JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

TOM 6 NUMER 2 KWIECIEŃ 2008 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY PRACA ORYGINALNA Liczba kopii genu naskórkowego czynnika wzrostu a wyniki kliniczne w leczonym panitumumabem przerzutującym raku jelita grubego André Sartore-Bianchi, Mauro Moroni, Silvio Veronese, Carlo Carnaghi, Emilio Bajetta, Gabriele Luppi, Alberto Sobrero, Carlo Barone, Stefano Cascinu, Giuseppe Colucci, Enrico Cortesi, Michele Nichelatti, Marcello Gambacorta i Salvatore Siena Ospedale Niguarda Ca Granda; Istituto Nazionale Tumori, Milan; Istituto Clinico Humanitas, Rozzano; Università Modena e Reggio Emilia, Modena; Ospedale San Martino, Genova; Policlinico Gemelli, Università Cattolica, Policlinico Umberto I, Università La Sapienza, Rome; Università Politecnica Marche, Ancona; and Istituto Tumori Giovanni Paolo II, Bari, Italy. Otrzymano 10 marca 2007, zaakceptowano 8 maja 2007. Finansowane z grantów badawczych Associazione Italiana Ricerca Cancro i Oncologia Ca Granda ONLUS Fondazione. A. S.-B., M. M. i S. V. w takim samym stopniu przyczynili się do powstania tej pracy. Oświadczenie na temat potencjalnych konfliktów interesów oraz wkładu poszczególnych autorów zamieszczono na końcu artykułu. Prośby o przedruki należy adresować: Salvadore Siena, MD, Divisione Oncologia Falck, Ospedale Niguarda Ca Granda, Piazza Ospedale Maggiore 3, 20162 Milan, Italy; e-mail: salvatore.siena@ospedaleniguarda.it. 2007 by American Society of Clinical Oncology 0732-183X/07/2522-3238/$20.00 DOI: 10.1200/JCO.2007.11.5956 S T R E S Z C Z E N I E Cel W przeprowadzonym przez nas poprzednim badaniu sugerowaliśmy, że odpowiedź na leczenie przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu (epidermal growth factor receptor, EGFR) obserwowana w przerzutującym raku jelita grubego (metastatic colorectal cancer, mcrc) ma podstawy genetyczne i jest powiązana ze zwiększoną liczbą kopii genu (gene copy number, GCN) EGFR mierzoną z wykorzystaniem metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (fluorescence in situ hybridization, FISH) w poszczególnych nowotworach. Obecne badanie miało na celu określenie wartości predykcyjnej GCN EGFR, ocenionej w kontekście wyników klinicznych pacjentów leczonych panitumumabem. Chorzy i metody Pacjenci z mcrc opornym na standardowe terapie, stanowiący podgrupę uczestników z badania III fazy porównującego skuteczność panitumumabu skojarzonego z najlepszym leczeniem objawowym ([best supportive care, BSC] n = 58) względem wyłącznie BSC (n = 34), zostali wybrani na podstawie dostępności próbek nowotworu do badania FISH. Wyniki W grupie pacjentów leczonych panitumumabem średnia liczba kopii EGFR niższa niż 2,5/jądro lub polisomia chromosomu 7 obserwowana w mniej niż 40% komórek nowotworowych były czynnikami predykcyjnymi krótszego czasu przeżycia bez progresji (progression-free survival, PFS; odpowiednio P = 0,039 i P = 0,029) i przeżycia całkowitego (overall survival, OS; odpowiednio P = 0,015 i P = 0,014). U żadnego pacjenta leczonego panitumumabem wykazującego średnią liczbę kopii EGFR poniżej 2,47/jądro lub frakcję komórek nowotworowych wykazujących polisomię chromosomu 7 niższą niż 43% nie odnotowano obiektywnej odpowiedzi na leczenie. W przeciwieństwie do tego u sześciu na 20 i sześciu na 19 pacjentów z odpowiednimi wartościami wyższymi niż wymienione wartości graniczne (odpowiednio P = 0,0009 i P = 0,0007) odnotowano korzyść terapeutyczną. Ocena pacjentów z grupy BSC bez leczenia wykazała brak korelacji między GCN EGFR lub stanem polisomii chromosomu 7 a PFS. Wnioski Wyniki otrzymane w większej i bardziej jednorodnej niż w poprzednich badaniach grupie sugerują, że pacjenci z mcrc, których nowotwór w analizie metodą FISH wykazuje jednorodną disomię genu EGFR lub niski poziom polisomii chromosomu 7, mają mniejsze prawdopodobieństwo odpowiedzi na panitumumab. J Clin Oncol 25:3238 3245. 2007 przez Amerykańskie Towarzystwo Onkologii Klinicznej WSTĘP Przeciwciało monoklonalne (moab) panitumumab skierowane przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu (epidermal growth factor receptor, EGFR) skutecznie przedłuża przeżycie pacjentów z przerzutującym rakiem jelita grubego (metastatic colorectal cancer, mcrc) po niepowodzeniu konwencjonalnej chemioterapii. 1,2 Dane kliniczne sugerują, że u około 10% pacjentów uzyskuje się obiektywną odpowiedź na leczenie moab przeciwciałem anty-egfr. 1-3 Dlatego możliwość identyfikacji pacjentów, którzy mogą skorzystać z terapii moab anty-egfr, staje się coraz bardziej istotna dla poprawy strategii terapeutycznych, jak również dla zmniejszenia obciążenia finansowego systemu opieki zdrowotnej. 4 W poprzednich badaniach wykazaliśmy, że wśród pacjentów z mcrc obiektywną odpowiedź na przeciwciała moab skierowane przeciwko EGFR cetuksymab i panitumumab otrzymuje się w podgrupie pacjentów z podwyższoną liczbą kopii genu 112

