RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1926499 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 18.09.2006 068030.7 (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 47/48 (2006.01) A61K 31/68 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 22.01.2014 Europejski Biuletyn Patentowy 2014/04 EP 1926499 B1 (4) Tytuł wynalazku: Zastosowanie terapeutycznie aktywnych lipidów wraz ze sposobem wytwarzania swoistych dla narządu/tkanki terapeutycznie aktywnych lipidów (30) Pierwszeństwo: 21.09.200 DE 2000412 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 04.06.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/23 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 30.06.2014 Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/06 (73) Uprawniony z patentu: PAT GmbH, München, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 1926499 T3 WOLFGANG STREMMEL, Heidelberg, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J 02-776 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
1 20 2 30 3 40 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy lizofosfolipidu, który jest kowalencyjnie związany z kwasem galusowym lub asjaloglikoproteinami, do zastosowania do leczenia zapalnych chorób wątroby. Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto sposobu wytwarzania specyficznych dla wątroby terapeutycznie skutecznych lipidów do leczenia zapalnych chorób wątroby, przy czym lizofosfatydyloetanoloamina (LysoPE) jest związana z grupą karboksylową u (UrsoDOCA), która to grupa jest przekształcana w ester, z wytworzeniem związku LysoPE- DOCA. [0002] Specyficzne terapeutycznie korzystne lipidy są skuteczne w sposób pro-zapalny i przeciwzapalny (ANES i współpracownicy Nat. Cell. Biol. 2003; 6: 793-802). WO 01/03 ujawnia koniugaty lipidowe z kwasem galusowym do medycznego zastosowania. Nawet na modelach makrofagowych i fagosomowych invitro, możliwym było przedstawienie działania terapeutycznego fosfatydylocholiny (PC) i lizofosfatydylocholiny (LysoPC), na procesy zapalne lub zakłócony metabolizm, w przypadku wzbogacenia tymi lipidami dotkniętych komórek (ANES i współpracownicy Nat. Cell. Biol. 2003; : 793-802). Terapeutyczne działanie PC zostało także wykazane na modelu zwierzęcym, na przykład miejscowe stosowanie skutecznej przeciwzapalnie fosfatydylocholiny na modelach szczurzych, chroniące błonę śluzową okrężnicy przed zapaleniem okrężnicy wywołanym przez kwas octowy i kwas trinitrobenzenosulfonowy (FABIAN et al., Digestion 1992; 3: 3-44; MOURELLE et al. Gastroenterology 1996; 1: 1903-7). Zasadę tą zastosowano również u ludzi w leczeniu często przewlekłego stanu zapalnego jelit, colitis ulcerosa. Możliwe jest wykazanie, że podawanie doustne fosfatydylocholiny w postaci preparatu o wolnym uwalnianiu z uwalnianiem w dalszej części jelita cienkiego i jelicie grubym, znacząco tłumi aktywność zapalną w colitis ulcerosa (STREMMEL et al. Gut 200; 4: 966-997, patent europejski 1141 B1). W porównaniu z grupą kontrolną leczoną placebo, możliwe było osiągnięcie średnio 70% wzrostu w aktywności klinicznej u 90% pacjentów leczonych PC. W ciągu trzech miesięcy, nawet ponad połowa pacjentów osiągnęła kliniczną remisję. W tym samym czasie poprawiły się wyniki endoskopowe oraz histologiczne w dalszej części jelita cienkiego i w jelicie grubym, a także jakość życia pacjentów. [0003] W oparciu o niniejsze wyniki, jest prawdopodobne, że choroby związane z zapaleniami innych, niż jelito cienkie i jelito grube, komórek, tkanek i narządów mogą być również leczone