Nowoczesne metody cytogenetyczne w diagnostyce prenatalnej i postnatalnej Alicja Ilnicka Pracownia Cytogenetyczna Zakład Genetyki Instytut Psychiatrii i Neurologii 21.11.2016r.
Dynamiczny rozwój genetyki, a szczególnie biologii molekularnej, dostarcza coraz więcej wiedzy na temat patogenezy wielu wrodzonych wad i chorób uwarunkowanych genetycznie. Obecnie wiele z nich można diagnozować stosując metody: - analizy DNA - cytogenetyki klasycznej - cytogenetyki molekularnej - biochemiczne Powyższe techniki pozwalają na weryfikację rozpoznania klinicznego chorób wywołanych mutacjami monogenowymi czy też rearanżacjami chromosomowymi.
Cytogenetyka jest jedną z dziedzin genetyki medycznej, która zajmuje się analizą liczby i struktury chromosomów. Metody jakimi posługuje się cytogenetyka można podzielić na: - klasyczne - molekularne - GTG, CBG, NOR, HRBT - FISH, CGH, acgh, QF PCR, MLPA, BoBs Obecnie, w wielu przypadkach, dla pełnej oceny kariotypu konieczne jest zastosowanie obu, wzajemnie uzupełniających się metod.
Za początek cytogenetyki medycznej można uznać rok 1956, gdyż wtedy ustalono prawidłową liczbę chromosomów u człowieka (Tijo i Levan). Trzy lata później rozpoznano pierwszą aberrację chromosomową i powiązano ją z opisanym klinicznie już w 1866 roku zespołem Downa. z.downa 47,XY,+18 z.edwardsa 47,XY,+13 z.patau
Aberracje chromosomowe - liczbowe aneuploidie - trisomie, monosomie, tetrasomie poliploidie - triploidie, tetraploidie - strukturalne - translokacje inwersje insercje duplikacje, delecje chromosomy pierścieniowe izochromosomy chromosomy markerowe
Częstość występowania aberracji chromosomowych 1: ~ 160 (żywo urodzonych dzieci) chromosomów płci Aberracje liczbowe 1: ~ 250 chromosomów autosomalnych zrównoważone Aberracje strukturalne 1: ~ 375 niezrównoważone 1: ~ 440 1: ~ 700 1: ~ 490 1: ~ 1600 Z. Turnera 1: ~ 4000 Z.Klinefeltera 1: ~ 1000 ZD 1: ~ 830 ZE 1: ~ 7500 ZP 1: ~ 22 700 Translokacje 1: ~ 625 wzajemne Delecje 1 : ~ 5000 subtelomerowe Delecje 1 : ~ 4000 interstycjalne Shaffer & Lupski, 2000
GTG, 550 prążków kariogram 46,XY NOR CBG
Idiogram - GTG (ISCN 2013, 2016) An International System For Human Cytogenetic Nomenklature
Ryzyko 3-15% do 100% Ryzyko dla K dla M
Zespół Downa 1: 830 ż. u. 47,XY,+ 21 Ryzyko dla K-15% dla M - 1% Ryzyko wystąpienia u płodu zespołu Downa wzrasta wraz z wiekiem matki 46,XX,der(14;21),+21 W badaniu USG płodu z ZD - zwiększona przezierność fałdu karkowego (NT> powyżej normy) - brak uwidocznionej kości nosowej w I trymestrze - skrócenie kości długich - u 70% wada serca (AVSD, ASD, VSD, TOF) - nieprawidłowy przepływ w przewodzie żylnym (fala α ) - 90% - niedomykalność zastawki trójdzielnej 65% - hyperechogenne jelito - ogniska hyperechogenne w sercu - powiększona wątroba z nieprawidłwymi przepływami Ryzyko -100% 46,XY,der(21;21),+21
Zespół Duchenne`a (DMD) u dziewczynki: * translokacja X- autosom z pęknięciem w genie DMD (zmapowano gen dystrofiny) * nielosowa inaktywacja chromosomu X preferująca aktywność chromosomu X z mutacją w genie DMD * monosomia chromosomu X (w zespole Turnera) z mutacją w genie DMD * matczyna isodisomia chromosomu X z mutacją w genie DMD * mutacja receptora androgenowego (AR) powodująca rewersję płci kariotyp 46,XY u dziewczynki (np. mutacja genu SRY lub del 9p24.3) i dodatkowo współistniejąca mutacja w genie DMD
W diagnostyce cytogenetycznej stosowane są metody prążkowe o różnym stopniu rozdzielczości oraz metody cytomolekularne. Technika Rozdzielczość - GTG ( ~ 550 prążków) >5 Mpz ( ~450 prążków) - Metoda HR CGH > 3 Mpz - Metoda FISH 40 250 Kpz - Metoda MLPA ~ 40 Kpz - acgh z sondami BAC ~ 1 Mpz - acgh z sondami 3 100 Kpz oligonukleotydowymi - acgh z sondami SNP 1pz Ze względu na różne metody jakimi dysponujemy i możemy zastosować, bardzo ważne są sugestie dotyczące rozpoznania klinicznego.