Liczba kopii genu EGFR w raku jelita grubego EGFR, stwierdzoną metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (fluorescent in situ hybridization, FISH). 5 Predykcyjna rola liczby kopii EGFR w mcrc była następnie oceniana w kolejnych badaniach, w których wykazano jej związek z obiektywną odpowiedzią na leczenie 6 i przeżyciem całkowitym (overall survival,os) 7 po leczeniu cetuksymabem. Niemniej jednak z powodu częściowych rozbieżności i problemów technicznych z odtwarzalnością, 7 a także na skutek niejednorodności i niedostatecznej liczby ocenianych pacjentów, nie udało się do tej pory wprowadzić do badań klinicznych testu predykcyjnego umożliwiającego wyselekcjonowanie kandydatów odpowiednich do leczenia moab anty-egfr. Niniejsze badanie przeprowadzono w celu wyjaśnienia predykcyjnej roli liczby kopii genu EGFR w kontekście obiektywnej odpowiedzi na leczenie, czasu przeżycia bez progresji (progression-free survival, PFS) i przeżycia całkowitego (OS), u pacjentów poddanych monoterapii panitumumabem. Analizę przeprowadzono w większej i bardziej jednolitej niż w poprzednich badaniach grupie pacjentów uczestniczących w randomizowanym badaniu III fazy porównującym działanie panitumumabu skojarzonego z najlepszym leczeniem objawowym (best supportive care, BSC) względem samego BSC w tych przypadkach mcrc, w których zanotowano niepowodzenie trybu leczenia fluoropirymidyną, oksaliplatyną i irynotekanem. 1-2 Możliwość porównania wyników leczenia z wynikami leczenia w grupie pacjentów, u których zastosowano jedynie BSC, pozwoliła na oszacowanie roli liczby kopii genu EGFR jako czynnika prognostycznego. CHORZY I METODY Chorzy Oceniliśmy próbki nowotworów pobranych od 64 pacjentów z mcrc leczonych w dziewięciu ośrodkach we Włoszech zgodnie z 408. randomizowanym, otwartym badaniem III fazy dla panitumumabu (Amgen, Thousand Oaks, CA) oraz 194. otwartym badaniem panitumumabu. U wszystkich tych pacjentów progresja mcrc wystąpiła w czasie lub po standardowym leczeniu. Immunohistochemicznie stwierdzono u nich ekspresję EGFR, ale informacje na ten temat opublikowano w innym miejscu. 1,2 Grupa pacjentów do niniejszego badania została wybrana spośród 92 pacjentów zrekrutowanych z całych Włoch na podstawie dostępności tkanek nowotworowych odpowiednich do analizy typu FISH. Odpowiedź lub oporność nowotworu na leczenie były określane radiologicznie przez badaczy zgodnie z Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST). Pacjenci wyrazili pisemną zgodę na analizę EGFR oraz przyjmowanie założonego w badaniu leczenia. Badanie zostało zatwierdzone przez komisje ds. etyki w poszczególnych ośrodkach (nowelizacja 4). Związek między liczbą kopii EGFR a obiektywną odpowiedzią na leczenie, PFS i OS zostały ocenione u 58 pacjentów (33 mężczyzn i 25 kobiet; mediana wieku 61 lat; zakres od 44 do 78 lat), którzy otrzymywali panitumumab (badanie 408 lub badanie 194), oraz u 34 pacjentów (21 mężczyzn i 13 kobiet; mediana wieku 61 lat; zakres od 44 do 76 lat), początkowo losowo przydzielonych do ramienia BSC badania 408. W drugiej grupie oceniano jedynie PFS. Wśród 58 pacjentów leczonych panitumumabem 30 otrzymywało go od początku badania. Pozostałych 28 pierwotnie przydzielonych do ramienia BSC otrzymało panitumumab w następstwie progresji nowotworu (w badaniu 194). Wśród 34 pacjentów, którzy byli analizowani w trakcie BSC, sześciu nie przeszło do ramienia panitumumabu. Tak więc dane od 28 pacjentów, którzy przeszli do ramienia panitumumabu, były analizowane dwukrotnie pod względem związku między liczbą kopii genu a obrazem klinicznym (z leczeniem i bez leczenia panitumumabem; Ryc. 1). Całkowity okres narażenie na zgon dla OS wynosił 439 osobomiesięcy, mediana czasu obserwacji wynosiła 7,1 miesiąca (zakres od 0,8 do 17,7 miesiąca); łączny czas narażenia na zgon