniejszy niż ptaki eksponowane, nie poddane szczepieniu wcześniej (Tab. )

15 Tabela Pierwsze zaszczepienie Prychnięcie/ptaka/min. dnia po ekspozycji na wirulentnego IBV M41- (szczepienie) CK Mock 0,96 BeauR 0,60 BeauR-M41 (S) 0,18 M41-CK 0.11 Mock (nieprowokowane) 0,06 [0086] Eksponowanie na M41-CK powodowało wysięk z nosa u 6% ptaków szczepionych mock i nie obserwowano wysięku z nosa u ptaków, które były szczepione BeauR-M41 (S) lub M41-CK (Tab. 6). Tabela 6 Pierwsze zaszczepienie (szczepienie) Ptaki z wysiękiem z nosa dnia po ekspozycji na wirulentnego IBV M41-CK (%) Mock 6 BeauR 6 BeauR-M41 (S) 0 M41-CK 0 Mock (nieprowokowane) 0 1 [0087] Eksponowanie na M41-CK powodowało umiarkowane lub silne rzężenia u 23% ptaków szczepionych mock 6 dnia po infekcji i nie obserwowano rzężenia u ptaków, które były szczepione wirusami ribv (Tab. 7) Tabela 7 Pierwsze zaszczepienie Ptaki wykazujące umiarkowane i ciężkie rzężenia 6 dnia po ekspozycji na (szczepienie) wirulentnego IBV M41-CK (%) Mock 23 BeauR 0 BeauR-M41 (S) 0 M41-CK 0 Mock (nieprowokowane) 0 [0088] Ptaki, które były szczepione M41-CK były w pełni chronione przed ekspozycją na M41-CK; aktywność rzęsek wynosiła 0%, w przeciwieństwie do ptaków nieszczepionych, gdzie nie obserwowano aktywności rzęsek. Większość (7/9) ptaków zaszczepionych BeauR-M41(S) posiadało aktywność rzęsek (>0%) po ekspozycji tzn. były niewrażliwe na ekspozycję. Pozostałe dwa ptaki posiadały aktywność około 0% (Tab. 8). Pierwsze (szczepienie) zaszczepienie Tabela 8 Ptaki z 0% aktywności rzęsek w tchawicy 4, i 6 dnia po ekspozycji na wirulentnego IBV M41-CK liczba/całkowita liczba % Mock 0/6 0 BeauR 11/9 11 BeauR- M41 (S) 27/9 77 M41-CK 6/6 0 Mock (nieprowokowane) 6/ innych ptaków w tej grupie wykazywało <2% aktywności rzęsek. 2 2 inne ptaki w tej grupie wykazywało 48% i 4% aktywności rzęsek. [0089] Nie wykryto wirusa użytego do eksponowania w różnych grupach szczepionych ptaków (Tab. 9)