Rutynowo stosowane metody prążkowe (GTG) nie zawsze pozwalają na jednoznaczną ocenę kariotypu ( markery, addycje, insercje, translokacje, rearanżacje de novo, mikroaberracje). Obecnie wiele problemów związanych z interpretacją aberracji chromosomowych może być wyjaśnionych dzięki zastosowaniu metod cytogenetyki molekularnej. Wykorzystując techniki biologii molekularnej, powielając fragmenty DNA metodą PCR czy klonowania, tworzy się sondy molekularne komplementarne do odpowiednich regionów chromosomu. Podstawową techniką stosowaną w cytogenetyce molekularnej jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ - FISH Sondę molekularną stanowi fragment DNA, którego sekwencja nukleotydów jest znana i komplementarna do badanego regionu chromosomu. W zależności od rodzaju stosowanej sondy można rozpoznawać określone regiony na chromosomie : - cały chromosom - centromer - telomer - specyficzne, unikatowe sekwencje DNA
Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ ( FISH) niezbędna jest do: - identyfikacji dodatkowego materiału genetycznego (chromosomy markerowe) - jednoznacznej oceny złożonych aberracji strukturalnych chromosomów (translokacji, duplikacji, delecji, addycji) - wykrywania submikroskopowych aberracji chromosomowych (czułość 50 150 kpz) - szybkiej detekcji aneuploidii/ poliploidii chromosomowej w diagnostyce pre- i postnatalnej Ograniczenia: - wymaga wcześniejszej wiedzy na temat badanej sekwencji DNA - można badać niewielką liczbę sekwencji jednocześnie - nie dostarcza informacji o aberracjach innych niż badane
Dzięki rozwojowi cytogenetyki molekularnej możliwe jest obecnie diagnozowanie wielu tzw. zespołów mikrodelecji Najczęstszą przyczyną zespołów mikrodelecji jest utrata jednego lub kilku leżących obok siebie genów, czego efektem jest monosomia określonego odcinka chromosomu. Delecja obejmuje zwykle od 1 do 3 mpz wykrycie jej nie jest możliwe metodami klasycznymi. Wiele tych zespołów zostało wcześniej klinicznie zdefiniowanych, a dopiero niedawno wykryto, że mikrodelecje konkretnych miejsc na chromosomach odpowiedzialne są za ich wystąpienie. Obecnie znanych jest około 500 chorób powodowanych mikroaberracjami chromosomowymi. Dla skutecznego zastosowania techniki FISH istotne jest właściwe rozpoznanie kliniczne oparte na analizie wystepujących u pacjenta wad, cech dysmorficznych i behawioralnych (wskazanie do badania).