przeciwzapalnie skutecznymi lipidami. Jednak, nie można przewidzieć, czy nieselektywnym podawaniem ogólnoustrojowym, na przykład, fosfatydylocholiny,osiągnie się konieczny przeciwzapalny poziom skuteczności in situ, z tego powodu miejscowe podawanie byłoby konieczne. Zatem, na przykład, przeciwzapalne lipidy jako takie mogą być podawane miejscowo w przypadku miejscowych warunków spowodowanych zapaleniem, tak jak na przykład, w miejscowym stosowaniu na objętą stanem zapalnym skórę, w podaniu kroplowym do jam stawowych w przypadku zapalenia stawu, w inhalacji odpowiednich preparatów do układu oskrzelowego w celu leczenia zapaleń płuc lub w podawaniu kroplowym zawiesin lipidowych do przewodu pokarmowego, na przykład, przełyku, żołądka, dwunastnicy i odbytnicy. [0004] Miejscowe podawanie do narządów miąższowych, takich jak wątroba, serce i mózg, wydaje się być trudniejsze. Chociaż może to być przeprowadzone jako miejscowy wlew skutecznych terapeutycznie zawiesin lipidowych lub przez stosowanie metod odwracalnej embolizacji w celu osiągnięcia wysokiego miejscowego stężenia w tych narządach, to nie stanowi to realnych alternatyw dla podawania miejscowego w odniesieniu do czasu trwania infuzji i ryzyka, jakiego należy się obawiać przy stosowaniu metody embolizacji. 1
1 20 2 30 3 40 [000] Zatem przedmiotem niniejszego wynalazku jest dostarczenie zastosowania terapeutycznie skutecznych lipidów do wzbogacania specyficznego narządu/tkanki do leczenia chorób zapalnych, niedokrwiennych lub zwyrodnieniowych i/lub do stymulowania regeneracji rodzaju jak wspomniano we wstępie, dla wszystkich narządów, tkanek i komórek, aby zapobiegać ryzyku i długotrwałym infuzjom, których stosowanie wywołuje terapeutycznie skuteczne stężenie lipidów w narządach, tkankach i komórkach. [0006] Powyższy przedmiot zrealizowano według wynalazku dzięki cechom z zastrzeżeń patentowych 1, 7 i 8. Odpowiednio, stosowanie tych terapeutycznie skutecznych lipidów skonfigurowano w taki sposób, że lipidy są związane w czasie podawania z kwasami galusowymi lub asjaloglikoproteinami jako cząsteczkami nośnikowymi, dla których istnieją komórkowo-specyficzne układy wychwytu w komórkach narządów i/lub tkanek. [0007] Powyższy przedmiot zrealizowano ponadto dzięki cechom z 6 zastrzeżenia patentowego. Odpowiednio, sposób wytwarzania specyficznych dla narządu/tkanki terapeutycznie skutecznych lipidów, z rodzaju jak wspomniane na wstępie, skonfigurowano tak, że lizofosfatydyloetanoloamina (LysoPE) jest połączona z grupą karboksylową ursodeoksycholanu (UrsoDOCA), która to grupa jest przekształcana w ester, do wytworzenia związku LysoPE-DOCA. [0008] Stwierdzono zgodnie z wynalazkiem, że specyficzne wzbogacenie tych lipidów można również osiągnąć w narządach miąższowych tak, aby wykluczyć metody embolizacji lub infuzji poprzez stosowanie lipidów, które są połączone z cząsteczkami nośnika, jeśli istnieją specyficzne komórkowe, tkankowe lub narządowe układy wychwytu dla cząsteczek nośnika. Stwierdzono dalej, że komórki nie mogą pochłaniać lipidów złożonych, takich jak na przykład fosfatydylocholina i dlatego lizofosfolipidy, które są wyraźnie pochłaniane przez komórki są związane z cząsteczkami nośnikowymi. Zatem, wychwyt terapeutycznie skutecznych lipidów selektywnie w komórkach, tkankach lub narządach jest możliwy przez to specyficzne dla komórki ukierunkowanie do terapeutycznie skutecznego stężenia. Zatem, na przykład, terapeutycznie skuteczne stężenie lipidów w komórkach wątroby, w której występują zmiany zapalne, można otrzymać stosując związki lipidowe, wytwarzane zgodnie ze sposobem według zastrz. 