Immobilizacja enzymów Enzymy odznaczają się wysoką aktywnością w relatywnie niskich temperaturach (30-110 o C) oraz unikalną selektywnością substratową, regio- i enancjoselektywnością. Jednakże tylko niewielka liczba reakcji katalizowanych enzymatycznie znajduje zastosowanie na skalę przemysłową. Związane jest to zazwyczaj z niestabilnością preparatów enzymatycznych, niską produktywnością, wrażliwością na rozpuszczalniki organiczne i ograniczeniem do prowadzenia reakcji w roztworach wodnych. Rys 1. Najczęstsze metody immobilizacji 1/10
Problemy te mogą zostać rozwiązane przez stosowanie preparatów immobilizowanych. Enzymy można osadzać na różnych nośnikach, zamykać wewnątrz polimerów, sieciować. Dzięki procesowi immobilizacji rozpuszczalny, homogeniczny biokatalizator przekształcony zostaje w katalizator heterogeniczny. Pozwala to na stosowanie procesów ciągłych i ułatwia izolowanie produktów. Bardzo często rośnie także jego stabilność, maleje wrażliwość na zmiany ph i temperatury (wysoka aktywność nawet w 80 o C). Immobilizacja powoduje też podwyższenie selektywności w porównaniu z enzymem natywnym. Najczęstsze metody immobilizacji zostały przedstawione na Rys.1. 1. Związanie enzymu z powierzchnią nośnika a) Adsorpcja Adsorpcja biokatalizatora na powierzchni nierozpuszczalnego w wodzie nośnika jest jedną z najstarszych i najłatwiejszych metod immobilizacji. Może być stosowana w przypadku izolowanych enzymów, jak i żywych komórek. Biokatalizator wiąże się z podłożem dzięki siłom van der Waalsa, oddziaływaniom jonowym lub przez wytwarzanie wiązań wodorowych. Oddziaływania te są dosyć słabe i nie powodują zmian konformacyjnych białka. Metoda jest prosta, efektywna, tania i szybka. Jednakże preparaty tego typu mają ograniczone zastosowanie w reakcjach prowadzonych w środowisku wodnym, ponieważ często następuje pogorszenie właściwości katalitycznych związane, nie ze spadkiem aktywności, ale z desorpcją enzymu z nośnika. Natomiast w układach niewodnych sprawdzają się bardzo dobrze. Wyróżnia się kilka procedur wiązania białka przez adsorpcję: Prosta adsorpcja nośnik zawiesza się w roztworze enzymu i po zakończeniu procesu adsorpcji odmywa się niezwiązane białko, Agregacja do roztworu białka, zawierającego nośnik, dodaje się rozpuszczalnik organiczny lub zwiększa siłę jonową w celu wywołania agregacji białka i jego sorpcji na nośniku, Depozycja roztwór białka z nośnikiem poddaje się łagodnemu suszeniu. Agregacja i depozycja powodują zwiększenie ilości zaadsorbowanego białka na powierzchni nośnika. Najczęściej wykorzystywanymi nośnikami są: celit (ziemia okrzemkowa), tlenek glinu, krzemionka, celuloza, skrobia, alginiany, aktywowany węgiel, nośniki syntetyczne (najczęściej żywice jonowymienne). b) Wiązanie z udziałem metali przejściowych Metoda ta wykorzystuje chelatujące właściwości metali przejściowych (tytan, wanad, cynk, żelazo, nikiel, miedź) pozwalające wytworzyć kompleksy z nośnikiem i białkiem. Immobilizację białka poprzedza wytworzenie chelatu z grupami hydroksylowymi nośnika, a następnie po odmyciu nadmiaru jonów dodaje się białko, w którym jako ligandy wiążące się z metalem wykorzystywane są grupy karboksylowe kwasu asparaginowego i glutaminowego, grupy -OH seryny, tyrozyny i treoniny, 2/10