- wykrywanie submikroskopowych aberracji chromosomowych (mikrodelecje) (czułość 50 150 kpz) Zespół Williamsa del(7)(q11.23) (1:20 000 ż. u.) W obrazie USG płodu : - u 75% wada serca (zwężenie nadzastawkowe aorty) - zwężenie tętnicy płucnej - wewnątrzmaciczne opóźnienie rozwoju płodu 46, XX. ish del(22)(q11.2 q11.2)(d22 S75 -) Zespół DiGeorge`a del(22)(q11.2) W obrazie USG płodu : (1:4000 ż.u.) - u 75% wada serca (szczególnie wady stożka i pnia tętniczego - AS, VSD, ASD, TOF, TGA) - wielowodzie - wewnątrzmaciczne opóźnienie rozwoju płodu - zwiększona przezierność fałdu karkowego - brak lub hipoplazja grasicy
- szybka detekcji aneuploidii chromosomowej w diagnostyce pre- i postnatalnej ( bez konieczności hodowli komórkowej ) 13 21 FISH do jąder interfazowych ch. 21,18,13,X,Y 18 X Y A.Vethut - Prenat Diagn 2009;29;995-998
Conventional CGH Comparative Genomic Hybridization - CGH ( Porównawcza Hybrydyzacja Genomowa i HR-CGH ) Array CGH ( acg Label patient DNA with Cy3 Label control DNA with Cy5 Label patient DNA with Cy3 Label control DNA with Cy5 Zalety Label patient DNA with Cy5 Mix - możliwość Mix wykrywania niezrównoważonych aberracji chromosomowej bez konieczności prowadzenia hodowli komórkowej Hybridize DNA to genomic clone microarray (poronione płody, onkologia) - czułość metody od 3Mpz HR-CGH do <10 Kpz dla acgh Analyze Cy3/Cy5 fluorescence ratio of patient to control Wady M Cy3/Cy5 ratio >1 Duplication Cy3/Cy5 ratio <1 Deletion HR - CGH (~ 3Mpz) - nie wykrywa zrównoważonych translokacji chromosomowych Cy3/Cy5 ratio >1 Duplication Cy3/Cy5 ratio <1 Deletion Cy3/Cy5 ratio < Duplication (1/500 u zdrowych ludzi) - nie wykrywa kariotypów mozaikowych i poliploidii
HR - CGH GTG FISH 47,XY,der(22)t(11;22)(q23.3;q11.2) Zespół Emanuela - wada serca (u ~ 50%) - przepuklina przeponowa - hipoplazja (agenezja) nerek - małogłowie - wysoko wysklepione podniebienie - dysmorfie twarzy - zarośnięcie odbytu - niedorozwój narządów płciowych u chłopców - upośledzenie umysłowe W 99% jeden z rodziców jest nosicielem translokacji zrównoważonej t(11;22)
46,XX,del(5)(p15.1p15.31)
Niezrównoważone rearanżacje a efekt fenotypowy Rodzice i potomstwo zdrowi Rodzice zdrowi a potomstwo o nieprawidłowym fenotypie Nieprawidłowy fenotyp u rodzica i dziecka (różna ekspresja) Duplikacje Delecja J.C.K.Barber J Med Genet 2005;42;605-629
arraycgh (acgh) porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy ( 2001) Zalety - czułość badania ( nawet do 1pz) - pozwala na jednoczesne badanie: - całego genomu (sondy BAC) - wielu zespołów mikrodelecji i mikroduplikacji - jednocześnie wszystkich aberracji subtelomerowych - komercyjne mikromacierze prenatalne zespołów mikrodelecji wad serca niepełnosprawności intelektualnej Czułość acgh w zależności od stosowanych sond: - sondy BAC > 1Mpz - oligonucleotydowe 3-100Kpz - SNP Wady - wysoka cena badania - nie można wykryć zrównoważonych rearanżacji - poliploidie wykrywa tylko acgh - SNP
Wprowadzenie metody acgh zmieniło radykalnie możliwości diagnostyczne ( wykrywa zmiany genomu rzędu 50 100pz). W diagnostyce postnatalnych powinno być to podstawowe badanie kierowane do pacjentów z niepełnosprawnością intelektualną i / lub z wadami wrodzonymi ( w USA od 2005r.). W takiej grupy pacjentów z uprzednio prawidłowym kariotypem acgh wykrywa dodatkowo 14 22% aberracji submikroskopowych. ( Hochstenbach,2011) W ostatnich latach ukazało się wiele publikacji donoszących wyniki badań acgh w diagnostyce prenatalnej. Wykorzystywane są mikromacierze z sondami BAC/ oligonukleotydowymi / SNP na określone regiony chromosomów lub na cały genom. Badanie acgh pozwala wykryć o ~ 6-7% więcej aberracji niż w rutynowym badaniu kariotyp u płodów z wadami stwierdzonymi w badaniu w USG oraz ~ 0.8-1,7% aberracji więcej u płodów z grupy niskiego ryzyka. Ponadto stwierdza się około 1% zmian CNV o nie nieznanym znaczeniu klinicznym (New EnglJ Med 2012;6,2175 EurJHumGen 2013;21725-730). Zastosowanie acgh potwierdza, że ~ 25% translokacji zrównoważonych de novo w badaniu rutynowym, wykazuje submikroskopową aberrację, nie koniecznie w miejscu pęknięcia chromosomów.