dla PFS wynosił 183,5 miesiąca, z medianą czasu obserwacji 1,8 miesiąca (zakres od 0,8 do 11,2 miesiąca). Wśród pacjentów leczonych panitumumabem (n = 58) u sześciu (10,4%) uzyskano obiektywną odpowiedź na leczenie (jedna odpowiedź całkowita i pięć częściowych), u 14 (24,1%) osiągnięto stabilizację choroby, a u 38 (65,5%) nastąpiła progresja. Wśród pacjentów, w przypadku których stosowano wyłącznie BSC (n = 34), u dwóch (5,9%) choroba po 8 tygodniach miała przebieg stabilny, a u 32 (94,1%) zanotowano progresję. Wynik ten jest reprezentatywny dla oczekiwanych korzyści klinicznych stosowania panitumumabu zaobserwowanych zarówno w podstawowym badaniu III fazy 408 (ogólny odsetek odpowiedzi na leczenie wynosił 10%; PFS wynosił 8 tygodni, a OS 6,4 miesiąca), jak też w badaniu kontynuacyjnym 194 (ogólny odsetek odpowiedzi na leczenie 11,6%; PFS wynosił 9 tygodni, a OS 6,3 miesiąca). 1,2 Analiza liczby kopii genu EGFR metodą FISH Cienkie skrawki tkanek (2 \m) inkubowano w roztworze wstępnym przez 10 minut w 96 C, następnie pozostawiono je Ryc. 1 Nabór pacjentów do leczenia. Chorzy z przerzutującym rakiem jelita grubego opornym na standardowe leczenie byli podgrupą pacjentów włączonych do III fazy badania klinicznego 408 panitumumabu skojarzonego z najlepszym leczeniem objawowym (BSC) względem wyłącznie BSC. 1 Dwudziestu ośmiu spośród 34 pacjentów, którzy zostali losowo przypisani do ramienia BSC badania, na skutek progresji choroby uzyskało zgodę na otrzymywanie panitumumabu w badaniu kontynuacyjnym 194. 2 www.jco.org 113

Sartore-Bianchi i wsp. Tabela 1. Obiektywna odpowiedź na leczenie i liczba kopii genu EGFR oznaczona metodą FISH w nowotworach u pacjentów z przerzutującym rakiem jelita grubego leczonych panitumumabem Iloraz liczby kopii genu EGFR Analiza FISH Nr pacjenta CEP7 Jądro Polisomia chromosomu 7 (%) Najlepsza obiektywna odpowiedź 1 1,13 2,47 50 PR 2 1,03 3,29 75 PR 3 1,01 4,04 85 SD 4 1,10 3,84 70 PR 5 1,03 3,67 65 PR 6 1,04 1,88 0 SD 7 1,06 2,16 0 SD 8 1,00 3,48 85 PD 9 1,00 2,76 55 SD 10 0,91 1,70 0 PD 11 1,02 2,00 0 PD 12 1,03 2,00 0 PD 13 1,18 2,10 0 PD 14 0,92 1,90 0 PD 15 1,00 1,88 0 PD 16 0,99 1,90 0 PD 17 0,97 1,68 0 PD 18 0,94 1,60 0 PD 19 0,91 1,78 5 PD 20 0,97 1,73 0 PD 21 1,08 1,98 0 PD 22 1,01 3,51 85 PD 23 1,04 2,37 40 PD 24 0,90 1,84 0 SD 25 0,90 1,84 0 SD 26 1,00 1,67 0 PD 27 0,81 1,50 0 PD 28 1,05 1,65 0 PD 29 1,05 2,10 5* SD 30 0,97 1,20 0 PD 31 1,03 2,50 43 PR 32 0,96 1,34 0 PD 33 1,02 3,23 65 CR 34 0,98 2,23 10 PD 35 1,01 3,38 75 PD 36 1,21 2,72 50 PD 37 1,05 2,70 50 PD 38 1,01 3,68 90 SD 39 1,01 2,85 65 SD 40 1,09 2,00 0 PD 41 1,01 2,01 10 PD 42 1,03 1,80 10 SD 43 1,00 1,79 0 PD 44 1,03 3,26 80 PD 45 1,03 2,00 15 SD 46 1,03 3,03 65 PD 47 1,05 3,32 75 SD 48 1,10 1,97 0 PD 49 1,04 2,02 20 SD 50 1,07 3,64 65 PD 51 1,02 2,40 38 PD 52 0,97 1,88 0 PD 53 0,97 1,70 0 PD 54 1,09 1,62 0 SD 55 1,01 2,29 40 PD 56 1,03 2,20 5* PD 57 1,07 2,57 40 PD 58 1,11 2,12 15 PD UWAGA. Status genu EGFR został oceniony jako średnia liczby kopii genu EGFR/jądro, jako średnia liczby kopii genu EGFR/CEP7 (patrz Chorzy i metody) oraz jako procentowa frakcja z polisomią chromosomu 7 (" 3 sygnałów na jądro) na podstawie obserwacji 200 komórek nowotworowych. Odpowiedź na leczenie była określana zgodnie z Response Evaluation Criteria in Solid Tumors. Skróty: EGFR receptor naskórkowego czynnika wzrostu; FISH fluorescencyjna hybrydyzacja in situ; CEP7 sonda R-centromeryczna do chromosomu 7; PR odpowiedź częściowa; SD stabilizacja choroby; PD progresja choroby; CR odpowiedź całkowita. *Ogniskowy obszar amplifikacji. 114 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

Liczba kopii genu EGFR w raku jelita grubego w tym samym roztworze na 30 minut do schłodzenia w temperaturze pokojowej. Po przepłukaniu roztworem buforowym preparat inkubowano w roztworze pepsyny przez 30 minut w37 C. Skrawki tkanek były następnie wybarwiane roztworem jodku propidyny (0,6 \g/ml; QBiogene, Irvine, CA) w celu określenia, czy jądra komórkowe komórek nowotworowych zostały wystarczająco strawione, aby otrzymać optymalną przepuszczalność dla sond. Jeśli trawienie enzymatyczne uznano za niewystarczające, kolejne etapy trawienia tkanek przeprowadzano co 15 minut. Dwukolorowa, dwuobiektowa analiza FISH została wykonana w sposób opisany wcześniej. 