Key words: PCR, molecular diagnostics, parasitological diagnostics, parasitosis, Protozoa

Streszczenie Pierwotniaki pasożytnicze, mogą być przyczyną wielu groźnych chorób człowieka. Mogą umiejscawiać się w różnych częściach naszego organizmu, co sprawia że ich wykrycie u żywiciela staje się coraz trudniejsze, a co za tym idzie często bardzo trudno jest prawidłowo zdiagnozować przyczynę choroby ze względu na ogromne zróżnicowanie gatunkowe pierwotniaków. Do niedawna diagnostyka opierała się głównie na metodach bezpośrednich (mikroskopowych) lub pośrednich (serologicznych), ale wraz z dynamicznym rozwojem biologii molekularnej do puli metod wykorzystywanych w diagnostyce parazytologicznej weszły znacznie dokładniejsze, czulsze i ciągle doskonalone metody molekularne. Te metody należą podobnie jak metody serologiczne do pośrednich metod diagnostycznych, a ich zastosowanie sięga tam gdzie kończą się możliwości klasycznych metod diagnostycznych. W pracy tej w sposób przeglądowy została przedstawiona możliwość wykorzystania metod biologii molekularnej, w diagnostyce najpopularniejszych parazytoz człowieka wywoływanych przez pierwotniaki (Protozoa). Abstract Parasitic protozoa are responsible for many serious human diseases. Protozoa species are highly differentiated and can be found in various parts of human organism, therefore it is very difficult to make a correct diagnosis. Recent parasitological diagnostics adds very precise and reliable tools of molecular biology to the microscopic and serological methods. This report presents a review of the possible use of molecular biology in diagnosing most common human parasitic diseases caused by protozoa. Key words: PCR, molecular diagnostics, parasitological diagnostics, parasitosis, Protozoa Słowa kluczowe: diagnostyka, pierwotniaki, Protozoa, PCR, metody molekularne, parazytozy. W dobie dynamicznego rozwoju biologii molekularnej oraz coraz większej wiedzy na temat genomu pasożytów, a także dostępu do nowych technologii mamy możliwość wykonania coraz dokładniejszej diagnostyki chorób wywoływanych przez pasożyty u człowieka, jak i u zwierząt. Obecnie diagnosta laboratoryjny dysponuje szerokim wachlarzem metod, które może zastosować w swojej pracy zawodowej. Metody te możemy podzielić na dwie grupy: bezpośrednie oraz pośrednie. Metody bezpośrednie (morfologiczne) opierają się głównie na obserwacjach mikroskopowych preparatów sporządzonych z materiału pobranego do badań diagnostycznych (np. krew, limfa, płyn mózgowo-rdzeniowy, mocz, kał), umożliwiają bezpośrednie wykrycie pasożyta, oraz morfologiczne odróżnienie organizmów. Wśród zalet tych metod należałoby wymienić: niskie koszty oraz prostotę wykonania. Wadami tych metod są między innymi to, że są pracochłonne i czasochłonne oraz wymagają dużej wprawy i doświadczenia diagnosty. Metody te zwykle wykonywane są w pierwszej kolejności w laboratorium, natomiast w razie wystąpienia jakichkolwiek wątpliwości wynik jest potwierdzany lub wykluczany za pomocą pośrednich metod diagnostycznych. Grupę metod pośrednich można podzielić na dwie podgrupy: serologiczne i molekularne. Metody serologiczne opierają się na poszukiwaniu specyficznych antygenów lub przeciwciał w surowicy pacjenta. Ich zaletą jest szybkość i prostota wykonania oraz automatyzacja procesu diagnostyki. Metody te posiadają jednak niską specyficzność oraz wymagają użycia standaryzowa-

