diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2011 Volume 47 Number 1 85-89 Praca oryginalna Original Article Badanie procesów utleniania osocza krwi metodami relaksacyjnymi NMR Investigation of oxydative processes of blood serum using NMR relaxation methods Lech W. Skórski, Bogdan Solnica 1, Barbara Blicharska Instytut Fizyki Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków, 1 Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków Streszczenie W pracy przedstawiamy wyniki zastosowania metody relaksacyjnej do badania kinetyki procesów utleniania osocza krwi króliczej i ludzkiej, zainicjowanych dodaniem do niego roztworu nadtlenku wodoru. Jako wprowadzające wykonane zostały pomiary czasów relaksacji w wodnych roztworach nadtlenku wodoru w funkcji koncentracji H 2. Interesującym jest fakt, że w roztworach tych czasy relaksacji T 2 zachowują się podobnie jak w roztworach jonów paramagnetycznych (np. jonów Fe 2+ lub Cu 2+ ), podczas gdy T 1 w zasadzie nie zależy od koncentracji H 2. Od momentu dodania roztworu H 2 do osocza krwi, które w naturalny sposób zawiera jony Fe 2+ i Cu 2+ oraz antyoksydanty, czasy relaksacji zaczynają się zmieniać. Na początku czasy T 1 i T 2 szybko maleją i po osiągnięciu minimum zaczynają odrastać. Interpretację takiego zachowania oparliśmy na pomiarach czasowych zmian czasów relaksacji w roztworach jonów żelaza i miedzi, w roztworach albuminy oraz w osoczu krwi króliczej po dodaniu antyoksydantów - witaminy C oraz glutationu. Pokazały one, że odrosty czasów relaksacji obserwowane są jedynie w osoczu i są one zależne od koncentracji antyoksydantów. Uważamy, że zaprezentowana przez nas metoda relaksacyjna w pełni nadaje się do badań kinetyki procesów utleniania substancji biologicznych i być może okaże się przydatna w diagnozowaniu niektórych chorób. Summary In this paper we present results of the relaxation method used to research oxidative kinetic processes in human and rabbit blood serum by adding hydrogen peroxide. As a first step, measurements of the relaxation times in aqueous hydrogen peroxide solutions as a function of H 2 concentration were done. It is interesting that in aqueous H 2 solutions, T 2 and T 1ρ behavior is similar to that obtained for paramagnetic ions like Fe 2+ and Cu 2+, while T 1 is almost independent on H 2 concentration up to very high values. When H 2 is added to blood serum, which naturally containing Fe 2+ and Cu 2+ ions and antioxidants, relaxation times start to change. At the beginning relaxation time T 1 and T 2 decreases rapidly and, after reaching its minimum, it again starts to grow. The measurements of the relaxation time are helpful in the evaluation of the role of antioxidants like Vit.C and glutathione. These antioxidants concentration dependence of relaxation behavior shows that the presence of these media in a solution restrain the progress of oxidation. Our results indicate that measurements of relaxation times may be used for the study of kinetics of oxidative processes in biological liquids and, in the future, be helpful in the diagnosis of certain diseases. Słowa kluczowe: procesy utleniania, osocze krwi, metody relaksacyjne NMR Key words: Oxidative processes, blood serum, NMR relaxation methods Wstęp Dwutlenek wodoru H 2 należy do aktywnych form tlenu (ROS reactive oxygen species), które inicjują procesy utleniania, będące reakcją chemiczną przenoszącą elektrony z substancji utlenianej do czynnika utleniania. W ten sposób