4 Analizę przeprowadzono z użyciem mikroskopu fluorescencyjnego Imager Z1 (Zeiss, Gottingen, Niemcy). Do zbierania i obróbki zdjęć użyto ISIS FISH System (Meta-Systems, Altlussheim, Niemcy). Gen EGFR, który znajduje się na krótszym ramieniu chromosomu 7, został uwidoczniony jako czerwony sygnał za pomocą filtra do izotiocyjanianu tetrametylorodaminy, podczas gdy sonda R-centromeryczna do chromosomu 7 (CEP7) została uwidoczniona jako sygnał zielony za pomocą filtra do izotiocyjanianu fluoresceiny, a jądra komórkowe jako niebieski sygnał za pomocą filtra do 4,6-diamino-2-fenyloindolu. Reprezentatywne zdjęcia próbek zostały otrzymane za pomocą kamery cyfrowej CV-M4 o podwójnej szybkości z megapikselową matrycą i progresywnym skanowaniem (Jai Europe, Kopenhaga, Dania) jako obrazy monochromatyczne, które następnie nałożono na siebie przy użyciu oprogramowania ISIS. Co najmniej 200 nienakładających się jąder interfazowych zostało zanalizowanych pod względem liczby kopii EGFR oraz CEP7 w powiększeniu 400, po początkowym podglądzie na powiększeniu 200 w celu określenia wzoru fluorescencji. Status genu EGFR określono jako średnią liczbę czerwonych sygnałów EGFR na jądro oraz jako stosunek czerwonych sygnałów EGFR do zielonych sygnałów CEP7. Prawidłową kontrolę stanowiła linia nabłonkowych komórek pigmentowych siatkówki oraz pobrana od każdego pacjenta normalnie wyglądająca błona śluzowa jelita grubego przylegająca do zmiany nowotworowej. Kontrolą dodatnią dla amplifikacji EGFR była linia A431. Wyniki kliniczne 10 pacjentów, których opisano w poprzednim badaniu 4 z użyciem innej metodologii FISH, były znane patologom przed wykonaniem niniejszej analizy. Polisomię genu EGFR stwierdzano w przypadku zanotowania zwiększonej ponad normę liczby sygnałów czerwonych EGFR (" trzech sygnałów na jądro), któremu towarzyszyło zwiększenie liczby kopii chromosomu 7 (na którym znajduje się gen EGFR) mierzonej za pomocą zielonych sygnałów CEP7 na jądro. Analiza statystyczna Omawiane badanie było promowane przez centrum koordynacji testów panitumumabu 408 i 194 we Włoszech. Udział w badaniu zaproponowano 10 ośrodkom rekrutacyjnym, dziewięć z nich dostarczyło 64 próbki z grupy 92 pacjentów uczestniczących w badaniu we Włoszech. Liczebność badanej próby została zdeterminowana przez największą liczbę pacjentów włączonych do badania, u których dostępne były fragmenty guza nadające się do badań FISH. Wszystkie dane zostały wstępnie zanalizowane i opisane za pomocą średniej i odchylenia standardowego lub za pomocą mediany i zakresu, w zależności od ich rozkładu. Punkty końcowe binarne były analizowane metodą jednowymiarowej regresji logistycznej; modele oceniono testem ilorazu wiarygodności i za pomocą ich wartości pseudo- R 2, podczas gdy poziom istotności każdej niezależnej zmiennej oceniono testem Walda. Do analizy niezależnych zmiennych binarnych wykorzystano następnie tabulację krzyżową i do- Ryc. 2. Przykładowe wyniki analizy metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) pokazujące następujące wzory mikroskopowe (powiększenie 200 ): (A) nieobecność dodatkowych kopii genu EGFR i jednorodny wzór disomii (pacjent 48); (B) podwyższenie liczby kopii genu EGFR na skutek polisomii chromosomu 7 (pacjent 4); (C) ogniskowa amplifikacja genu EGFR w mniej niż 5% komórek nowotworowych (pacjent 29). www.jco.org 115

Sartore-Bianchi i wsp. kładny test Fishera. Wszystkie testy statystyczne były dwustronne. Występowanie zdarzeń w czasie oszacowano za pomocą estymatora Kaplana-Meiera, równość funkcji przeżycia oceniono następnie za pomocą testu log-rank. Dla pacjentów przyjmujących panitumumab OS zdefiniowano jako czas od losowego przypisania do ramienia panitumumabu w badaniu 408, a dla tych, którzy dołączyli do ramienia panitumumabu później, od opcjonalnego przejścia do badania 194 do zgonu z dowolnej przyczyny; pacjenci, którzy w chwili oceny nadal żyli, nie byli brani pod uwagę; PFS został zdefiniowany jako czas od przypisania do określonego protokołu do momentu progresji nowotworu. Dla pacjentów z ramienia otrzymującego wyłącznie BSC PFS był definiowany jako czas od losowego przypisania do tego ramienia badania 408 do progresji. Na podstawie analizy krzywej charakterystyki roboczej odbiorcy (receiver operating characteristic, ROC) wyznaczono prawdopodobną wartość odcięcia dla zmiennej ciągłej liczby kopii EGFR; dla każdej wielkości wyznaczono procentowe wartości