nych odczynników co znacznie zwiększa koszty wykonania. W razie pojawienia się wątpliwości wynik badania zwykle jest potwierdzany metodami molekularnymi pod warunkiem, że są one dostępne dla danego pasożyta. Metody molekularne stanowią drugą podgrupę pośrednich metod diagnostycznych. Ich rozwój rozpoczął się od momentu odkrycia przez Watsona i Cricka w 1953 roku struktury kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA). Metody te polegają na wyodrębnieniu specyficznej sekwencji DNA lub RNA w genomie pasożyta, a następnie poszukiwania jej w genomie żywiciela. Do technik stosowanych w diagnostyce molekularnej zaliczamy techniki hybrydyzacji kwasów nukleinowych takie jak: Dot-blot, Southern-blot, Northernblot, Fluorescent In Situ Hybridisation (FISH), czy mikromacierze oraz opracowaną w 1985 roku technikę łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR Polymerase Chain Reaction). Technika ta z czasem wzbogaciła się o wiele odmian m. in. RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR), gniazdowe PCR (nested-pcr), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), RACE (Rapid Amplification of cdna), wielokrotny PCR (multiplex-pcr), RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism), PCR konkurujący (competitive-pcr), PCR w czasie rzeczywistym (Real Time PCR), oraz odmiany służące do analizy całych cząsteczek DNA takie jak SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) oraz DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR) polega na sekwencji wielokrotnego podgrzewania i oziębiania próbki. W reakcji namnażany zostaje wybrany odcinek DNA. Zwykle następuje to po 20-35 cyklach. Każdy cykl obejmuje 3 etapy: denaturację, w wyniku której następuje rozplecenie podwójnej nici DNA; przyłączanie starterów czyli anneling. Startery zapoczątkowują syntezę nowego polinukleotydu poprzez kopiowanie matrycowego DNA; elongację czyli syntezę specyficznego fragmentu DNA komplementarnego do matrycy z wykorzystaniem Ryc. 1. Schemat reakcji RFLP [wg 1, zmienione]. termostabilnych polimeraz DNA. Do detekcji produktów amplifikacji wykorzystuje się elektroforezę na żelach (agarozowych lub poliakrylamidowych). Metoda RT PCR polega na amplifikacji określonego fragmentu RNA, który jest przepisywany na komplementarne cdna, w procesie odwrotnej transkrypcji w wyniku użycia enzymu odwrotnej transkryptazy. Real Time PCR pozwala na obserwowanie amplifikacji w czasie, w którym przebiega. Wraz z przybywaniem produktu reakcji PCR rośnie intensywność fluorescencji, która jest rejestrowana przez detektor. W odmianie nested PCR wykorzystuje się dwie pary starterów dla pojedynczego locus, co zapewnia większą specyficzność metody. W odmianie RAPD fragmenty DNA amplifikowane są przypadkowo. Jest ona wykorzystywana wtedy, gdy nieznane są sekwencje specyficzne. Natomiast odmiana RACE pozwala na amplifikację nieznanych końców fragmentów transkryptu, używając znanych informacji ze środka tran skryptu, co pozwala na otrzymanie pełnej długości sekwencji gdy znany jest tylko jej fragment. Odmiana RFLP łączy reakcje PCR z analizą restrykcyjną. Polega ona na porównaniu długości prążków w żelu agarozowym, powstałych po cięciu enzymami restrykcyjnymi (jednym lub kilkoma), produktu amplifikacji reakcji PCR (Ryc. 1) [1].

Competitive PCR polega na umieszczeniu w mieszaninie reakcyjnej badanego DNA oraz kontrolnego DNA o znanym stężeniu. Oba rodzaje DNA konkurują o reagenty co powoduje, że ilość DNA kontrolnego jest odwrotnie proporcjonalna do ilości DNA badanego. Multiplex PCR jest odmianą pozwalającą na amplifikacje wielu loci równocześnie, podczas jednej reakcji PCR, dzięki wykorzystaniu kilku par starterów w jednej mieszaninie reakcyjnej. SSCP jest odmianą polegającą na elektroforetycznej separacji jednoniciowych kwasów nukleinowych, opartej na subtelnej różnicy w sekwencji, która daje w wyniku odmienne drugo i trzeciorzędowe struktury, a co za tym idzie zmierzalne różnice w ruchliwości w żelu. Analogiczna z SSCP jest odmiana DDGE, jednak dochodzi tutaj dodatkowy element - gradient denaturujący. Cząsteczki podczas migracji w różnym punkcie gradientu zwiększają swoją mobilność. Hybrydyzacja