ROZDZIAŁ 9. gruntów zanieczyszczonych związkami z grupy wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych.

ROZDZIAŁ 9 POŁĄCZENIE HPLC Z NMR I MS JAKO TECHNIKA POZWALAJĄCA NA OKREŚLANIE STRUKTURY CHEMICZNEJ NIEZNANYCH SUBSTANCJI CHEMICZNYCH, OBECNYCH W PRÓBKACH ŚRODOWISKOWYCH Karsten Levsen 1), Alfred Preiss 1) and Manfred Spraul 2) 1) Fraunhofer-Institute of Toxicology and Medical Research, Nikolai-Fuchs-Str. 1, D-30625 Hannover, Niemcy, 2) Bruker BioSpin GmbH, Silberstreifen, D-76287 Rheinstetten, Niemcy STRESZCZENIE Połączenie chromatografu cieczowego ze spektrometrem magnetycznego rezonansu jądrowego (ang. Nuclear Magnetic Resonance NMR) lub spektrometrem masowym (ang. Mass Spectrometry MS) może być z powodzeniem zastosowane do identyfikacji i oznaczania śladowych ilości nielotnych, nieznanych związków (ang. non-target compounds) obecnych w próbkach środowiskowych. Zastosowanie tych technik może być źródłem wzajemnie uzupełniających się informacji o strukturze chemicznej oznaczanych związków. Optymalne informacje o nieznanych składnikach badanych próbek można uzyskać w przypadku, kiedy wszystkie trzy urządzenia połączone są w układzie on-line. W rozdziale omówione są podstawowe zagadnienia związane z wykorzystaniem następujących zestawów: HPLC-NMR, HPLC-MS i HPLC-NMR-MS. Przedstawiono wady i zalety w/w zestawów pomiarowych w określaniu struktury nieznanych związków chemicznych. Wykorzystanie tych technik do badań próbek środowiskowych zostało zilustrowane na przykładzie analizy próbek: zanieczyszczonych wód gruntowych pochodzących z terenów dawnej fabryki amunicji, odcieków ze składowisk odpadów przemysłowych,. ścieków z zakładów tekstylnych, gruntów zanieczyszczonych związkami z grupy wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych. 1. WSTĘP Zanieczyszczenie środowiska, spowodowane olbrzymią liczbą różnorodnych związków chemicznych, stanowi wielkie wyzwanie dla chemika analityka. Szczególny przypadek to obszary gromadzenia odpadów niebezpiecznych, gdzie zarówno gleba jak i wody gruntowe ulegają skażeniu przez złożone mieszaniny organicznych związków o bardzo zróżnicowanej polarności, występujących w szerokim zakresie stężeń. Inny przykład to ścieki przemysłowe, bądź odcieki pochodzące ze składowisk odpadów przemysłowych, gdzie również występują złożone mieszaniny związków stanowiących zanieczyszczenia. Identyfikacja tych substancji jest trudna, gdyż w analizowanych próbkach obecne są nie tylko związki pierwotnie wprowadzone do środowiska. W związku z zachodzącymi w środowisku procesami chemicznymi, fotochemicznymi i mikrobiologicznymi ciągle pojawiają się dodatkowe i często trudne do przewidzenia produkty tych przemian. Monitoring tego rodzaju próbek środowiskowych zwykle ogranicza się do analizy znanych lub oczekiwanych związków bądź klas związków (ang. target analysis), dla których opracowano i zoptymalizowano właściwe procedury analityczne. Natomiast identyfikacja związków nieznanych (ang. non-target analysis) jest znacznie bardziej

skomplikowana. W tym przypadku bowiem, metoda instrumentalna musi się charakteryzować wysoką rozdzielczością, równocześnie dostarczając jak najwięcej informacji o strukturze badanego związku. Ponadto, wykorzystując różne techniki ekstrakcji i rozdzielania, uwzględnić należy bardzo zróżnicowane (a wcześniej nieznane) fizyczne i chemiczne właściwości poszczególnych związków organicznych. Dla związków o wysokiej i średniej lotności, które są termicznie stabilne, właściwą techniką jest chromatografia gazowa połączona ze spektrometrią mas (Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS) z jonizacją elektronową, łączy bowiem w sobie wysoką sprawność rozdzielania chromatograficznego ze specyficznością strukturalną spektrometrii masowej.do celów identyfikacji różnych związków chemicznych oraz rozpoznania mechanizmów fragmentacji jonów molekularnych powstających w warunkach jonizacji elektronowej, dostępne są olbrzymie biblioteki (bazy) dobrze udokumentowanych widm masowych. Ponadto, możliwa jest analiza ilościowa, zwłaszcza przy użyciu izotopowo znaczonego wzorca wewnętrznego, co pozwala uwzględnić zarówno niecałkowity odzysk na etapie wstępnej ekstrakcji próbek, jak i zróżnicowaną względem poszczególnych związków odpowiedź układu detekcyjnego. Znacznie trudniejsze do identyfikacji są obecne w próbkach środowiskowych, nielotne bądź termicznie nietrwałe związki polarne. W przypadku analiz opartych na wykorzystaniu techniki GC oraz GC-MS, otrzymanie na drodze derywatyzacji substancji pochodnych, zwiększa ich lotność. Sposób ten, chociaż czasochłonny, jest często wykorzystywany w przypadku analizy próbek o docelowo znanym składzie substancji. Jego zastosowanie może być jednak utrudnione w sytuacji kiedy związek oznaczany jest kompletnie nieznany. Chociaż wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. High Performance Liquid Chromatography HPLC) jest efektywna w rozdzielaniu związków polarnych i termicznie labilnych, to jednak nie jest ona przystosowana do określania struktury nieznanych związków, nawet jeśli zastosowany zostanie detektor (foto)diodowy (ang. Diode Array Detector DAD). Ponadto, sprawność rozdzielania techniką HPLC jest znacznie niższa w porównaniu z techniką GC, a detekcja z wykorzystaniem detektora DAD możliwa jest tylko w przypadku, kiedy w cząsteczce oznaczanej substancji obecna jest grupa chromoforowa. Więcej informacji o strukturze badanego związku można uzyskać, jeśli połączymy urządzenia do HPLC i MS. Takie połączenie jest obecnie szeroko wykorzystywane przy oznaczaniu nielotnych związków polarnych obecnych w próbkach środowiskowych [1-3]. Choć technika ta jest idealnie dostosowana do oznaczania związków znanych lub takich, których obecność jest oczekiwana (nawet, jeśli brak w nich grupy chromoforowej), to jednak określanie za pomocą tego układu struktury nieznanych związków nadal pozostaje trudne, co w sposób bardziej szczegółowy omówione zostanie poniżej. Aczkolwiek spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) to znana od dziesięcioleci technika o olbrzymich możliwościach w zakresie określania struktury chemicznej różnych związków, niestety w przypadku oznaczania substancji organicznych obecnych w próbkach środowiskowych uważana była dotąd za nieprzydatną ze względu na zbyt niską czułość. Czułość tej metody uległa jednak znacznemu polepszeniu, wraz z rozwojem nowoczesnych spektrometrów NMR o wysokim natężeniu pola magnetycznego oraz z wynalazkiem kriosondy. Co więcej, doprowadziło to do otrzymania bardzo wąskich sygnałów NMR, dzięki czemu rozdzielczość informacyjna tej techniki jest dobra [4] i ciągle wzrasta wraz z rozwojem aparatów pracujących przy coraz wyższym natężeniu pola magnetycznego (patrz poniżej). To, że technika NMR (bez separacji chromatograficznej składników mieszaniny) może być zastosowana do 186