6. [0009] W szczególnie korzystny sposób, skuteczne terapetycznie lipidy działają w sposób przeciw- i prozapalny. Jeżeli specyficzne dostarczenie lipidów, uzyskane poprzez cząsteczki nośnikowe czy też bezpośrednio przez inhalację lub wkraplanie terapeutycznie skutecznych lipidów, takich jak na przykład fosfatydylocholina lub lizofosfatydylocholina (LysoPC), do komórek, tkanek lub narządów, powiodło się, ich przeciw zapalne działanie może się rozwinąć. Oprócz zwykłej substytucji wszystkich brakujących lipidów, efekt terapeutyczny jest dalej utrzymywany przez nieodłączną działalność przeciwzapalną lipidów, poprzez wpływ na mediatory i drogi transmisji sygnału. W ten sposób, na przykład, reakcje zapalne, które powstają jako odpowiedź fizjologiczna, na przykład, na mechaniczne/zwyrodnieniowe, spowodowane przez patogeny, niedokrwienne, wywołane przez wolne rodniki, immunologicznie nabyte mechanizmy uszkodzenia lub mechanizmy uszkodzenia, które są spowodowane przez leki, substancje chemiczne albo promienie, mogą być traktowane przeciwzapalnie skutecznymi lipidami. Kiedy te lipidy są pobierane przez makrofagi lub inne komórki układu obronnego i immunologicznego, efekt immunosupresyjny jest również możliwy. [00] Zastosowanie lipidów prozapalnych jest szczególnie wskazane w pożądanej regeneracji. Ponieważ zapalenie (przenoszone przez mediatory, takie jak na przykład, IL6 i TNFα) często indukuje regenerację, w rezultacie regeneracja, naprawa i hiperplazja komórek, tkanek i narządów może być wspomagana przez stosowane terapeutycznie prozapalne lipidy ponownie stosowane miejscowo. Na przykład, regeneracyjne 2
1 20 2 30 3 40 zdolności wątroby mogą być wykorzystane w celu umożliwienia później większej częściowej resekcji wątroby w przypadku zajęcia guzem (innych segmentów wątroby). W szczególnie korzystny sposób, zastosowanie prozapalnych lipidów w narządach, w których masa komórkowa osiągnęła wartość krytyczną wskutek przewlekłej choroby lub utraty wywołanej wypadkiem/operacją, jest korzystne. [0011] Zastosowanie skutecznych prozapalnych lipidów jest szczególnie korzystne przed planowaną, rozległą częściową resekcją wątroby, na przykład, w celu usunięcia przerzutów w wątrobie, aby indukować wystarczającą masę komórkową w pozostającej wątrobie. W związku z tym prozapalne lipidy są selektywnie podawane przed operacją do fragmentów wątroby, które później nie będą usunięte. [0012] Ponadto, prozapalny efekt może sprzyjać immunostymulacji w złośliwych komórkach, a zatem być stosowany w leczeniu przeciw nowotworowym (na przykład indukcja apoptozy). [0013] Ponadto zastosowanie ligandów, które naturalnie występują w organizmie, do leczenia jako cząsteczki nośnikowe, z którymi lipidy są kowalencyjnie związane, jest korzystne. Ligandy są odpowiednio rozpoznawane przez swoiste receptory komórkowe systemów transportujących związanych z błoną bocznopodstawną, za pomocą których lipidy są wprowadzane do komórki. Zatem, lipidy są związane na przykład kowalencyjnie z kwasem galusowym lub asjaloglikoproteinami jako ligandami dla specyficznego dla hepatocytów wychwytu. W szczególności polipeptyd współtransportujący Na + /taurocholan (białko transportujące NTCP), za pomocą którego ponad 90% kwasów galusowych jest wprowadzanych do komórek wątroby, powinien być wspomniany jako system transportujący swoisty dla hepatocytów. [0014] Ze względu na występowanie efektu przeciwzapalnego lub pro-zapalnego w komórce, lipidy takie jak na przykład lizofosfatydylocholina (LysoPC) lub lizofosfatydyloetanoloamina (LysoPE), mogą uwalniać się od ligandów po wychwyceniu w obszarze cytoplazmy komórki. Osiąga się to na przykład przez hydrolizę w cytoplazmie. Jeżeli, jak we wspomnianym wyżej przypadku, lizofosfatydyloetanoloamina zostaje wprowadzona do komórki, konwersja enzymatyczna LysoPE do postaci przeciw zapalnie skutecznej PC ma miejsce po uwolnienie od ligandu. [001] Ogólnie wszystkie drogi podawania są dostępne do zastosowania terapeutycznie skutecznych lipidów, takie jak na przykład podawanie bezpośrednie, inhalacyjne, kroplowe (infuzja), doustne, dożylne lub dootrzewnowe. W szczególności podawanie bezpośrednie jest odpowiednie, jak opisano wyżej, do stosowania przeciwzapalnych lipidów w celu leczenia zapalnie uszkodzonej skóry lub wstrzyknięcia do stawów lub przestrzeni podpajęczynówkowych. Doustne, dożylne lub dootrzewnowe podawanie jest szczególnie odpowiednie w wybiórczym wzbogacaniu narządów miąższowych, tkanek i komórek ze zmianami zapalnymi, w terapeutycznie skuteczne lipidy. Podawanie dożylne lipidów związanych z cząsteczkami nośnikowymi jest szczególnie odpowiednie, ponieważ docierają one do odpowiednich narządów, tkanek lub komórek bezpośrednio przez krwioobieg bez wcześniejszego przechodzenia przez ścianę jelita, jak w podawaniu doustnym, które wiąże się z ryzykiem całkowitego wychwytu lipidów przez komórki jelita. [0016] Leczenie oparte na lipidach, ogólnie rzecz biorąc, dostarcza dobrą kliniczną skuteczność z niewielkim albo nieistniejącym profilem efektów ubocznych, ponieważ są zaangażowane naturalne lipidy, które występują w organizmie i które nie są immunogenne. To sprawia, że możliwe jest podawanie miejscowo wysokich dawek tych lipidów, utrzymując stężenia układowe w zakresie fizjologicznym. [0017] Obecnie istnieje kilka możliwości konfiguracji i rozwoju ujawnień niniejszego wynalazku w korzystny sposób. W związku z tym, z jednej strony, odniesień można dokonywać do załączonych zastrzeżeń, a z 3
drugiej strony do następujących objaśnień korzystnych postaci wykonania, które tłumaczą zastrzegany sposób wytwarzania swoistych dla narządu/tkanki terapeutycznie skutecznych lipidów. 1 20 2 Przykład [0018] Przykładowe wzbogacanie przeciwzapalnych fosfolipidów w hepatocytach w celu stłumienia zapalenia wątroby [0019] Lipidy złożone, takie jak fosfatydylocholina (PC) nie mogą być jako takie pobierane do komórek. Wychwyt ma miejsce w postaci lizofosfolipidów, które są kowalencyjnie związane z ligandem, na przykład kwasem galusowym lub asjaloglikoproteiną, które są w ten sposób pobierane poprzez transportery kwasu galusowego (na przykład NTCP) na podstawno-bocznej błonie plazmatycznej hepatocytów w cytoplazmatycznym obszarze komórek. W związku z tym na przykład lizofosfatydylocholina (LysoPC) może być kowalencyjnie związana z kwasem galusowym, na przykład z dezoksycholanem (DOCA). Jednak synteza związku lizofosfolipid-doca związanego z lizofosfatydyloetanoloaminą (LysoPE) jest chemicznie znacznie bardziej korzystna. Na przykład następująca reakcja może być dokonana: najpierw, grupa karboksylowa urso-doca jest przekształcana przez karbodiimid do postaci aktywowanego estru. Następnie dokonuje się przyłączenie do LPE. Takie sprzężenie grup pozwala na pasaż związku LysoPE-DOCA, poprzez transportery kwasu galusowego, do komórek wątroby. W tym miejscu LysoPE może być ponownie uwolniona przez podział hydrolityczny i jest wówczas przekształcana enzymatycznie do postaci przeciwzapalnego PC. [0020] Dla porównania, może być przeprowadzone sprzężenie łańcucha acylowego, w którym DOCA jest związane z acylowym łańcuchem bocznym w pozycji Sn-1 lub Sn-2 PC. Po ekspozycji na fosfolipazę A2 lub A1, grupa boczna Sn-1 lub Sn-2 musi być przekształcona do postaci alkoholu. Jest to spowodowane wiązaniem się z produktami pośrednimi reakcji pomiędzy pirydyną a aktywowanym estrem DOCA i karbodiimidem. [0021] Poniższy diagram ilustruje powyżej opisaną sekwencję reakcji. 4