kwasów nukleinowych polega na łączeniu 2 różnych polinukleotydów na podstawie komplementarności zasad. Badana próba utrwalana jest na membranie nylonowej lub celulozowej. Potem następuje inkubacja z sondą (jednoniciowe DNA komplementarne do matrycy wyznakowane tak, aby umożliwić detekcję miejsc w których doszło do połączenia z badana próbą) i odpłukanie niezwiązanych cząsteczek. Ostatni etap to uwidocznienie miejsc w których doszło do związania sondy i badanej próby. Odmiany tej metody to: Dot blot (wykrywanie i identyfikacja białek); Southern blot (wykrywanie fragmentów DNA); Northen blot (wykrywanie fragmentów RNA) oraz FISH (wykrywanie fragmentów DNA i RNA). Inną technikę stanowią mikromacierze będące szklanymi lub plastikowymi płytkami zwierającymi sondy molekularne. Na płytki następnie nanoszone są wyznakowane fluorescencyjnie próby badanego DNA. Wyniki odczytuje się w mikroskopie konfokalnym. Techniki biologii molekularnej są coraz powszechniejsze w diagnostyce chorób wywoływanych przez pierwotniaki (Protozoa) jak i w badaniach nad ich różnorodnością gatunkową. Techniki biologii molekularnej stosuje się do rozróżniania podgatunków Trypanosoma brucei (T. b. brucei, T. b. rhodesiense, T. b. gambiense), które są morfologicznie identyczne. Wykorzystuje się do tego startery amplifikujące wysokopowtarzalną sekwencje (ang. highly repetitive sequence) DNA o wielkości 177 par zasad [pz]. Dzięki temu można wykryć T. brucei we krwi metodą Real Time PCR. Granica wykrywalności wynosi 100 pasożytów w 1 ml krwi [2, 3]. Obiecującym narzędziem do diagnostyki śpiączki afrykańskiej wywoływanej przez tego pasożyta wydaje się być molekularny wskaźnik tzw. HA-PCR-OC (Human African Trypanosomiasis PCR Oligochromatography). Test ten wykrywa zmodyfikowane DNA T. brucei. Najniższy poziom tego testu to 5 fg (femto gram) czystego DNA. Pozwala on Ryc. 2. Trypanosoma cruzi postać amastigota w mięśniu sercowym (Fot. Piotr Szilman). na wykrycie 1 pasożyta w około180 ml krwi, a jego czułość i specyficzność ocenia się na 100% [4]. Do diagnostyki molekularnej T. cruzi (Ryc. 2) można wykorzystać genomowe lub konserwatyne minipowtarzalne (ang. mini repeat) sekwencje kinetoplastowego DNA (kdna) o wielkości 330 pz, które są gatunkowo specyficzne, sekwencje satelitarnego DNA o wielkości 195 pz, powtórzone sekwencje E13 oraz geny miniegzonowe (ang. mini exon genes). DNA do badań może być izolowane z krwi, surowicy, bezpośrednio z pasożytów lub z jądra pasożyta [2]. Natomiast w diagnostyce leiszmanioz wykorzystuje się liczne metody molekularne takie jak: tradycyjny PCR, PCR-RFLP lub Real Time PCR. W wyborze odpowiedniej metody ważne jest określenie celu badań oraz substratów potrzebnych do wykonania próby. W przypadku gdy ważna jest dla nas czułość reakcji, kwantyfikacja lub gdy chcemy zbadać zmienność wtedy do diagnostyki wybieramy geny kodujące rrna, kdna lub geny miniegzonowe. W przypadku identyfikacji gatunkowej wybieramy gp63, RNA, geny wewnętrznie transkrybowanych spacerów, hsp70 lub proteinazy cysteinowe. Natomiast w przypadku gdy chcemy wykonać fingerprinting wykorzystujemy kdna, mikrosatelitarne DNA lub geny kodujące niektóre antygeny. Do identyfikacji Leishmania spp. używa się jednak zwykle powtarzalnych sekwencji kdna, gdyż zawierają wiele sekwencji konserwatywnych [2]. Obiecującymi metodami będącymi w trakcie opracowywania są metody: PCR-ELISA, OC-PCR oraz LAMP [5]. W przypadku diagnostyki kala-azar można wykorzystać metodę gniazdowego PCR. Amplifikuje się wtedy gen miniegzonu, który jest unikalny i tandemowo powtórzony w genomie Leishmania spp. Dzięki tej metodzie można przeprowadzać diagnostykę z krwi pacjenta. Natomiast w przypadku, gdy chce się odróżnić nawrót choroby od reinfekcji u pacjentów z leishmaniosis viscelaris używa się metody PCR-RFLP [6, 7]. Do diagnostyki Trichomonas vaginalis opracowanych zostało wiele par starterów, których czułość waha się od 85-100%. Startery są specyficzne dla regionu genu kodującego 18S rrna. DNA do badań można otrzymać zarówno z wymazów z pochwy jak i z hodowli założonej z wydzieliny pochwowej. Czułość metody gdy DNA izolowane jest z wymazu pochwowego wynosi 100%, natomiast w przypadku izolacji z hodowli czułość wynosi 99,7% W wyizolowanym