bezpośredniej analizy próbek środowiskowych zostało już wykazane wcześniej [4-6]. Trzeba jednak zaznaczyć, że rozdzielczość informacji analitycznych może być dodatkowo polepszona, jeśli spektrometr NMR zostanie połączony w układzie on-line z chromatografem, np. z HPLC [7, 8]. Od chwili wprowadzenia na rynek układów HPLC-NMR, taka technika łączona została zastosowana przede wszystkim do określania struktury metabolitów w badaniach nad procesami metabolizmu leków w organizmach żywych [9, 29, 36] oraz do identyfikacji związków naturalnych, wyizolowanych z ekstraktów roślinnych [10, 30, 32]. Zostały również opublikowane prace nt. zastosowania tej techniki w analizie próbek środowiskowych [10-14, 31]. Optymalne informacje o strukturze związku uzyskuje się, gdy HPLC-MS i HPLC-NMR są wykorzystywane razem do identyfikacji nieznanych substancji, obecnych w skomplikowanych mieszaninach. Takie właśnie podejście jest prezentowane w tym opracowaniu, na przykładzie analizy zanieczyszczonych wód gruntowych pobranych w sąsiedztwie terenów dawnych zakładów produkcji amunicji, odcieków pochodzących ze składowisk odpadów przemysłowych, ścieków przemysłowych oraz gleby skażonej przez związki z grupy wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych. Jako pierwsze zostaną zaprezentowane i omówione wady i zalety łączonych technik HPLC-NMR i HPLC-MS, a w szczególności ich potencjał w określaniu struktury nieznanych związków. Natomiast w rozdziale 4 zostanie przedstawione omówienie możliwości połączenia technik HPLC-NMR-MS w układzie on-line, zaś w rozdziale 5 opisane zostanie zastosowanie tych technik w analizie próbek środowiskowych. 2. HPLC-NMR Istnieją dwa zasadnicze warunki, które należy spełnić w przypadku łączenia chromatografu cieczowego (HPLC) ze spektrometrem magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) [9, 27, 28]: a) Probówka stosowana w konwencjonalnych sondach spektrometrów NMR, musi zostać zastąpiona przez naczyńko przepływowe. Obecnie jest to zazwyczaj rurka ze zwykłego szkła w kształcie litery U, o średnicy 1,7-4 mm, umieszczona pionowo w wnętrzu magnesu, co daje objętość detekcji 30-200µl (objętość detekcji nie powinna być większa niż objętość eluatu z HPLC odpowiadająca pojedynczemu pikowi, co w przybliżeniu odpowiada dwukrotnej szerokości piku w połowie jego wysokości pomnożonej przez natężenie przepływu fazy ruchomej w kolumnie). Cewki nadawcza i odbiorcza częstotliwości radiowej (ang. Radio Frequency RF) są przymocowane bezpośrednio do zewnętrznych ścianek naczyńka przepływowego, co pozwala na uzyskanie optymalnego współczynnika wypełnienia (czyli stosunku objętości próbki do objętości wewnątrz cewki detektora), i związanej z tym maksymalnej czułości. Komora przepływowa powinna być zaprojektowana w ten sposób, żeby zachować przepływ laminarny eluatu z HPLC, co zabezpiecza przed pogorszeniem rozdzielczości chromatograficznej na skutek efektów pozakolumnowych. W takim układzie możliwe jest uzyskanie odpowiedniej rozdzielczości spektralnej. b) W przypadku zastosowania w układzie HPLC-NMR rozpuszczalników zawierających protony, sygnał rezonansowy fazy ruchomej jest zdecydowanie najsilniejszym sygnałem w widmie. W dostępnych obecnie układach spektrometrów, bezpośrednia detekcja słabych sygnałów pochodzących od analitów w obecności silnego sygnału rozpuszczalnika nie jest efektywna, z powodu ograniczonego zakresu dynamicznego detektora i przetwornika. Problem ten w zasadzie może zostać przezwyciężony poprzez użycie całkowicie deuterowanych rozpuszczalników. W praktyce rozwiązanie to jest stosowane, jeśli wykorzystuje się wychwytywanie analitów do fazy stałej, co szczegółowo zostanie opisane poniżej. Jednakże, w normalnych analizach HPLC- 187

NMR z przepływem ciekłej fazy ruchomej do spektrometru NMR, użycie w pełni deuterowanych rozpuszczalników jest często zbyt kosztowne. Istnieją już dziś bardzo skuteczne metody tłumienia sygnałów rozpuszczalnika, polegające na tradycyjnych technikach presaturacji lub nowszych technikach sekwencji impulsów, takich jak np. tłumienie sygnału wody wzmocnione przez efekt czasu relaksacji T 1 (ang. Water suppression Enhanced through T 1 WET). Jednak nawet wielokrotne tłumienie sygnału rozpuszczalnika pozostawia większe okno spektralne, jeśli w fazie ruchomej zastosowana jest D 2 O zamiast H 2 O, a koszty D 2 O są raczej umiarkowane. Wielokrotne tłumienie przeprowadza się używając impulsów formowanych, modulowanych fazowo, w połączeniu z techniką WET lub sekwencjami opartymi na presaturacji. W celu poszerzenia okna spektralnego możliwe jest również wykonanie widma z rozprzęganiem sygnału węgla w celu pozbycia się węglowych satelitów w sygnałach pochodzących od rozpuszczalnika. 2.1 Sposoby łączenia HPLC-NMR. Połączenie chromatografu HPLC ze spektrometrem NMR można zrealizować na cztery sposoby: a) Przy zastosowaniu sposobu z zatrzymanym przepływem, kiedy to cały proces chromatograficzny jest zatrzymywany po określonym czasie, po którym centrum badanego piku chromatograficznego, wykryte z wykorzystaniem innej techniki spektroskopowej, np. UV, znajdzie się w naczyńku pomiarowym spektrometru NMR. Od tego momentu, w ciągu kilka godzin można przeprowadzić eksperymenty zarówno jedno- jak i dwuwymiarowe. Jeśli przepływ jest zatrzymany na mniej niż 2 godziny, rozmycie piku spowodowane dyfuzją, zostanie ponownie skupione na kolumnie, a co za tym idzie pozostanie bez wpływu na rozmycie kolejnych pików chromatograficznych. Natomiast przy dłuższym czasie zatrzymania, może dojść do rozmycia pików. Powinno się unikać rozdzielania w warunkach izokratycznych, gdyż on również powoduje rozmywanie pików o dłuższych czasach retencji. b) W celu przezwyciężenia tego problemu a zarazem skrócenia czasu analizy chromatograficznej, poszczególne frakcje eluatu z kolumny, lub nawet poszczególne części pików chromatograficznych mogą sukcesywnie przenoszone do pętli magazynujących, bez zakłócania przebiegu procesu rozdzielania chromatograficznego. Firma Bruker Biospin opracowała taki układ pętli magazynujących (zwany BPSU), złożony z 12 lub 36 pojedynczych pętli, w całości pozostających pod kontrolą komputera. Piki przechowywane w pętlach są później kolejno przenoszone do naczyńka pomiarowego spektrometru NMR [17]. Kształty pików LC są w pętlach zachowane, a dodatkowo w przypadku układu z 36 pętlami możliwe jest ich chłodzenie, co minimalizuje dyfuzję i tak już bardzo małą, co wynika z zastosowania cienkich kapilar. c) Alternatywnym sposobem jest wychwytywanie analitów odpowiadających poszczególnym pikom chromatograficznym w procesie ekstrakcji do fazy stałej (SPE Solid Phase Extraction). W przeciwieństwie do normalnego połączenia w układzie online SPE-HPLC, gdzie kolumny do SPE, służące do oczyszczania próbki i/lub wzbogacania analitów, umiejscowione są przed kolumną HPLC, w układzie HPLC- NMR kolumny do SPE znajdują za kolumną chromatograficzną, gdzie anality są natychmiast wychwytywane. Osiąga się to poprzez dodanie wody bezpośrednio za kolumną HPLC, co prowadzi do skupienia analitu na początkowym odcinku kolumny do SPE pracującej w układzie odwróconych faz. Stosunkowo wysoki stopień wzbogacenia analizowanej substancji można osiągnąć poprzez kilkakrotne, powtarzające się wyłapywanie z tego samego piku HPLC. W kolejnym etapie kolumna SPE jest osuszona strumieniem suchego azotu, co umożliwia usunięcie pozostałości 188

wody i wszystkich innych rozpuszczalników. Następny etap to wypłukanie wzbogaconego analitu z kolumny SPE do naczyńka pomiarowego spektrometru NMR, przy użyciu wyłącznie czystych deuterowanych rozpuszczalników (np. deuterowanego acetonitrylu). W rezultacie otrzymuje się bardzo wąskie pasmo (objętość wymywania ~ 25µl) oraz znaczny wzrost stosunku sygnału do szumu (ang. Signal-to- Noise ratio S/N), który w technice NMR zależy od stosunku objętości piku z zastosowanym wychwytywaniem do objętości piku bez wychwytywania analitu, oraz objętości naczyńka i rozmycia piku podczas jego przenoszenia (patrz także Rys. 1). Firma Bruker używa modyfikacji dostępnych na rynku układów SPE ze 192 kolumnami do wyżej opisanego wychwytywania analitów. Również i w tym przypadku układ jest sterowany komputerowo. d) W układzie przepływowym eluat jest w sposób ciągły przenoszony do naczyńka pomiarowego spektrometru NMR. Kiedy faza ruchoma z analitem przepływa przez naczyńko pomiarowe, spektrometr rejestruje widma jednowymiarowe. Widma te są przechowywane i mogą być później przedstawione w funkcji czasu retencji, w sposób analogiczny do stosowanego przy wykorzystaniu takich detektorów jak DAD lub MS (łączonej zarówno z HPLC jak i GC), gdzie widma masowe lub w zakresie UV są zbierane w sposób ciągły i przechowywane w pamięci komputera. Później widma takie mogą być przedstawiane w funkcji czasu ze stałym okresem pomiędzy kolejnymi widmami (w zależności od częstości ich zbierania). Alternatywą jest przedstawienie wyników całej analizy za pomocą techniki HPLC-NMR w postaci pseudo-dwuwymiarowego chromatogramu HPLC-NMR, lub wykresu warstwicowego, na którym wartości przesunięcia chemicznego naniesione są na jednej osi, a czas retencji na drugiej osi, zaś natężenie sygnałów stanowią linie warstwic (patrz niżej). 2.2.1. Czułość Technika łączona HPLC-NMR jest znacznie mniej czuła (w przybliżeniu trzy rzędy wielkości) w porównania z techniką HPLC-MS wykorzystującą jonizację przez elektrorozpraszanie (ESI ElectroSpray Ionization) lub jonizacji chemiczną pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization), co wyklucza zastosowanie tej techniki w analityce składników ultraśladowych. Stosunek sygnału do szumu piku NMR opisuje następujące równanie (1) ω B0 S / N St (1) k T ( RS + RWHIRL) f gdzie: ω to częstotliwość Larmora, B 0 natężenie pola magnetycznego, S I czułość cewki, k współczynnik sprzężenia, T temperatura bezwzględna, R S opór włączony w szereg z cewką odbiorczą, R WHIRL opór sondy, f szerokość pasma odbiornika. 189