GenetMed 2011;13;9;777-784
GenetMed 2011;13;9;777-784
Zmienna ekspresja i penetracja del/dup CNV Penetracja 46-62% 17-37% 34% AmJMedGen;2012;15;02;118-129 EurJMed Gen; 2014;57;151-156
Pacjentka lat 29 CI ZD CII - ARSA (del3 i dup1 u płodu i u matki) 3p26.3x1 (1,99Mpz) 1q32.1x3 (1,22Mpz) IMiD arr[hg18]1q32.1(197,684-198909,224)x3,3p26.3(69,430-2,062,244)x1
Przykładowy prenatalny panel arraycgh S.J.Gross- Prenatal Diagnosis 2011,31;259-266
Aktualne możliwości diagnostyczne Częstość występowania niepełnosprawności intelektualnej (NI) w populacji wynosi 2 3% Badaniami klasycznymi (GTG) aberracje chromosomowe stwierdza się u : - 30%- 40% pacjentów z NI głębokiego stopnia - 3% - 4% pacjentów z NI w stopniu lekkim Zastosowanie techniki FISH w grupie pacjentów z NI + dysmorfiami i prawidłowy kariotypem pozwala wykryć dodatkowo 3-7% aberracji subtelomerowych. Zastosowanie techniki acgh u pacjentów, u których uprzednie badania były prawidłowe, ujawnia dodatkowo jeszcze ok.15% - 20% mikroaberracji oraz ~ 15% pojedynczych delecji lub duplikacji klonów CNV o niepewnym znaczeniu klinicznym (VOUS)
- QF-PCR (Quantitative Fluorescence - PCR ) Podstawą metody ilościowego PCR jest amplifikacja specyficznych sekwencji genomowego DNA z użyciem starterów znakownych fluorochromem, a następnie pomiar intensywności fluorescencji poszczególnych alleli tych sekwencji. Rozdział powielonych sekwencji przeprowadza się elektroforezą przy użyciu sekwenatora. Pomiar poziomu fluorescencji umożliwia określenie liczby kopii danej sekwencji w komórce. Amplifikowane są polimorficzne, krótkie powtórzenia mikrosatelitarne (STR) specyficzne dla badanych regionów, np. chromosomów 21,13,18, X i Y. Jednocześnie bada się po kilka (4-5) sekwencji STR dla każdego z analizowanych chromosomów, gdyż niektóre mogą być nieinformatywne. Zalety: - szybka do wykrywania aneuploidii ( wynik w 24 godziny ) - powtarzalna i wiarygodna Wady: - nie wykrywa kariotypów mozaikowych >15% Niektóre zestawy mają certyfikat CE-IVD
MLPA - Multiplex Ligation dependent Probe Amplification (2002) (równoczesna amplifikacja wielu zależnych od ligacji sond molekularnych) 1. Sondy oligonukleotydowe hybrydyzują do określonej sekwencji badanego DNA. 2. Ligaza łączy zhybrydyzowane sondy tworząc matrycę dla reakcji PCR. 3. Zligowane fragmenty oligonukleotydowe są amplifikowane metodą PCR * Amplifikacja sond zależna jest od obecności komplementarnych sekwencji DNA w badanym materiale. ***Analiza reakcji umożliwia ocenę liczby kopii badanych sekwencji DNA, pośrednio więc liczbę chromosomów w komórce (jeśli badano sekwencje DNA poszczególnych chromosomów). - Długość produktów amplifikacji jest unikatowa dla każdej sekwencji DNA (120-480 nukleotydów) - Jednocześnie można badać do 40 sekwencji DNA - Można badać zmiany pojedynczych nukleotydów.