DNA startery flankują konserwatywny region β - tubuliny. Czułość tej metody diagnostycznej wynosi 97%, a specyficzność 98% [8, 9, 10]. Do diagnostyki rzęsistka pochwowego można również wykorzystać hybrydyzacje typu dot-blot fragmentu DNA o wielkości 2-3 kpz; sekwencja ta służy także do rozpoznawania rodzajów tego pasożyta z określonych regionów Włoch (Sardynia, Piemont) i Mozambiku. Dolny limit detekcji wynosi 200 pasożytów [2, 11]. Także metodę FISH można zastosować do diagnostyki T. vaginalis. Znakuje się wtedy powtarzalne sekwencje DNA, które widoczne są w jądrze pierwotniaka jako intensywny fluorescencyjny region o konkretnym wzorze [12]. W przypadku diagnostyki G. lamblia molekularne metody diagnostyczne mają zastosowanie w wykrywaniu zarówno cyst jak i trofozoitów w próbach kałowych. Próg detekcji to 10 4-10 5 oczyszczonych trofozoitów lub cyst. Metody te wykorzystuje się w dwóch przypadkach: żeby wykryć zróżnicowanie gatunkowe oraz żeby odróżnić żywe od martwych cyst [2]. Metody z wykorzystaniem reakcji PCR mogą być także zastosowane do wykrywania obecności pierwotniaków z rodzaju Giardia w wodzie. Ich czułość zależy od koncentracji cyst (1-5 cyst/ ml próby). Dzięki nim mamy możliwość monitorowania zanieczyszczenia wód cystami Giardia spp. [13]. Do diagnostyki lambliozy można także wykorzystać sekwencje 18S rdna lub gen dehydrogenazy glutaminowej. Stosuje się wtedy technikę nested PCR. Natomiast gdy wykorzystujemy do diagnostyki ETS wtedy stosujemy technikę PCR-RFLP [14]. W przypadku diagnostyki malarii PCR stanowi najczulszą i najbardziej specyficzną metodę diagnostyczną. Technika ta może być zastosowana zarówno do diagnostyki jak i do identyfikacji gatunkowej. W diagnostyce możemy wykorzystać tradycyjny PCR ze specyficznymi starterami lub w celu zwiększenia czułości możemy wykonać nested PCR. Natomiast gdy chcemy wykryć mieszaną infekcję np.: P. falciparum i P. vivax, wtedy musimy się oprzeć na genach kodujących białka w kryptosporozoitach, ponieważ są one obecne u każdego gatunku Plasmodium. W przypadku infekcji mieszanych do diagnostyki można także wykorzystać się Real Time PCR. Materiał do badań pobiera się ze szpiku kostnego. W tej metodzie można wykonać próbkę z małej ilości komórek gdyż wymaga małej ilości DNA, ok. 1 ng [2, 15]. Do identyfikacji P. falciparum wykorzystuje się sekwencje powtarzalną z genomu P. falciparum o wielkości 21 pz ponieważ nie hybrydyzuje ona z DNA żadnego z pozostałych 3 gatunków Plasmodium. Czułość wynosi od 4-550 pasożytów w 1 μl krwi [2, 16]. Inną metodą detekcji zarodźców jest tzw. PCR-LDR (multiplex PCR Ligase Detection Reaction) Technika ta pozwala na wykrycie jednego pasożyta w 1 μl krwi. PCR-LDR umożliwia także ominięcie 4 oddzielnych procedur oceny klinicznych prób dla P. falciparum, P. ovale, P. malariae i P. vivax [17]. Do diagnostyki malarii w małym formacie można zastosować nie izotopowy kalorymetryczny system bazujący na reakcji PCR. Został on opracowany komercyjnie (Digene SHARP Signa System).Technika ta jest specyficzna dla P. vivax i P. falciparum. Jej czułość wynosi 100%, a specyficzność 95%. Inna metodą również dostępną komercyjnie jest Real Art Malaria LC Assay (Arthus GmbH, Hamburg Germany). Metoda ta opiera się na reakcji Real Time PCR. Jest to bardzo szybki i czuły (99,5%) test, czas