Pętla magazynująca Pojedynczy układ SPE Czterokrotny układ SPE Czterokrotny układ SPE + kriosonda Rys.1. Czułość techniki łączonej HPLC-NMR w zależności od stosowanego sposobu połączenia obu technik oraz z zastosowaniem kriosondy. Z równania (1) wynika, że stosunek sygnału do szumu (S/N) jest wprost proporcjonalny do natężenia pola magnetycznego i odwrotnie proporcjonalny do pierwiastka z temperatury bezwzględnej. Zatem stosunek S/N, a przez to czułość spektrometru NMR może zostać zwiększona przez wzrost natężenia pola magnetycznego. Technologia stałych magnesów nadprzewodnikowych o coraz większym natężeniu pola magnetycznego (wyrażanej w MHz częstotliwości rezonansu protonowego) rozwijana jest w ostatnich latach bardzo intensywnie i obecnie wprowadzane są na rynek magnesy 900 MHz. Tak duże magnesy są nie tylko bardzo drogie, ale wymagają również znacznej przestrzeni dla instalacji całego instrumentu. Jeśli nie są przedsięwzięte specjalne środki zaradcze, charakteryzują się one także znacznym zasięgiem pola rozproszenia, co uniemożliwia jego łączenie z urządzeniami umieszczonymi w bliskim sąsiedztwie. Jednak powstałe w ostatnich latach instrumenty z aktywnie osłanianym magnesem i natężeniem pola do 800 MHz pozwoliły umieścić chromatograf cieczowy w odległości mniejszej niż 2 m od spektrometru NMR. Zastosowanie magnesów z osłoną aktywną stanowi kolejny warunek wstępny dla pomyślnej realizacji połączenia HPLC-NMR. Równanie (1) pokazuje, że istnieje inny sposób zwiększenia czułości spektrometru NMR, a mianowicie poprzez obniżenie temperatury cewki naczyńka pomiarowego. W ostatnich latach odpowiednie kriosondy zostały opracowane przez firmę Bruker i są obecnie również dostępne jako naczyńka przepływowe stosowane w instrumentach HPLC-NMR o natężeniu pola do 600 MHz [17]. Stosując takie sondy zaobserwowano zwiększenie stosunku S/N do wartości równej 8. Wykorzystanie kriosond (w których zwoje cewki chłodzone są do temperatury 15 o C) oraz zastosowanie wielokrotnego wychwytywania analitów z wykorzystaniem techniki SPE jest niewątpliwie znacznie mniej kosztownym sposobem zwiększenia całkowitej czułości układu HPLC-NMR (w porównaniu ze zwiększaniem natężenia pola magnetycznego). Wpływ różnych modyfikacji i ulepszeń na czułość układu HPLC-NMR zilustrowano na Rys.1, na którym dane 190

odnoszą się do spektrometru 500 MHz i glikozydu kwercytyny jako analitu [17]. Na rysunku tym porównano stosunek S/N dla oznaczenia z wykorzystaniem pętli magazynującej, oznaczenia z jednokrotnym wychwytywaniem z wykorzystaniem techniki SPE, z czterokrotnym wychwytywaniem z wykorzystaniem techniki SPE, a także oznaczenia z czterokrotnym wychwytywaniem z wykorzystaniem techniki SPE i dodatkowo z zastosowaniem kriosondy. Jak widać, w dwóch pierwszych eksperymentach wyniki są porównywalne, natomiast już w przypadku trzeciego układu uzyskuje się wzrost stosunku S/N aż 70 razy w porównaniu do stosowania pętli magazynującej. Stosując omówione wyżej metody podwyższenia czułości instrumentu, można zmierzyć stężenia analitów obecnych w próbce nawet w zakresie nanogramów. 2.3 Określanie struktury chemicznej analizowanej substancji Do określenia struktury chemicznej analitów z zastosowaniem techniki łączonej HPLC/ 1 H NMR można wykorzystać wartości przesunięcia chemicznego, multipletowość pików, stałe sprzężenia oraz czasy retencji. Całkowite rozdzielenie chromatograficzne, często trudne do uzyskania w przypadku pracy ze skomplikowanymi próbkami środowiskowymi, nie jest tutaj wymagane. Dzięki możliwości uzyskania wąskiego sygnału rezonansowego, w wielu przypadkach można zidentyfikować równocześnie kilka różnych związków w jednym widmie NMR. Równoczesna elucja dwóch związków generalnie rzec biorąc nie stanowi problemu. Jeśli chodzi o czułość, to pomiary z wykorzystaniem układu HPLC-NMR często będą ograniczone do widm 1 H i 19 F NMR. W niedalekiej przyszłości nie będą prawdopodobnie wykonywane bezpośrednie pomiary HPLC/ 13 C NMR, lecz istnieją możliwości zastosowania technik korelacji kilku widm, takich jak heterojądrowe wielokwantowe widma korelacyjne (HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherency), heterojądrowe jednokwantowe widma korelacyjne (HSQC), dwuwymiarowa spektroskopia z totalną korelacją (TOCSY Total Corelation Spectroscopy) oraz dwuwymiarowa spektroskopia z wykorzystaniem efektu jądrowego Overhausera (NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy), co udało się już zrealizować i pozwoliło na uzyskanie dodatkowych informacji o strukturze chemicznej badanego związku [10,27]. 2.4 Analiza ilościowa Często nie dostrzega się, że spektrometria NMR dobrze nadaje się do wykorzystania w analizie ilościowej, co jest szczególnie ważne w odniesieniu do próbek środowiskowych. Podstawą przeprowadzenia analizy ilościowej mieszaniny jest następujące równanie: csnsfa M a c a = (2) Fs M sna gdzie c oznacza stężenie, a indeksy dolne s i a odnoszą się odpowiednio do wzorca wewnętrznego i analitu, n oznacza liczbę protonów generujących sygnał NMR wybrany do analizy ilościowej, F oznacza powierzchnię piku sygnału NMR, a M masę molową związku. Do przeprowadzenia analizy ilościowej stosuje się technikę wzorca wewnętrznego, który dodaje się do analizowanej próbki. Zaletę stanowi fakt, że analiza ilościowa możliwa jest bez konieczności sporządzania krzywej kalibracyjnej. Analiza ilościowa jest możliwa nawet wtedy, kiedy nie są dostępne żadne związki odniesienia. W przypadku techniki HPLC-NMR analiza ilościowa odbywa się w systemie przepływowym tak jak to już wcześniej zostało opisane [16]. 191