P 095 Prawidłowy MLPA badanie prenatalne z zestawem sond na chromosomy 21,18,13,X,Y Zalety metody: - szybka i powtarzalna - tania - możliwość analizy jednocześnie do 40 różnych sekwencji Wady: - reakcja wrażliwa na kontaminację - nie można wykryć nieznanych mutacji - nie wykrywa triploidii i k. mozaikowych - nie można przygotować własnych sond (patent) Sondy dostępne są dla: - aneuploidii - 18, 13, 21, X, Y - regionów subtelomerowych - regiony centromerowe - zespołów mikrodelecyjnych - choroby monogenowe - choroby onkologicznych P 095 Trisomia 21 Lista dostępnych sond na www.mlpa.com
P036! mikrodelecja (15q11.2-q13) z. Pradera Willego MLPA!! P290 Sondy P036 (tel p) Sondy - P290 (mikrodelecje)
MLPA P070 18p11.31 46,XY,der(18) [add (18)(p11.2)?] MLPA P095 18p11.21 MLPA P 036 18p11.31 Pacjentka - lat 26 C I zdrowe dziecko C II : Test I trymestru - 1:341 NT 2,8 mm
18p11.31p11.21(5,097,801-14,071,934)x3 ~9Mpz 18p11.32p11.31(139,089-5,014,332)x1 4,9Mpz IMiD
BACs-on-BEADs - BoBs (Perkin-Elmer, 2010) BoBs pozwala na szybką i jednoczesną detekcję zdefiniowanych delecji / duplikacji w badanej próbce DNA: - Prenatal BoBs - aneuploidii chromosomów 13,18,21,X,Y i 9 mikrodelecji ( 22q11.2; 10p14; 7q11.23; 15q11.2; 17p11.2, 4p16.3; 5p15 ; 8q24; 17p13.3) - Karyolite BoBs - aberracji subtelomerowych i okołocentromerowych wszystkich chromosomów W technice tej używa się mikrokulek polistyrenowych pokrytych zdefiniowanymi sondami BAC, wybarwionymi dwoma barwnikami fluorescencyjnymi w różnych stężeniach. Mikrokulki hybrydyzuje się z mieszaniną wcześniej wyznakowanego i oczyszczonego DNA badanego i referencyjnego. Każda kulka pokryta jest 1-3 sondami BAC specyficznym dla badanego regionu DNA.
Pomiaru intensywności sygnału świadczącego o wystąpieniu lub braku hybrydyzacji dokonuje się w kapilarze cytometru przepływowego z użyciem 2 niezależnych laserów : - światło zielone o długości fali 635 nm - światło czerwone o długości fali 532 nm Uzyskane dane opracowywane są komputerowo, a ostateczny wynik przedstawiony jest w postaci graficznej
Genetyczna diagnostyka nieinwazyjna Odkrycie wolnego płodowego DNA - cffdna (1997r.) w krwiobiegu matki stworzyło nowe, nieinwazyjne możliwości diagnostyki płodu. cffdna pochodzi głównie z apoptozy komórek trofoblastu. Pojawia się w krwiobiegu matki około 4-7 Hbd i stężenie jego wzrasta do porodu a następnie gwałtownie spada ( 2 h). CffDNA reprezentuje cały genom płodu. Stanowi 3 15% całkowitego ffdna w krwiobiegu matki. Już od 2001 r. cffdna wykorzystywano do : Diagnostyki ryzyka konfliktu serologicznego badając czynnik RhD ; obecnie również RhC, RhE i Kell. > Określenia płci płodu (SRY): - zmniejsza o 50% diagnostykę inwazyjną w przypadkach chorób sprzężonych z X - pozwala leczyć hemofilię w łonie matki - pozwala wdrożyć wczesne leczenie hormonalne chroniące przed maskulinizacją płody żeńskie matek chorych na wrodzony przerost kory nadnerczy > Diagnostyki chorób jednogenowych (allel ojca): - dominujących wykrycie mutacji - recesywna - wykrycie allela ojca Przeprowadzano już diagnozę β-talasemii, hemofilii (czynnik F8 i 9) i anemii sierpowatej.