potrzebny na jego wykonanie wynosi około 45 minut [18, 19]. Do detekcji i rozpoznawania Plasmodium spp można zastosować Real Time PCR. Startery amplifikują wtedy gatunkowo specyficzny region 18S rrna. Analiza krzywej wykresu topnienia bazuje na zmienności nukleotydowej wewnątrz amplifikowanego fragmentu (amplikonu), co stanowi podstawę do dokładnego rozróżnienia Plasmodium spp. Czułość tej metody wynosi 97,4%. Do ulepszenia diagnostyki (zwiększenie czułości i specyficzności) stosuje się multiplex Real Time-PCR [20-22]. Dla ułatwienia wykrywania patogenu metodą PCR z prób krwi, czy kału usuwa się inhibitory polimerazy i kondensuje się DNA. Opracowano do tego metodę immunocząsteczkowej separacji, która polega na skoncentrowaniu pasożyta we krwi i następnie użyciu go do dalszych analiz. Badania wykazały, że ilość pozytywnie zdiagnozowanych pacjentów wzrosła o 12% w przypadku, gdy próba pochodziła z krwi (1μl), a w przypadku większej ilości (10 μl) wzrastała do 20,5% [22]. Do diagnostyki molekularnej T. gondii wykorzystuje się powtórzony konserwatywny gen B1. Czułość metody wynosi 10 pasożytów/100000 leukocytów [23]. Metoda PCR umożliwia szybką i czułą diagnostykę wrodzonej toksoplazmozy. Poza tradycyjnym PCR do wykrywania ilościowego T. gondii stosuje się Real Time PCR. Technika ta jest użyteczna do rutynowego badania T. gondii w laboratoriach klinicznych w połączeniu z innymi diagnostycznymi technikami takimi jak testy serologiczne. Zastosowanie ilościowej reakcji PCR stanowi także czułą specyficzną i szybką metodę detekcji T. gondii w płynie owodniowym, krwi, tkankach i płynie mózgowo-rdzeniowym, do diagnostyki prenatalnej, oraz atypowej ocznej toksoplazmozy [24-27]. W przypadku toksoplazmozy ocznej diagnostyka metodą PCR może stanowić uzupełnienie diagnostyki w atypowych lub klinicznie niejasnych przypadkach. Wykorzystuje się do tego celu specyficzny segment rdna o wielkości 88pz [28]. Natomiast w przypadku gdy chcemy odróżnić T. gondii od blisko spokrewnionych kokcidiów, które mają podobny zasięg lub podobnych żywicieli, stosujemy ryboprinting. Molekularna diagnostyka kryptosporidiozy może opierać się także na specyficznej sekwencji genomowego DNA wielkości 452 pz. Wykorzystuje się w tym przypadku do detekcji produktu reakcji barwniki chemiluminescencyjne [2]. Technika PCR może być użyta także do identyfikacji Cryptosporidium spp w ludzkich odchodach. Metoda ta wykorzystuje tą samą specyficzną sekwencję z tą jednak różnicą, że do protokołu reakcji PCR włącza się dutp i uracylo- N-glikozydazę [29]. Metody molekularne wykorzystywane są także do detekcji oocytów C. parvum w próbkach środowiskowych. Wykorzystuje się do tego celu sekwencje kodujące małą podjednostkę 18S rrna, która daje produkt o wielkości

435 pz. W próbach środowiskowych czułość tej metody wynosi 100% [30, 31]. Technika PCR stanowi również czułe i specyficzne narzędzie w diagnostyce ameboz jelitowych. Technika ta służy między innymi do badań polimorfizmu genetycznego E. histolytica, jest też bardzo pomocna w diagnostyce pełzakowego ropnia wątroby (łać. absces sus amoebica hepatis). Gdy do ekstrakcji DNA używamy utrwalonych w formalinie okazów wtedy metodą wielokrotnego PCR można wykryć 1 trofozoit w 1 mg próby. Czułość tej metody oscyluje w granicach 94%, natomiast specyficzność wynosi 100% [32]. W przypadku gdy chcemy zidentyfikować ameby na poziomie gatunku wykorzystujemy metodę RFLP lub technikę nested PCR połączoną z hybrydyzacją typu dot-blot. Hybrydyzacja DNA, która łączy wysoko powtarzalne i gatunkowo specyficzne sekwencje E. histolytica może być także zastosowana do identyfikacji pasożytów bezpośrednio w próbach kałowych pacjenta. Metoda ta jest bardzo czuła (100%), jest ona także tania i szybka oraz może być zastosowana do badania