2.5 Zalety i wady układu HPLC-NMR wykorzystywanego do analizy próbek środowiskowych Technika łączona HPLC-NMR wykorzystuje wysoki potencjał techniki NMR w zakresie dostarczania informacji strukturalnych, co stanowi jej szczególną zaletę w oznaczeniach składników nieznanych. Z powodu niskiego poziomu stężenia analitu w próbkach środowiskowych i wcześniej już omówionej ograniczonej czułości spektrometrii NMR, technika HPLC-NMR często jest ograniczona do widm 1 H NMR, a nie zawsze możliwe jest wykorzystanie pełnego potencjału dwuwymiarowych technik NMR. Dlatego też nie w każdym przypadku możliwa jest identyfikacja nieznanych związków. Technika ta jest szczególne przydatna w rozróżnianiu izomerów, jednak nie jest to już tak łatwe w momencie, gdy różnice pomiędzy grupami funkcyjnymi dają podobne wartości przesunięcia chemicznego sąsiadujących protonów (na przykład COOH w stosunku do grupy NO 2 ). Szczególnie istotny jest fakt wysokiego stopnia rozdzielczości informacyjnej w przypadku małych cząsteczek. Rozdzielczość informacyjna definiowana jest w NMR jako stosunek oczekiwanego zakresu przesunięcia chemicznego do szerokości sygnałów rezonansowych (w Hz [4]), i może osiągać wartości do 3000. (Należy zauważyć, że obecność kilku sygnałów rezonansowych nawet dla małych cząsteczek redukuje tę liczbę). Dla metod chromatograficznych, analogiczna rozdzielczość informacyjna jest definiowana jako stosunek maksymalnego czasu retencji do szerokości piku, jest zatem oczywiste że np. technika HPLC (gdzie wynosi ona np. 100) jest pod tym względem znacznie gorsza od techniki NMR. Dzięki połączeniu dwóch niezależnych metod analitycznych, rozdzielenie chromatograficzne analitów w złożonych próbkach środowiskowych nie jest koniecznym warunkiem dla ich identyfikacji z wykorzystaniem techniki HPLC-NMR. Zilustrowano to na Rys 2, gdzie przedstawiono wyniki analizy z wykorzystaniem techniki HPLC-NMR sztucznej mieszaniny kwasów aromatycznych (które zostały zidentyfikowane lub których obecność była podejrzewana w odciekach pochodzących ze składowisk odpadów przemysłowych). Rysunek przedstawia widma 1 H-NMR w funkcji czasu retencji i pokazuje że wysoka rozdzielczość informacyjna techniki NMR, pozwala na identyfikację kilku analitów w jednym widmie NMR, ale wszystkie anality mogą być rozdzielone na osi przesunięcia chemicznego tylko jeśli spektrometr NMR jest sprzężony z chromatografem cieczowym. Za pomocą techniki HPLC-NMR można przeprowadzać analizy mieszanin zawierających związki o szerokim zakresie polarności, w tym substancje nielotne i termicznie labilne, których oznaczanie nie jest możliwe z wykorzystaniem techniki GC-MS. Identyfikacja tej klasy nielotnych związków, w szczególności w próbkach środowiskowych, nadal wiąże się z licznymi trudnościami. W przeciwieństwie do technik GC-MS i HPLC-MS, technika HPLC-NMR jest techniką, która nie prowadzi do zniszczenia analizowanej próbki. Dzięki temu próbka ta może być odzyskiwana i później kolejno analizowana przy użyciu innych technik. Kolejną zaletą omawianej techniki jest to, że w przypadku widm 1 H NMR sygnał pochodzący od analitu bezpośrednio odzwierciedla jego stężenie (tzn. dla danej masy molowej, wielkość sygnału, wyrażona jako powierzchnia piku, zależy tylko od stężenia związku i liczby zawartych w nim równocennych protonów), podczas gdy w technice HPLC-MS odpowiedź detektora zależy od wydajności jonizacji tzn. od chemicznych właściwości analitu (patrz poniżej). Ostatecznie, jak wspomniano powyżej, analiza ilościowa substancji badanych jest możliwa w układzie przepływowym bez stosowania odpowiednich substancji wzorcowych i bez krzywej kalibracyjnej. 192

Rys. 2. Rozłożenie informacji uzyskiwanych techniką NMR (widm) w procesie chromatograficznym (dzięki uprzejmości wydawnictwa Elsevier). Główną wadą układu HPLC-NMR jest jego niska czułość, która generalnie jest trzy rzędy wielkości mniejsza niż czułość układu HPLC-MS. Zatem oznaczenia składników ultraśladowych w próbkach środowiskowych nie są możliwe bez przeprowadzenia odpowiedniej wstępnej obróbki próbek. Ponadto jeśli oznaczane związki obecne są w próbce na niskim poziomie stężeń (tzn. w zakresie kilkuset ppt), technika ta jest bardzo czasochłonna, gdyż konieczne jest zebranie aż kilku tysięcy sygnałów, zwanych swobodnych spadkiem indukcji (ang. Free Induction Decay FID), najczęściej w ciągu nocy, aby uzyskać akceptowalną wartość stosunku sygnału do szumu (S/N). W tym przypadku szczególnie korzystna jest wspomniana wcześniej metoda wielokrotnego wychwytywania analitów z wykorzystaniem techniki SPE. Inną wadę stanowi fakt, że zanieczyszczenia rozpuszczalnika dają często sygnały zbliżone rzędem wielkości do sygnału analitu i że stosowanie technik tłumienia sygnału rozpuszczalnika również redukuje intensywność sygnałów znajdujących się w sąsiedztwie sygnałów rozpuszczalnika. Ponadto, sygnały analitów, które się nakładają na sygnały pochodzące od rozpuszczalnika są także tłumione. Użycie całkowicie deuterowanych rozpuszczalników w kombinacji z wychwytywaniem z wykorzystaniem techniki SPE, jak to opisano powyżej, jest szczególnie użyteczne w takich przypadkach. Wreszcie sam sprzęt niezbędny do dodatkowego wzbogacania powoduje znaczny wzrost kosztów. Podsumowując, technika HPLC-NMR nie może być stosowana w rutynowych badaniach próbek środowiskowych. Metoda ta raczej dostarcza pierwszych informacji na temat zestawu zanieczyszczeń obecnych w danej próbce środowiskowej (na poziomie stężeń rzędu ppb, a w przyszłości możliwe, że i kilkuset ppt) i pozwala na identyfikację substancji nieznanych. Na podstawie informacji uzyskanych z wykorzystaniem techniki HPLC-NMR, do celów rutynowych mogą być stosowane odpowiednio prostsze i tańsze metody. 193

3. WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA SPRZĘŻONA ZE SPEKTROMETRIĄ MAS (HPLC-MS) W ciągu ostatniego trzydziestolecia opracowana została duża liczba różnorodnych połączeń dla układu HPLC i MS [1]. Dla skutecznego połączenia tych dwóch technik konieczne było przezwyciężenie dwóch podstawowych problemów: - układ próżniowy MS, musiał być dostatecznie wydajny, aby uporać się z dużymi ilościami rozpuszczalników eluowanych z HPLC, - musiały zostać opracowane nowe techniki jonizacji nielotnych związków polarnych (obecnych w roztworze). Pierwszy problem został rozwiązany z jednej strony przez wprowadzanie fazy ruchomej z HPLC do źródła jonowego MS w postaci aerozolu, przez co tylko mały ułamek całkowitej ilości stosowanych rozpuszczalników dostaje się do analizatorów MS, a z drugiej strony dzięki opracowaniu wyrafinowanych systemów pomp różnicowych, radzących sobie z różnicami ciśnienia do 8 rzędów wielkości (11 rzędów wielkości w przypadku stosowania MS z transformacją Fouriera i jonizacją przez elektrorozpraszanie). Ponadto, opracowano nowe metody jonizacji, które różnią się mechanizmami tworzenia jonów, ale wszystkie polegają na jednoczesnym wprowadzeniu eluatu z HPLC do źródła jonów MS w postaci drobno rozpylonych kropel. Wraz z wprowadzeniem źródeł jonów pracujących pod ciśnieniem atmosferycznym i wynalezieniem jonizacji chemicznej pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) [18, 19], fotojonizacji pod ciśnieniem atmosferycznym (ang. Atmospheric Pressure Photoionization APPI) [33] i jonizacji przez elektrorozpraszanie (ESI) [20,21], na rynek wkroczyły wytrzymałe, a równocześnie wysoce wyspecjalizowane instrumenty HPLC-MS. Były one początkowo używane w zastosowaniach bioanalitycznych, ale w ostatnich latach znajdują coraz szersze zastosowanie także w badaniach środowiskowych. [3] W niniejszym rozdziale nie są omówione mechanizmy i techniki jonizacji, oraz szczegóły rozwiązań konstrukcyjnych urządzeń HPLC-MS. Omówiono tutaj raczej generalne podejście do możliwości zastosowania techniki HPLC-MS do oznaczania w próbkach środowiskowych związków, których zawartość jest normowana (ang. target analysis), a w szczególności do oznaczeń w tych próbkach związków nieznanych (ang. non-target analysis), jak również zalety i wady tej techniki (w szczególności w porównaniu do techniki HPLC-NMR). 3.1 Oznaczanie związków o normowanej zawartości w próbkach środowiskowych za pomocą techniki HPLC-MS Jeśli związki oznaczane są zbyt polarne, żeby przejść przez kolumnę GC (przy oznaczaniu techniką GC-MS), to najwłaściwszą techniką dla oznaczania tych związków lub identyfikacji związków, których obecność w próbkach jest przypuszczalna (na przykład, metabolity powstające w wyniku procesów degradacji zachodzących w warunkach zarówno biotycznych jak i abiotycznych mogą być uważane za przykłady związków przypuszczalnie występujących w próbce, ponieważ znane są, przynajmniej dla niektórych klas związków, mechanizmy takiej degradacji) jest technika HPLC-MS. Technika HPLC-MS jest dalece bardziej selektywna i w większości przypadków również bardziej czuła od techniki HPLC z detektorem UV. W większości przypadków, dla potwierdzenia identyfikacji związku wykorzystywany jest jon (quasi)molekularny i czas retencji. W przypadku analizy złożonych próbek środowiskowych sposób ten może nie być wystarczająco specyficzny. Specyficzność może być poprawiona poprzez optymalizację 194