grupa -NH 2 lizyny, grupa SH cystieny i pierścień imidazolowy histydyny. Metoda ta ma ograniczone zastosowanie ze względu na obecność jonów metali przejściowych, co nie jest akceptowane przez przemysł spożywczy, farmaceutyczny i kosmetyczny. c) Wiązanie wykorzystujące specyficzne powinowactwo Jest to bardzo dobrze rokująca metoda wykorzystująca specyficzne powinowactwo biocząsteczek. Pozwala na związanie enzymu z ligandem w sposób trwały, ale odwracalny w specyficznych warunkach. Wiązanie przebiega w łagodnych warunkach ph, temperatury i bez rozpuszczalników organicznych. Możliwość utworzenia korzystnej orientacji enzymu względem nośnika przez najczęściej wielopunktowe wiązanie z ligandem zapewnia usztywnienie konformacji białka i większą stabilność preparatu; immobilizacji można poddawać enzymy w formie częściowo oczyszczonej, lub wręcz homogenaty. Najczęściej stosowanymi ligandami są glikoproteiny i przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne. Na razie szczególnie wysoki koszt tej metody (wytwarzanie ligandów i odpowiednia modyfikacja enzymów) ogranicza w znacznym stopniu jej zastosowanie. d) Wiązanie kowalencyjne z nośnikiem Technika ta polega na wytworzeniu wiązania kowalencyjnego pomiędzy grupami funkcyjnymi nośnika i białka. Metoda ta zapewnia trwałe związanie enzymu z powierzchnią nośnika, ale jednocześnie jej zasadniczą wadą są często dość drastyczne warunki, w jakich przebiegają reakcje. Zawsze obserwuje się więc spadek aktywności enzymu (nawet o 50%) spowodowany zmianami konformacyjnymi i częściową denaturacją. Wybór odpowiedniej metody bywa często przypadkowy, ponieważ prawdopodobieństwo wystąpienia konkretnego aminokwasu na powierzchni białka, jak i jego stabilność w warunkach reakcji, często nie jest znane. Do wytwarzania wiązań najczęściej wykorzystuje się grupy nukleofilowe aminokwasów: imidazolowe (His), fenylowe (Tyr), -SH (Cys), -NH 2 (Lys). Ogólnie immobilizacja tą metodą przebiega w dwóch etapach: aktywacja nośnika przez przyłączenie reaktywnej grupy łączącej, przyłączenie enzymu. Jako nośniki wykorzystuje się nośniki nieorganiczne (porowate szkło), polimery naturalne (celuloza, dekstran, agaroza, skrobia), polimery syntetyczne. Najważniejsze metody immobilizacji: a) polimery syntetyczne 3/10
b) nośniki nieorganiczne c) polimery naturalne 2. Sieciowanie (cross-linking) Wytwarzanie wiązań kowalencyjnych między cząsteczkami białka określane jest terminem crosslinking. Otrzymuje się w ten sposób wielkocząsteczkowe nierozpuszczalne agregaty. Cząsteczki enzymu mogą być łączone bezpośrednio między sobą lub za pośrednictwem obojętnych białek np. albumin (Rys. 1). Do sieciowania najczęściej wykorzystuje się związki dwufunkcyjne: aldehyd glutarowy (OHC-(CH 2 ) 3 -CHO), heksametylenodiizocyjanian lub heksametylenodiizotiocyjanian oraz heksanodikarboksyimidynian dimetylu (pochodna kwasu adypinowego: CH 3 OC(=NH)- -CH 2 ) 4 C(=NH)OCH 3 ). Reakcjom ulegać mogą nie tylko wolne grupy NH 2, ale także grupy SH i OH. Ogromną zaletą tej metody jest prostota i wyeliminowanie znacznego udziału nośnika, ale jednocześnie usieciowanie powoduje ograniczenie dostępu substratów do centrów aktywnych enzymu. Rys 2. Sieciowanie enzymu za pomocą aldehydu glutarowego 4/10
Sieciowanie może być prowadzone nie tylko w roztworze białka, ale też w postaci mikrokrystalicznej. Uzyskane w ten sposób cross-linking enzyme crystals (CLEC) wykazują wyjątkową odporność chemiczną (także na działanie proteaz) i mechaniczną, w porównaniu do tradycyjnego sieciowania. Zasadniczą wadą całego procesu jest jednak wysoki koszt, ponieważ enzymy muszą być odpowiednio czyste, a kryształy odpowiedniego rozmiaru. 