W 2008 roku opracowano technikę sekwencjonowania nowej generacji ( massively parallel sequencing) - MPS MPS umożliwia jednoczesną analizę ogromnej liczby sekwencji DNA. Porównując proporcje sekwencji DNA badanego chromosomu (np. 21) w stosunku do sekwencji pochodzących z innych chromosomów, możliwe jest wykazanie liczby kopii badanego chromosomu w genomie. W 2012r. pojawiły się pierwsze prace przedstawiające wyniki badań (NIPT) aneuploidii chromosomów 21,13 i 18 z zastosowaniem cffdna i NGS. Teoretycznie technika NGS umożliwia analizę całego genomu. W Polsce dostępnych jest kilka testów NIPT umożliwiających wykrycie najczęstszych aneuploidii - 21,18,13 i X,Y oraz niektórych mikrodelecji już od 10 tyg. ciąży. (czułość >99,6% ; swoistość >99,98%) Bianchi-Nature Medicine 2012
Amerykańskie i europejskie towarzystwa genetyki człowieka (ASHG, ESHG) rekomendują wykorzystanie NIPT w przesiewowej diagnostyce płodu: Test przesiewowy (PAPP-A+ βhcg + USG ) Gdy oszacowane ryzyko aneuploidii niższe niż 1:1000 Gdy ryzyko pomiędzy 1:1000 a 1: 150 + USG prawidłowe niskie ryzyko NIPT Gdy ryzyko wyższe niż 1:150 badanie inwazyjne Gdy w badaniu USG stwierdza się wady płodu badanie inwazyjne Przed NIPT jak i diagnostyką inwazyjną konieczna jest niedyrektywna porada genetyczna informująca o zaletach i ograniczeniach stosowanych badań. Nie rekomenduje się obecnie wykonywania badania NIPT w kierunku chromosomów płci i mikrodelecji ( ze względu na wysoki odsetek FPR). EurJHumGen 2015;23;1438-1450
Wskazania do cytogenetycznej diagnostyki postnatalnej * podejrzenie występowania aberracji chromosomowej (cechy fenotypowe) * mnogie wady rozwojowe (u dziecka żyjącego lub zmarłego/ martwo urodzonego) * niepełnosprawność intelektualna ze współistnieniem cech dysmorfii i/lub wad rozwojowych * nieprawidłowy rozwój płciowy * występowanie aberracji chromosomowej w rodzinie * niektóre izolowane wady rozwojowe * niepowodzenia rozrodu - niepłodność, poronienia samoistne
Wskazania do inwazyjnej Ryzyko urodzenia diagnostyki prenatalnej chorego dziecka * nieprawidłowy obraz USG płodu 20% - 40%!!! * wynik testu przesiewowego 1:300 lub większe * wiek matki >35 lat (zależne od wieku) * poprzednie urodzenie dziecka z aberracją chromosomową zwykle 0,5 1,5% ale i 100% * translokacje chromosomowe występujące w rodzinie zwykle 3% 15% ale i 100% * poprzednie urodzenie dziecka z chorobą monogenową np.: choroby metaboliczne, lizosomalne, CFTR, DMD, SMA, HD, SCA, 25% lub 50% Fra (X), ALD, DM * poprzednie urodzenie dziecka z otwartą 3% - 5% wadą cewy nerwowej Odsetek nieprawidłowych wyników badań prenatalnych wykonanych w Z.G. IPiN w 2014r. wyniósł 13% (z tego 75% w grupie - nieprawidłowy obraz USG)