procedur selekcji jonów (w pierwszym MS), a w szczególności, przez wykorzystanie kolizyjnie indukowanej fragmentacji (w drugim MS) w układzie tandem MS. Zastosowanie tej techniki, zwanej także połączeniem spektrometr masowy/spektrometr masowy (MS/MS) [22], nie tylko prowadzi do powstawania (specyficznych dla struktury cząsteczki) fragmentów, ale także redukuje interferencje wywołane współeluującymi składnikami analizowanej mieszaniny, oraz obecnością matrycy. Specjalne procedury skanowania, takie jak śledzenie fragmentów powstałych przez odszczepienie cząsteczek obojętnych, pozwalają na identyfikację znanych grup funkcyjnych w danej klasie związków. Tandemowa spektrometria mas może być realizowana nie tylko w przestrzeni (tzn. w układzie dwóch kolejnych analizatorów kwadrupolowych) ale również w czasie (tzn. poprzez indukowanie fragmentacji w pułapce jonowej) [22]. 3.2 Analiza ilościowa z zastosowaniem układu HPLC-MS W porównaniu z techniką GC-MS (z jonizacją za pomocą wiązki elektronów), a w szczególności z techniką HPLC-NMR, powierzchnia piku na chromatogramie złożonej mieszaniny (np. próbki środowiskowej) uzyskanym z wykorzystaniem techniki HPLC-MS nie dostarcza bezpośredniej informacji o stężeniu badanego związku obecnego w próbce. Związane jest to z faktem, że w warunkach jonizacji technikami APCI i ESI, wydajność jonizacji analitów może się dość znacznie różnić. W przypadku techniki APCI zasadowość i kwasowość w fazie gazowej determinuje zarówno typ powstającego jonu (quasi)molekularnego, jak i ilość, w jakiej zostaje on wytworzony. Zatem jeśli dwa związki o różnej zasadowości w fazie gazowej są eluowane przy tym samym lub zbliżonym czasie retencji, wtedy sygnał pochodzący od jednego z nich może być w znacznym stopniu tłumiony. Analiza ilościowa związków z zastosowaniem techniki HPLC-MS z jonizacją przez elektrorozpraszanie czynnika jonizującego (ESI) lub z wykorzystaniem jonizacji chemicznej pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) jest jeszcze bardziej skomplikowane przez fakt, że składniki matrycy w przypadku rzeczywistych próbek środowiskowych często powodują tłumienie lub wzmocnienie jonizacji. Zatem kalibracja uwzględniająca skład matrycy jest koniecznym warunkiem przeprowadzenia oznaczeń ilościowych. W przypadku oznaczeń ilościowych z wykorzystaniem techniki HPLC- MS wysoce pożądana jest również dostępność izotopowo znaczonych wzorców wewnętrznych. W analizach środowiskowych wpływ matrycy na wyniki oznaczeń ilościowych analitów jest niewielki w próbkach wód, ale może być znaczący w przypadku analizy próbek gleby. 3. 3 Oznaczanie nieznanych substancji w próbkach środowiskowych z wykorzystaniem techniki HPLC-MS Określanie struktury nieznanych związków obecnych w złożonych mieszaninach, jakimi są próbki środowiskowe, za pomocą techniki HPLC-MS jest znacznie bardziej utrudnione i często nie przynosi sukcesu jeśli opiera się wyłącznie na spektrometrii mas. W porównaniu z techniką kapilarnej GC, rozdzielczość techniki HPLC (a zatem i HPLC-MS) jest znacznie niższa. Zatem w przypadku złożonych mieszanin środowiskowych, koelucja jest powszechnie napotykanym problemem. Poniżej omówione zostaną pokrótce podstawowe etapy składające się na interpretację widma masowego nieznanego związku. 195

3.2.1 Jon (quasi)molekularny Wspomniana wcześniej koelucja może spowodować utrudnienia w identyfikacji jonu (quasi)molekularnego, co zwykle jest pierwszym etapem określania struktury nieznanych związków. Omawiane powyżej techniki jonizacji głównie stosowane w połączeniu z techniką HPLC-MS (czyli termorozpraszanie (ang. Thermospray TSP), ESI, APCI i APPI) zwykle prowadzą do otrzymywania jonów o parzystej liczbie elektronów [M+H] + i/lub [M-H], chociaż w warunkach jonizacji ujemnej, obserwuje się czasami także obecność jonorodnika [M] - o nieparzystej licznie elektronów. Za wyjątkiem związków bardzo zasadowych lub związków, które pozostają w postaci jonowej w całym zakresem ph, wiele związków może być zjonizowanych w warunkach powodujących tworzenie tak jonu dodatniego jak i ujemnego (chociaż z różną wydajnością). Poszukiwanie takich właśnie komplementarnych jonów [M+H] + i [M-H] jest ważne przy identyfikacji jonu (quasi)molekularnego. Jeśli jednak w wyżej wspomnianych warunkach jonizacji tworzone są tylko dodatnie jony (quasi)molekularne, jest to wówczas znaczący sygnał, że identyfikowany związek jest bardzo zasadowy, tzn. że prawdopodobnie zawiera on jeden lub kilka atomów azotu. Przeciwnie, stwierdzenie występowania wyłącznie jonów ujemnych może być uważane jako pierwszy znak obecności substancji kwaśnej. Oprócz jonów (quasi)molekularnych powstających w wyniku protonowania i deprotonowania cząsteczki, w wyżej omówionych warunkach jonizacji powstają także jony będące produktami przyłączenia, np. jonu amonowego lub jonów metali alkalicznych, jak [M+NH 4 ] +, [M+Na] + lub [M+K] + w warunkach tworzenia jonów dodatnich, zaś w warunkach tworzenia jonów ujemnych powstaje [M+ COOH] (np. w obecności kwasu mrówkowego lub mrówczanu amonu jako buforu). Te tzw. jony addycyjne, z jednej strony komplikują interpretację widma masowego, ale równocześnie mogą zostać użyte do potwierdzenia przypisania jonu (quasi)molekularnego. Wreszcie występowanie jonów klasterowych, takich jak [2M+H] +, [3M+H] + lub [C n+1 A n ] + (w warunkach tworzenia jonów dodatnich) gdzie C jest kationem, a A anionem, może jeszcze bardziej komplikować interpretację widma masowego. Jony klasterowe są zwykle luźno związanymi kompleksami, które rozpadają się pod wpływem zderzenia (patrz niżej), tworząc zjonizowany monomer. Taka fragmentacja może zostać wykorzystana do identyfikacji jonów klasterowych. Dodatkowo, zależność ilości powstających jonów klasterowych od stężenia analitu może być użyta do rozróżniania jonów molekularnych od jonów klasterowych, ponieważ te ilość tych drugich wzrasta znacznie gwałtowniej ze wzrostem stężenia analitu niż tych pierwszych. Reguła azotu (po JP) może być wykorzystana w celu uzyskania informacji o obecności lub nieobecności atomów azotu. Podczas gdy wartości stosunku m/z jonów [M+H] + dla związków zawierających atomy C, H, O, S lub halogenów są zawsze nieparzyste, to obecność jonów [M+H] + o parzystej wartości stosunku m/z dowodzi że związek zawiera 1, 3, 5, atomów azotu. Wysoka rozdzielczość. Chociaż jony (quasi)molekularne nieznanych związków dostarczają wartościowych informacji na temat ich masy cząsteczkowej (która nie jest możliwa do określenia w oparciu o widma NMR), to jednak nie otrzymuje się żadnych informacji na temat ich struktury o ile nie jest dostępna aparatura o wysokiej rozdzielczości. Zatem dla pomyślnego określenia struktury chemicznej w przypadku korzystania ze spektrometrii mas do identyfikacji nieznanych substancji, wysoce pożądana jest MS o wysokiej rozdzielczości, przynajmniej w stosunku do jonu (quasi)molekularnego, a jeśli to możliwe także jonów fragmentacyjnych. Oprócz raczej kosztownych spektrometrów mas cyklotronowego rezonansu jonowego z transformacją Fouriera, które mogą dostarczyć tych właśnie informacji, na rynku dostępne są spektrometry z analiza-