czułości, swoistości i łącznej dokładności. Analizy wykonano na poziomie istotności P! 0,05; wszystkie obliczenia przeprowadzono za pomocą oprogramowania STATA SE 9.2 (STATA Corp, College Station, TX) w środowisku Windows XP (Microsoft, Redmond, WA). WYNIKI Wyniki analizy amplifikacji genu EGFR, przeprowadzonej metodą FISH, u 58 pacjentów z mcrc leczonych panitumumabem zestawiono w Tabeli 1. Pokazano również średnie wartości liczby kopii EGFR i procentowy udział komórek wykazujących polisomię chromosomu 7 (gen EGFR/jądro " 3) i/lub amplifikację genu EGFR (liczby kopii genu EGFR/CEP7 " 2). Żaden z nowotworów nie wykazywał jednorodnej amplifikacji genu EGFR, natomiast u dwóch pacjentów znaleziono ogniskowe obszary amplifikacji w # 5% powierzchni guza. Ryc. 2 przedstawia reprezentatywny wzór sygnału EGFR oceniony metodą FISH. Hipoteza dotycząca związku między liczbą kopii EGFR a obiektywną odpowiedziąnapanitumumabzostaławstępnieoszacowana metodą regresji logistycznej. Wykazano istotną statystycznie, dodatnią zależność między podwyższeniem średniej liczby kopii EGFR a prawdopodobieństwem odpowiedzi na lek (iloraz szans = 5,62; 95% przedział ufności [confidence interval, CI] od 1,506 do 20,974). Swoistość modelu wynosiła 98,1% (95% CI, od 89,7% do 99,9%) i z tego powodu wydaje się on odpowiedni do identyfikacji osób nieodpowiadających na lek (wartość predykcji wyników ujemnych 89,5%; 95% CI, od 78,5% do 96,0%). Następnie przeprowadzono analizę ROC w celu wyznaczenia wartości odcięcia dla średniej liczby kopii genu EGFR (Ryc. 3). Wynikało z niej, że najlepszą wartością graniczną rozróżniającą pacjentów odpowiadających i nieodpowiadających na panitumumab jest " 2,47 kopii EGFR/jądro, co wyznaczono z całkowitą dokładnością 75,9% (95% CI, od 62,8% do 86,1%). Żaden z pacjentów zliczbąkopiigenuegfr poniżej tej wartości nie reagował na leczenie, co odpowiada czułości 100% (95% CI, od 54,1% do 100%), podczas gdy u sześciu z 20 pacjentów Ryc. 3. Analiza charakterystyki roboczej odbiorcy dotycząca modelu logistycznego opartego na średniej (A) liczbie kopii genu EGFR lub (B) frakcji komórek wykazujących polisomię chromosomu 7, z obiektywną odpowiedzią na panitumumab jako punktem końcowym. Oba modele osiągają swoistość w przybliżeniu 75%, przy zachowaniu 100% czułości. AUC pole pod krzywą. z liczby kopii genu EGFR " 2,47/jądro uzyskano obiektywną odpowiedź (P = 0,0009, Tabela 2). W świetle tych danych wyznaczyliśmy praktyczną wartość liczby kopii " 2,5/jądro jako wartość graniczną w dalszych analizach przeżywalności. Test log-rank wykazał istotną różnicę na korzyść, pod względem zarówno PFS, jak i OS, tych pacjentów, których nowotwory wykazywały podwyższoną wartość liczby kopii EGFR (odpowiednio P = 0,039 i P = 0,015; Ryc. 4). Ze względu na niejednorodny wzór liczby kopii EGFR w poszczególnych guzach mcrc, często wykazujących 116 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

Liczba kopii genu EGFR w raku jelita grubego Tabela 2. Obiektywna odpowiedź na leczenie pacjentów z przerzutującym rakiem jelita grubego leczonych panitumumabem zestawiona według zaproponowanych wartości odcięcia oszacowanych na podstawie analizy charakterystyki roboczej odbiorcy Najlepsza odpowiedź na leczenie (liczba pacjentów) Wartość graniczna PD + SD CR + PR Całkowita liczba pacjentów Liczba kopii genu EGFR*!2,47 38 0 38 "2,47 14 6 20 Ogółem 52 6 58 Polisomia lub amplifikacja chromosomu 7!43% 39 0 39 "43% 13 6 19 Ogółem 52 6 58 Skróty: PD progresja choroby; SD stabilizacja choroby; CR odpowiedź całkowita; PR odpowiedź częściowa; EGFR receptor naskórkowego czynnika wzrostu. *Dokładny test Fishera, P = 0,0009. Dokładny test Fishera, P = 0,0007. zmienny stosunek disomii i polisomii chromosomu 7 i/lub stopień amplifikacji genu EGFR, postanowiliśmy również ocenić procentową frakcję komórek z polisomią chromosomu 7 i/lub amplifikacją genu EGFR (Tabela 1). Przy zastosowaniu identycznych kryteriów zwiększenie frakcji komórek z polisomią chromosomu 7 wykazywało istotny związek z prawdopodobieństwem odpowiedzi na leczenie (iloraz szans = 1,04; 95% CI, od 1,007 do 1,074). Inaczej ujmując, jest to równoznaczne ze stwierdzeniem, że wzrost o jedną jednostkę procentową liczby komórek z polisomią odpowiada 4% wzrostowi szans na odpowiedź. Analogicznie do analizy na podstawie średniej liczby kopii EGFR powyższy model ma 