Oznaczanie metodą MS mieszaniny pestycydów pozyskanych z materiału roślinnego Prowadzący: Dr Paweł Miśkowiec Miejsce wykonywania ćwiczenia: Ul. Gronostajowa 3 (III Kampus UJ), pok. 032, 033.
Wstęp Spektrometria mas (MS) jest techniką analityczną, której zadaniem jest pomiar stosunku masy do ładunku elektrycznego danego jonu. Zastosowanie spektrometrii mas ze względu na jej uniwersalność oraz duŝy zakres analizowanych mas jest bardzo szerokie, od ochrony środowiska, poprzez analizę składu, chemię sądową aŝ do szeroko pojętych badań biologicznych, biochemicznych i medycznych. Pierwszy spektrometr mas został zbudowany przez Josepha Johna Thompsona 1 w 1911 roku. Współcześnie istnieje szereg odmian tej techniki, z których kaŝda posiada inne zastosowanie i wymaga stosowania spektrometrów o innej konstrukcji. Podstawy metody i aparatura Działanie tradycyjnego spektrometru mas opiera się na zjawisku rozdziału strumienia jonów badanej substancji w polu elektrycznym lub/i magnetycznym. Strumień ten moŝe być odchylany pod róŝnym kątem, bądź przyspieszany z przyspieszeniem zaleŝnym od stosunku masy do ładunku. Wszystkie cząsteczki analizowane w spektrometrze mas muszą mieć zatem ładunek elektryczny. Wewnątrz spektrometru mas panuje wysoka próŝnia, dzięki czemu ruch jonów nie jest zakłócany przez zderzenia z cząsteczkami gazów. Typowy spektrometr mas składa się z następujących części: układ wprowadzania próbki, źródło jonów, analizator jonów, detektor oraz rejestrator danych. NajwaŜniejszymi i decydującymi o parametrach (oraz cenie) spektrometru częściami są jonizator oraz analizator. Podział najpopularniejszych metod jonizacji próbki: jonizacja elektronami (EI), jonizacja chemiczna (CI), elektrorozpylanie (ESI), termorozpylanie (TE), bombardowanie szybkimi atomami (FAB), jonizacja plazmą wzbudzoną indukcyjnie (ICP), jonizacja/desorpcja laserowa wspomagana matrycą (MALDI). Najczęściej wykorzystywanymi analizatorami z kolei są: analizator kwadrupolowy (Q), pułapka jonowa (IT), analizator czasu przelotu (TOF), sektor magnetyczny (B), Analizator cyklotronowego rezonansu jonów (ICR), Orbitrap. Detektorami w metodzie MS są: powielacz elektronowy, detektor mikrokanalikowy, fotopowielacz. 1 W 1906 r. J. J. Thompson otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie fizyki w uznaniu zasług za teoretyczne i eksperymentalne badania nad przewodnictwem elektrycznym gazów, które doprowadziły do odkrycia elektronu 2
Zasada działania jonizatora typu elektrorozpylanie: W powyŝszej metodzie jonizacji, próbka w stanie ciekłym rozpylana jest pod ciśnieniem atmosferycznym w komorze nebulizującej. Jednocześnie pomiędzy igłą nebulizera, a wlotem do spektrometru przyłoŝone jest napięcie rzędu 4kV. Dzięki temu na formujących się kroplach ładunek elektryczny ulega uporządkowaniu. Jednocześnie pod wpływem gazu osuszającego, którym najczęściej jest azot, rozpuszczalnik paruje z naładowanej kropli, aŝ do osiągnięcia momentu, gdy siły napięcia powierzchniowego zostaną zrównowaŝone przez siły odpychania kulombowskiego. W tym momencie kropla ulega tzw. eksplozji kulombowskiej, która doprowadza do utworzenia wielu mniejszych, bardziej stabilnych kropelek. Nowe kropelki ulegają dalszej desolwatacji i kolejnym eksplozjom kulombowskim. Kolejny etap zaleŝy od natury analitu. Generalnie wyróŝniamy tu dwa warianty: a) wariant desorpcja jonu z kropli do fazy gazowej w wyniku działania pola elektrycznego, b) wariant odparowanie rozpuszczalnika do sucha (mechanizm ten dotyczy duŝych, polarnych cząsteczek). Zasada działania pułapki jonowej: Pułapka jonowa jest analizatorem działającym na podobnej zasadzie co jeden z najpopularniejszych analizatorów analizator kwadrupolowy. Pozwala jednak na przetrzymywanie w jej wnętrzu jonów. Składa się ona z dwóch stoŝkowych pokryw, do których przyłoŝone jest zmienne