Standardy badania parazytologicznego-wybrane aspekty

Transkrypt

1 Standardy badania parazytologicznego-wybrane aspekty Diagnostyka parazytologiczna jest ważnym elementem potwierdzenia przypadku zarażenia danym pasożytem oraz wdrożenia skutecznego leczenia. Wykorzystywane są metody mikroskopowe, serologiczne, molekularne oraz hodowla in vitro i/lub in vivo. Każde laboratorium zajmujące się diagnostyką parazytologiczną powinno opracować i wdrożyć odpowiednie procedury badawcze oraz udostępnić zleceniodawcom instrukcje dotyczące badania (przygotowanie pacjenta do badania, pobieranie materiału, warunki przechowywania, transportu). Do badań parazytologicznych, w zależności od gatunku oraz poszukiwanej formy rozwojowej pasożyta, można użyć następujących materiałów diagnostycznych: -kału -odcisku/wymazu okołoodbytniczego -krwi -moczu -wydzieliny z dróg moczowo-płciowych popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowe -plwociny -płynu mózgowo-rdzeniowego -treści dwunastniczej -aspiratów z torbieli wątroby -ropni wątroby/płuc -materiału z gruczołów limfatycznych, szpiku, śledziony -materiału aspirowanego ze zmian skórnych -materiału tkankowego -innych

2 Badanie kału Kał pobiera się przed rozpoczęciem leczenia lub po 1-3 tygodniach od zakończenia leczenia. Materiał powinien zostać oddany do czystego, suchego papierowego woskowanego naczynia lub naczynia z tworzywa sztucznego, ewentualnie na papier, a następnie pobrany patyczkiem z 2-3 miejsc do właściwego pojemnika, wypełnionego maksymalnie do 2/3 objętości. Zaleca się trzykrotne wykonanie badania kału w odstępach 2-3 dniowych w przeciągu 10 dni. Taki sposób postępowania znacznie podnosi prawdopodobieństwo wykrycia pasożytów, przede wszystkim nieregularnie wydalanych cyst pierwotniaków. W przypadku badania wymazu okołoodbytniczego w kierunku owsika ludzkiego (Enterobius vermicularis) materiał pobiera się z okolic odbytu po rozchyleniu fałdów skórnych rano, przed myciem i oddaniem kału. Wymaz pobiera się w odstępach 3-5 dniowych za pomocą przylepca celofanowego (metoda Grahama), bagietki z celofanem (metoda Halla) lub wykorzystując wymazówkę z parafiną i wazeliną. Po pobraniu należy materiał niezwłocznie dostarczyć do laboratorium. Transportować w temperaturze pokojowej lub schłodzone (w przypadku poszukiwania koproantygenów). W przypadku kału uformowanego materiał może zostać zbadany do 72 godzin od momentu pobrania, przy czym do tego czasu powinien być przechowywany w temperaturze lodówki. Dłuższe przechowywanie umożliwia stosowanie odpowiednich utrwalaczy. Kał wodnisty lub po środkach przeczyszczających należy zbadać do 30 minut, kał luźny do 60 minut od pobrania (poszukiwanie trofozoitów pierwotniaków). Badanie powinno obejmować zarówno ocenę makroskopową (konsystencja kału, obecność śluzu, krwi, postaci dorosłych lub fragmentów pasożytów) jak i mikroskopową (możliwe: preparat w soli fizjologicznej, preparat podbarwiany płynem Lugola, preparaty zagęszczane metoda sedymentacji lub flotacji, preparat gruby wg Kato i Miura, preparat trwale

3 barwiony, hodowla in vitro). Informacje zawarte na wyniku badania parazytologicznego powinny obejmować nazwę gatunkową pasożyta wraz z jego postacią rozwojową, wskazanie przybliżonej liczby postaci rozwojowych pasożyta (mało-poniżej 2 w 10 polach widzenia, średnio- 3-9 w 10 polach widzenia, dużo-powyżej 10 w 10 polach widzenia), określenie innych struktur mogących świadczyć o patologii (np. erytrocyty, włókna mięsne, kule tłuszczu, makrofagi), formę jaja glisty ludzkiej (gdy stwierdzono obecność-jajo zapłodnione lub niezapłodnione) oraz żywotność jaj Schistosoma (gdy stwierdzono obecność- żywe lub martwe). Badanie krwi Krew pobiera się przed rozpoczęciem leczenia, natomiast w przypadku podejrzenia malarii lub babeszjozy materiał pobiera się natychmiast bez względu na stosowanie środków farmakologicznych. Gdy lekarz podejrzewa leiszmaniozę lub filariozę materiał można pobrać w późniejszym czasie. Przy badaniu w kierunku malarii, jeżeli w pierwszej próbie nie wykryto zarodźców malarii, badania wykonuje się przez kolejne 3 dni co 6 do 8 godzin. Przy badaniu w kierunku wiciowców tkankowych częstotliwość badań to raz dziennie przez kolejne 3 dni. W przypadku badań w kierunku filariozy zwykle pobiera się materiał co 8 do 12 godzin przez 3 kolejne dni. Rozmazy krwi obwodowej (preparat w soli fizjologicznej, cienki rozmaz krwi, gruba kropla krwi) powinny zostać wykonane do 30 minut od pobrania i przechowywane w temperaturze pokojowej. W diagnostyce stosuje się także metodę zagęszczania mikrofilarii (wg Knott a lub z zastosowaniem filtrów membranowych). Do barwienia rozmazów stosuje się zwykle odczynnik Giemzy lub Wrighta, cienkie rozmazy można barwić metodą May-Grunwald- Giemza, natomiast w barwieniu mikrofilarii znajduje zastosowanie hematoksylina i eozyna. Na wyniku badania mikroskopowego pasożytów powinny się znaleźć