torem czasu przelotu (ang. Time Of Flight TOF), które również dostarczają danych o wysokiej rozdzielczości dla jonu (quasi)molekularnego. Wysoka rozdzielczość jonów fragmentacyjnych, powstających w wyniku kolizji jest także możliwa, dzięki zastosowaniu analizatora kwadrupolowego z analizatorem czasu przelotu (Q-TOF). Wysoka rozdzielczość dla jonu (quasi)molekularnego (np. rozdzielczość M/ M rzędu 10000 do 20 000) ułatwia określenie składu elementarnego jonu (quasi)molekularnego, co jest często warunkiem koniecznym dla pomyślnego określenia struktury chemicznej analizowanej substancji za pomocą techniki MS. Jeśli znany jest skład elementarny jonu (quasi)molekularnego, w celu uzyskania dalszych informacji o strukturze chemicznej analitu może być zastosowana zasada pozwalająca na określenie liczby miejsc nienasycenia (pierścienie plus wiązania podwójne). Dla związku o wzorze ogólnym C x H y N z O n, łączna liczba zawartych w jego cząsteczce pierścieni i podwójnych wiązań, RD, dla parzystoelektronowego jonu [M+H] + jest określona wzorem RD = x ½ y + ½ z +1. Piki izotopowe. Piki izotopowe ( 37 Cl, 81 Br, 34 S) są szczególnie przydatne w określaniu struktury nieznanych związków, jako że pozwalają one oznaczać liczbę atomów halogenków oraz siarki, podczas gdy pik 13 C pozwala wyznaczyć średnią liczbę atomów węgla (przynajmniej w widmach z ujemnymi jonami powstałymi z wykorzystaniem jonizacji techniką ESI lub APCI), jeśli niedostępne są dane o wysokiej rozdzielczości. Czas retencji. Również dane chromatograficzne, takie jak czas retencji mogą być skutecznie wykorzystane do uzyskiwania informacji o strukturze badanego związku, jako że w przypadku wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconym układem faz (RP-HPLC Reversed Phase HPLC), związki są eluowane w kolejności ich malejącej polarności, tzn. wcześniej wymywane są substancje, które posiadają grupy polarne i odwrotnie. 3.3.2. Jony fragmentacyjne Na widmie masowym związków labilnych uzyskanym z wykorzystaniem jonizacji techniką APCI, można czasem zaobserwować fragmenty powstające jako skutek naprężeń termicznych, do jakich dochodzi przed i podczas jonizacji. Fragmentacje w przypadku stosowania techniki jonizacji APCI mogą wynikać zarówno z termicznej fragmentacji przed jonizacją, ale również z fragmentacji właściwej dla spektrometrii mas, tzn. rozpadu termicznie wzbudzonego jonu (quasi)molekularnego. Oba typy fragmentacji mogą być użyte do identyfikacji cech strukturalnych nieznanych związków. W przeciwieństwie do przypadków, kiedy do jonizacji wykorzystuje się technikę APCI, widma masowe uzyskane z wykorzystaniem jonizacji techniką ESI są często pozbawione wszelkich jonów fragmentacyjnych. W tym przypadku fragmentacja może być wywołana zderzeniami z cząsteczkami gazu obojętnego, na przykład helu czy argonu. Taka aktywacja kolizyjna może być indukowana już w stożku wlotowym (ang. skimmer) dwu- lub trójwymiarowego kwadrupolowego spektrometru mas (tj. w filtrze masowym lub spektrometrze masowym z pułapkami jonowymi). Jeśli analizie poddawane są złożone mieszaniny, takie jak próbki środowiskowe, powstające tam fragmenty w normalnym widmie masowym mają małą wartość informacyjną, ponieważ mogą być mylone z jonami (quasi)molekularnymi substancji koeluujących. Do określania struktury związków nieznanych znacznie lepiej nadaje się tandemowa spektrometria mas (MS/MS), w której rozdzielenie mas jonów prekursorów, na przykład jonów (quasi)molekularnych w mieszaninie oraz kolizyjna aktywacja lub dysocjacja (w komorze kolizyjnej lub w specjalnym obszarach kolizyjnych) są rozdzielone w przestrzeni (np. w potrójnych kwadrupolach lub instrumentach Q-TOF) lub w czasie (jak np. instrumentach z pułapkami jonowymi). W spektrometrach mas z pułapkami jonowymi rozdziele- 197

nie mas jonów prekursorów i aktywacja kolizyjna oraz dysocjacja mogą być uzyskane w kilku kolejnych etapach, dając widma MS 2, MS 3, MS n. Widma typu MS n są szczególnie przydatne w określaniu struktury substancji nieznanych, ponieważ pozwalają one na odróżnienie fragmentacji pierwszorzędowej, drugorzędowej, trzeciorzędowej... itd. Mimo wszystko, interpretacja kolizyjnie indukowanych fragmentów powstających z jonów [M+H] + i [M-H] związków jonizowanych za pomocą technik ESI i/lub APCI w układzie HPLC-MS, jest z kilku powodów bardziej skomplikowana niż interpretacja fragmentów powstających w warunkach jonizacji za pomocą wiązki strumienia elektronów: a) Po zderzeniu nieparzystoelektronowych jonów molekularnych, np. jonów [M] +, pod wpływem jonizacji typu ESI lub APCI, powstają jony elektronowe takie jak [M+H] + i [M-H] lub wcześniej wspomniane jony addycyjne, które różnią się zachowaniem fragmentacyjnym. Podczas gdy fragmentacja głównej klasy związków, w wyniku jonizacji kolizyjnej, czyli fragmentacji nieparzystoelektronowych jonów molekularnych, jest dobrze udokumentowana w licznych publikacjach i kilku książkach, to niestety znacznie mniej jest wiadomo na temat fragmentacji jonów parzystoelektronowych. b) Fragmentacja jonów parzystoelektronowych, powstających podczas jonizacji typu ESI lub APCI jest ogólnie opisywana przez regułę parzystości elektronowej [34], twierdzącą, że: parzystoelektronowy jon quasimolekularny rozpada się w przeważającej części z wytworzeniem jonu parzystoelektronowego i cząsteczki parzystoelektronowej (tzn. obojętnej cząsteczki), tworząc zatem zarówno termochemicznie stabilne jony oraz cząsteczki obojętne. (Zauważmy że znane są liczne wyjątki od reguły parzystości elektronowej). Takiej fragmentacji jonu parzystoelektronowego towarzyszy powszechnie reakcja przegrupowania z utworzeniem stanu przejściowego. Dla kontrastu, nieparzystoelektronowy jonorodnik cząsteczkowy, powstający w warunkach jonizacji wiązką elektronów, może ulegać rozkładowi na drodze bezpośredniego zerwania wiązania z utworzeniem jonu parzystoelektronowego i rodnika obojętnego lub na drodze reakcji przegrupowania z wytworzeniem nieparzystoelektronowego jonu fragmentacyjnego i cząsteczki obojętnej, co wyjaśnia, dlaczego jony parzystoelektronowe i nieparzystoelektronowe różnią się sposobem fragmentacji. c) W warunkach jonizacji wiązką elektronów, energia rzędu kilku elektronowoltów może zostać przeniesiona jako energia wewnętrzna na jon molekularny, który przechodzi w stan wysoce wzbudzony. Przy tak wysokiej energii wewnętrznej, dominuje zależne od struktury bezpośrednie pękanie wiązań. Dla kontrastu, znacznie mniejsze energie są przenoszone, podczas niskoenergetycznych zderzeń w tandemowy spektrometrze z analizatorem kwadrupolowym, a jeszcze niższe energie podczas wzbudzania w pułapce jonowej. Zatem zarówno w wyniku reguły parzystości elektronowej, jak i znacznie niższych średnich energiach wzbudzania podczas aktywacji kolizyjnej w spektrometrach mas z liniowymi kwadrupolami lub z pułapkami jonowymi, dominują reakcje przegrupowania (dające mniejszą ilość informacji strukturalnych niż bezpośrednie zrywanie wiązania). Zatem tworzenie fragmentów poprzez aktywację kolizyjną parzystoelektronowych jonów (quasi)molekularnych, powstających w trakcie analizy w układzie HPLC-MS pod wpływem jonizacji typu ESI lub APCI, dostarcza mniej informacji strukturalnej niż widmo masowe generowane np. w instrumencie GC-MS z jonizacją za pomocą wiązki elektronów. 198

d) Biblioteki widm masowych, zawierające ponad 100 000 widm, są dostępne w przypadku widm uzyskanych z wykorzystaniem jonizacji za pomocą wiązki elektronów, natomiast bardzo uboga jest biblioteka widm jonów fragmentacyjnych indukowanych kolizyjnie z jonów [M+H] + powstających w warunkach jonizacji typu ESI lub APCI. Odszczepianie obojętnych cząsteczek. Obserwacja odszczepianych w procesie fragmentacji cząsteczek obojętnych odgrywa ważną rolę przy interpretacji widm masowych nieznanych związków, co dotyczy nie tylko widm masowych otrzymanych z wykorzystaniem jonizacji techniką wiązki elektronowej zawierających nieparzystoelektronowe jony molekularne, ale także w szczególności fragmentów indukowanych kolizyjnie, powstających z jonów parzystoelektronowych, ponieważ tworzeniu parzystolelektronowych jonów fragmentacyjnych zawsze towarzyszy utrata obojętnej cząsteczki, podczas gdy strata obojętnych rodników jest obserwowana jedynie w rzadkich przypadkach. W Tabeli 1 zestawiono typy obojętnych cząsteczek, których odszczepianie można zaobserwować podczas indukowanej kolizyjnie fragmentacji jonów parzystoelektronowych. Niektóre rodzaje cząsteczek obojętnych, jak np. woda, są mało specyficzne, a zatem mają ograniczone zastosowanie w określaniu struktury chemicznej. Ponadto, kilka rodzajów strat cząsteczek obojętnych, takich jak np. utrata CO i C 2 H 4, oznaczają utratę takiej samej masy nominalnej i mogą być rozróżnione tylko w przypadku, gdy dostępne są dane o wysokiej rozdzielczości odnośnie jonów cząsteczkowych i fragmentacyjnych. Małe jony fragmentacyjne. Poza stratami obojętnymi, także małe jony fragmentacyjne mogą mieć istotną wartość diagnostyczną. W ten sposób, na przykład, dodatni jon fragmentacyjny o stosunku m/z równym 43 (CH 3 CO + ) wskazuje na acetylowanie związku, podczas gdy ujemny jon o stosunku m/z wynoszącym 46 (NO 2 ) wskazuje na obecność aromatycznych związków nitrowych. Przy określaniu struktury chemicznej nieznanych związków, wadą jest to, że szeroko stosowane spektrometry mas z pułapkami jonowymi tłumią te małe jony fragmentacyjne. Tabela1. Rodzaje cząsteczek obojętnych powstających w wyniku indukowanej kolizyjnie fragmentacji jonów parzystoelektronowych. Masa Cząsteczka obojętna Jonizacja Klasa związku 1 H + antrachinony (-), aromatyczne diaminy 2 H 2 15 CH 3 + grupa metylowa w pierścieniu aromatycznym, N- metyl 16 CH 4 + etyloanthrachinony 17 NH 3 + aminy, aminy aromatyczne, addukty amoniaku OH + tlenek azotu, fenole, antrachinony alkohole alifatyczne, ketony, antrachinony, 18 H 2 O + kwasy węglowe, tlenki azotowe, sulfotlenki 20 HF fluorki 26 CN aminy aromatyczne w podstawniku 27 HCN + aminy aromatyczne w podstawniku 28 C 2 H 4 + grupy etylowe związane z heteroatomem lub pierścieniem aromatycznym 199