3. Zamykanie w żelu Biokatalizatory mogą zostać uwięzione w makroskopowej matrycy, przez którą swobodnie mogą przenikać cząsteczki reagentów. W zależności od typu procesu i reaktora preparat może mieć różne formy np. kulek, włókien itp. Ze względu na łagodne warunki, metoda ta może być stosowana także do immobilizacji żywych komórek. W tym przypadku najczęściej używa się żeli agarowych, alginianów, κ-karaginianów. Formowanie żelu z biokatalizatorem może być przeprowadzone przez zmianę temperatury lub siły jonowej roztworu (Rys 3). Rys 3. Zamykanie biokatalizatora w żelu Zamykanie enzymów w alginianie Alginian sodu jest liniowym polisacharydem izolowanym najczęściej z brązowych morskich alg i wodorostów. Zbudowany jest z dwóch kwasów uronowych: β-d-mannuronowego (M) i α-l-glukuronowego (G) (Rys 4). W zależności od pochodzenia, łańcuchy mogą być homopolimerami M lub G, kopolimerami M i G, a także mieszaniną wszystkich typów polimerów. Kwas alginowy tworzy rozpuszczalne w wodzie sole z kationami metali alkalicznych i kationem amonowym, natomiast sole kationów wielowartościowych (np. wapnia) będą tworzyły żele. Dwuwartościowy kation wapnia wiąże się z dwiema grupami karboksylowymi kwasu glukuronowego w obrębie tego samego lub sąsiednich łańcuchów, co prowadzi do zmniejszenia rozpuszczalności (Rys 5 a i b). Ponieważ metoda opiera się na obecności reszt kwasu glukuronowego (który występuje 5/10
w mniejszych ilościach niż kwas mannuronowy), wielkość porów w żelu (decydująca o szybkości dyfuzji reagentów) nie zależy od warunków immobilizacji, ale od materiału wyjściowego. 2 Na(Alginian) + Ca 2+ Ca(Alginian) 2 + 2 Na + Żele alginianowe są termostabilne w zakresie 0-100 o C, a ogrzewanie nie powoduje upłynniania. Jednakże żel można łatwo przeprowadzić w zol przez dodanie wysokich stężeń soli sodowych, potasowych lub amonowych. Rys 4. Struktura składników kwasu alginowego a) b) Rys 5. Struktura przestrzenna alginianu wapnia 6/10
4. Zamykanie w membranach Nie jest to ściśle metoda immobilizacji, ale zapewnia ona umieszczenie enzymu w ograniczonej przestrzeni, izolując go w ten sposób od środowiska reakcyjnego. Małe cząsteczki mogą swobodnie przenikać przez membranę, natomiast enzym pozostaje w niej uwięziony. Podzielenie przestrzeni reakcyjnej na kompartmenty przez membrany imituje biologiczną immobilizację w komórce, ponieważ wiele enzymów działa w powiązaniu z błonami biologicznymi. Enzymy mogą być zamykane w micelach lub liposomach tworzących się w obecności odpowiednich środków powierzchniowo-czynnych (Rys 6). Woda uwięziona wewnątrz tego typu struktur zapewnia wysoką aktywność enzymu. Micele zderzają się ze sobą i dzięki temu następuje wymiana zawartości i reakcja może przebiegać wydajnie i szybko. Wadą tego typu immobilizacji są problemy podczas izolacji produktów (związki powierzchniowoczynne w tym momencie przeszkadzają). Rys 6. Zamykanie enzymu w micelach i liposomach Bardziej przydatnymi układami są reaktory zawierające membrany syntetyczne. Produkuje się membrany różnych typów o określonej wielkości porów w zależności od zapotrzebowania. Membrany takie długo były wykorzystywane w oczyszczaniu białek np. za pomocą dializy, czyli małe cząsteczki mogą swobodnie dyfundować przez membranę. Na Rys 7 przedstawiono przykładowy schemat reaktora. Rys 7. Reaktor membranowy 7/10
Literatura 1. Ćwiczenia z biochemii, praca zbiorowa red. L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN 2003 2. K. Faber, Biotransformation in Organic Chemistry, Sprinter, 2004 3. J. Bryjak, Immobilizacja enzymów. Część 1: Metody konwencjonalne, Wiadomości Chemiczne, 2004, 58, 691 4. J. Bryjak, Immobilizacja enzymów. Część 2: Reaktory membranowe, Wiadomości Chemiczne, 2004, 58, 747 Część doświadczalna W trakcie ćwiczeń należy wyznaczyć zawartość białka w surowym i wysolonym PLE oraz przygotować dwa preparaty: PLE i lipazę Amano PS immobilizowane w 2% roztworze alginianu sodu, a następnie zbadać aktywność otrzymanych preparatów w reakcji z maślanem p-nitrofenylu i wyciągnąć wnioski. 