POWIERZCHNIOWO WZMOCNIONY EFEKT RAMANA. (ang. surface-enhanced Raman scattering, SERS)

POWIERZCHNIOWO WZMOCNIONY EFEKT RAMANA (ang. surface-enhanced Raman scattering, SERS) Edyta Podstawka 1 i Leonard M. Proniewicz 2 1 Środowiskowe Laboratorium Analiz Fizykochemicznych i Badań Strukturalnych Uniwersytet Jagielloński, ul. Ingardena 3, 30-060 Kraków; e-mail: podstawk@chemia.uj.edu.pl 2 Wydział Chemii, Uniwersytet Jagielloński, ul. Ingardena 3, 30-060 Kraków; e-mail:proniewi@chemia.uj.edu.pl 1. Wprowadzenie Badania nad ustaleniem molekularnej tożsamości i strukturalnej charakterystyki pojedynczych molekuł stanowi w ostatnich kilku latach podstawowy cel chemii i fizyki analitycznej. Otrzymanie informacji na temat indywidualnych właściwości pojedynczej molekuły i porównanie ich z własnościami, jakie wykazują one w fazach skondensowanych pozwalają na zrozumienie występujących wzajemnych oddziaływań, a tym samym na przewidywanie własności fizykochemicznych projektowanych, czy izolowanych ze skomplikowanych układów, materiałów. Spektroskopia molekularna stanowi uniwersalną drogę badań zmian fizycznych i chemicznych zachodzących w tkankach, komórkach, chromoforach i w wielu organicznych i biologicznych związkach oferując szerokie możliwości w diagnostyce i terapii. Nic też dziwnego, że dziedzina ta charakteryzuje się ogromnym dynamizmem rozwoju. Nie tylko rozwijane są nowe techniki pomiarowe, ale podążają za tym także zaawansowane metody obliczeniowe. W latach ubiegłych spektroskopia fluorescencyjna była pierwszą ze spektroskopii, która została wykorzystana do badania pojedynczych molekuł. 1-3 Jednakże szerokie pasmo fluorescencyjne uzyskiwane w standardowych warunkach pomiarowych, w pokojowej temperaturze i środowisku ciekłym często maskuje cechy indywidualne pojedynczych molekuł. Ponadto, rezonansowe wzbudzenie przejść elektronowych w badaniach fluorescencyjnych niejednokrotnie powoduje fotodekompozycję badanego związku, a tym samym ogranicza czas, w którym molekuła jest dostępna do badań fluorescencyjnych. Należy również dodać, iż stosunkowo długi czas życia elektronowych stanów wzbudzonych w porównaniu z czasem życia stanów oscylacyjnych ogranicza maksymalną liczbę cyklów wymuszonej emisji fotonów, które są emitowane przez molekułę w warunkach nasycenia do około 10 3 na sekundę. Porównując z innymi metodami, spektroskopia Ramana (ang. Raman spectroscopy, RS) wydaje się niemalże perfekcyjnym narzędziem do pokonania tychże problemów. Charakteryzuje się ona unikalną własnością, albowiem widmo Ramana stanowi odcisk palca badanej cząsteczki. Dodatkowo, spektroskopia RS może być używana in situ w warunkach fizjologicznych, a gdy zostaną spełnione wymogi rezonansowego rozproszenia Ramana (ang. resonance Raman spectroscopy, RR) technika ta staje się wysoce selektywna. Jakkolwiek pojawia się kilka niedogodności związanych z wykorzystaniem spektroskopii RS w biomedycynie. Należą do nich mały efektywny ramanowski przekrój czynny (ang. Raman cross-section) obniżający poziom sygnału, co niestety uniemożliwia użycie tej techniki w badaniach na poziomie pojedynczej molekuły, możliwość termicznej degradacji próbki oraz pojawienie się silnego tła fluorescencyjnego pochodzącego od zanieczyszczeń obecnych w biomedycznych ekstraktach, próbkach komórek i tkanek. Dodatkowo, rozproszenie Ramana jest raczej słabym efektem. Jednakże efekt ten może być znacznie wzmocniony, jeżeli badana cząsteczka jest zaadsorbowana lub znajduje się w mikroskopowej odległości od odpowiednio porowatej powierzchni metali, takich jak np.: Ag, Cu lub Au. 4,5 Metoda ta, nazwana powierzchniowo wzmocnionym efektem Ramana (ang. surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS), 6,7 została odkryta przez 5 6

Fleishmana, Hendrę i McQuillana w 1974 roku, 6,8 jakkolwiek wytłumaczenie obserwowanych efektów nastąpiło dopiero w 1977 roku, w którym to Jeanmaire i Van Duyne 9 oraz Albrecht i Creighton 10 niezależnie opublikowali i objaśnili widma SERS pirydyny zaadsorbowanej na elektrodzie srebrowej. Z końcem lat 70-tych Koglin i Sequarias 11 oraz Cotton 12,13 i Nabiev 14-16 jako pierwsi rozwinęli technikę SERS w badaniach związków biologicznych. Zyskuje ona obecnie wiele uwagi w biomedycynie 17 i genetyce 18, albowiem umożliwia wzmocnienie efektywnego ramanowskiego przekroju czynnego cząsteczek zaadsorbowanych na powierzchni metalu (tzw. adsorbatu) o kilka rzędów wielkości (10 2-10 6, a dla pewnych systemów nawet 10 8-10 15 ) 5,19-22 w stosunku do efektywnego ramanowskiego przekroju czynnego cząsteczek nie zaadsorbowanych. 23-26 Technika SERS posiada także inne niezwykle ważne cechy, do których należą: (1) wzmocnienie sygnału rzędu 10 6 na ziarnach metalu jest uzyskiwane tylko, gdy zarówno średnica ziaren metalu jest znacznie mniejsza od długość promieniowania wzbudzającego (a<0.02λ), jak i indeks odbicia ziaren metalu przy linii wzbudzającej (5) mechanizm wzmocnienia efektu SERS jest uwarunkowany tworzeniem π- elektronowych kompleksów aromatycznych, np. reszt aminokwasowych i δ- kompleksów grup zawierających niesparowaną parę elektronów z powierzchnią metalu, (6) może pojawić się luminescencja, absorpcja, pewne nieliniowe efekty i adsorpcją wyindukowana aktywność optyczna chiralnych chromoforów. Wzmocnienie sygnału SERS zależne jest od efektywnego ramanowskiego przekroju czynnego, od częstości promieniowania wzbudzającego (λ exc. ), rodzaju powierzchni metalicznej i stopnia jej schropowacenia (rysunek 1), a także chemicznego pochodzenia molekuły. 14 Wzmocnienie to staje się jeszcze bardziej intensywne, jeżeli częstość promieniowania wzbudzającego jest w rezonansie z pasmem absorpcyjnym, o dużym współczynniku ekstynkcji molowej, badanej cząsteczki. To tzw. powierzchniowo wzmocniony rezonansowy efekt Ramana (ang. surface-enhanced resonance Raman spectroscopy, SERRS). lub Ramana wynosi m= 2i (warunek rezonansu dla oscylującego dipola elektrycznego), (2) znaczna redukcja tła fluorescencyjnego, które jakże często maskuje widmo Ramana związków biologicznych, (3) wysoka selektywność informacji molekularnej co związane jest z faktem, że tylko cząsteczki (lub pojedyncze grupy molekularne) znajdujące się na lub bardzo Rysunek 1. Elektronowe widma absorpcyjne dla koloidów srebra różniących się stopniem agregacji [K. Kneipp, H. Kneipp, I. Itzkan, R. Dasari, M. S. Feld, J. Phys.: Condens. Mater, Surface-enhanced Raman scattering and biophysics, 14 (2002) R597, za pozwoleniem Institute of Physics Publishing]. blisko powierzchni metalu dają wkład do widma SERS; co więcej, nie wszystkie pasma SERS są równocennie wzmocnione, (4) ultra-wysoka czułość pozwala na uzyskanie widm SERS przy stężeniach badanych związków nawet rzędu 10-14 M, dzięki czemu może być potencjalnie stosowana do badań pojedynczych cząsteczek, 2. Mechanizm efektu SERS Podejścia mające na celu wyjaśnienie anomalnie dużego wzmocnienia sygnału w SERS do chwili obecnej nie są w pełni satysfakcjonujące. Odpowiednie wyjaśnienie musi bowiem uwzględniać zmiany anomalnej czułości wzmocnienia względem stopnia schropowacenia 7 8