Ursodeoksycholan ph, N-etylo-N -(3-dimetyloamionpropylo) carbodiimid (EDC) Koniugat ursodeoksycholan 18:1 LysoPE ph 7,4 1-Oleoilo-2-hydroksy-sn-glicero -3-fosfoetanoloamino (18:1 LysoPE) [0022] W celu zbadania selektywnego wzbogacenia w związek LysoPE-DOCA, komórki HepG2 (hepatocyty) inkubowano z oznaczonym fluorescencyjnie ursodeoksycholano-1-palmitoilem, koniugatem 2- NBD-PE (przy 0 um) przez minut w 37 C, przemywano, a następnie traktowano % surowiczą bydlęcą albuminą w celu usunięcia koniugatu z zewnętrznej błony plazmatycznej komórek. Następnie, komórki obserwowano pod mikroskopem z kontrastem fazowym i w świetle fluorescencyjnym. [0023] Figura 1 przedstawia na zdjęciu A obraz z mikroskopu świetlnego komórek HepG2 po inkubacji z oznaczonym fluorescencyjnie ursodeoksycholano-1-palmitoilem, koniugatem 2-NBD-PE z kontrastem fazowym i zdjęcie B przedstawia badanie mikroskopem fluorescencyjnym komórek przedstawionych na zdjęciu A. [0024] Figura 1 przedstawia na zdjęciu A i na zdjęciu B komórki HepG2 (hepatocyty) po inkubacji z terapeutycznie skutecznym lipidem według wynalazku (ursodeoksycholano-1-palmitoilem, koniugatem 2-
NBD-PE), który jest znakowany w celu zobrazowania wzbogacenia w komórkach z fluorescencyjnym znacznikiem. W odróżnieniu od komórek HepG2 obserwowanych na A z kontrastem fazowym, te same komórki mają intensywne żółto/zielone zabarwienie w cytoplazmie, ale nie w jądrach komórkowych badanych pod mikroskopem fluorescencyjnym. 6
1 Zastrzeżenia patentowe 1. Lizofosfolipid, który jest kowalencyjnie związany z kwasami galusowymi lub asjaloglikoproteinami, do zastosowania do leczenia zapalnych, niedokrwiennych lub degeneracyjnych chorób wątroby. 2. Lizofosfolipid do zastosowania według zastrz. 1, przy czym lizofosfolipid jest lizofosfatydylocholiną lub lizofosfatydyloetanoloaminą. 3. Lizofosfolipid do zastosowania według zastrz. 1, przy czym kwas galusowy jest ursodeoksycholanem lub deoksycholanem. 4. Lizofosfolipid do zastosowania według któregokolwiek z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że lizofosfolipid może być uwalniany od ligandu po zaabsorbowaniu przez komórki.. Lizofosfolipid do zastosowania według któregokolwiek z zastrz. 1 do 4, który jest podawany bezpośrednio, w sposób wziewny, kroplowy, doustny, dożylny lub dootrzewnowy. 6. Sposób wytwarzania hepatospecyficznych terapeutycznie skutecznych lipidów do leczenia zapalnych chorób wątroby, znamienny tym, że lizofosfatydyloetanoloamina (LysoPE) jest połączona z grupą karboksylową ursodeoksycholanu (UrsoDOCA), która to grupa jest przekształcana w ester, z wytworzeniem związku LysoPE-DOCA. 7.Związek LysoPE-DOCA, który może być otrzymany zgodnie ze sposobem według zastrz. 6. 8. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek LysoPE-DOCA według zastrz. 7. 7
Fig. 1 8
Odnośniki cytowane w opisie Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego i nie stanowi części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo, że dołożono największej staranności przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe cytowane w opisie Literatura niepatentowa cytowana w opisie 9