100% swoistości (95% CI, od 93,2% do 100%)zwysokąwartościąpredykcyjnąwynikówujemnych (89,7%; 95% CI, od 78,8% do 96,1%). Odpowiednia wartość odcięcia, wynosząca 43% polisomii chromosomu 7, została wyznaczona w analizie ROC z dokładnością 77,6% (95% CI, od 64,7% do 87,5%) i czułością 100% (95% CI, od 54,1% do 100%). Zgodnie z nią sześciu na 19 pacjentów z polisomią chromosomu 7 w " 43% komórek wykazało odpowiedź na leczenie w porównaniu z grupą 39 pacjentów, w której nikt nie uzyskał odpowiedzi, a polisomię chromosomu 7 wykazano w mniej niż 43% komórek (P = 0,0007; Tabela 2). Przyjmując " 40% jako wartość odcięcia, analiza Kaplana-Meiera wykazała lepsze wartości PFS i OS dla pacjentów z " 40% polisomią chromosomu 7 (odpowiednio P = 0,029 i P = 0,014; Ryc. 4). Jednorodna disomia chromosomu 7 została zaobserwowana u 26 z 58 pacjentów. Była ona najczęściej występującym typem zmiany wśród guzów z niepodwyższoną liczbą kopii EGFR. Analizy przeżycia 34 pacjentów poddanych wyłącznie BSC bez podawania panitumumabu (ramię kontrolne badania 408 III fazy dla panitumumabu) wykazały brak korzyści w PFS zarówno dla pacjentów ze średnią liczbą kopii genu EGFR " 2,5/jądro, jak i polisomią chromosomu 7w" 40% komórek (Ryc. 5). DYSKUSJA W poprzednich badaniach pokazaliśmy, że w mcrc obiektywna odpowiedź na leczenie moab skierowanymi przeciwko EGFR cetuksymabem i panitumumabem jest związana z podwyższoną liczbą kopii genu EGFR, stwierdzoną metodą FISH w próbkach z poszczególnych guzów. 5 Kolejne badanie z wykorzystaniem metody chromogennej hybrydyzacji in situ, przeprowadzone przez Liévre i wsp., 6 potwierdziło te wyniki u 30 pacjentów z mcrc. Oba badania nie są jednak jednoznacznie rozstrzygające, ponieważ zostały przeprowadzone na ograniczonej liczbie różnorodnie leczonych pacjentów (tj. otrzymujących pojedyncze przeciwciała moab cetuksymab lub panitumumab albo panitumumab w połączeniu z chemioterapią, przyjmujących moab jako pierwszą lub drugą linię terapii). Lenz i wsp. 7 ocenili status liczby kopii EGFR w grupie 34 pacjentów metodą reakcji łańcuchowej polimerazy i wykazali brak związku między podwyższoną liczbą kopii a obiektywną odpowiedzią na leczenie oraz PFS. Wykryli natomiast istotną dodatnią korelację z OS. Ci sami autorzy stwierdzili, że sprzeczność ich wyników z pracami innych grup 5,6 może wynikać z zastosowania odmiennych technik (FISH w porównaniu z łańcuchową reakcją polimerazy). Jak zaproponowano w badaniach patologicznych, problemy z powtarzalnością mogą być tłumaczone rozcieńczeniem lizatu nowotworowego tkankami normalnymi lub ograniczeniami próbkowania. 8,9 Ponadto Lenz i wsp. 7 przypuszczają, że związek podwyższonej liczby kopii EGFR z OS może odzwierciedlać jego rolę jako niezależnego czynnika prognostycznego. Przedstawione badanie zostało przeprowadzone w jednorodnej grupie pacjentów otrzymujących panitumumab skojarzony z BSC lub wyłącznie BSC. Pacjenci pochodzą z jednego badania klinicznego grupującego przypadki mcrc po niepowodzeniu terapii z użyciem irynotekanu i oksaliplatyny. Na podstawie otrzymanych danych średnie wyniki # 2,5 GCN EGFR/jądro i # 40% polisomii chromosomu 7 uznano za odpowiednie wartości graniczne mogące posłużyć do identyfikacji pacjentów, którzy mają mniejszą szansę odpowiedzi na panitumumab. Pozwala to na postawienie hipotezy, że nowotwory charakteryzujące się takimi cechami są niezależne od szlaku EGFR i dlatego wykazują odmienną (obniżoną) wrażliwość na panitumumab. W naszym badaniu odsetek odpowiedzi na leczenie wśród pacjentów, u których obserwowano średnio " 2,5 GCN EGFR/jądro i " 40% polisomii chromosomu 7 w guzie,byłtrzyrazywyższyniżwgrupiewszystkichbadanych (w przybliżeniu odpowiednio 30% względem 10%). Żaden z pacjentów odpowiadających na leczenie nie miał nowotworu z liczbą kopii EGFR niższą niż wartość graniczna. Zgodnie z odsetkiem odpowiedzi analiza PFS i OS po- www.jco.org 117