powierzchni metalu, fakt, iż adsorpcja na srebrze, złocie, czy miedzi wywołuje ogromny efekt (10 2-10 6 dla wzbudzenia linią z zakresu promieniowania widzialnego) 27 w porównaniu z adsorpcją na powierzchniach innych metali (np. dla Pd i Pt obserwuje się wzmocnienie rzędu 10 2-10 3 przy wzbudzeniu w bliskim nadfiolecie) 5, sposób, w jaki sygnał zanika wraz z odległością badanego użytego metalu, częstości promieniowania wzbudzającego może zostać wytłumaczona poprzez warstwy struktury ziaren metalu z adsorbatem pokrywającą gładką powierzchnie metaliczną. Stwierdził on, iż takie umieszczenie obok siebie ziaren metalu może prowadzić do kooperatywnego rezonansu, który ma swe pochodzenie w procesach elektronowych pokrewnych związku względem powierzchni, 28 depolaryzację silnie spolaryzowanych pasm i zależność do rezonansu plazmy wykazywanego przez pojedyncze izolowane ziarna metalu. W 1982 roku intensywności promieniowania ramanowskiego względem linii wzbudzającej. Inne czynniki, które należałoby również uwzględnić, to możliwa zależność kąta padania promieniowania wzbudzającego względem kątów odbicia i upakowania zaadsorbowanych molekuł. Nawiązując do zależności wzmocnienia sygnału względem długości linii wzbudzającej w 1978 roku Creighton 29 opisał nadspodziewany wzrost intensywności pasm wraz z obniżeniem częstości padającego promieniowania elektromagnetycznego. W rok później Van Dune 30, jako pierwszy podjął próbę wyjaśnienia sześciokrotnego wzmocnienia pasm pirydyny zaadsorbowanej na elektrodzie srebra, w porównaniu do pirydyny nie zaadsorbowanej. Zasugerował on, iż wzmocnienie to jest w pewnym stopniu proporcjonalne od zdolności metalu do odbijania padającego promieniowania. Inne podejście wyjaśnienia SERS zaproponowane przez Efrima i Metiu 31,32 polegało na zastosowaniu modelu klasycznego dipola znajdującego się na gładkiej płaskiej powierzchni metalicznej z zależną od czasu polaryzowalnością. W modelu tym, początkowe pole elektromagnetyczne generuje oscylujący moment dipolowy, który zawiera zarówno elastyczną część promieniowania o tej samej częstości, co promieniowanie padające i nieelastyczną część promieniowania o częstościach ramanowskich. Ponieważ promieniowanie jest odbijane od płaskiej powierzchni metalicznej w kierunku molekuły pojawia się sprzężenie zwrotne prowadzące do wyższej harmonicznej. Na tej podstawie, Efrima i Metiu 31,32 przypisali występowanie efektu SERS do wielokrotnego efektu rozproszenia. Z drugiej strony Moskovits 33 zaproponował, iż zależność wzmocnienia sygnału SERS od stopnia schropowacenia, rodzaju Cooney i współpracownicy 34 przypisali efekt SERS laserowej fotodegradacji związku na powierzchni metalu i wtrąceniu adsorbatów do grafitowego węgla na powierzchni metalu. Otto 35 w swym artykule przeglądowym z 1984 roku przedstawił tzw. mechanizm chemiczny i klasyczny wzmocnienia SERS, podczas gdy Metiu i Das 36 zaproponowali tłumaczenie wzmocnienia SERS poprzez mechanizm elektromagnetyczny. Z kolei, Chang i Lube 37 przedyskutowali efekt SERS bazując na zjawiskach rządzących elektrochemią i optyką nieliniową. W rok później, Efrima 38 krytykując powyższe teorie wprowadził pojecie mechanizmu rezonansowego. Natomiast Moskovits 5 uwzględnił wpływ adsorpcji, emisji, fotochemii i procesów nieliniowych na wzmocnienie SERS. Nie jest naszym zadaniem ani celem wyczerpujące omówienie mechanizmów, które są proponowane w celu wyjaśnienia powstania efektu SERS. Czytelników, którzy chcą zapoznać się dokładniej z tymi zagadnieniami odsyłamy do bogatej literatury. 4-16,19-37 Tutaj jedynie chcemy nakreślić podstawowe elementy, które decydują o powstaniu tego efektu. Więcej czasu natomiast chcemy poświęcić na omówienie zastosowania tej techniki do specjalistycznych badań strukturalnych związków biologicznych, czy tych, które są związkami mającymi potencjalną aktywność fizjologiczną. Efektywny ramanowski przekrój czynny można opisać poprzez moment dipolowy cząsteczki µ(ω L ) wyindukowany przez oddziaływanie pola elektromagnetycznego padającego promieniowania (E L ) i polaryzowalności cząsteczki (α): [1] 9 10

gdzie: µ (ω L ) moment dipolowy E L (ω L ) pole elektromagnetyczne α - polaryzowalność cząsteczki µ (ω L ) = α E L (ω L ) wydaje się logiczne, że obserwowane w SERS wzmocnienie promieniowania rozproszonego (wzmocnienie ramanowskiego przekroju czynnego) przez zaadsorbowaną cząsteczkę następuje przez wzrost intensywności pola elektromagnetycznego lub zwiększonej polaryzowalności tej cząsteczki lub też, gdy równocześnie wzrastają obie te wielkości. Równanie powyższe opisuje mechanizmy wzmocnienia efektu SERS, w którym pole elektromagnetyczne jest odpowiedzialne za opis mechanizmu elektromagnetycznego, a polaryzowalność cząsteczki wpływa na powstanie mechanizmu chemicznego (cząsteczkowego) efektu SERS. Mechanizm elektromagnetyczny (EME) jest dominującym mechanizmem wzmocnienia sygnału, gdyż mechanizm chemiczny (CE) jest odpowiedzialny za powstanie sygnału SERS intensywniejszego o 10 1-10 2 w stosunku do RS. 39 EME zależy silnie od obecności tzw. schropowaceń na powierzchni metalu (twory w postaci np. igieł), a CE wpływa wyłącznie na zmianę stanu elektronowego zaadsorbowanej cząsteczki w wyniku jej chemisorpcji. 40 Zgodnie z CE, natura chemiczna zaadsorbowanej molekuły zmienia się podczas jej oddziaływania z metalem, podczas gdy EME zmienia intensywność rozproszenia zaadsorbowanej cząsteczki nie zmieniając efektywnego przekroju czynnego. 