1.1. Wyznaczenie ilości białka w preparatach PLE (metoda Lowry ego) W oznaczeniu wykorzystuje się reakcje barwne: biuretową (jonów miedzi (II) z wiązaniami peptydowymi) oraz reakcje zachodzące pomiędzy resztami tyrozyny, tryptofanu i histydyny (prawdopodobnie) a odczynnikiem Folina-Ciocalteu (FC). Aminokwasy te redukują jony Mo 6+ /W 6+ zawarte w odczynniku FC, a stężenie produktów o barwie niebieskiej mierzy się spektrofotometrycznie przy λ=750nm. Odczynniki: roztwór wzorcowy BSA 150μg/ml, bufor fosforanowy ph 7,20; odczynnik Lowry ego, odczynnik Folina-Ciocalteu. Sprzęt: próbówki szklane i wirówkowe, kolby miarowe, pipety, zlewki, bagietka, kolorymetr. Wykonanie: 1. Do próbówki typu Falcone o poj. 15ml odważyć 300 mg surowego PLE i dodać 4 ml buforu fosforanowego o ph=7,2. 2. Do próbówki wirówkowej typu Ependorff odważyć 50 mg PLE wysolonego i dodać 1,5 ml buforu fosforanowego o ph=7,2. 3. Obie próbówki dokładnie mieszać przez kilka minut, a następnie odwirować przez 10 min (10000 obr/min). 4. Każdy supernatant zlać oddzielnie do próbówki z miarką i zmierzyć jego objętość. 5. Do kolby miarowej o pojemności 100 ml odpipetować 1 ml supernatantu PLE surowego, dopełnić wodą destylowaną do kreski i dokładnie wymieszać. 8/10
6. Do kolby miarowej o pojemności 25 ml odpipetować 1 ml supernatantu PLE wysolonego, dopełnić wodą destylowaną do kreski i dokładnie wymieszać. 7. Przygotować 21 próbówek szklanych i postępując zgodnie z tabelą 1 odpipetować odpowiednie roztwory. 8. Zmierzyć absorbancję przygotowanych roztworów przy długości fali 750 nm. 9. Obliczyć stężenia BSA (w µg/ml) w roztworach wzorcowych a następnie wykreślić krzywą wzorcową (A=f(µg/ml)). 10. Obliczyć ilość mg białka na 1 g preparatu (pamiętać o rozcieńczeniach!). Tabela 1. Roztwór Białko O. Ozn. Woda BSA badane Lowry Zero - 1,000-5 Czekać O. CF Czekać 0,5 S1; S2-0,500 0,500 5 0,5 S3; S4-0,250 0,750 5 0,5 S5; S6 - - 1,000 5 0,5 W1; W2 - - 1,000 5 0,5 W3; W4-0,500 0,500 5 20 min 0,5 1; 2 0,200 0,800-5 0,5 30 min 3; 4 0,400 0,600-5 0,5 5; 6 0,600 0,400-5 0,5 7; 8 0,800 0,200-5 0,5 9; 10 1,000 - - 5 0,5 Wszystkie objętości podano w ml. S1-S6 PLE surowa; W1-W4 PLE wysolona 1.2. Immobilizacja PLE Odczynniki: preparat enzymatyczny PLE, lipaza Amano PS, alginian sodu, 0,3 mol/l roztwór chlorku wapnia. Sprzęt: zlewki 25, 100 ml, lejek Schotta, kolba ssawkowa, mieszadło magnetyczne, strzykawka, bagietka, pipety 1 i 5 ml, cylinder miarowy. Wykonanie: Do zlewki 25 ml odważyć 0,2g alginianu sodu i dodać 10 ml wody. Zawartość delikatnie mieszać bagietką do całkowitego rozpuszczenia alginianu i odstawić na 30 min. Następnie dodać 1 ml 9/10
otrzymanego wcześniej supernatantu surowego PLE. Po wymieszaniu otrzymaną zawiesiną napełnić strzykawkę. W zlewce o poj. 100 ml umieścić 50 ml 0,3-molowego roztworu chlorku wapnia i postawić na mieszadle magnetycznym. Następnie pojedynczymi kroplami wstrzykiwać roztwór alginianu (1 kropla/sek.). Po zakończeniu zawiesinę mieszać jeszcze 5 min, a potem na lejku Schotta odsączyć otrzymany preparat i przemyć go 10 ml wody. Analogicznie przygotować preparat Amano PS, tylko w próbówce wirówkowej odważyć 150 mg lipazy i rozpuścić ją w 1,5 ml buforu fosforanowego ph 7,20. 1.3. Badanie i porównywanie aktywności hydrolitycznej preparatów natywnych i immobilizowanych. Odczynniki: maślan p-nitrofenylu, aceton, bufor fosforanowy o ph=7,2, preparat enzymatyczny PLE (surowy i immobilizowany), lipaza Amano PS (surowa i immobilizowana). Sprzęt: próbówki szklane, pipety. Wykonanie: Do czterech próbówek szklanych wprowadzić 1-2 krople maślanu p-nitrofenylu, 1 ml acetonu i 5 ml buforu fosforanowego o ph=7,2. Następnie do próbówek 1 i 2 dodać niewielką ilość natywnego preparatu PLE i lipazy Amano PS, natomiast do próbówek 3 i 4 odpowiednio PLE i Amano PS immobilizowane. Zawartość każdej próbówki wymieszać, zapisać obserwacje i wyciągnąć wnioski. 10/10