CO + ketony, antrachinony, fenole, estry 29 C 2 H 5, HCO 30 CH 2 =O + podstawnik alkilowy, etery NO aromatyczne związki nitrowe 32 S siarczki CH 3 OH + estry metylowe 34 H 2 S związki siarki 35 Cl chloropochodne aromatyczne 36 HCl chloropochodne alifatyczne i aromatyczne 42 CH 2 N 2 (carbodiimide) + triazyny C 3 H 6 + + N propyl CH 2 =C=O pochodne acetylowane i/lub N- acetylowane 43 HN=C=O (+) hydroksytriazyny 44 C 2 H 4 O 44 CO 2 (+) kwasy węglowe, karbaminiany 46 HCOOH + kwasy węglowe NO 2 aromatyczne związki nitrowe CH 3 OCH 3 + estry metylowe C 2 H 5 OH estry etylowe C 4 H 8 + N butyl 58 C 2 H 2 O 2 (glioksal) fenoksykwasy 60 CH 3 COOH octany 60 HCOOCH 3 (mrówczan metylu) estry metylowe S=C=O tiokarbaminiany 64 SO 2 (+) sulfoniany, siarczany (estry) 64 CHClO (chlorek formylu) chlorowane antrachinony 70 C 3 H 6 N 2 (etylokarbodiimid) + triazyny 72 C 3 H 4 O 2 (kwas akrylowy) 75 glicyna + związki zawierające resztę glutationylową 79 Br + bromopochodne aromatyczne 80 HBr bromopochodne aromatyczne i alifatyczne SO 3 + sulfoniany, siarczany (estry) 92 toluen pochodne benzylowe 129 kwas glutaminowy pochodne glutationu 162 anhydroglukoza związki zawierające resztę glukozylową 176 kwas anhydroglukuronowy + glukuroniany 194 kwas glukuronowy acetylo-,benzyloglukuroniany 248 anhydromalonyloglukoza związki zawierające resztę resztę glikozylomalonylową 200

3.2.2 Ścieżki fragmentacji jonów parzystoelektronowych Miejsce protonowania. W celu ustalenia ścieżki fragmentacji (dodatniego) parzystoelektronowego jonu (quasi)molekularnego potrzebne są pewne informacje o miejscu protonowania. W oparciu o znane powinowactwo do protonu poszczególnych klas związków można wnioskować, że łatwość protonowania cząsteczki rośnie w następującym porządku: kwasy sulfonowe < kwasy karboksylowe < węglowodory aromatyczne < etery, ketony < alkohole < tiole < fosfiny < aminy drugorzędowe < aminy pierwszorzędowe. Zatem dla związków posiadających zarówno aminową jak i hydroksylową grupę funkcyjną, jonizacja typu ESI oraz APCI prowadzi do preferencyjnego protonowania grupy aminowej. Zasady fragmentacji. W interpretacji widma masowego nieparzystoelektronowych jonów molekularnych uzyskanego z zastosowaniem jonizacji wiązką elektronów, ustalone zostały ogólne zasady fragmentacji, podczas gdy reguł takich na ogół brakuje w przypadku kolizyjnie indukowanej fragmentacji parzystoelektronowych jonów (quasi)molekularnych, zwykle powstających w układzie HPLC-MS, co znacznie utrudnia określanie struktury nieznanych związków. Związki izomeryczne. Widma masowe izomerów są często bardzo podobne. Dotyczy to w szczególności izomerów różniących się sposobem podstawienia w pierścieniu aromatycznym. Zatem, ogólnie ujmując, spektrometria mas nie pozwala na rozróżnienie pomiędzy związkami podstawionymi w położeniu meta od podstawionych w położeniu para, podczas gdy informacja ta jest łatwa do uzyskania z zastosowaniem techniki 1 H-NMR. Podsumowując, spektrometria masowa może być źródłem wartościowych informacji o strukturze nieznanych związków, lecz kompletne i jednoznaczne określenie struktury jest możliwe tylko w niektórych przypadkach. 3.3 Porównanie układów HPLC-NMR i HPLC-MS jako technik służących do określania struktury nieznanych związków obecnych w próbkach środowiskowych. Spektrometria mas umożliwia określanie masy molowej i (jeśli dostępna jest wysoka rozdzielczość) skład elementarny nieznanej substancji, co nie jest możliwe przy zastosowaniu spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego. Ponadto grupy funkcyjne (takie jak chlorkowa, bromkowa, COOH, NO 2, SO 3 H) są łatwo wykrywane zarówno dzięki pikom izotopowym, jak i charakterystycznym stratom cząsteczek obojętnych, podczas gdy wartość przesunięcia chemicznego odzwierciedla obecność takich grup funkcyjnych tylko w sposób pośredni. Z drugiej jednak strony, widmo 1 H-NMR daje więcej szczegółowych informacji o strukturze nieznanego związku niż widma masowe. Na przykład, powierzchnia piku sygnału NMR dla danego stężenia, bezpośrednio odzwierciedla liczbę równocennych protonów. W porównaniu z techniką MS, możliwe jest też poprawne określenie układu podstawników w pierścieniu aromatycznym. W określaniu struktury pomocne są techniki widm korelacyjnych, takie jak heterojądrowe wielokwantowe widma korelacyjne (HMQC), heterojądrowe jednokwantowe widma korelacyjne (HSQC), dwuwymiarowa spektroskopia z totalną korelacją (TOCSY) oraz dwuwymiarowa spektroskopia z wykorzystaniem efektu jądrowego Overhausera (NOESY), które były już pomyślnie stosowane również w pracach z wykorzystaniem układu HPLC-NMR, pozwalając na uzyskanie dodatkowych informacji strukturalnych [10, 27, 35, 36].