2.1. Mechanizm elektromagnetyczny (EME) Jak już wspomniano, dominującą częścią wzmocnienia sygnału SERS jest wzmocnienie zachodzące zgodnie z zaproponowanym mechanizmem elektromagnetycznym, które jest bezpośrednim wynikiem obecności schropowaceń na powierzchni metalicznej. Schropowacenia te, czy inaczej mówiąc nierówności, mogą być uzyskane na różne sposoby (patrz punkt 3). Kerker i inni 41 rozwinęli teorię EME dla izolowanych sferycznych ziaren metalu o różnych rozmiarach, która następnie została przedyskutowana dla ziaren sferoidalnych 42 i elipsoidalnych 43. Mechanizm elektromagnetyczny zakłada wprost, iż intensywność zarówno padającego, jak i rozproszonego promieniowania elektromagnetycznego jest wyższa na powierzchni metalu, aniżeli w jego wnętrzu. Intensywność promieniowania rozproszonego (I R ) można opisać zależnością: I R ~ α (E R (r,ω S )) 2 [2] gdzie: E R (r,ω S ) - całkowite natężenie pola związanego z zaadsorbowaną cząsteczką To całkowite natężenie pola związanego z zaadsorbowaną cząsteczką na powierzchni metalu (E R (r,ω S )) stanowi sumę natężeń pola elektromagnetycznego działającego na adsorbat będący dipolem pod nieobecność schropowaceń (E dip (r,ω S )) i pola emitowanego przez poszczególne schropowacenia (E sc (ω SC )). 5,27 W przypadku normalnego efektu Ramana E dip (r,ω S ) przyjmuje stosunkowo niewielką wartość ze względu na małą energię oddziaływania dipol-promieniowanie laserowe. Natomiast w SERS, schropowacenia, a w szczególności nierówności typu igieł, czy nanostruktury klasterów stanowią źródło dodatkowego bardzo silnego pola elektromagnetycznego (E sc (ω SC )), które działa bezpośrednio na zaadsorbowaną na powierzchni metalu molekułę wywołując ogromny wzrost E R. Ponieważ występowanie elektronów powierzchniowych metalu jest ograniczone do miejsc schropowaceń, których rozmiary są małe, stąd wzbudzenie plazmonów jest również ograniczone do miejsc schropowaceń. Wytworzone tak pole plazmonów jest bardzo intensywne biorąc pod uwagę, że natężenie pola elektrycznego na czubku takiej szpilki w teorii osiąga wartość dążącą do nieskończoności. 5 Wysoka gęstość energii w miejscach schropowaceń wywołuje zmiany intensywności promieniowania rozproszonego (I R ) zgodnie z zależnością przedstawioną powyżej. 11 12

Powoduje to, iż pole oddziałujące na cząsteczkę zaadsorbowaną pomiędzy dwoma aktywnymi ziarnami metalu będzie znacznie bardziej wzmacniane niż to, gdy cząsteczka będzie zaadsorbowana tylko na jednym ziarnie metalu przy zachowaniu podobnej geometrii ziaren przesunięcie maksimum rezonansu w stronę niższych energii 46 (ang. red shift)), a co za tym idzie wpływa na wielkość wzmocnienia i rezonansową częstość plazmonów. Wzmocnienie EME jest silne, gdy ziarna metalu wykazują dużą krzywiznę. A zatem, (schropowaceń). 19 Dodatkowo, poprzez rezonans plazmonowy wzmacniane są szczególnie oscylacje cząsteczki zaadsorbowanej wzdłuż długich lub cienkich osi elipsoidalnych lub drgania, dla których promieniowanie wzbudzające i rozproszone jest prostopadłe do powierzchni metalu, słabiej natomiast oscylacje, dla których promieniowanie rozproszone lub padające jest prostopadłe do powierzchni metalu. Natomiast, najsłabiej będą wzmacniane drgania, dla których padające promieniowanie elektromagnetyczne oraz rozproszone nie są prostopadłe w stosunku do powierzchni metalicznej. 44 sferoidalnych ziaren metalu są silniej wzmacniane, aniżeli te dla cząsteczki zaadsorbowanej na ziarnach metalu o kształcie kulistym o tej samej objętości. 5,47 Hilderbrant i Stockburger 48 sugerowali, iż miejscami szczególnie aktywnymi były miejsca wiązania o wysokim powinowactwie (65 KJ/mol) związane z występowaniem anionów takich, jak: Cl - i Br -. Jest rzeczą stwierdzoną, iż właśnie w obecności tych anionów sygnał SERS potrafi być wzmocniony nawet o rząd wielkości. koliod metalu E L (ω L ) powierzchnia elektrody ε s ε m α E LM (ω L ) E SC (ω S ) r A r E dip (r,ω S ) E R (r,ω S ) E P (r,ω L ) biocząsteczka (dipol) Rysunek 2. Schemat mechanizmu wzmocnienia elektromagnetycznego (EME) w SERS [ε m i ε s - funkcje dielektryczne ziarna metalu i jego otoczenia, E L (ω L ) - natężenie pola padającego promieniowania elektromagnetycznego, E LM (ω L ) - natężenie elastycznie rozproszonego pola ziarna metalu opisanego według teorii Lorenza-Mie, E P (r,ω L ) całkowite natężenie pola na zewnątrz ziarna metalu, E SC (ω S ) - natężenie pola na zewnątrz ziarna metalu, E dip (r,ω S ) - natężenie pola elektrycznego dipola i E R (r,ω S ) - natężenie pola elektrycznego w punkcie A] [przystosowane z E. Koglin, J.-M. Sequaris, Surface enhanced Raman sattering of biomolecules, Top. Cur. Chem., 134 (1986) 1, za pozwoleniem Springer]. 2.2. Mechanizm chemiczny (CE) Mechanizm chemiczny przewiduje znaczny wzrost polaryzowalności cząsteczki zaadsorbowanej na powierzchni metalu w wyniku jej oddziaływania z metalem w zależności od wielkości przeniesienia ładunku, tworzenia par elektron-dziura, czy istnienia tzw. adatomów. 35 W mechanizmie zakładającym przeniesienie elektronu uważa się, iż proces chemisorpcji molekuły powoduje powstanie nowego stanu wzbudzonego, który wchodzi w rezonans z promieniowaniem wzbudzającym, podobnie jak ma to miejsce w rezonansowym efekcie Ramana. W związku z tym, w celu scharakteryzowania efektu przeniesienia ładunku wprowadzono model 2.1.1. Miejsca szczególnie aktywne Istotnym zagadnieniem mechanizmu wzmocnienia elektromagnetycznego jest wpływ rozmiaru, kształtu i orientacji schropowaceń obecnych na powierzchniach metalicznych na wielkość wzmocnienia sygnału SERS. 45 Wielkości te wraz z rodzajem użytego metalu modulują optymalną częstość promieniowania (np. wzrost rozwinięcia powierzchni metalicznej wywołuje zaproponowany przez Albrechta do opisu rezonansowego rozproszenia Ramana. 10 W modelu tym, poziom Fermiego położony jest pomiędzy zapełnionymi i niezapełnionymi orbitalami molekularnymi. Takie jego położenie pozwala na tunelowanie elektronu, w wyniku którego powstają nowe stany pośrednie z przeniesieniem ładunku wykazujące znacznie wyższy ramanowski efektywny przekrój czynny dla molekuły zaadsorbowanej na powierzchni metalu. 19 Przeniesienie ładunku następuje albo z poziomu Fermiego danego metalu na niezapełnione 13 14