napięcie elektryczne oraz elektrody pierścieniowej do której przyłoŝony jest zmienny prąd elektryczny o wysokiej częstości. Zmieniając parametry prądu elektrycznego moŝna uwięzić w pułapce jony o określonym stosunku masy do ładunku (m/z) lub jony o szerokim zakresie m/z. Wyrzucane jony trafiają bezpośrednio do detektora. WaŜnym atutem pułapki jonowej jest moŝliwość izolacji jonów o określonym m/z. Wybrany jon moŝe zostać poddany wówczas fragmentacji przez zderzenia z cząsteczkami helu. W ten sposób pułapka jonowa moŝe zastąpić tandemowy spektrometr mas. Rys. schemat pułapki jonowej (za zgodą Bruker Daltonics). 3
Pestycycdy jako przykłady niskocząsteczkowych związków aktywnych biologicznie Pestycydy (łac. pestis zaraza, pomór, caedo zabijam) ogół substancji pochodzenia naturalnego lub uzyskanych na drodze syntezy, stosowanych do zwalczania niepoŝądanych organizmów. UŜywane głównie w rolnictwie do ochrony roślin uprawnych, lasów, zbiorników wodnych, ale równieŝ zwierząt, ludzi, czy produktów Ŝywnościowych, a takŝe do niszczenia Ŝywych organizmów, uznanych za szkodliwe, w budynkach inwentarskich, mieszkalnych, szpitalnych i magazynach. Podział pestycydów w zaleŝności od kierunku zastosowania I. Zoocydy - środki do zwalczania szkodników zwierzęcych: 1. Insektycydy - środki owadobójcze (Karbaryl), 2. Rodentycydy - środki gryzoniobójcze, 3. Moluskocydy - środki mięczakobójcze, 4. Nematocydy - środki nicieniobójcze, 5. Larwicydy - środki larwobójcze, 6. Aficydy - środki mszycobójcze, 7. Akarycydy - środki roztoczobójcze, 8. Owicydy - środki do niszczenia jaj owadów i roztoczy. II. Fungicydy - środki grzybobójcze. (Nimrod, Topsin) III. Herbicydy - środki chwastobójcze (Roundup). IV. Regulatory wzrostu - środki stymulujące lub hamujące procesy Ŝyciowe roślin: V. Atraktanty - środki zwabiające. VI. Repelenty - środki odstraszające. Podział pestycydów pod względem chemicznym I. Pestycydy nieorganiczne coraz rzadziej uŝywane: 1. Insektycydy arsenowe: zieleń paryska Cu(CH 3 COO) 2.Cu 3 (AsO 2 ) 2, arsenian ołowiu PbHAsO 4, 2. Insektycydy fluorkowe: kryolit Na 3 AlF 6, fluorek sodu NaF, fluorokrzemian sodu Na 2 SiF 6, 3. Herbicydy nieorganiczne: amidosulfonian amonu H 2 NS(O 2 )ONH 4, boraks Na 2 B 4 O 7, chloran sodu NaClO 3, 4. Fungicydy nieorganiczne: zasadowy chlorek miedzi(ii) 3Cu(OH) 2.CuCl 2.H 2 O, ciecz bordoska 3Cu(OH) 2.CuSO 4.CaSO 4, siarka. II. Pestycydy organiczne: 1. Pestycydy chlororganiczne, np. HCH, DDT, metoksychlor, 2. Pestycydy fosforoorganiczne, np. monokrotofos, chlorfenwinfos, fenitrotion, 3. Karbaminiany, np. aminokarb, propoksur, karbaryl, 4. Pochodne kwasu fenoksyoctowego, np. 2,4-D; 2,4-DB; 2,4,5-T, 5. Benzoimidazole 6. Pochodne triazynowe, np. symazyna, atrazyna, propazyna. 7. Pochodne pirymidyny SprzedaŜ poszczególnych rodzajów środków ochrony roślin w Polsce w 2012 roku przedstawia tabela w załączniku do niniejszego ćwiczenia. WaŜnymi ze względu na ochronę środowiska oraz zdrowia ludności jest przestrzeganie okresu karencji i okresu prewencji. 4
Ćwiczenie Oznaczanie pestycydów w owocach metodą spektrometrii mas Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest uzyskanie przez studenta umiejętności: - zaplanowania oraz przeprowadzenia modelowania wypłukiwania pestycydów z materiału roślinnego - identyfikacji substancji czynnej danego środka ochrony roślin na bazie otrzymanych widm masowych - interpretacji uzyskanych wyników pod kątem róŝnic w wypłukiwaniu danych pestycydów z materiału roślinnego. Zakres materiału naukowego - rodzaje pestycydów i ich wpływ na organizmy Ŝywe, - okres karencji i okres prewencji pestycydów, - pestycydy a łańcuch pokarmowy, - zasada działania spektrometru mas z jonizacją typu elektrorozpylanie i analizatorem w postaci pułapki jonowej, - pojęcia: m/z, jon molekularny, jon pseudomolekularny, widmo masowe, chromatogram masowy, rodzaje źródeł jonów, rodzaje analizatorów. Literatura podstawowa 1. K. Małek, L. M. Proniewicz [red.] Wybrane metody spektroskopii i spektrometrii molekularnej w analizie strukturalnej, Wyd. UJ, Kraków 2005, str. 185-204 3. 