dużej ilości prób. Metodą tą można rozpoznać wszystkie gatunki E. histolytica z wyjątkiem E. histolytica sensu lato [2, 33]. Do odróżnienia patogennej formy magna od nie patogennej formy minuta E. histolytica wykorzystywana jest sekwencja nukleotydowa małej podjednostki rrna, która jest wykorzystywana w hybrydyzacji [34]. Inną czułą (94%) i wysoce specyficzną (100%) metodą diagnostyczną jest nested multiplex PCR. Pozwala on na otrzymanie wyniku w ciągu 12h od dostarczenia próby do badania. Służy ona zarówno do diagnostyki jak i rozróżnienia gatunkowego [35]. Do diagnostyki amebozy można także zastosować Real Time PCR. Metodą tą można wykryć 10 trofozoitów w 1ml próbki. Jest ona wykorzystywana do wykrywania ameb w próbach pochodzących z odchodów. Granica detekcji wynosi 0,1 komórki na 1 gram odchodów. Także tzw. pojedynczy PCR (single rund PCR) może być wykorzystany w diagnostyce 3 gatunków ameb (E. histolytica, E. dispar, E. moshkovskii). W odróżnieniu od nested PCR, PCR-RFLP, czy PCR połączonego z hybrydyzacją dot-blot, nie wymaga on dodatkowych kroków. Metodą tą można wykryć bardzo małe ilości pasożyta (10 pg E. histolytica oraz 20 pg E. dispar). Skuteczność tej metody została także potwierdzona na innych pierwotniakach oraz bakteriach [36-38]. W przypadku N. fowleri metody diagnostyki molekularnej opierają się na starterach specyficznych dla sekwencji genu wirulencji. Pozwalają na wykrycie pojedynczej komórki pierwotniaka oraz pozwalają na identyfikacje N. fowleri z kultur pierwotnych i środowiska. Wykrywalność od 1-10 trofozoitów lub 1-10 cyst [2, 39, 40]. Do szybkiej identyfikacji N. fowleri ze środowiska oraz odróżnienia od innych blisko spokrewnionych lecz niepa- Ryc. 3. Acanthamoeba spp. trofozoity (Fot. Piotr Szilman). togennych organizmów wykorzystuje się technikę PCR- RFLP [41]. Metody z wykorzystaniem reakcji PCR są także użyteczne w diagnostyce ameb z rodzaju Acanthamoeba (Ryc. 3). Mają tu zastosowanie sekwencje pochodzące ze zmiennego regionu 26S rdna. Technika ta pozwala na wykrycie 10 komórek Acanthamoeba. Diagnostykę można także prowadzić analizując sekwencje DNA kodującego fragment lub całość podjednostki 18S r RNA. Analiza tej sekwencji wykorzystywana jest w diagnostyce zapalenia rogówki wywoływanego przez Acanthamoeba. Specyficzność tej metody jest porównywalna z metodami tradycyjnymi. Czułość wynosi od 84% do 87,5%. W diagnostyce akantameboz wykorzystuje się także techniki RAPD i RFLP [42-44]. Obiecującą metodą diagnostyki akantamebozy jest FISH. Metoda ta polega na tym, że fluorescencyjnie wyznakowana 22 nukleotydowa próba hybrydyzuje specyficznie z sekwencjami 18S rdna (specyficzna sekwencja - ST4P) wszystkich gatunków Acanthamoeba [45]. W przypadku diagnostyki molekularnej Babesia spp. wykorzystuje się sekwencje genu kodującego małą podjednostkę 16S rrna, które są wysoce konserwatywne. Czułość tej metody wynosi 3 merozoity [2, 46]. Piśmiennictwo 1. Brown TA. Genomy. Wydawnictwo Naukowe PWN. Warszawa 2009. 2. Weiss JB. DNA probes and PCR for diagnostic of parasitic infections. Clin Microbiol Rev., 1995, 8, 113-130. 3. Becker S i wsp. Real-time PCR for detection of Trypanosoma brucei in human blood samples. Diagn Microbiol Infect Dis., 2004, 50, 193-199. 4. Deborggraeve S i wsp. Molecular Dipstick Test for Diagnosis of Sleeping Sickness. J. Clin. Microbiol., 2006, 44, 2884-2889. 5. Reithiger R, Dujardin JC. Molecular diagnosis of Leishmaniasis: Current status and future applications. J. Clin. Microbiol., 2007, 45, 21-25. 6. Katakura K i wsp. Diagnosis of Kala-Azar by nested PCR based on amplification of the Leishmania miniexon gene. J. Clin. Microbiol., 1998, 36, 2173-2177. 7. Sundar S, Rai M. Laboratory diagnosis of viscelar leishmaniasis. Clin Diagn Lab Immunol., 2002, 9, 951-958.