orbitale molekularne, albo z zapełnionych orbitali molekularnych na poziom Fermiego metalu. Proces ten ograniczony jest przez czas życia elektronu w stanie wzbudzonym. Aby był efektywny W wyniku mechanizmu z przeniesieniem ładunku wzmacniane są drgania pełnosymetryczne efektywnie relaksujące energię pomiędzy molekułą a metalem, tzn. drgania wymagany jest bliski kontakt molekuła/metal. 49 To tłumaczy fakt tzw. krótkozasięgowości opisywane współrzędnymi normalnymi, wzdłuż których stan wzbudzony (molekuła-metal) mechanizmu CE, który odnosi się praktycznie tylko do pierwszej warstwy adsorbatu. 44 relaksuje efektywnie do stanu podstawowego. Dla takich drgań obserwuje się także w widmie A LUMO SERS nadtony. 44 hν S Rysunek 3. Mechanizm CE poprzez przeniesienie ładunku: A - z poziomu Fermiego metalu na niezapełniony orbital molekularny i B - z zapełnionego orbitalu molekularnego na poziom Fermiego [W. Grochala, Analiza składowych współczynników wzmocnienia w widmach powierzchniowo wzmocnionego rezonansowego (SERRS) i nierezonansowego rozproszenia ramanowskiego (SERS), Praca doktorska, Warszawa 1998 r.]. B E F E 4 2 4 1 4 3 1 hν 0 2 3 HOMO E CT 3. Przykładowe formy substratów najczęściej stosowanych w technice SERS (1) koloid metalu w roztworze, w którym rozmiary ziaren są małe w porównaniu z długością wzbudzającego promieniowania elektromagnetycznego, (2) elektrody, których odpowiednio porowate powierzchnie aktywne otrzymywane są w określonych cyklach utleniania-redukcji (ORC) zachodzących w celach Ag 5s E F stan podstawowy elektrochemicznych, Q 0 v = 1 v = 0 Q (3) aktywne powierzchnie metaliczne o kontrolowanej homogeniczności i regularnej porowatości otrzymane przy wykorzystaniu technik mikrolitograficznych, napylania metalu na różnorodne powierzchnie lub polistyrenowe nanocząsteczki. 5,47 Rysunek 3 przedstawia jeden z proponowanych mechanizmów CE. W wyniku absorpcji fotonu przez metal następuje wybicie elektronu (1), w wyniku czego w pobliżu poziomu Fermiego metalu powstaje para elektron-dziura. Wybite elektrony są pułapkowane na powierzchni metalu (2) (czas życia ok.10-14 -10-13 s) i w zależności od kierunku przeniesienia ładunku są przenoszone (koherentne tunelowanie) na lub z odpowiedniego orbitalu molekularnego zaadsorbowanej cząsteczki. W kolejnym etapie (3) elektron (lub dziura) powraca do metalu pozostawiając 4. Substraty stosowane w SERS (1) metale, jak np.: Ag, Au i Cu, których d-pasmo leży poniżej poziomu Fermiego, (2) metale przejściowe, jak np.: Ni, Pd, Pt, których d-pasmo pokrywa się z poziomem Fermiego, (3) metale: Al, Na i K, które nie mają d-pasma. molekułę we wzbudzonym stanie oscylacyjnym. Następnie elektron i dziura rekombinują (4), czemu towarzyszy emisja fotonu. 5. Przykładowy schemat systemu z mikroskopem do pomiarów techniką SERS 15 16

Na rysunku 4 przedstawiona jest przykładowa aparatura pomiarowa używana w technice powierzchniowo wzmocnionego efektu Ramana. pojedynczych molekuł. W technice tej orientacja badanej molekuły oraz odległość jej grup funkcyjnych względem powierzchni metalu, na którym została zaadsorbowana, odgrywa kluczową rolę we wzbudzeniu indywidualnych pasm ramanowskich. Warunek ten pozwala na uzyskanie wyjątkowych (specyficznych) informacji na temat struktury zaadsorbowanego związku na powierzchni roztwór/ciało stałe i pozwala na zrozumienie oddziaływań substrat-powierzchnia, Rysunek 4. Schemat typowego systemu do pomiarów techniką SERS [L. Sneppen, Section Analytical Chemistry and Applied Spectroscopy, Virije University Amsterdam, 2003]. co może prowadzić do zrozumienia wielu mechanizmów substrat-receptor. A więc, technikę SERS wykorzystuje się do starannego wyznaczenia struktur, topografii i składu związków, do wyznaczenia różnic w sposobie ich oddziaływania z powierzchnią metalu, ich orientacji (ułożenia) na powierzchni metalu, co stanowi pierwsze podejście w zaproponowaniu np. mechanizmu wiązania substratu do receptora o nieznanej strukturze oraz do wyznaczenia siły wytworzonych wiązań w bardzo specyficznych układach, jak również selektywnego badania 6. Zastosowanie SERS do badań związków biologicznych Dzięki możliwości stosowania różnorodnych substratów i systemów eksperymentalnych oraz dzięki niezwykłej czułości i selektywności SERS wyłania się jako niezwykle potężna technika badań (bio)chemicznych szeroko wykorzystywana do ilościowej i jakościowej analizy szerokiej gamy związków. Może być stosowana do badań rozkładu leków w żywych komórkach, w selektywnym oznaczeniu składników membran komórkowych, jak również w analizie zanieczyszczeń ekstraktów biomedycznych, czy przy modelowaniu oddziaływań wirus-inhibitor. To tylko część z możliwych pól badawczych. Co więcej, widma SERS mogą być z łatwością otrzymane dla aminokwasów, peptydów, kwasów nukleinowych, białek rozpuszczalnych w wodzie i membranowych, puryn i pirymidyn, katecholamin, porfiryn i chlorofili, czy flawin. pewnych fragmentów złożonych cząsteczek, jak np. specyfiki oddziaływania z odpowiednio przygotowanymi substratami aromatycznych (fenyloalanina (Phe), tryptofan (Trp), tyrozyna (Tyr) i histydyna (His)), kwasowych (kwas asparaginowy (Asp) i glutaminowy (Glu)) i zasadowych aminokwasów (arginina (Arg) i lizyna (Lys)), mostków disiarczkowych (S-S) i wiązań peptydowych (-CO-NH-), zasad pirymidynowych i purynowych, reszt fosfonowych i cukrowych, kwasów nukleinowych, czy grup chromoforowych, porfiryn, chlorofili, flawin, retinalu, żółci, barwników oczu i leków, które są zlokalizowane na powierzchni metalu. 6.1. Aminokwasy i peptydy Wyniki badań aminokwasów i niewielkich peptydów zaadsorbowanych na powierzchni metalicznego złota przy użyciu techniki SERS są nieliczne. 50-55 Natomiast proces adsorpcji tych W ostatnim dziesięcioleciu technika SERS została uznana za jedną z najefektywniejszych molekuł na powierzchni srebra znalazł swe odbicie w szeregu opracowań. 13,15,16,23,56-72 Nie technik do ilościowej i jakościowej analizy różnorodnych biocząsteczek obecnych w roztworze w stężeniach 10-3 10-10 M. Zalety tej techniki brane są pod uwagę w rozwijaniu tzw. spektroskopii zaskakują pojawiające się jednakże różnice w prezentowanych widmach SERS dla danego związku, co tłumaczy się rodzajem powierzchni metalicznej i sposobem jej przygotowania, 17 18