4 podstawowe informacje jak wyżej wymienione, natomiast parazytemię wyraża się w % zarażonych krwinek lub liczbie pasożytów w 1 µl krwi (inne: Plasmodium-ilość pasożytów na 200 leukocytów; mikrofilarie-ilość w 1 ml krwi). Badanie moczu lub wydzieliny z dróg rodnych Mocz pobiera się jako materiał diagnostyczny w kierunku Schistosoma haematobium, trofozoidów Trichomonas vaginalis, Dioctophyma renale oraz mikrofilarii. W kierunku T.vaginalis można także wykorzystać badanie wymazu z pochwy lub szyjki macicy. W przypadku badania w kierunku S.haematobium należy pobrać ml moczu (bardzo ważny jest końcowy strumień) lub zastosować DZM. Zaleca się trzykrotne pobranie w godzinach od do lub po wysiłku. Przechowywanie materiału i jego transport powinien odbywać się w temperaturze lodówki. W badaniu wykonuje się z odwirowanego moczu preparat bezpośredni lub filtrowany przez filtry membranowe (8 µm). W przypadku badania w kierunku T.vaginalis pobiera się tzrykrotnie początkowy strumień moczu. Ocenia się rozmaz bezpośredni oraz barwiony. Wymaz z pochwy ocenia się wykonując preparat w soli fizjologicznej oraz preparat barwiony (Giemzą, trichromem lub hematoksyliną, ewentualnie błękitem metylenowym, zielenią malachitową). Zakłada się również hodowlę in vitro na podłużu Roiron, Diamond a lub Simitch a. Badania immunologiczne W parazytologicznej diagnostyce immunologicznej wykorzystuje się: wykrywanie przeciwciał w surowicy, które są produkowane przez żywiciela po kontakcie z pasożytem (podejrzenie toksokarozy, bąblowicy, wągrzycy, włośnicy, fascjolozy, malarii, leiszmaniozy trzewnej, filarioz, schostosomozy czy paragonimozy)

5 -wykrywanie swoistych przeciwciał w płynach ustrojowych (podejrzenie parazytozy OUN, postaci ocznej toksoplazmozy czy toksokarozy) wykrywanie antygenów we krwi (Malaria test) -wykrywanie antygenów w kale (Giardia, Cryptosporidium, Entamoeba histolytica) -wykrywanie cyst/oocyst Giardia oraz Cryptosporidium metoda IF bezpośredniej W przypadku podejrzenia parazytozy, zwłaszcza pozajelitowej, dobrym uzupełnieniem diagnostyki jest badanie w surowicy swoistych przeciwciał w klasie IgG, IgM, IgA czy IgE. Zwykle pobiera się około 3-4 ml krwi na skrzep. Tak uzyskaną surowicę należy schłodzić i dostarczyć do 24 godzin do laboratorium. W przypadku poszukiwania antygenów pasożytów wykorzystuje się jako materiał diagnostyczny kał lub krew pobraną na EDTA. Diagnostyka molekularna Badania molekularne wykorzystuje się w diagnostyce parazytologicznej jeżeli intensywność zakażenia jest poniżej progu wykrywalności metod mikroskopowych, celem różnicowania gatunków bliźniaczych, celem potwierdzenia rozpoznania lub okreslenia lekooporności pasożyta. Wykorzystuje się kilka technik: PCR, RT-PCR, LAMP oraz FISH. Badania molekularne prowadzone są przy podejrzeniu: toksoplazmozy wrodzonej (płyn owodniowy) w trudnościach diagnostycznych malarii (krew, szpik) różnicowanie Entamoeba histolytica, E.dispar oraz

6 E.moshkovskii (kał) diagnozowanie bąblowicy wielojamowej (tkanka) inne Hodowla in vitro i in vivo W diagnostyce parazytologicznej stosuje się hodowle in vitro w celu zwiększenia wykrywalności pewnych gatunków pierwotniaków i helmintów oraz różnicowania niektórych larw filariopodobnych. Na odpowiednich podłożach istnieje możliwośc hodowli T.vaginalis, Entamoeba spp., Balantidium coli, Acanthamoeba spp., Naegleria spp., Leishmania spp., T.cruzi, T.gondii, Ancylostoma, Strongyloides. W hodowli in vivo na myszach można wyhodować T.cruzi, T.gondii, Trichinella spp., na szczurach T.gambiense, T.rhodesiensae, na chomikach Leishamania spp. Każde laboratorium zajmujące się diagnostyką parazytologiczną powinno opracować i wdrożyć odpowiednie procedury badawcze Możliwości diagnostyki parazytoz rodzimych i tropikalnych są coraz szersze. Jednych z najważniejszych elementów wykrywania chorób pasożytniczych jest wybranie odpowiedniego materiału do badań. W związku z faktem, iż w ciągu ostatnich kilkunastu lat znacznie zwiększyła się ilość podróży zagranicznych, należy pamiętać, że wzrosło również prawdopodobieństwo zarażenia się pasożytami z rejonów tropikalnych i subtropikalnych, i nie zapominać o uwzględnieniu ich w dochodzeniu diagnostycznym.

7 Opracowano na podstawie: Myjak P. i wsp. Standardy w zakresie laboratoryjnych czynności w parazytologii medycznej, oceny ich jakości i wartości diagnostycznej oraz laboratoryjnej interpretacji i autoryzacji wyników badań. Diagnostyka laboratoryjna 2011; 3(47):