Sartore-Bianchi i wsp. Ryc. 3. Przeżycie wolne od progresji i przeżycie całkowite w przerzutującym raku jelita grubego u pacjentów leczonych panitumumabem według zaproponowanych wartości odcięcia (A i B) liczby kopii genu EGFR/jądro! 2,5 (n = 39) względem " 2,5 (n = 19) oraz (C i D)! 40% polisomii chromosomu 7 (n = 36) względem " 40% (n = 22) ocenionych metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w poszczególnych guzach. twierdziła lepsze wyniki kliniczne pacjentów z podwyższoną liczbą kopii wyznaczoną przez te dwa parametry. Ze względu na ograniczoną liczbę pacjentów ocenionych w niniejszym badaniu wyznaczone wartości graniczne powinny być traktowane jako wstępne i przydatne do badań na większą skalę. Zwłaszcza ich ocena mogłaby zostać przeprowadzona metodą analizy ROC na większej próbie badanej równolegle z zastosowaniem zaproponowanych wartości granicznych w celu potwierdzenia ich czułości i swoistości. Interesujący jest fakt, że w grupie pacjentów otrzymujących BSC analiza PFS nie wykazała różnic między podwyższoną i normalną liczbą kopii EGFR, wskazując tym samym raczej na predykcyjną niż prognostyczną wartość tej cechy biologicznej. Analiza OS dla pacjentów z grupy wyłącznie BSC nie została przeprowadzona, ponieważ przechodzenie z jednego ramienia badania do drugiego pozwalało na rozpoczęcie leczenia panitumumabem w przypadku progresji. W różnych badaniach opisywano wykryty metodą FISH niejednorodny status liczby kopii EGFR w mcrc, potencjalnie podważając odtwarzalność wyników tego badania. 8,9 Analiza amplifikacji genu EGFR metodą FISH w mcrc okazała się odmienna od ewaluacji HER2 w raku piersi, w którym przypadki z podwyższoną liczbą kopii genu są najczęściej jednorodne i wykazują skupiony sygnał amplifikacji genu HER2. 9 W naszej grupie przypadki mcrc z podwyższoną liczbą kopii EGFR prezentowały na ogół niejednorodny wzór, ze zróżnicowanym stosunkiem disomii do polisomii chromosomu 7 i niską procentową amplifikacją genu EGFR występującą ogniskowo (Ryc. 2). Biorąc pod uwagę te czynniki i podejmując próbę polepszenia jakości technicznej oraz odtwarzalności wyników FISH, przeanalizowaliśmy dużą liczbę komórek (przynajmniej 200 dla każdego przypadku) w cienkich skrawkach grubości 2 \m w celu uniknięcia nakładania się jąder. Ponadto zdecydowaliśmy się analizować przypadki nie tylko pod względem średniej wartości liczby kopii 118 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

Liczba kopii genu EGFR w raku jelita grubego Ryc. 5. Przeżycie wolne od progresji choroby u pacjentów, wobec których zastosowano najlepsze leczenie objawowe bez podawania panitumumabu, według zaproponowanych wartości odcięcia! 2,5 kopii genu EGFR (GCN)/jądro (n = 26) względem " 2,5 (n = 8). Ci sami pacjenci, u których stwierdzono podwyższoną liczbę kopii EGFR (" 2,5 kopii/jądro), wykazywali również polisomię chromosomu 7 " 40%, co przekłada się na brak różnic w przeżyciu wolnym od progresji według obu wartości odcięcia (P = 0,6354). EGFR/jądro, ale również biorąc pod uwagę proporcję polisomii chromosomu 7 w całym guzie. Większość nowotworów z niepodwyższoną liczbą kopii EGFR wykazywała jednorodną disomię (26 na 58 pacjentów miało 100% disomii chromosomu 7). Według naszej opinii ten wzór jest łatwiejszy do identyfikacji i oceny z morfologicznego punktu widzenia. Ponieważ analiza danych uwidoczniła, że ogólny model ma szczególne znaczenie we wskazywaniu na podstawie disomii pacjentów mających mniejszą szansę odpowiedzi na panitumumab, kliniczne wykorzystanie analizy FISH do oceny stanu genu EGFR jako czynnika predykcyjnego może być bardziej skuteczne niż przewidywano i opierać się głównie na wykrywaniu disomii chromosomu 7. W naszym poprzednim badaniu 5 opisaliśmy związek podwyższonej liczby kopii EGFR z odpowiedzią na leczenie. Wyniki zaprezentowane w tym artykule potwierdzają, że powodzenie terapii moab anty-egfr związane jest ze zwiększoną liczbą kopii genu EGFR. W przeciwieństwie do poprzedniego badania zaprezentowano nowe dowody wskazujące, że tylko część guzów z podwyższoną liczbą kopii EGFR wykazuje obiektywną odpowiedź na leczenie. Niezgodność z naszymi poprzednimi wynikami jest przypuszczalnie wynikiem zastosowanej wówczas strategii wzbogacania klinicznego, przeprowadzonego w celu oceny pacjentów odpowiadających na terapię, u których konsekwentnie obserwowano podwyższoną liczbę kopii EGFR w nowotworach. Ponadto w naszym poprzednim badaniu zanotowaliśmy szersze rozpowszechnienie amplifikacji EGFR niż w obecnym. Wynika to z faktu, że wyżej wymieniony niejednorodny wzór ogniskowej amplifikacji był, w niektórych przypadkach, uznawany uprzednio za amplifikację. W tym badaniu użycie czulszej aparatury pozwoliło patologom na rozróżnienie sygnałów nawet w małym powiększeniu, gwarantując tym samym ocenę całego fragmentu tkanki. Niedawno pokazano, że mutacje w genach KRAS i/lub BRAF w mcrc są czynnikami predykcyjnymi oporności na przeciwciała monoklonalne anty-egfr cetuksymab i panitumumab i wiążą się z gorszym rokowaniem. 