stężeniem badanego związku i kinetyką jego adsorpcji, czy też warunkami temperaturowymi. Wskazuje to jednoznacznie, iż SERS jest techniką, w której warunki pomiaru muszą być w sposób perfekcyjny kontrolowane, jeśli otrzymane wyniki mają być powtarzalne, zrozumiałe i prawdziwe. Dodatkowo, prowadzone badania wskazują raczej na krótko-zasięgowy mechanizm wzmocnienia drgań dla aminokwasów i niewielkich peptydów. 16 Chumanow i inni 16 zaproponowali podział aminokwasów na trzy grupy pod względem sposobu ich oddziaływania z powierzchnią metalu. Do pierwszej grupy zaliczyli aminokwasy alifatyczne (glicyna (Gly), alanina (Ala), walina (Val), cysteina (Cys) i leucyna (Leu)), które zależności od mechanizmu adsorpcji wzmocnienie drgań pierścienia aromatycznego następuje zarówno poprzez mechanizm elektromagnetyczny, jaki i chemiczny. Przykładowo, w widmie SERS Phe (C 2v ) wzmacniane są przede wszystkim drgania o symetrii a 1 (~1601 cm -1, ν 8a ), b 1 (~1000 cm -1, ν 12 ) i b 2 (~1514 cm -1, ν 19b ) wówczas, gdy pierścień Phe zajmuje pozycję prostopadłą w stosunku do powierzchni metalu. Natomiast, w sytuacji równoległego ułożenia pierścienia Phe względem powierzchni metalu wzmacniane są drgania o symetrii a 1, a 2 (1326 cm -1, ν 3 ) i b 1. 16,24 Wielką ciekawość budzą badania SERS cysteiny (Cys) i metioniny (Met), aminokwasów zawierających siarkę w swym łańcuchu bocznym. Mogą one spontanicznie adsorbować na oddziałują z powierzchnią metalu poprzez zjonizowaną grupę karboksylową (w widmie SERS elektrodzie srebrowej, 56,73,74 jakkolwiek Cys z łatwością tworzy wiązania disiarczkowe. obserwuje się charakterystyczne pasma pochodzące od drgań ν s (COO - ) i ν(c-coo - ) pojawiające się, odpowiednio, przy około 920 i 1390 cm -1 ) i sprotonowaną grupę aminową (pasma drgań δ(nh + 3 ) w zakresie częstości 1120-1140 cm -1 ). 16,60,70 Grupę drugą stanowiły: kwas asparaginowy (Asp) i glutaminowy (Glu), których oddziaływanie z metalem odbywa się poprzez dwie grupy Właściwości elektrochemiczne Cys zaadsorbowanej na powierzchni różnych typów elektrod 69,75,76 i na koloidalnym srebrze 70,77, a także badania in situ warstwy Cys na Au(III) 78-80 przy użyciu skaningowej mikroskopii tunelowej (STM) oraz Met zaadsorbowanej na powierzchni koloidalnego srebra 70,73 i elektrody srebrowej 69 wykazały, iż aminokwasy te oddziałują z karbksylowe i jedną aminową. 16,69 Należy wspomnieć, iż w widmach SERS tych dwóch powierzchnią metalu przede wszystkim przez grupę karboksylową i aminową, jak również aminokwasów oraz ich pochodnych (asparagina (Asn) i glutamina (Gln)) dodatkowo obserwowano pasma pochodzące od drgań szkieletowych (ν(cc)) i grup CH 2 - (δ(ch 2 )). Jest to możliwe dzięki obecności w tych cząsteczkach dodatkowych miejsc adsorpcji, które zmniejszają efektywną odległość pomiędzy daną grupą atomów, a powierzchnią metalu. Natomiast do grupy trzeciej zaliczono aminokwasy aromatyczne (fenyloalanina (Phe), histydyna (His), tyrozyna (Tyr) i tryptofan (Trp)), które adsorbując się poprzez grupę karboksylową i ewentualnie pierścień aromatyczny powodując najintensywniejsze spośród wszystkich aminokwasów widma SERS. 61-65,67,69,70 Wzmocnienie to zostało przypisane tworzeniu kompleksów pomiędzy π-elektronowym systemem pierścienia, a powierzchnią metalu. 61-65,69,70 Profile wzbudzeń SERS wskazują, iż w poprzez atom siarki łańcucha bocznego (pasmo SERS drgania ν(cs) w zakresie częstości 620-750 cm -1 ). Praktycznie, w obecności mostka disiarczkowego, adsorpcja powoduje zerwanie wiązania S-S, jakkolwiek w widmach SERS można obserwować drganie ν(ss), które nie adsorbuje się na powierzchni metalu lecz pojawia się w jej pobliżu. 72,91 Spośród badania adsorpcji peptydów najwięcej kontrowersji dotyczyło dipeptydu glicyny (Gly-Gly). 24,60,62,65 Suh 60,65 i Nabiev 62 pokazali, iż dipeptyd ten oddziałuje z powierzchnią srebra bezpośrednio poprzez grupę karboksylową, podczas gdy Garrell 24 wykazał, iż adsorbuje się on na nanocząsteczkach srebra poprzez grupę aminową. Rozwiązanie tego zagadnienia przyniosły nasze badania. 70 W pomiarach SERS zależnych od czasu wykazaliśmy, iż dipeptyd ten początkowo adsorbuje się głównie poprzez grupę karboksylową, a po upływie kilku dni następuje 19 20

najprawdopodobniej zmiana struktury koloidu przedstawił wyniki SERS otrzymane srebra, co powoduje przeorientowanie dla peptydów zawierających resztę Cys Met homodipeptydu glicyny, która wiąże się do powierzchni grupą aminową. Ten przykład dobitnie wskazuje, jak decydujące na otrzymane Trp, które charakteryzowały się silnym pasmem pochodzącym od grupy aminowej i słabym pasmem Cy s Met Gly wyniki jest zachowanie warunków przygotowania próbki i potem jej pomiaru. A więc otrzymany charakterystycznym dla grupy karboksylowej (np. Trp-Gly i Trp-Gly- Gly Ala Leu wynik sugeruje, iż agregacja koloidu i stężenie Gly-Gly na powierzchni lub między ziarnami Gly). Co ciekawe, udowodnił on, iż atom azotu indolowego pierścienia Trp Leu Val Pro metalu srebra zmieniają się w czasie wymuszając zmiany orientacji i sposobu wiązania się tego wiąże się z powierzchnią metalu tylko w sytuacji, gdy reszta Trp zajmuje Ile Pro Phe dipeptydu. Widma SERS peptydów pozycję C-terminalną peptydu. Z Phe 500 1000 1500 przesunięcie ramanowskie (cm -1 ) zawierających aromatyczne aminokwasy w kolei, Watanabe i Maeda 56 pokazali, iż łańcuchu bocznym charakteryzują się mostek disiarczkowy cystyny (Cys- Tyr Rysunek 5. Widma SERS aminokwasów zaadsorbowanych na powierzchni koloidalnego srebra [E. Podstawka, Y. Ozaki, L. M. Proniewicz, Part I: Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Investigation of Amino Acids and Their Homodipeptides Adsorbed on Colloidal Silver, Appl. Spectrosc., 58 (2004) 570, za pozwoleniem intensywnymi pasmami pochodzącymi od drgań pierścieni aromatycznych (np. Phe-Gly, Gly-Phe, Phe-Val, Phe-Ala, Tyr-Gly, Trp-Leu), 16,24,72,81 co Cys) ulega redukcji do tioli przy ujemnym potencjale elektrody srebrowej, przy czym proces ten jest 1600 1400 1200 1000 800 600 przesunięcie ramanowskie (cm - 1 ) Trp wskazuje na udział tych pierścieni w aktywnym oddziaływaniu peptydu z metalem. Dodatkowo, szereg badań SERS na niewielkich peptydach pokazuje, iż oddziaływują one z powierzchnią srebra poprzez grupę karboksylową (np. Leu-Leu i Pro-Pro, Phe-Val, Gly-Phe, Gly-Tyr, Gly-Trp odwracalny przy dodatnim potencjale. Natomiast Podstawka i współ. 70 pokazali, że cystyna zaadsorbowana na Rysunek 6. Widma SERS dipeptydów zaadsorbowanych na powierzchni elektrody srebrowej [przystosowane ze S. Stewart, P. M. Fredericks, Surface-enhanced Raman spectroscopy of peptides and proteins adsorbed on an electrochemically prepared silver surface, Spectrochim. Acta, Part A, 55 (1999) 1615, za pozwoleniem Elsevier]. Ala-Gln, Gly-Glu, Ser-Gly, Phe-Gly-Gly-Phe, poli-ala, poli-phe, czy poli-lys). 63,70,72,81,82 Jakkolwiek, Herne 24 oraz Podstawka i współp. 70 wykazali, iż niektóre z tych peptydów adsorbują się na powierzchni srebra nie tylko przez grupę karboksylową, ale również angażują do tego procesu grupę aminową (np. Met- i Leu-enkefaliny, Cys-Cys i Met-Met). Natomiast Lee 23 (lub leżąca w pobliżu) powierzchni koloidalnego srebra zachowuje mostek disiarczkowy. Dodatkowo, wykazaliśmy, 70 że struktura Met w jej różnych dipeptydach (X-Met i Met-X, gdzie: X=Gly, Leu, Pro i Phe) zaadsorbowanych na koloidalnym srebrze silnie zależy od związanego z nią aminokwasu. 71 Widma SERS tych peptydów, za wyjątkiem Phe-Met, zawierają pasma drgań 21 22

.. Tyr-Gly Trp-Leu Met-Phe 1600 1400 1200 1000 800 600 przesunięcie ramanowskie (cm -1 ) Rysunek 7. Widma SERS dipeptydów zaadsorbowanych na powierzchni elektrody srebrowej [przystosowane ze S. Stewart, P. M. Fredericks, Surface-enhanced Raman spectroscopy of peptides and proteins adsorbed on an electrochemically prepared silver surface, Spectrochim. Acta, Part A, 55 (1999) 1615, za pozwoleniem Elsevier]. rozciągających ν(c COO ) i ν(coo ), odpowiednio, w zakresie 920 930 i 1380 1396 cm 1 i pasma drgań ν(cs), co świadczy o ich oddziaływaniu z powierzchnią przez atom siarki i. grupę karboksylową. Ponadto, zaobserwowano. niskiej intensywności pasma drgań grupy aminowej, co może sugerować, iż grupa ta w pewnym stopniu również jest odpowiedzialna za oddziaływanie peptydów z metalem lub znajduje się w jego pobliżu. 71 Pro-Pro-Thr-(DOPA)-Lys-Ala (x8) występujących w pobliżu chymotrypsyny (AMBA-Cys-Glu-Cys-Glu, AMBA = kwas p- aminometylobenzoil-p-benzoesowy) wiążą się do powierzchni złota wymuszając prostopadłe ustawienie szkieletu polipeptydowego względem powierzchni. 6.2. Białka niehemowe Spektroskopia Ramana (RS) jest szeroko stosowana do badań białek niehemowych. Analiza widm RS daje informacje na temat łańcucha polipeptydowego i jego konformacji, obecności i geometrii mostków disiarczkowych, wpływu rozpuszczalnika na łańcuchy boczne, takie jak: Tyr, Trp, czy Met. W technice SERS informacje te uzyskuje się jedynie z fragmentu białka, który jest w bliskim kontakcie z powierzchnia metalu. Widma SERS białek różnią się od ich widm Ramana nie tylko pod względem ilości i częstości obserwowanych pasm, ale również ich intensywności. Różnice te w sposób prosty zależą od różnych mechanizmów wzmocnienia RS i SERS. 83 Po pierwsze, widma RS i SERS są obrazem Ooka 51 w badaniach peptydów zawierających różnych fragmentów struktury białka. Po drugie, fizyko- lub chemisorpcja białek na powierzchni DOPA (3,4-dihydroksyfenyloalanina) (Thr-(DOPA)-Lys- Ala, Pro-Thr-(DOPA)-Lys-Ala, Prp-Pro-Thr-(DOPA)- Lys-Ala) będących analogami białek adhezyjnych z morskiego omułka Mytilus edulis wykazał, iż związki te adsorbują się na złocie przez atom tlenu cząsteczki DOPA i pierwszorzędową grupę aminową oraz, że sekwencja diproliny wywołuje naprężenia konformacyjne, co ma decydujący wpływ na struktury i sposób zaadsorbowania się badanych peptydów. Z kolei, Bass i współ. 50 pokazli, iż reszty Cys w peptydach Pro-Thr-(DOPA)-Lys-Ala (x2) Thr-(DOPA)-Lys-Ala 400 800 1200 1600 przesunięcie ramanowskie (cm -1 ) Rysunek 8. Widma SERS peptydów zaadsorbowanych na powierzchni koloidalnego złota [A. A. Ooka, R. L. Garrell, Surface-enhanced Raman spectroscopy of DOPA-containing peptides related to adhesive protein of marine muszel, mytilus edulis, Biopolymers (Biospectroscopy), 57 (2000) 92, za pozwoleniem Wiley Publisher Science]. metalu wywołuje zmiany w ich strukturze. Po trzecie, reszty łańcuchów bocznych białka oddziałują z powierzchnią metalu zwiększając odległość innych fragmentów białka, np. wiązań amidowych, od powierzchni metalu, w wyniku czego pasma od tych fragmentów są niewidoczne w widmach SERS. Przyjmuje się, iż białka winny adsorbować się na powierzchni srebra poprzez aminokwasy, które wiążą się z tym metalem. Preferowane są: Cys (wolna para elektronowa siarki), His, Trp (wolna para elektronowa azotu pierścienia aromatycznego), Phe (π-elektronowy system), Tyr (πelektronowy system i wolna para elektronowa tlenu) i w wysokich ph zasadowe aminokwasy: Lys i Arg. Z kolei, kwasowe aminokwasy, Asp i Glu, powinny brać udział w oddziaływaniu białka z metalem, gdy ich grupy karbonylowe uległy deprotonacji. 84 23 24

Jak do tej pory, ze względu na brak powtarzalności wyników (bardzo skomplikowany układ pomiarowy), niewiele białek zostało przebadanych przy użyciu techniki SERS. 16,61,62,72,83,85-91 W latach 80-tych uzyskano pierwsze widma SERS polipeptydów i białek rozpuszczalnych w wodzie: Leu-Ile-Val, specyficznych Leu-białek z periplazmatycznej przestrzeni E. coli 92, oksydazy glukozowe 93, białka wiążące ryboflawiny 94 i inne 94-96. W rzeczywistości, nie ma pełnego srebrze (ν(c=o) przy 1728, 1695, 1673, 1585 i 1418 cm -1 ). 90 Jakkolwiek, nie zdefiniowano pasm amidu I i III, co wytłumaczono maskowaniem ich przez silne rozproszenie pochodzące od aromatycznych aminokwasów. Natomiast dla BSA i lizozymu zaadsorbowanego na elektrodzie srebrowej na podstawie obserwacji częstości pasma amidu I w widmach SERS stwierdzono, iż BSA oddziaływuje z powierzchnią przede wszystkim prze α-helisę, natomiast wiązanie insuliny i logicznego przypisania obserwowanych pasm SERS występujących w widmach białek następuje poprzez jej fragment o strukturze nieuporządkowanej. 72 Z kolei badania SERS na odpowiednim drganiom, za wyjątkiem może albuminy z surowicy wołu (BSA) 16,72,83,86, immunoglobuliny G (IgG) 72,90, lizozymu 16,64,72,86,87,89,91, czy insuliny, oxytocyny (OXT), α- chypotrypsyny (α-cht), inhibitoru trypsyny wyizolowanego z soji (STI) i inhibitoru z Streptomyces Subtilisin (SSI) 72,91,97,98. Jakkolwiek, część z tych przypisań pozostaje w dalszym koloidalnym srebrze α-cht, insuliny, lizozymu, oxytocyny, SST i SSI pokazują, iż wszystkie te białka oddziałują z powierzchni srebra przede wszystkim przez α-helisę i atomy siarki, za wyjątkiem STI. W ciągu przedmiotem dyskusji badaczy. Widma SERS białek niehemowych zawierają głównie pasma od drgań pierścieni aromatycznych aminokwasów, co potwierdza wysokie powinowactwo tych aminokwasów do metalu i wskazuję, iż reszty te biorą udział w oddziaływaniu białek z powierzchnią metalu lub znajdują się blisko powierzchni metalicznej. Warto nadmienić, iż w widmie SERS lizozymu, białka zawierającego trzy Phe, drganie oddychające pierścienia spodziewane przy ~1000 cm -1 nie występuje. Fakt ten sugeruje, iż łańcuch boczny zawierający reszty Phe znajduje się daleko od powierzchni metalu. W widmach białek dodatkowo obserwuje się pasma od innych grup. 76,84,99 W przypadku IgG zaadsorbowanej na elektrodzie srebrowej analiza widma wskazuje, że mostek disiarczkowy tego białka oddziałuje z