8. Mayta H i wsp. 18S ribosomal DNA-based PCR for diagnosis of Trichomonas vaginalis. J. Clin. Microbiol., 2000, 38, 2683-2687. 9. Schwebke JR, Burgess D. Trichomoniasis. Clin Microbiol Rev., 2004, 17, 794-803. 10. Madico G i wsp. Diagnosis of Trichomonas vaginalis infection by PCR using vaginal swab samples. J. Clin. Microbiol., 1998, 36, 3205-3210. 11. Rubino S i wsp. Molecular probe for identification of Trichomonas vaginalis DNA. J. Clin. Microbiol., 1991, 29, 702-706. 12. Muresu R i wsp. A new method for identification of Trichomonas vaginalis fluorescent DNA in situ hybridization. J. Clin. Microbiol., 1994, 32, 1018-1022. 13. Abbaszadegan M, Gerba Ch, Rose JB. Detection of Giardia Cysts with cdna probe and applications to water samples. Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57, 927-931. 14. Kozak-Cięszczyk M. Diagnostyka molekularna w parazytologii. Kosmos, 2005, 54, 49-60. 15. Imirzaliogu C i wsp Diagnosis of mixed Plasmodium malariae and P. vivax infection in a development aid volunteer by examination of bone-marrow specimens by Real- Time PCR. J. Clin. Microbiol., 2006, 44, 2307-2310. 16. Chiodini PL, Moody AH. Techniques for the detection of malaria parasites. J R Soc Med., 1989, 82, 41-43. 17. McNamara D.T i wsp. Development of a multiplex PCRligase detection reaction assay for diagnosis of infection by the four parasite species causing malaria in humans. J. Clin. Microbiol., 2004, 42, 2403-2410. 18. Zhong KJY., Kain K.C. Evaluation of a colorimetric PCR-based assay to diagnose Plasmodium falciparum malaria in travelers. J. Clin. Microbiol., 1999, 37, 339-341. 19. Farcas GA i wsp. Evaluation of the RealArt malaria LC Real-Time PCR assay for malaria diagnosis. J. Clin. Microbiol., 2004, 42, 636-638. 20. Mangold KA i wasp. Real-Time PCR for detection and identification of Plasmodium spp. J. Clin. Microbiol., 2005, 43, 2435-2400. 21. Rougemont M. et al.: Detection of four Plasmodium species in blood from humans by 18S rrna gene subunit-based and species-specific Real-Time PCR assays. J. Clin. Microbiol., 2004, 42, 5636-5643. 22. Seesod N i wsp. Immunomagnetic purification to facilitate DNA diagnosis of Plasmodium falciparum. J. Clin. Microbiol., 1993, 31, 2715-2719. 23. Burg JL i wsp. Direct and sensitive detection of a pathogenic protozoan, Toxoplasma gondii, by polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 1989, 27, 1787-1792. 24. Grover ChM i wsp. Rapid prenatal diagnosis of congenital Toxoplasma infection by using polymerase chain reaction and amniotic fluid. J. Clin. Microbiol., 1990, 28, 2297-2301. 25. Lin M-H i wsp. Real-Time PCR for quantitative detection of Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol., 2000, 38, 4121-4125. 26. Reishl U i wsp. Comparison of two DNA targets for the diagnosis of Toxoplasmosis by real-time PCR using fluorescence resonance energy transfer hybridization probes. BCM Infections Diseases, 2003, 3, 7. 27. Simon A i wsp. Use of fluorescence resonance energy transfer hybridization probes to evaluate quantitative Real-Time PCR for diagnosis of ocular Toxoplasmosis. J. Clin. Microbiol., 2004, 42, 3681-3685. 28. Aouizerate F i wsp. Detection of Toxoplasma gondii in aqueous humour by the polymerase chain reaction. BJO., 1993, 77, 107-109. 