2. W. Szczepaniak Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa 1996, str. 345-358, 376-383. 3. E. Szczepaniec-Cięciak [red] Chemia Środowiska cz. 2. Kraków 1999 str. 173-184. 4. Cygański A Metody spektroskopowe w chemii analitycznej Warszawa 2009str. 398-416.. 5. E. Hoffmann Spektrometria mas, Warszawa 1998 Literatura uzupełniająca 1. M. Biziuk [red] Pestycydy - występowanie oznaczanie i unieszkodliwianie,, Wydawnictwo Naukowo Techniczne, Warszawa 2001. 2. http://sitem.herts.ac.uk/aeru/ppdb/en/ Pesticide Properties DataBase - baza danych większości pestycydów uŝywanych na Świecie. 3. L. RóŜański Przemiany pestycydów w organizmach Ŝywych i środowisku, wyd. Agra-enviro Lab, Poznań 1998. 4. J.R. Dojlido - Chemia wód powierzchniowych, wyd. Ekonomia i Środowisko Białystok 1995 str 220-233. 5. http://www.minrol.gov.pl/pol/informacje-branzowe/produkcja-roslinna/ochrona-roslin strona internetowa Ministerstwa Rolnictwa i Rozwoju Wsi dotycząca m.in. dopuszczenia środków ochrony roślin do obrotu w Polsce. 5
Przyrządy, materiały, odczynniki: 1. Spektrometr mas Bruker Amazon SL. 2. Próbka roslinna (owoc) spryskana przed ćwiczeniami mieszaniną analizowanych fungicydów. 3. Woda dejonizowana, metanol. 4. Roztwory wodne pestycydów sporządzone wg instrukcji producenta. Nimrod 25EC Składnik czynny: Bupirymat Topsin M 500 S.C. Składnik czynny tiofanat metylowy Score 250 EC Składnik czynny difenokonazol 6
Wykonanie ćwiczenia: 1. Przygotowanie spektrometru do pracy poprzez nastrzyk metanolu. 2. Ustalenie i omówienie parametrów pomiarowych dla mieszaniny pestycydów, będących przykładem niskocząsteczkowych związków chemicznych. 3. Przygotowanie preparatu roślinnego (owocu), oraz procedury modelowania wypłukiwania pestycydu z próbki ekstrakcja określoną ilością wody dejonizowanej pestycydu z owocu przez z góry określony czas. 4. Przygotowanie mieszaniny woda z analitem: metanol w stosunku 50:50 (v/v) bez dodatku oraz z dodatkiem donora protonów 1% HCOOH. 5. Bezpośredni nastrzyk tak przygotowanego roztworu do spektrometru mas. 6. Ponowna ekstrakcja pestycydów z owocu przynajmniej dwukrotne powtórzenie czynności z punktów 3 oraz 4. 7. Analiza jakościowa oraz quasi-ilościowa uzyskanych widm pod kątem róŝnic w sposobie wypłukiwania obu pestycydów. Opracowanie wyników 1. Porównanie róŝnic w intensywności sygnałów z dodatkiem i bez dodatku donora protonów. 2. Interpretacja uzyskanych wyników poprzez analizę jakościową widm (sygnał od jonu pseudomolekularnego oraz adduktów) pestycydów, jak równieŝ analizę quasiilościową względnej zmiany stęŝenia obu składników czynnych w kolejnych ekstraktach. 3. Wyciągniecie wniosków odnośnie róŝnic w sposobie jonizacji składników czynnych pestycydów z róŝnych grup (tworzenie adduktów) oraz róŝnic w sposobie ich wypłukiwania z materiału roślinnego. 7
TABELA 1 SPRZEDAŻ I ZAPASY ŚRODKÓW OCHRONY ROŚLIN W POLSCE W ROKU 2012 /dane od producentów i importerów/ ETAP I - Agregacja według rodzajów środków ochrony roślin Rodzaj środków ochrony roślin Kod pozycji Sprzedaż (bez eksportu) Ogółem Producenci Importerzy w kg Zapas Środki owadobójcze I 4 247 356,55 190 276,59 4 057 079,96 364 232,67 Środki chwastobójcze II 38 747 999,25 8 610 058,31 30 137 940,94 6 197 315,23 Regulatory wzrostu III 2 841 960,40 1 090 956,83 1 751 003,57 870 838,56 Środki grzybobójcze IV 14 474 090,39 2 517 101,13 11 956 989,26 3 413 135,06 Środki gryzoniobójcze IV.a 85 595,80 24 000,00 61 595,80 23 340,20 Pozostałe IV.b 1 407 706,99 551 230,39 856 476,60 124 067,40 Suma 61 804 709 12 983 623 48 821 086 10 992 929 TABELA 1 Strona 1 z 1