powierzchnią metalu poprzez jeden atom siarki (ν(ss) przy 509 cm -1 i ν(cs) przy 667 cm -1 ) za wyjątkiem wysokiego ph, w którym następuje dysocjacja wiązania S-S (ν(sh) przy 2581 cm -1 ). Grupy karbonylowe Asp i Glu biorą również udział w adsorpcji na wiązanie to zaangażowane jest także grupa iminowa Trp i His. 91 Ponadto, Trp oddziałując z metalem przyjmuje kątowe ułożenie pierścienia indolowego względem metalu, a Tyr adsorbuje się poprzez grupę hydroksylową. Natomiast mostek(i) disiarczkowy(e) w α-cht, insulinie, lizozymie, OXT i SSI wiąże(ą) się do srebra bez rozerwania (ν(ss) przy 511-515 dla GGG, 527-530 dla TGG i 543-546 cm -1 dla TGT konformeru). Być może obecność drgania ν(ss) α-cht insulina lizozym OXT STI SSI Rysunek 9. Widma SERS α-chypotrypsyny (α-cht), insuliny, lizozymu, oxytocyny (OXT), inhibitoru trypsyny (STI) i inhibitoru z Streptomyces Subtilisin (SSI) [E. Podstawka, Y. Ozaki, L. M. Proniewicz, Adsorption of S S Containing Proteins on a Colloidal Silver Surface Studied by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, Appl. Spectrosc., 58 (2004) w druku, za pozwoleniem Society for Applied Spectroscopy]. 25 26

świadczy o tym, iż mostek disiarczkowy nie jest bezpośrednio związany z powierzchnią koloidalnego srebra, lecz jedynie pozostaje w jego najbliższej odległości. Białka te oddziałują z powierzchnią srebra również poprzez grupę karboksylową (ν s (COO - ) i ν(c-coo - ) są obserwowane, odpowiednio, przy około 1390 i 908-936 cm -1 ). 91 6.3. Hemoproteidy Kolejnym dowodem na oddziaływanie białek z powierzchnią metalu poprzez grupę karboksylową są widma SERRS cytochromów, oxyhemoglobiny i związków modelowych hemu. Widma te pokazują, iż pierścień hemu wiąże się z powierzchnia metalu głównie przez podstawniki propionowe. 100 Rezonansowe wzmocnienie obserwowane w powierzchniowo wzmocnionym rezonansowym efekcie Ramana (SERRS) wzmacnia sygnał dodatkowo o 10 2-10 3. Obok czułości, jak już wspomniano, selektywność jest dodatkową i wielką zaletą SERRS. Na przykład, pomiar widma SERRS cytochromu cd 1 zaadsorbowanego na powierzchni elektrody srebrowej umożliwił selektywne wzmocnienie albo tylko hemu c albo tylko hemu d 1, co nie było możliwe przy trudniej utlenialna, (2) jego potencjał oksydacyjny jest wyższy aniżeli Ag, co pozwala na szerokie jego stosowanie w badaniach reakcji oks- i redoks na elektrodach, (3) możliwe także, iż hemoproteidy zaadsorbowane na powierzchni Au będą w mniejszym stopniu ulegać denaturacji. Po pierwszych doniesieniach SERRS dla cytochromu c 12 szereg badań przeprowadzono na cytochromie c 46,89,101-107 i innych cytochromach, np. cytochromie cd 13,108 1, cytochromie c 109-111 3 i cytochromie P450 111-116, jak również ma hemoglobinie (Hb) 100,117, mioglobinie (Mb) 12, czy peroksydazie tyroidowej (HTI) 116. Przebadano także strukturalnie podobne cytochromy do P450, czyli PB 3a i PB 3b (97% zgodności strukturalnej), a wyniki badań pokazały jednoznacznie, iż cytochromy te maja różne otoczenia hemu. 114 Przeprowadzone badania wykazały, iż obserwowane zmiany strukturalne mogą być spowodowane warunkami, które nie są związane z oddziaływaniem hemoproteidu z powierzchnią metalu. Na przykład, w hemoproteidach zaadsorbowanych na powierzchni koloidalnego srebra otrzymanego poprzez redukcje AgNO 3 borowodorkiem litu hem tworzy µ-okso dimery. 106 Zaobserwowano, iż liczba tworzących się dimerów jest większa w przypadku Hb i cytochromu b, aniżeli dla cytochromu c. Wynik ten wskazuje, iż hem w Hb i wykorzystaniu RR. 13 Technika ta pozwala więc na wysoce selektywne badanie fragmentów cytochromie b jest niekowalencyjne związany z białkiem, w przeciwieństwie do cytochromu c, co struktur grup prostetycznych białek przenoszących tlen molekularny, centrów aktywnych kataliz, reakcji redoks zachodzących w cytochromach i procesów fotochemicznych mających miejsce w z kolei wpływa na stabilność tych białek. Przyczynę dysocjacji wiązań hem-białko upatrywano w zmianach ładunku powierzchniowego i efektach agregacji, aby następnie przypisać obserwowane chlorofilach. W widmach SERRS, podobnie jak w widmach rezonansowego efektu Ramana (RR), zjawisko obecności jonów Ag + w roztworze. Natomiast wykazano, że hemoproteidy pasma od białka nie są wzmacniane. Obserwuje się więc tylko pasma pochodzące od drgań hemu zaadsorbowane na powierzchni koloidalnego srebra zredukowanego cytrynianem sodowym będącego w rezonansie z linia wzbudzającą, przy czym czułość SERRS jest wyższa aniżeli RR. zachowują swą natywną formę. 12,107 Efekt ten przypisano adsorpcji na powierzchni koloidu Srebro jest powszechnie używanym metalem w SERRS, podczas gdy złoto zaczyna odgrywać ogromne znaczenie, jakkolwiek kontrola jego stabilności i odtwarzalności struktury powierzchni pozostawia jeszcze wiele do życzenia. Tym samym wyniki te są często nie powtarzalne. Złoto ma bowiem wiele zalet w stosunku do srebra: (1) jego powierzchnia jest cytrynianu lub produktów jego utlenienia, które chronią białko przed bezpośrednią jego adsorpcją na powierzchni metalu, co chroni białko przed denaturacją. 115,118 Wyniki te dobitnie wskazują, co już podkreślano w tej pracy, iż sposób przygotowania substratu, a następnie prowadzona adsorpcja w sposób decydujący wpływa na kształt widma SER(R)S, a tym samym na interpretacje 27 28

otrzymanych wyników. Eksperymenty te pokazały dodatkowo, iż wzbudzenie SERRS przebiega zgodnie z spodziewanym mechanizmem EME. 37,119 Zredukowane białka są znacznie trwalsze na powierzchni koloidalnego srebra. 120 Analiza widm SERRS niskiego zakresu (zakres występowania pasm czułych na strukturę hemu i oddziaływania hem-białko) pokazuje, iż widma te są praktycznie identyczne z widmami RR, co białko jest zaadsorbowane na elektrodzie o ujemnym potencjale. Stwierdzono zatem, iż zachowanie adsorpcyjne białka silnie zależy od potencjału elektrod, czego w sumie należało się spodziewać. Otrzymano także widma SERRS cytochromu c zaadsorbowanego na elektrodzie w temperaturze ciekłego azotu. 