29. Gobet P i wsp. Detection of Cryptosporidium parvum DNA in formed human feces by a sensitive PCR-based assay including Uracil-N-Glycosylase inactivation. J. Clin. Microbiol., 1997, 35, 254-256. 30. Johnson DW i wsp. Development of a PCR protocol for sensitive detection of Cryptosporidium oocysts in water samples. Appl. Environ. Microbiol., 1995, 61, 3849-3855. 31. Morgan UM i wsp. Comparison of PCR and microscopy for detection of Cryptosporidium parvum in human fecal specimens: clinical trial. J. Clin. Microbiol., 1998, 36, 995-998. 32. Tanyuksek M, Petri A JR. Laboratory diagnosis of amebiasis. Clin Microbiol Rev., 2003, 16, 713-729. 33. Samuelson J i wsp. DNA hybridization probe for clinical diagnosis of Entamoeba histolytica. J. Clin. Microbiol., 1989, 27, 671-676. 34. Que X, Reed SL. Nucleotide sequence of small subunit ribosomal RNA (16S-like rrna) gene from Entameoeba histolytica: differentiation of pathogenic from nonpathogenic isolates. Nucl. Acids Res., 1991, 19, 5438. 35. Khairnar K, Parija S.C. A novel nested multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay for differential detection of Entamoeba histolytica, E. moshkovski and E. dispar DNA in stool samples. BCM Microbiology, 2007, 7: 47. 36. Roy S i wsp. Real-Time-PCR assay for diagnosis of Entamoeba histolytica infection. J. Clin. Microbiol., 2005, 43, 2168-2172. 37. Blessmann J i wsp. Real-Time PCR for detection and differentiation of Entamoeba histolytica and Entamoeba dispar in fecal samples. J. Clin. Microbiol., 2002, 40, 4413-4417. 38. Hamzah Z i wsp. Differential detection of Entamoeba histolytica, Entamoeba Dispar, and Entamoeba moshkovskii by a single-round PCR assay. J. Clin. Microbiol., 2006, 44, 3196-3200. 39. Sparagano O. Detection of Naegleria fowleri cysts in environmental samples by using a DNA probe. FEMS Microbiol Lett., 1993, 112, 349-351. 40. Kivington S, Beeching J. Development of a PCR for identification of Naegleria fowleri from the environment. Appl. Environ. Microbiol., 1995, 61, 3764-3767. 41. Kivington S, Beeching J. Identification and epidemiological typing of Naegleria fowleri with DNA probes. Appl. Environ. Microbiol., 1995, 61, 2071-2078. 42. Lehmann OJ i wsp. Polymerase chain reaction analysis of corneal epithelial and tear samples in the diagnosis of Acanthamoeba keratitis. Invest Ophthamol Vis Sci., 1998, 39, 1261-1265. 43. Pasricha G i wsp. Use of 18S rrna gene-based PCR assay for diagnosis of Acanthamoeba keratitis in noncontact lens wearers in India. J. Clin. Microbiol. 2003, 41, 3206-3211.

44. Marciano-Cabral F, Cabral G. Acanthamoeba spp. As agents of disease in humans. Clin Microbiol Rev., 2003, 16, 273-307. 45. Stothard DR i wsp. Fluorescent oligonucleotide probes for clinical and environmental detection of Acanthamoeba and the T4 18S rrna gene sequence type. J. Clin. Microbiol., 1999, 37, 2687-2693. Persing DH i wsp. Detection of 46. Babesia microti by Polymerase Chain Reaction. J. Clin. Microbiol., 1992, 30, 2097-2103. Adres do korespondencji: mgr Marek Asman Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Zakład Parazytologii ul. Jedności 8, 41-218 Sosnowiec tel.: +48 32 364 11 90 e-mail: masman@sum.edu.pl