powstają tzw. wolne rodniki, które mają silne działanie przeciwbakteryjne [1,9]. Własność tę wykorzystuje się powszechnie używając 3% wodnego roztworu H 2, zwanego potocznie wodą utlenioną, do odkażania ran. Po polaniu rany i zetknięciu wody utlenionej z krwią obserwujemy gwałtownie powstające pęcherzyki tlenu i tak zachodząca reakcja, katalizowana przez jony ciężkich metali (Fe 2+, Cu 2+, Co 2+, Ti 3+, Cr 5+ ), nazywa się reakcją Habera-Fentona [8]. Wykonane przez nas wstępne pomiary pokazały, że dodanie H 2 do czystej wody zmienia wartości jej czasów relaksacji (ryc. 1.). Tym sposobem odkryliśmy 85
Badanie procesów utleniania osocza krwi metodami relaksacyjnymi NMR możliwość wykorzystania metody relaksacyjnej NMR do obserwacji kinetyki procesów utleniania. Jako materiał, którego składniki poddano utlenianiu, wybraliśmy osocze krwi króliczej i ludzkiej badane in vitro. Wiadomo, że osocze krwi ludzkiej zawiera niewielkie ilości jonów żelaza i miedzi (w ilości ok. 10-21 µmol/l i 11- -24 µmol /l), i dlatego po dodaniu do niego dwutlenku wodoru zachodzi reakcja Fentona. W naszych eksperymentach mierzyliśmy, pojawiające się w czasie po zmieszaniu osocza z roztworem H 2, zmiany wartości czasów relaksacji spinowo-sieciowej T 1 i spinowo-spinowej T 2. Mimo że procesy utleniania są aktualnie przedmiotem licznych badań przeprowadzanych metodami fizyko-chemicznymi (w szczególności EPR), nadal pozostaje wiele niewyjaśnionych pytań dotyczących ich kinetyki [5]. Dlatego uważamy, że zaprezentowana poniżej metoda badań relaksacyjnych NMR, jako innowacyjna względem dotychczas używanych metod, może okazać się być bardzo użyteczną w praktyce. Materiały i metody Pomiary czasów relaksacji wykonano za pomocą spektrometru NMR firmy Bruker typu MINISPEC, pracującego w polu magnetycznym 1.41 T (co odpowiada częstości rezonansu protonowego 60 MHz). Czas relaksacji spinowo sieciowej T 1 zmierzono metodą IR (Inversion Recovery), czas relaksacji spinowo-spinowej T 2 metodą ciągu ech CPMG, zaś czas relaksacji T 1ρ w wirującym układzie współrzędnych za pomocą specjalnej sekwencji (π/2-impuls podtrzymujący o długości τ-fid) [6,10]. Pomiarom poddano wiele próbek osocza, zarówno króliczego, jak i ludzkiego. Każdy pomiar powtarzano w co najmniej dwóch próbkach przygotowanych z tego samego osocza. Powtarzalność i dokładność pomiaru czasów relaksacji wynosiła ok. ±2%. Pomiary wykonano w temperaturze +25 C, która stabilizowana była z dokładnością do ±1 o C. W badaniach używano nadtlenku wodoru w roztworze wodnym o stężeniu 30% (zakupionego w firmie Serva Aldrich) oraz kupionej w aptece wody utlenionej (3% roztwór H 2 ). Osocze krwi króliczej sporządzono rozpuszczając liofilizat zakupiony w Wytwórni Surowic i Szczepionek w Krakowie w wodzie dwukrotnie destylowanej i dejonizowanej. Próbki osocza krwi ludzkiej otrzymano z Zakładu Diagnostyki Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie. Próbki te stanowiły nadmiar osocza, w którym wcześniej oznaczono (metodą fotometryczną) koncentrację żelaza i miedzi. Do próbek osocza dodawano wody utlenionej w stosunku wagowym 1:8 i 1:10 w zależności od przeprowadzanego eksperymentu. Jako antyoksydantów używano czystej witaminy C oraz glutationu (firmy Serva) wówczas po dodaniu ich do osocza proporcje wynosiły 1:1:8 (odpowiednio: roztworu 3% H 2, roztworu antyoksydantu, osocza). ocenić, jak zmieniają się one w zależności od koncentracji nadtlenku wodoru. Maksymalna koncentracja wodnego roztworu nadtlenku