108 6.4. Pirymidyny, puryny, DNA sugeruje, że adsorpcja białka na powierzchni metalu nie powoduje zmian w oddziaływaniu hem- Obiektem intensywnych badań RRS (Fe +2 -cytochrom c) białko. Jakkolwiek, w widmie deoksy Hb pasmo drgania rozciągającego wiązania Fe-His (ν(fe- His)) ulega przesunięciu z 215 do 200 cm -1, co wskazuje na pewne zmiany konfirmacyjne hemu w SERS są również zasady purynowe i pirymidynowe. Wyniki badań nad tymi SERRS (Fe +2 -cytochrom c) na AgORC elektrodzie zaadsorbowanym białku. Poszerzenie tego pasma, dodatkowo wskazywało na heterogeniczność otoczenia hemu w tetramerycznej cząsteczce Hb. 86 związkami zebrane są w wielu artykułach 46,82,89,101,102 Spośród nich SERRS (Fe +2 -cytochrom c) na AgFON elektrodzie Hilderbrant i Stockbourger 103 pokazali, że cytochrom c zaadsorbowany na koloidalnym srebrze wykazuje temperaturowo zależną odwracalną artykuł przeglądowy Paisley i Morris jest znakomitym podsumowaniem eksperymentów prowadzonych do 1987 SERRS (Fe +2 -cytochrom c) na AgFON/6-MHA elektrodzie 1600 1400 1200 1000 oxyhb (Fe +3 PP) 2 O 1000 1200 1400 1600 przesunięcie ramanowskie (cm -1 ) Rysunek 10. Widma SERRS oxy hemoglobiny i (Fe +3 PP) 2 O zaadsorbowanej na koloidalnym srebrze [J. degroot, R. G. Hester, Surfaceenhanced resonance Raman spectroscopy of oxyhemoglobin adsorbed onto colloidal silver, J. Phys. Chem., 91 (1987) 1693, za pozwoleniem American American Chemical Society]. równowagę stanu spinowego. W niskich temperaturach dominująca część hemu występuje w formie wysoko-spinowej. Natomiast cytochrom c na elektrodzie Ag ulega zazwyczaj fotodegradacji, która odpowiedzialna jest za zmiany obserwowane w widmie SERRS. Po 25 s naświetlania przechodzi on z natywnego stanu nisko-spinowego do zdenaturowanego wysoko-spinowego. Badacze wykazali, że potencjał redoks zaadsorbowanego cytochromu c jest identyczny z tym w roztworze, gdy roku. 82 Pierwsze badania SERS nad zasadami purynowymi i pirymidynowymi miały na celu Rysunek 11. Widma RRS i SERRS Fe +2 cytochromu c zaadsorbowanego na różnych powierzchniach srebrowych [L. A. Disk, A. J. Haes, R. P. Van Duyne, Distance and Orientation Dependence of Heterogeneous Electron Transfer: A Surface- Enhanced Resonance Raman Scattering Study of Cytochrome c Bound to Carboxylic Acid Terminated Alkanethiols Adsorbed on Silver Electrodes, J. Phys. Chem. B, 104 (2000) 11752, za pozwoleniem American Chemical Society]. określenie orientacji tych związków na powierzchni metalicznej poprzez analizę intensywności pasm. Podobnie, jak w przypadku aminokwasów i tu pojawiły się niezgodności w publikowanych widmach. I tak, adenina (A) daje intensywne widmo SERS. Przy niskich stężeniach (poniżej 10-5 M) pierścień A przyjmuje równolegle ułożenie do powierzchni metalu. W wysokich stężeniach pierścień jest zorientowany prostopadle do powierzchni srebra wiążąc się poprzez grupę aminową. W tym wypadku procesy stężeniowe są dominujące i sposób adsorpcji A nie zależy od potencjału elektrody. Jeśli grupa aminowa jest metylowana to A przyjmuje dwie różne orientacje przy 29 30

potencjale -0.2 i -0.7 V. Przy potencjale dodatnim jej pierścień jest ustawiony praktycznie prostopadle do powierzchni elektrody, podczas gdy przy -0.7 V równolegle. Na tej podstawie DNA jest związane ze znacznymi zmianami obserwowanymi w widmie SERS, co wynika ze zmian w oddziaływaniu tych cząsteczek z powierzchnią metalu. Orientacje, jakie mononukleotydy Otto 121 stwierdził, że grupa aminowa odgrywa ważną role w procesie adsorpcji adeniny. przyjmują na powierzchni elektrody są tłumaczone poprzez oddziaływanie pola elektrycznego Dodatkowo, Itoh 122 wykazał, iż orientacja 9-metyloadeniny na elektrodzie srebrowej jest zależna od ph i potencjału tej elektrody. Nabiev 123 pokazał, że na koloidzie srebra aktywowanym NaCl tylko dadp daje intensywne widmo, ale tylko w sytuacji, gdy do koloidu dodana jest równomolowa mieszanina nukleotydów. Nieaktywowany koloid nie wyróżnia pod względem intensywności widma żadnego z nukleotydów. Cytozyna (C) i tymina (T) zazwyczaj orientują się prostopadle do powierzchni srebra, jakkolwiek ich elektrody z ładunkiem i momentem dipolowym adsorbatu. Na przykład, na elektrodzie naładowanej dodatnio (-0.1 V), ładunek reszty OPO 2-3 w 3 CMP (3 -monofosforan cytozyny) determinuje jego orientację. 3 CMP adsorbuje się więc bezpośrednio poprzez grupę fosforanową (pasmo przy 236 cm -1 ), a pierścień cytozyny skierowany jest w kierunku roztworu w pewnej odległości od powierzchni (brak sygnału w widmie SERS). 62,89,126 Zaadsorbowana ryboza znajduje się prawdopodobnie w odległości 0.6 nm od powierzchni metalu, podczas gdy pierścień cytozyny w odległości 1 nm. Eksperyment ten wskazuje na zależność wielkości wzmocnienia sygnału SERS damp dgmp dcmp dtm P 1500 1000 500 przesunięcie ramanowskie (cm -1 ) Rysunek 12. Widma SERS dezoksynukleotydów zaadsorbowanych na nie aktywowanym koloidzie srebra [I. R. Nabiev, K. V. Sokolov, O. N. Voloshin, Surface-enhanced Raman spectroscopy of Biomolecules. Part III: Determination of the local Destabilization regions in the double helix, J. Raman Spectrosc., 21 (1990) 333, za pozwoleniem John orientacja jest ściśle zależna od ph, stężenia i obecności jonów przeciwnych. Lee 124 pokazał, że cytozyna i jej pochodna 5 -rcmp zmieniają orientację wraz ze zmianą stężenia, przy czym 5 - rcmp zmienia dodatkowo swe ułożenie pod wpływem zmian ph. Natomiast uracyl (U) daje intensywne widma SERS na elektrodzie srebrowej i na koloidalnym srebrze. Jest to prawdopodobnie wynikiem zmian zachodzących w orientacji pirymidyny pod wpływem zmian potencjału powierzchni. 125 Dodanie do zasad purynowych i pirymidynowych reszt rybozy i grupy fosforanowej, a zatem badanie mono-, di- i polinukleotydów, czy od odległości określonych fragmentów cząsteczki od powierzchni metalu. Natomiast, przy zmianie potencjału elektrody do -0.6 V w widmie SERS 3 CMP, w zakresie częstości od 790 do 1650 cm -1 pojawia się szereg pasm, a pasmo 236 cm -1 przypisane oddziaływaniu Agmonofosforan praktycznie zanika. Spośród tych pasm, to obserwowane przy 798 cm -1 jest pasmem charakterystycznym cytozyny i pochodzi od drgań oddychających jej pierścienia. Pozostałe pasma (1028, 1218, 1304, 1510, 1584 i 1645 cm -1 ) są przypisane drganiom szkieletowym cytozyny. 127,128 Widma SERS dinukleotydów, np. ApU (adenylyl(3-5 )-urydyny) i ApC (adenylyl-(3-5 )- cytydyny), w zakresie drgań oddychających, wykazują silną zależność intensywności pasm w zależności od potencjału elektrod. Przy potencjale -0.1 V adenina rozprasza silnie, co sugeruje, iż adsorpcja zachodzi poprzez pierścień A i resztę fosforanową, a zasady U i C są odpychane przez powierzchnię. 89 Natomiast widma SERS polinukleotydów, np. poli-a (podwójna helisa w niskim ph) wskazują na preferencyjne oddziaływanie rybozo-fosforanowego szkieletu z powierzchnią metalu (796 cm -1 ). 89 31 32