Podsumowując, techniki łączone HPLC-MS i HPLC-NMR dostarczają wzajemnie uzupełniających się informacji o strukturze nieznanych związków, a zatem powinny być stosowane w kombinacji. 4. TECHNIKA ŁĄCZONA HPLC-NMR-MS W UKŁADZIE ON-LINE Równoczesne połączenie wysokosprawnego chromatografu cieczowego ze spektrometrem NMR i spektrometrem mas (HPLC-NMR-MS) zostało już opisane kilka lat temu [23, 24], a odpowiedni instrument jest dostępny na rynku. W wersji handlowej obie jednostki są sterowane komputerowo za pomocą wspólnego oprogramowania. Schemat takiego układu jest przedstawiony na rys 3. Eluat z HPLC (możliwie przed przejściem przez układ próbkowania pików, BPSU, lub przed wychwytywaniem pików do fazy stałej, SPE, patrz wyżej) jest rozdzielany na dwa strumienie. Ponieważ spektrometria mas (przy stosowaniu technik jonizacji typu ESI lub APCI) jest znacznie czulsza niż spektroskopia NMR, zaledwie 5% eluatu jest przenoszone do układu MS, a pozostałe 95 % do instrumentu NMR. Jak pokazano na rys.3, do układu, za pomocą trójnika można podłączyć dwie pompy strzykawkowe, co pozwala na dodanie do eluatu dodatkowego buforu lub wody jeszcze przed spektometrem mas w celu: a) polepszenia warunków jonizacji, b) powrotnej wymiany D/H, lub c) rozcieńczenia próbki dla wielokrotnych eksperymentów z wykorzystaniem techniki MS, na przykład stosowania na przemian jonizacji dodatniej i ujemnej lub badań typu MS n. W celu takiego rozcieńczania próbki, do układu dodana jest pętla magazynująca, połączona przez zawór dziewięciodrożny. Zawór ten pozwala również na łączenie chromatografu cieczowego z innymi urządzeniami podczas, gdy spektrometr NMR jest zajęty analizą wcześniej rozdzielonej próbki. Ponieważ dane z eksperymentów NMR i MS uzyskiwane z wykorzystaniem zestawu aparaturowego HPLC-NMR-MS połączonych w układzie on-line, pochodzą z tego samego rozdzielania chromatograficznego, nie natrafia się tu na omawiane wyżej wątpliwości, jakie powstają przy oddzielnym stosowaniu technik łączonych HPLC- NMR i HPLC-MS. Ponadto, określanie struktury chemicznej dokonywane jest tu w znacznie krótszym czasie i z lepszym wykorzystaniem próbki, niż w oddzielnych układach. Dodanie spektrometru mas nie tylko zwiększa potencjał układu w zakresie określania struktury nieznanych związków, ale również pozwala na wyzwalanie (zainicjowanie) eksperymentów NMR (na przykład przy stosowaniu techniki z zatrzymanym przepływem) w sposób znacznie skuteczniejszy niż w przypadku wykorzystania do tego celu detektora UV, co jest szczególnie cenne, jeśli w próbce znajdują się składniki o niskiej absorbancji w zakresie UV. W przypadku oznaczania znanych związków, pomiar techniką NMR może być inicjowany pojawieniem się jonu (quasi)molekularnego albo przez jeden lub kilka jonów fragmentacyjnych. Ponadto, jeśli w analizie chromatograficznej dochodzi do nakładania się pików, monitoring jonów (quasi)molekularnych dwóch nakładających się składników pozwala na zainicjowanie pomiaru techniką NMR przy takim czasie retencji, kiedy pik znanego związku jest czysty. Powrotna wymiana H/D. Jak już powiedziano wyżej, tłumienie sygnału rozpuszczalnika w spektroskopii NMR jest ułatwione jeśli jako rozpuszczalnik w fazie ruchomej w technice HPLC stosowana jest D 2 O. Powoduje to jednak częściową lub całkowitą wymianę D/H wszystkich kwasowych protonów analitu i przesunięcie wartości m/z jonu (quasi)molekularnego o wartość równą liczbie kwasowych protonów (wliczając w to protony użyte do protonowania analitu w warunkach jonizacji typu ESI i APCI). Jeśli w drugim eksperymencie z wykorzystaniem techniki MS pompy strzykawkowe prezen- 202

towane na rys. 3 są używane do powrotnej wymiany H/D, różnica w wartości m/z jonu (quasi)molekularnego przed i po takiej wymianie, może być użyta do identyfikacji liczby protonów kwasowych, co stanowi dodatkowo cenną informację o strukturze związku. Ponadto, w sprzyjających przypadkach, zastosowanie powrotnej wymiany H/D pozwala na rozróżnianie fragmentów izobarycznych. W ten sposób, na przykład, w widmie MS/MS drugorzędowej aminy metoksyfenyloalkilowej obserwuje się stratę obojętną, odpowiadającą masie 31 Da, którą pierwotnie interpretowano jako stratę rodnika CH 3 O. Jednak po powrotnej wymianie H/D obserwowano stratę równą 33, a nie 31 Da, co udowadnia, że podczas indukowanego kolizyjnie rozpadu eliminowana jest (deuterowana) metyloamina, a nie rodnik metoksy (co pozostaje w zgodności z opisaną wcześniej regułą parzystości elektronowej ). Powrotna wymiana H/D jest oczywiście możliwa w każdym spektrometrze masowym, lecz znajduje ona z oczywistych powodów szczególne zastosowanie w układach HPLC-NMR-MS. Rys. 3. Schemat połączenia w układzie on-line HPLC-NMR-MS (BPSU moduł z pętlami magazynującymi). 5. ZASTOSOWANIE TECHNIK ŁĄCZONYCH HPLC-NMR I HPLC-MS W ANALIZIE PRÓBEK ŚRODOWISKOWYCH. W celu zilustrowania potencjału łącznego zastosowania technik HPLC-NMR i HPLC- MS w analizie próbek środowiskowych o nieznanym składzie zostały wybrane cztery przykłady: - zanieczyszczonych wód gruntowych pochodzących z obszarów dawnej fabryki amunicji, - odcieków wodnych ze składowisk odpadów przemysłowych, - ścieków z zakładów tekstylnych; - próbek gleby zanieczyszczonej związkami z grupy WWA. Ekstrakcja próbek wodnych nie będzie tutaj omawiana w szczegółach. Ogólnie, ekstrakcję przeprowadzano przy użyciu techniki SPE, w której jako fazę stałą stosowano specjalne kopolimery polistyrenu i dwuwinylobenzenu. W przypadku ekstrakcji związków organicznych o charakterze kwasowym, próbkę należy zakwasić. W kilku przypadkach, ekstrakty SPE były przed właściwą analizą poddawane liofilizacji. Do detekcji związków w spektrometrze mas wykorzystywano głównie jonizację chemiczną pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) lub jonizację techniką rozpraszania elektrostatycznego (ESI), zarówno w celu otrzymywania jonów dodatnich, jak i ujemnych, ale i również jonizację techniką termorozpraszania (TSP). Jako analizatory wykorzystywano analizator kwadrupolowy lub pułapkę jonową. Ta ostatnia umożliwiała przeprowadza- 203

nie wielokrotnych eksperymentów MS/MS (MS n ), które okazały się szczególnie cenne w określaniu struktury chemicznej oznaczanych związków. Pomiary HPLC-NMR odbywały się zarówno w systemie przepływowym, jak i techniką w zatrzymanym przepływie, za pomocą 600 MHz spektrometru NMR. 5.1Niebezpieczne odpady w dawnych miejscach produkcji amunicji W rezultacie ogromnej produkcji amunicji przed i podczas drugiej wojny światowej, w Niemczech istnieje duża liczba skażonych miejsc, gdzie zarówno gleba jak i woda są zanieczyszczone materiałami wybuchowymi i produktami ich przemiany. W Niemczech zidentyfikowanych zostało 3400 takich potencjalnie zanieczyszczonych miejsc [25]. W celu przeprowadzenia oceny stopnia występującego w tych miejscach zagrożenia, zbadano ogromną liczbę próbek gleby i wody, przy czym analizy były zwykle ograniczone do związków znanych, to znaczy materiałów wybuchowych jakich można było się spodziewać, lub jakie znaleziono w danym miejscu, a także kilku produktów ubocznych tworzonych w wyniku procesów foto- i biodegradacji niektórych prekursorów. Przeprowadzone badania [4-6, 11-12, 26] ujawniły, że próbki wodne pochodzące z zanieczyszczonych w ten sposób miejsc mogą również zawierać szereg związków o charakterze kwasowym, które nie zostały zauważone we wcześniejszych badaniach, ukierunkowanych przede wszystkich na oznaczanie związków o normowanych dopuszczalnych zawartościach w środowisku. Skażone wody gruntowe analizowano techniką spektroskopii NMR oraz techniką łączoną HPLC-NMR, a możliwe struktury zaproponowane w wyniku tych badań potwierdzano z wykorzystaniem techniki łączonej HPLC- MS [6, 11, 12]. Na Rys. 4 pokazano część pseudodwuwymiarowego chromatogramu NMR (wykres warstwicowy) próbki wody gruntowej skażonej materiałami wybuchowymi i produktami ich degradacji. Analiza próbki na zawartość składników nieznanych z wykorzystaniem techniki HPLC- 1 H NMR dała wykres konturowy pokazany na Rys. 4a. Jeśli z tego wykresu wybierze się jedynie anality znane (o normowanej zawartości w środowisku), rutynowo oznaczane techniką HPLC, otrzymuje się wykres warstwicowy pokazany na Rys. 4b. Porównanie tych dwóch wykresów pozwala wykazać jak wiele (zwłaszcza polarnych) składników zostało pominiętych w analizach rutynowych. Cały szereg tych nowych składników został zidentyfikowanych poprzez wykorzystanie zarówno techniki HPLC-NMR jak i HPLC-MS (chociaż wiele związków nadal pozostaje nieznanych), co zostało zilustrowane na Rys. 4a. 5.2. Odcieki ze składowisk odpadów przemysłowych Odcieki ze składowisk odpadów przemysłowych często stanowią mieszaninę różnorodnych chemikaliów. Związki te mogą być produktami końcowymi, prekursorami lub produktami pośrednimi w procesach technologicznych, albo też zanieczyszczeniami i produktami ubocznymi powstającymi w wyniku trudnych do przewidzenia przemian, z których to powodów ich kontrola w środowisku stanowi poważny problem. Odcieki te mogą zawierać nie tylko zanieczyszczenia pierwotnie znajdujące się w odpadach, ale również produkty przemian zachodzących w masie odpadów podczas starzenia się składowiska. Produkty przemian są zazwyczaj bardziej polarne niż ich prekursory. Opisano tu odcieki z dwóch wysypisk przemysłowych, scharakteryzowane z wykorzystaniem technik HPLC-NMR, HPLC-MS oraz HPLC-TSP MS, gdzie szczególny nacisk położono na związki o charakterze kwasowym [13], podczas gdy większość związków lotnych była analizowana z wykorzystaniem techniki GC-MS, co w niniejszym rozdziale pominięto. 204