wodoru wynosiła tylko 30%, w większych koncentracjach wodny roztwór H 2 jest bowiem niedostępny jako substancja silnie wybuchowa po zetknięciu z jonami żelaza lub miedzi. Rycina 1. przedstawia zależność zmierzonych czasów relaksacji T 1, T 2 od koncentracji H 2 dla jego roztworów wodnych. Widać na nim, że o ile obecność H 2 zaczyna znacznie skracać czasy relaksacji T 2 powyżej koncentracji wagowej 1%, to czas T 1 w badanym zakresie pozostaje praktycznie stały - zaczyna lekko rosnąć dopiero dla koncentracji ponad 10%. Przebieg zależności dla T 2 przypomina zależności tych czasów relaksacji od koncentracji jonów paramagnetycznych (np. w roztworach wodnych jonów Fe 2+ i Cu) [4]. Ponieważ sama woda utleniona nie jest paramagnetyczna, skracanie czasu relaksacji może być tutaj spowodowane m.in. zmianami lepkości wody po dodaniu H 2 [2,14]. Wiadomo także, że w wodnym roztworze H 2 zachodzi szybka wymiana chemiczna jąder wodoru pomiędzy drobinami nadtlenku wodoru i wody [2]. Czas tej wymiany determinuje wartość T 1, gdyż jest od niego znacznie krótszy i nie pozwala protonom wody, zanim się wymienią, wyrelaksować poprzez oddziaływanie dipolowe. Dlatego czas relaksacji T 1 nie zmienia się wraz z koncentracją. Z drugiej strony, ten sam czas wymiany jest dużo dłuższy względem czasów T 2 i dlatego nie zaburza obserwowanej ich silnej zależności od stężenia H 2. Zatem, w zależności od relacji między czasem wymiany i czasami relaksacji, które związane są z oddziaływaniami dipolowymi, mierzone wartości czasów relaksacji zależą albo od odwrotności czasu korelacji (parametru dynamiki molekularnej), albo od czasu wymiany [2]. Po dodaniu do osocza dwutlenku wodoru w proporcji 1:10 mierzone czasy relaksacji zaczynają się zmieniać. Przykładowy przebieg czasowy zmian czasu relaksacji T 1 pokazany jest na rycinie 2 dla próbek osocza ludzkiego o różnej zawartości żelaza i miedzi. Podobne przebiegi obserwowali- Wyniki i dyskusja Jak już wspomniano wyżej, przed pomiarami w osoczu zmierzyliśmy czasy relaksacji dla wodnych roztworów H 2 aby Rycina 1. Zależność czasów relaksacji T 1 T 2 od koncentracji H 2 w roztworze wodnym w temperaturze 25º C. 86
L.W. Skórski, B. Solnica i B. Blicharska chodzi o jony miedzi, to dla nich, porównując czasy relaksacji zmierzone dla wielu próbek osocza o różnej ich koncentracji, nie znaleźliśmy żadnej regularności zmian. W pierwszym dodatkowym eksperymencie dodaliśmy wody utlenionej do wodnego roztworu FeSO 4 (o koncentracji jonów Fe 2+ równej 10-1 M) (ryc. 4.). Po zainicjowaniu reakcji Fentona mierzony czas relaksacji ulegał szybkiemu skróceniu i po pewnym czasie stabilizował się. Dla takiej próbki nie zaobserwowaliśmy odrostów. Rycina 2. Czasowe przebiegi zmian czasu relaksacji T 1 po dodaniu wody utlenionej (w proporcji 1:10 wagowo) do próbek osocza krwi ludzkiej o różnej zawartości żelaza i miedzi. śmy, mierząc T 2 [12]. Jak widać na rycinie 2, mierzony czas relaksacji najpierw gwałtownie się skraca i po osiągnięciu minimum (po ok. 5 minutach) zaczyna odrastać. Odrosty te mają różny przebieg dla różnych próbek osocza. Wyjaśnienie otrzymanej zależności czasowej, pokazanej na rycinie. 2, rozpoczęliśmy od analizy czynników determinujących czas relaksacji spinowo-sieciowej osocza. Czynników tych jest kilka, dlatego wartość zmierzonego T 1, z powodu różnego składu osocza (np. dla próbek osocza pochodzących od różnych osób), nie jest taka sama [15]. Najważniejszymi trzema czynnikami wpływającymi na wartość czasu relaksacji są: obecność w osoczu szeregu białek (m.in. albumin) o róż- nym stężeniu, 2+ obecność jonów paramagnetycznych (np. Fe, Cu 2+ ), obecność antyoksydantów. Wykonane przez nas systematyczne pomiary pokazały, że naturalnie występujące jony żelaza skracają liniowo czasy relaksacji wraz ze wzrostem koncentracji jonów (ryc. 3). Jeśli Rycina 4. Czasowy przebieg zmian czasów relaksacji T 1 po dodaniu wody utlenionej (w proporcji 1:10 wagowo) do roztworu jonów żelaza (10-1 M). W następnym kroku wykonaliśmy czasowe pomiary T 1 polegające na, podobnym jak wyżej, dodawaniu wody utlenionej do 7% wodnego roztworu liofilizowanej albuminy krwi bydlęcej. Zaobserwowaliśmy, że zaraz po wymieszaniu, podobnie jak dla roztworów jonów, czas relaksacji także ulega skróceniu, a następnie stabilizacji. I tu też nie było widać odrostu (ryc. 5). Doświadczenia te pokazały, że odrost czasu relaksacji obserwowany jest tylko dla osocza krwi i jest on, naszym zdaniem, wynikiem działania obronnych mechanizmów antyoksydacyjnych. Aby sprawdzić słuszność tej hipotezy wykonaliśmy pomiary czasowych zmian T 1 w osoczu krwi króliczej (o koncentracji Rycina 3. Wartości czasów relaksacji T 1, T 2 dla różnych próbek osocza ludzkiego w funkcji koncentracji żelaza. Rycina 5. Czasowy przebieg zmian czasów relaksacji T 1 po dodaniu wody utlenionej (w proporcji 1:10 wagowo) do wodnego roztworu albuminy o koncentracji 7% 87
Badanie procesów utleniania osocza krwi metodami relaksacyjnymi NMR liofilizatu 10%) wzbogaconym antyoksydantami: witaminą C i glutationem [3,11,7]. Przebiegi te, dla różnych stężeń witaminy C (w granicach od 6% do 16 % wagowo) pokazuje ryc. 6. Podobne pomiary wykonano dla osocza króliczego po dodaniu, użytego jako antyoksydant, roztworu glutationu o trzech stężeniach (w granicach od 6% do 9% wagowo) (ryc. 7). Analogiczne pomiary wykonano dla osocza krwi ludzkiej [7]. Wyniki przedstawione na ryc. 6. i ryc. 7. pokazują, że obecność podwyższonej koncentracji antyoksydantów zmienia przebieg czasowy zmian czasów relaksacji osocza zachodzących po dodaniu wody utlenionej. Widać, że wraz ze wzrostem stężenia witaminy C (lub glutationu) maleje zarówno głębokość minimum, jak i wartość ustabilizowanego czasu relaksacji. To skrócenie ustabilizowanej wartości spowodowane jest częściowo tym, że w roztworach wodnych zarówno witamina C, jak i glutation, powodują także skrócenie czasów relaksacji [7]. Rycina. 6. Czasowa zależność czasu relaksacji T 1 surowicy krwi króliczej po dodaniu wody utlenionej i wodnego roztworu witaminy C w czterech różnych koncentracjach w proporcji 8:1:1 wagowo. Rycina 7. Czasowa zależność czasu relaksacji T 1 dla roztworów osocza krwi króliczej po dodaniu wody utlenionej i roztworu glutationu w czterech różnych koncentracjach w proporcji 8:1:1 wagowo. Wnioski Badania relaksacyjne NMR w układach biologicznych takich, jak osocze krwi, polegają na pomiarach czasów relaksacji protonów wody. Zachodzący, po zmieszaniu osocza z roztworem H 2, proces utleniania prowadzi, jak zaobserwowaliśmy, do zmian czasów relaksacji. Skracająca się gwałtownie wartość czasu relaksacji T 1 (podobnie jak i T 2 ) nie jest stabilna i, po osiągnięciu minimum, w dalszym przebiegu odrasta ku wartości początkowej czasu relaksacji otrzymanego dla czystego osocza. Z naszych dodatkowych pomiarów wynika, że takie zachowanie się czasów relaksacji po dodaniu H 2 jest charakterystyczne tylko dla osocza, bowiem analogiczne badania przebiegów zmian czasu relaksacji T 1 w wodnych roztworach jonów paramagnetycznych i w wodnych roztworach białek nie wykazują odrostów. Dlatego uważamy, że odrost ten jest wynikiem działania czynników antyoksydacyjnych obecnych w osoczu. Mogą nimi być zarówno przeciwutleniacze (glutation, witamina C), jak i enzymy, takie jak: katalaza, dysmutaza ponadtlenkowa i inne, których rolą jest zapobieganie destruktywnym procesom spowodowanym pojawieniem się wolnych rodników [3,11,13]. Przeprowadzone przez nas pomiary wykazały, że metoda relaksacyjna NMR, jako nieinwazyjna i wystarczająco szybka, nadaje się do obserwacji kinetyki przebiegu reakcji Fentona oraz badania wpływu na nią rozmaitych czynników. Ze względu na to, że pomiarów czasów relaksacji można dokonywać in vivo za pomocą tomografów MR, otwiera ona nowe możliwości prowadzenia badań procesów utleniania, zachodzących nie tylko w osoczu krwi ex vivo, ale również w tkankach żywych organizmów. Dodatkowym atutem metody jest fakt, że badania te przeprowadziliśmy w niskim polu magnetycznym ok. 1.5 tesli, które jest najczęściej stosowane w diagnostyce medycznej (MRI). Piśmiennictwo 1. Bartosz G. Druga Twarz Tlenu. Wyd Naukowe PWN, Warszawa 2003. 2. Biljubasich L, Blumich B, Stapf S. Reaction monitoring of hydrogen peroxide decomposition by NMR relaxometry. Chemical Engineering Science 2010; 65(4): 1394-1399. 3. Bilska A, Kryczyk A, Włodek L. Różne oblicza biologicznej roli glutationu. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej. 2007; 61: 438 453. 4. Blicharska B, Witek M, Fornal M, Mackay AL. Estimation of free copper ion concentation in blood serum using T 1 relaxation rates. J Magn Reson 2008; 194: 41-45. 5. Halliwell B, Gutteridge J. Oxygen toxicity, oxygen radicals, transition metals and disease. Biochem J 1984; 219: 1-14. 6. Hausser K, Kalbitzer H. NMR w biologii i medycynie. Badania strukturalne, tomografia, spektroskopia in vivo. Wyd. Naukowe UAM, Poznań 1993. 7. Kamińska J. Wpływ antyoksydantów na procesy utleniania osocza krwi badane metodami relaksacyjnymi NMR. Praca magisterska IF UJ 2010. 8. Kehrer JP. The haber-weiss reaction and mechanisms of toxicity. Toxicology 2000; 149: 43-50. 88
L.W. Skórski, B. Solnica i B. Blicharska 9. Łuszczewski A, Matyska-Piekarska E, Trefler J i wsp. Reaktywne formy tlenu - znaczenie w fizjologii i stanach patologii organizmu. Reumatologia 2007; 45/5: 284-289. 10. Mc Brierty VJ, Packer KJ. Nuclear Magnetic Resonance in solid polymers. Cambridge University Press, Cambridge 1993. 11. Naidu K A. Vitamin C in human health and disease is still a mystery? an overview. Nutrition Journal 2003; 2/7: 1-10. 12. Skórski L, Kobierski J, Blicharska B. Kinetyka reakcji Fentona w osoczu krwi badana metodami relaksacyjnymi NMR. Materiały Ogólnopolskiego Seminarium MRJ i jego zastosowań, Kraków IFJ 2008. 13. Sroka Z, Gamian A, Cisowski W. Niskocząsteczkowe związki przeciwutleniające pochodzenia naturalnego. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej 2005; 59: 34-41. 14. Stephenson NA, Bell AT. Quantitative analysis of hydrogen peroxide by 1H NMR spectroscopy. Anal Bioanal Chem 2005; 381: 1290-1293. 15. Zefirova TP, Glebov AN. Nuclear magnetic relaxation in biochemical analysis of plasma and serum. Plenum Publishing Corporation 1993; 29: 958-959. Adres do korespondencji: Lech W. Skórski Zakład Radiospektroskopii, Instytut Fizyki UJ 30 059 Kraków, ul. Reymonta 4 Tel. 12 663 5543 e-mail: lech.skorski@uj.edu.pl Zaakceptowano do publikacji: 02.02.2011 89