5,6,10 Białka kodowane przez te geny są efektorami komórkowymi, które działają w szlaku sygnałowym poniżej ścieżki naskórkowego czynnika wzrostu, a ich nieprawidłowa aktywacja wskutek mutacji może niezależnie osłabiać hamujące działanie moab anty-egfr. Wykazano to na modelu komórkowym, w którym transfekcja genem KRAS z mutacją G12V odwróciła wrażliwość na cetuksymab. 10 W przyszłości wykrywanie mutacji KRAS i/lub BRAF w mcrc połączone z określeniem liczby kopii EGFR może przynieść lepsze zrozumienie ścieżek molekularnych. To zaś może być wykorzystane w praktyce klinicznej do optymalizacji terapii moab anty-egfr przeznaczonej dla poszczególnych pacjentów z mcrc. PIŚMIENNICTWO 1. Van Cutsem E, Peeters M, Siena S, et al: Open-label phase III trial of panitumumab plus best supportive care compared with best supportive care in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 25:1658-1664, 2007 2. Van Cutsem E, Siena S, Humblet Y, et al: An open-label, single-arm study assessing safety and efficacy of panitumumab in patients with metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy. Ann Oncol 2007 (in press) 3. Cunningham D, Humblet Y, Siena S, et al: Cetuximab monotherapy and cetuximab plus irinotecan in irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 351:337-345, 2004 4. Schrag D: The price tag on progress: Chemotherapy for colorectal cancer. N Engl J Med 351:317-319, 2004 5. Moroni M, Veronese S, Benvenuti S, et al: Gene copy number for epidermal growth factor receptor (EGFR) and clinical response to anti-egfr treatment in colorectal cancer: A cohort study. Lancet Oncol 6:279-286, 2005 6. Liévre A, Bachet JB, Le Corre D, et al: KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res 66:3992-3995, 2006 7. Lenz HJ, Van Cutsem E, Khambata-Ford S, et al: Multicenter phase II and translational study of cetuximab in metastatic colorectal carcinoma refractory to irinotecan, oxaliplatin, and fluoropyrimidines. J Clin Oncol 24:4914-4921, 2006 8. Shia J, Klimstra DS, Li AR, et al: Epidermal growth factor receptor expression and gene amplification in colorectal carcinoma: An immunohistochemical and chromogenic in situ hybridization study. Mod Pathol 18:1350-1356, 2005 9. OoiA,TakehanaT,LiX,etal:Proteinoverexpression and gene amplification of HER-2 and EGFR in colorectal cancers: An immunohistochemical and fluorescent in situ hybridization study. Mod Pathol 17:895-904, 2004 10. Benvenuti S, Sartore-Bianchi A, Di Nicolantonio F, et al: Oncogenic activation of the RAS-RAF signaling pathway impairs the response of metastatic colorectal cancers to anti EGFR antibody therapies. Cancer Res 67:2643-2648, 2007 Oświadczenie na temat potencjalnych konfliktów interesów Autorzy nie wskazali możliwości konfliktu interesów. www.jco.org 119

Sartore-Bianchi i wsp. Wkład poszczególnych autorów Pomysł i projekt badania: Andrea Sartore-Bianchi, Mauro Moroni, Salvatore Siena Wsparcie finansowe: Salvatore Siena Dostarczenie próbek lub umożliwienie dostępu do chorych: Carlo Carnaghi, Gabriele Luppi, Emilio Bajetta, Alberto Sobrero, Carlo Barone, Stefano Cascinu, Giuseppe Colucci, Enrico Cortesi, Salvatore Siena Zbieranie i gromadzenie danych: Andrea Sartore-Bianchi, Silvio Veronese Analiza i interpretacja danych: Andrea Sartore-Bianchi, Mauro Moroni, Silvio Veronese, Michele Nichelatti, Marcello Gambacorta, Salvatore Siena Pisanie manuskryptu: Andrea Sartore-Bianchi, Mauro Moroni, Salvatore Siena Ostateczna akceptacja manuskryptu: Andrea Sartore-Bianchi, Mauro Moroni, Silvio Veronese, Carlo Carnaghi, Emilio Bajetta, Gabriele Luppi, Alberto Sobrero, Carlo Barone, Stefano Cascinu, Giuseppe Colucci, Enrico Cortesi, Michele Nichelatti, Marcello Gambacorta, Salvatore Siena Podziękowania Jesteśmy wdzięczni Alberto Bardelliemu za współpracę nad projektem dotyczącym molekularnych czynników predykcyjnych w celowanych terapiach nowotworów, Roberto Brusamolino za dyskusje nad wynikami fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, Cinzii Maisano za pomoc techniczną przy FISH oraz Giovannie Marrapese i Ines Andreotti za koordynację dostarczania próbek do badań. 120 JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY