RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2419728 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 12.04. 71928.8 (13) (1) T3 Int.Cl. G01N 33/0 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 08.01.14 Europejski Biuletyn Patentowy 14/02 EP 2419728 B1 (4) Tytuł wynalazku: Biomarker do monitorowania pacjentów () Pierwszeństwo: 17.04.09 EP 09328 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 22.02.12 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 12/08 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:.0.14 Wiadomości Urzędu Patentowego 14/0 (73) Uprawniony z patentu: Transgene SA, Illkirch Graffenstaden, FR (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 2419728 T3 BRUCE ACRES, Strasbourg, FR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska 73 00-712 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
14/P34004PL00 EP 2 419 728 B1 Opis 1 2 [0001] Niniejszy wynalazek należy do dziedziny immunoterapii i dotyczy sposobów określania skuteczności pewnych typów leczenia immunoterapeutycznego. Sposoby według niniejszego wynalazku obejmują mierzenie specjalnego biomarkera po pewnym czasie od rozpoczęcia leczenia immunoterapeutycznego w celu oceny klinicznego wyniku takiego leczenia. Wynalazek ma zatem zastosowanie w dziedzinie medycyny. [0002] Od wielu lat są znane tradycyjne techniki szczepienia, polegające na wprowadzeniu do systemu zwierzęcego antygenu (na przykład peptydów, białek), który może indukować odpowiedź immunologiczną i chronić w ten sposób wspomniane zwierzę, na przykład przeciwko zakażeniu. Techniki te obejmują ponadto opracowywanie szczepionek zarówno żywych, jak i inaktywowanych. Szczepionki żywe są to typowo atenuowane niepatogenne wersje czynnika zakaźnego, które są w stanie zapoczątkować odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko patogennej wersji czynnika zakaźnego. [0003] W ostatnich latach poczyniono postępy w rozwoju szczepionek rekombinowanych, zwłaszcza rekombinowanych szczepionek żywych, w których stanowiące przedmiot zainteresowania obce antygeny są kodowane i ulegają ekspresji z wektora. Spośród nich obiecujące okazały się wektory oparte na rekombinowanych wirusach i odgrywają one ważną rolę przy opracowywaniu nowych szczepionek. Prowadzi się badania wielu wirusów pod kątem ich zdolności do ekspresji białek z obcych patogenów lub z tkanki nowotworowej oraz do indukowania swoistej odpowiedzi immunologicznej przeciwko tym antygenom in vivo. Ogólnie, te szczepionki genowe mogą stymulować
- 2-1 2 silną humoralną i komórkową odpowiedź immunologiczną, a wektory wirusowe mogą być skuteczną strategią zarówno dostarczania genów kodujących antygeny, jak i ułatwiania i wzmagania prezentacji antygenu. Idealny wektor wirusowy do wykorzystania jako nośnik szczepionki powinien być bezpieczny i powinien umożliwiać skuteczną prezentację pożądanych swoistych patogenowo antygenów układowi immunologicznemu. Układ wektorowy musi ponadto spełniać kryteria umożliwiające jego produkcję na dużą skalę. Do tej pory pojawiło się kilka wirusowych wektorów szczepionek; wszystkie z nich wykazują względne korzyści i ograniczenia, w zależności od proponowanego zastosowania (przegląd rekombinowanych szczepionek wirusowych można znaleźć na przykład w: Harrop i Carroll, 06, Front Biosci., 11, 804-817; Yokoyama i wsp., 1997, J Vet Med Sci., 9, 311-322). Zastosowanie takich rekombinowanych szczepionek nazywa się zazwyczaj immunoterapią celowaną lub antygenowo swoistą albo immunoterapią czynną. [0004] Po zaobserwowaniu we wczesnych latach '90 XX w., że wektory plazmidowego DNA mogą bezpośrednio transfekować komórki zwierzęce in vivo, podjęto także istotne wysiłki ukierunkowane na rozwój technik immunoterapii opartych na wykorzystaniu plazmidów DNA do indukowania odpowiedzi immunologicznej, przez bezpośrednie wprowadzanie do organizmu zwierzęcia DNA kodującego antygeny. Takie sposoby, określane ogólnie jako szczepienie DNA lub immunoterapia DNA, stosuje się obecnie do wywoływania ochronnej odpowiedzi immunologicznej w wielu modelach chorób. Przegląd informacji na temat szczepionek DNA można znaleźć w:
- 3-1 2 Reyes-Sandoval i Ertl, 01 (Current Molecular Medicine, 1, 217-243). [000] Ogólnym problemem w dziedzinie immunoterapii jest jednak identyfikowanie metod indukowania u leczonych osobników odpowiedzi immunologicznej dostatecznie silnej, żeby zabezpieczała ich przed zakażeniami i chorobami. [0006] W ostatnich latach podjęto zatem na przykład znaczne wysiłki ukierunkowane na odkrycie nowych związków leczniczych, które działałyby przez stymulowanie pewnych kluczowych aspektów układu immunologicznego, co posłużyłoby do zwiększenia odpowiedzi immunologicznej indukowanej przez immunoterapię. Większość z tych związków, określanych jako modyfikatory odpowiedzi immunologicznej (ang. immune response modifier - IRM) lub adiuwanty, działa, jak się wydaje, przez podstawowe mechanizmy układu immunologicznego, wykorzystując receptory Toll-like (ang. Toll-like receptor - TLR) do indukowania biosyntezy różnych ważnych cytokin (takich jak na przykład interferony, interleukiny, czynnik martwicy nowotworu itd. - zob. na przykład Schiller i wsp., 06, Exp Dermatol., 1, 331-341). Wykazano, że takie związki stymulują szybkie uwalnianie pewnych cytokin wywodzących się z komórek dendrytycznych, monocytów i makrofagów; są również zdolne do stymulowania komórek B do wydzielania przeciwciał, które odgrywają istotną rolę w aktywności przeciwwirusowej i przeciwnowotworowej związków IRM. [0007] Alternatywnie proponowano strategie immunoterapii, z których większość opiera się na schemacie szczepienia pierwotnego i szczepienia przypominającego. Według tych protokołów terapii ze szczepieniem pierwotnym i przypominającym układ immunologiczny najpierw indukuje
- 4-1 2 się przez podawanie pacjentowi kompozycji zapoczątkowującej odpowiedź immunologiczną i następnie tę odpowiedź wzmacnia się przez podawanie drugiej kompozycji w szczepieniu przypominającym (zob. na przykład EP1411974 lub US01976). [0008] Ponadto w kontekście opieki zdrowotnej wykazano, że jeden ze sposobów leczenia może być skuteczny tylko w pewnej specyficznej grupie pacjentów. Korzystne jest zatem dostarczenie lekarzom narzędzi i sposobów, które umożliwią im dopasowanie optymalnej, spersonalizowanej terapii do potrzeb każdego pacjenta, to znaczy zalecenie właściwej terapii właściwemu pacjentowi we właściwym czasie, żeby zwiększyć odsetek powodzenia leczenia, monitorować odpowiedź na leczenie, zwiększyć skuteczność leku i bezpieczeństwo, wyeliminować zbędne leczenie pacjentów, dla których terapia nie jest odpowiednia, oszczędzić pacjentom zbędnej toksyczności i efektów ubocznych, zmniejszyć ponoszone przez pacjentów i ubezpieczycieli koszty zbędnych lub niebezpiecznych, nieskutecznych leków i poprawić jakość życia pacjentów, tak, aby na koniec osiągnąć opanowanie nowotworu, z wykonywaniem w miarę potrzeby badań kontrolnych. [0009] W odniesieniu do tego, w piśmiennictwie proponuje się rozmaite narzędzia i metody, takie jak na przykład: - farmakogenetykę, która polega na badaniu indywidualnej odpowiedzi na leki jako funkcji różnic genetycznych. Taka odpowiedź jest związana z tym, jak lek działa u każdego osobnika, jak jest metabolizowany, zależy od jego toksyczności i wymogów co do dawkowania. Po podjęciu projektu poznania ludzkiego genomu farmakogenetyka rozwinęła się w farmakogenomikę. Farmakogenomika wychodzi poza farmakogenetykę, z
- - 1 2 możliwością znalezienia zastosowania dla odkrywanych leków i dla rozwoju leków, ukierunkowanego odkrywania i walidacji leków oraz badań klinicznych; - w dziedzinie medycyny spersonalizowanej można również zastosować metabolomikę. W przeciwieństwie do farmakogenetyki, która ogranicza się do czynników genetycznych, farmakometabolomika umożliwia przewidywanie odpowiedzi osobnika na lek na podstawie nie tylko czynników genetycznych, lecz również czynników innych niż genetyczne, takich jak obecność innych leków w organizmie pacjenta, aktualny stan zdrowia pacjenta itd.; - w rozwoju klinicznym środków terapeutycznych coraz ważniejszą rolę odgrywają biomarkery. Biomarker może być wskaźnikiem prawidłowych procesów biologicznych, procesów chorobowych lub odpowiedzi farmakologicznej na interwencję terapeutyczną. Ich rola bywa różna - od rozwarstwienia populacji pacjentów, umożliwiającej zidentyfikowanie pacjentów odpowiadających na leczenie w porównaniu z pacjentami nieodpowiadającymi na leczenie, do określania skuteczności środka terapeutycznego. Biomarkery mogą być cennym narzędziem w podejmowaniu lepszych decyzji, które zmniejszą koszty rozwoju leków i pozwolą właściwej populacji pacjentów uzyskać dostęp do terapii. [00] W kilku publikacjach opisano określanie poziomu komórek T CD3+ i(lub) CD69+ u pacjentów w powiązaniu z różnymi stanami chorobowymi lub różnymi terapiami; na przykład Rossi i wsp. (Cancer Res. 6 (0), - 61), Ampel i wsp. (Mycopathologia 161 (06), 67-72), Melichar i wsp. (Immunopharmacology and Immunotoxicology 23 (01), 163-173), Devarapu i wsp. (Immunopharmacology
- 6-1 2 and Immunotoxicology 28 (06), 387-39), Lavasani i wsp. (Scandinavian J. Immunol. 6 (07), 39-47) i Huang i wsp. (Pediatr. Allergy Immunol. 13 (02), 426-433). W żadnej z nich nie sugeruje się jednak korelacji poziomu limfocytów CD3+ CD69+ po podaniu kompozycji immunogennej, zwłaszcza kompozycji zawierającej rekombinowany wektor wirusowy, i skuteczności leczenia taką kompozycją. [0011] Przedmiotem niniejszego wynalazku są materiały i sposoby oceny skuteczności leczenia obejmującego podawanie pacjentowi kompozycji immunogennej (to znaczy immunoterapii) z wykorzystaniem markerów biologicznych (biomarkerów), co do których ustalono, że są wystarczająco wiarygodną cechą charakterystyczną, korelującą z pożądaną odpowiedzią terapeutyczną, ściślej - z pożądaną odpowiedzią immunologiczną. Biomarkery są obecne w próbkach biologicznych uzyskiwanych od pacjenta. Możliwość przewidywania klinicznego wyniku leczenia, wkrótce po jego rozpoczęciu, umożliwi klinicystom i pacjentom zidentyfikowanie terapii nieskutecznych i pozwoli na podejmowanie świadomych decyzji odnośnie przebiegu leczenia, w tym między innymi decyzji o zaprzestaniu leczenia bądź o wdrożeniu innego sposobu leczenia. [0012] W rozumieniu niniejszego opisu, w całym zgłoszeniu, terminy w liczbie pojedynczej stosuje się w takim znaczeniu, że oznaczają one co najmniej jeden, co najmniej pierwszy, jeden lub więcej lub wiele danych związków lub etapów, o ile kontekst nie wskazuje inaczej. Termin komórka obejmuje na przykład wiele komórek, w tym ich mieszaninę. Konkretniej, określenia co najmniej jeden oraz jeden lub więcej oznaczają
- 7-1 2 liczbę, która wynosi jeden lub więcej niż jeden, przy czym szczególnie korzystne są liczby jeden, dwa lub trzy. [0013] Termin i(lub) stosowany w niniejszym opisie obejmuje znaczenia słów i, lub oraz wszystkie elementy lub dowolna kombinacja elementów określanych danym terminem. [0014] Termin około lub w przybliżeniu, w rozumieniu niniejszego opisu, oznacza liczby w granicach plus lub minus %, korzystnie %, korzystniej %. [001] Terminy pacjent i osobnik oznaczają kręgowca, zwłaszcza ssaka, i obejmują między innymi nie będąc ograniczonymi zwierzęta domowe, zwierzęta sportowe oraz naczelne, w tym człowieka. [0016] W rozumieniu niniejszego opisu, termin leczenie obejmuje profilaktykę i(lub) terapię. Zgodnie z tym, immunogenne kombinacje lub sposoby według niniejszego wynalazku nie są ograniczone do zastosowań terapeutycznych i mogą być stosowane w profilaktyce. Jest to objęte terminem rozwijanie odpowiedzi profilaktycznej lub terapeutycznej, korzystnie odpowiedzi immunologicznej z niniejszego opisu. Profilaktyka nie ogranicza się do zapobiegania chorobom, które wystąpiłyby natychmiast (takim jak na przykład choroby zakaźne): pojęcie to obejmuje także zapobieganie długofalowym skutkom tych zakażeń, takim jak marskość lub choroba nowotworowa. [0017] Ilość skuteczna lub ilość wystarczająca związku czynnego jest to ilość wystarczająca do wywarcia korzystnych lub pożądanych rezultatów, w tym rezultatów klinicznych. Ilość skuteczną można podawać jednorazowo lub w kilku podaniach. Ilość terapeutycznie skuteczna jest to ilość służąca uzyskaniu korzystnych wyników
- 8-1 2 klinicznych, takich jak między innymi złagodzenie jednego lub więcej objawów związanych z zakażeniem wirusowym, jak również zapobieganie chorobie (na przykład zapobieganie jednemu lub więcej niż jednemu objawowi zakażenia). [0018] Według pierwszego przykładu wykonania, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób ex vivo oceny skuteczności leczenia obejmującego podawanie pacjentowi kompozycji immunogennej, zawierającej co najmniej jeden rekombinowany wektor wirusowy, kodujący ukierunkowany antygen, przy czym sposób ten obejmuje: - oznaczanie poziomu aktywowanych limfocytów T CD3+ CD69+ w próbce biologicznej pobranej z organizmu pacjenta, któremu podano jedną lub więcej niż jedną dawkę kompozycji immunogennej, przy czym wspomnianą próbkę biologiczną pobiera się po przynajmniej po jednym wspomnianym podaniu; - gdzie poziom aktywowanych limfocytów T CD3+ CD69+ powyżej około,4% wskazuje na pozytywny wynik kliniczny leczenia osobnika. [0019] W korzystnym przykładzie wykonania pozytywny wynik kliniczny oznacza zwiększenie odsetka przeżycia. [00] Zatem niniejszy wynalazek dostarcza sposób ex vivo oceny skuteczności leczenia obejmującego podawanie pacjentowi kompozycji immunogennej (to znaczy immunoterapii). [0021] Według wynalazku, termin ocena należy rozumieć jako monitorowanie, modyfikowanie lub korekta leczenia obejmującego podawanie pacjentowi kompozycji immunogennej. [0022] Sposób obejmuje ocenę skuteczności leczenia immunoterapeutycznego na podstawie poziomu aktywowanych limfocytów T CD3+ CD69+ (określanych w dalszym ciągu
- 9-1 2 niniejszego opisu także jako aktywowane limfocyty T (CD3+ CD69+) ) u pacjenta po leczeniu immunoterapeutycznym. [0023] Sposób obejmuje oznaczanie u pacjenta poziomu aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) po leczeniu immunterapeutycznym i ocenę skuteczności leczenia immunoterapetycznego na podstawie poziomu aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+). [0024] W niektórych aspektach sposób może ponadto obejmować oznaczanie u pacjenta poziomu aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) przed leczeniem immunoterapeutycznym. [002] W niektórych aspektach sposób obejmuje oznaczanie u pacjenta poziomu aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) co najmniej jeden raz w kilka tygodni po leczeniu immunoterapeutycznym i ocenę skuteczności leczenia immunoterapeutycznego na podstawie poziomu aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+). [0026] Czas od rozpoczęcia leczenia immunoterapeutycznego do oznaczania poziomu aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) może wynosić od około 1 dnia do około 48 tygodni lub więcej (na przykład od około 1 dnia do około 1 tygodnia, od około 1 tygodnia do około 2 tygodni, od około 2 tygodni do około 4 tygodni, od około 4 tygodni do około 8 tygodni, od około 8 tygodni do około 12 tygodni, od około 12 tygodni do około 16 tygodni, od około 16 tygodni do około 24 tygodni, od około 24 tygodni do około 48 tygodni lub dłużej). W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku czas ten wynosi około tygodni. Można również dokonywać dodatkowych pomiarów (to znaczy pomiaru trzeciego, czwartego, piątego itd.) w podobnych odstępach czasu po drugim pomiarze.
- - 1 2 [0027] Leczenie immunoterapeutyczne obejmuje co najmniej jedno podanie kompozycji immunogennej pacjentowi. Według szczególnego przykładu wykonania immunoterapia składa się z wielokrotnego podawania pacjentowi kompozycji immunogennej, konkretniej obejmuje ono podawanie cotygodniowe przez co najmniej 2 tygodnie, korzystnie przez co najmniej 6 tygodni. [0028] Sposób obejmuje oznaczanie poziomu aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) u pacjenta po podaniu pacjentowi kompozycji immunogennej, porównanie tego poziomu z wyżej wymienionymi wartościami odcięcia i ocenę skuteczności leczenia immunoterapeutycznego na podstawie poziomu aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) w porównaniu z wartością odcięcia. [0029] W rozumieniu niniejszego opisu termin aktywowane limfocyty T (CD3+ CD69+) oznacza komórkę limfocytu, na powierzchni którego ulegają ekspresji antygeny powierzchniowe CD3 i CD69. [00] Według wynalazku poziom aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) można określać na przykład metodą cytometrii przepływowej (na przykład cytofluorymetrii przepływowej), testu lizy komórek docelowych, a konkretniej metodą cytometrii przepływowej z analizą dwóch lub więcej kolorów (na przykład Beckton Dickinson, Beckman Coulter). Zob. na przykład Chizzolini i wsp., 1991, Eur J Immunol.; 21(11), 2727-33. [0031] Według wynalazku poziom aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) można określać z próbki krwi pełnej lub z izolowanych obwodowych komórek jednojądrzastych (PBMC) [poprzez na przykład oczyszczanie obwodowych komórek jednojądrzastych (PBMC) metodą Ficoll-Hypaque (Bennett i Breit 1994, J Leukoc Biol., 6(3), 236-40), przez
- 11-1 2 zastosowanie układu Sigma Accuspin (Sigma-Aldrich Ltd.) zgodnie z instrukcjami producenta itp.]. [0032] Według jednego z przykładów wykonania wynalazku poziom aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) określa się poprzez zastosowanie przeciwciał. [0033] Według pewnego konkretnego przykładu wykonania wynalazku wspomnianymi przeciwciałami są przeciwciała monoklonalne. [0034] Przykładami przeciwciał, które można zastosować, są przeciwciała anty-cd3 (Beckman Coulter, nr kat. A07748) i anty-cd69 (Beckman Coulter, nr kat. IM266U) [003] Według pewnego konkretnego przykładu wykonania wynalazku wspomniane przeciwciała opatruje się tagami, stosując na przykład znaczniki fluorescencyjne, radioznaczniki, enzymy, biotynę lub dowolnymi innymi metodami przeznaczonymi do wykrywania komórek wyznakowanych tymi przeciwciałami. Takie techniki są powszechnie stosowane i znane w stanie techniki. [0036] Według jednego z korzystnych przykładów wykonania wynalazku poziom aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) oznacza się przez zastosowanie przeciwciał swoistych wobec CD3 i CD69. [0037] I tak na przykład, poziom aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) oznacza się przez pobranie krwi obwodowej i inkubację komórek z przeciwciałami monoklonalnymi (na przykład z anty-cd3 i -CD69). Następnie oznacza się poziom aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) za pomocą cytometru przepływowego, produkcji na przykład Instrumentation Laboratory-Beckman Coulter, z promieniem lasera He-Ne, rozpoznającym długość fal czterech różnych fluorochromów (izotiocyjanian fluoresceiny FITC, fikoerytryna PE/RD1, ECD, PC/PE).
- 12-1 2 [0038] Poziom aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) można wyrażać albo (i) jako procent (%) limfocytów krwi obwodowej, wykazujących ekspresję antygenów powierzchniowych CD3 i CD69 lub (ii) jako liczbę bezwzględną aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) na mikrolitr obwodowej krwi pełnej. [0039] Poziom aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) wynoszący ponad około,4% odpowiada poziomowi ponad 148 limfocytów CD3+ CD69+ na µl krwi pełnej. Korzystnie, wspomniany poziom aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) oznacza się w dniu 43 po rozpoczęciu leczenia obejmującego podawanie pacjentowi kompozycji immunogennej. [0040] W korzystnym przykładzie wykonania wynalazku sposób według niniejszego wynalazku obejmuje także etap wstępny, polegający na oznaczeniu poziomu aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) w organizmie pacjenta przed podaniem kompozycji immunogennej. [0041] Według niniejszego wynalazku poziom aktywowanych limfocytów T (CD3+ CD69+) oznacza się w próbce biologicznej uzyskanej od pacjenta. Do próbek biologicznych należą między innymi próbki krwi i innych cieczy pochodzenia biologicznego oraz próbki tkanek litych, takie jak bioptaty. W korzystnym przykładzie wykonania próbką biologiczną jest krew, osocze lub surowica; w tych przypadkach uzyskanie próbek od pacjenta jest procedurą względnie prostą i nieinwazyjną. Metody uzyskiwania krwi lub surowicy są dobrze znane w stanie techniki i nie stanowią części wynalazku. [0042] Użyte w niniejszym opisie terminy kompozycja immunogenna kompozycja szczepionki, szczepionka lub podobne można stosować zamiennie i oznaczają one środek
- 13-1 2 nadający się do stymulowania/indukowania/nasilania działania układu immunologicznego osobnika w celu złagodzenia aktualnego stanu albo w celu ochrony lub zredukowania obecnego lub przyszłego zranienia lub zakażenia (w tym zakażeń wirusowych, bakteryjnych, inwazji pasożytniczych), na przykład w celu zmniejszenia proliferacji lub przeżycia komórek nowotworowych, zmniejszenia replikacji patogenu lub jego szerzenia się u osobnika albo w celu wykrywalnego zmniejszenia objawu lub objawów niepożądanych związanych ze stanem lub chorobą oraz w celu wydłużenia przeżycia pacjenta. Wspomniana kompozycja immunogenna zawiera co najmniej jeden rekombinowany wektor wirusowy kodujący ukierunkowany antygen. [0043] Według alternatywnego przykładu wykonania kompozycja immunogenna według wynalazku zawiera ponadto co najmniej jeden środek modyfikujący odpowiedź immunologiczną. [0044] Do przykładów takich środków modyfikujących odpowiedź immunologiczną (ang. immune response modifier - IRM) należą oligonukleotydy CpG (zob. na przykład US 6,194,388; US06094683; WO 04039829), lipopolisacharydy, kompleksy kwas poliinozynowy:policytydylowy (Kadowaki i wsp., 01, J. Immunol. 166, 2291-229) oraz polipeptydy i białka, o których wiadomo, że indukują wytwarzanie cytokin z komórek dendrytycznych i(lub) monocytów/makrofagów. Innymi przykładami takich środków modyfikujących odpowiedź immunologiczną (IRM) są drobnocząsteczkowe związki organiczne, takie jak imidazochinolinoaminy, aminy imidazopirydynowe, poddane fuzji w pozycjach 6,7 aminy cykloalkiloimidazopirydynowe, aminy
- 14-1 2 imidazonaftyrydynowe, aminy oksazolochinolinowe, aminy tiazolochinolinowe i zawierające mostki w pozycjach 1 i 2 aminy imidazochinolinowe (zob. na przykład US 4,689,338; US,389,640; US 6,1,929 i US 6,331,39). [004] Jak użyto w niniejszym opisie termin antygen odnosi się do dowolnej substancji, w tym do antygenów złożonych (takich jak na przykład komórki nowotworowe, komórki zakażone wirusami itd.), która może być celem odpowiedzi immunologicznej. Antygen może być celem na przykład komórkowej i(lub) humoralnej odpowiedzi immunologicznej organizmu pacjenta. Termin antygen obejmuje na przykład wszystkie lub część antygenów wirusowych, antygenów swoistych dla nowotworów lub antygenów związanych z nowotworami, antygenów bakteryjnych, antygenów pasożytniczych i tym podobnych: - do antygenów wirusowych należą na przykład antygeny wirusów zapalenia wątroby typu A, B, C, D i E, HIV, wirusów opryszczki, cytomegalowirusa, wirusa ospy wietrznej i półpaśca, wirusów brodawczaka, wirusa Epsteina-Barr, wirusów grypy, wirusów paragrypy, adenowirusów, wirusów Coxsackie, pikornawirusów, rotawirusów, syncytialnych wirusów oddechowych, wirusów ospy, rinowirusów, wirusa różyczki, papowirusa, wirusa świnki, wirusa odry. Niektóre nieograniczające przykłady znanych antygenów wirusowych obejmują następujące: antygeny pochodzące z HIV-1, takie jak tat, nef, gp1 lub gp160, gp40, p24, gag, env, vif, vpr, vpu, rev lub part i(lub) ich kombinacje; antygeny pochodzące z ludzkich wirusów opryszczki, takie jak gh, gl, gm, gb, gc, gk, ge lub gd, ich część i(lub) ich kombinacje lub białko bezpośrednio-wczesne, takie jak ICP27, ICP47, ICP4,
- 1-1 2 ICP36 z HSV1 lub HSV2; antygeny pochodzące z cytomegalowirusa, zwłaszcza cytomegalowirusa ludzkiego, takie jak gb lub jego pochodne; antygeny pochodzące z wirusa Epsteina-Barr, takie jak gp lub jego pochodne; antygeny pochodzące z wirusa ospy wietrznej i półpaśca, takie jak gpl, 11, 111 i IE63; antygeny pochodzące z wirusa zapalenia wątroby, takie jak antygen pochodzący z wirusa zapalenia wątroby typu B, zapalenia wątroby typu C lub zapalenia wątroby typu E (na przykład białko env E1 lub E2, białko rdzeniowe, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NSa, NSb, p7 lub ich część i(lub) ich kombinacje wirusa zapalenia wątroby typu C); antygeny pochodzące z ludzkich wirusów brodawczaka (na przykład HPV6, 11, 16, 18, na przykład L1, L2, E1, E2, E3, E4, E, E6, E7 albo ich część i(lub) ich kombinacje); antygeny pochodzące z innych patogenów wirusowych, takich jak syncytialny wirus oddechowy (na przykład białka F i G lub ich pochodne), wirus paragrypy, wirus odry, wirus świnki, flawiwirusy (na przykład wirus żółtej febry, wirus dengi, wirus kleszczowego zapalenia mózgu, wirus japońskiego zapalenia mózgu) lub wirus grypy (na przykład białka HA, NP, NA, lub M, albo ich część i(lub) ich kombinacje); - do antygenów swoistych wobec nowotworów lub związanych z nowotworami należą między innymi antygeny raka, chłoniaka, blastomy, mięsaka i białaczki. Do bardziej szczegółowych przykładów takich nowotworów należą nowotwór sutka, nowotwór prostaty, nowotwór okrężnicy, rak płaskokomórkowy, drobnokomórkowy rak płuca, niedrobnokomórkowy rak płuca, nowotwory układu pokarmowego, nowotwór trzustki, glioblastoma, nowotwór
- 16-1 2 szyjki macicy, nowotwór jajnika, nowotwór wątroby, nowotwór pęcherza moczowego, wątrobiak, nowotwór jelita grubego, nowotwór śluzówki macicy, rak ślinianek, nowotwór nerki, nowotwór wątroby, nowotwór sromu, nowotwór tarczycy, rak wątroby, różne typu raków głowy i szyi, nowotwór nerek, czerniak złośliwy, nowotwór krtani, nowotwór prostaty. Antygeny nowotworowe są to antygeny, które mogą potencjalnie stymulować faktycznie swoistą wobec nowotworu odpowiedź immunologiczną. Niektóre z tych antygenów są kodowane przez komórki prawidłowe, jakkolwiek niekoniecznie ulegają ekspresji w tych komórkach. Te antygeny można scharakteryzować jako antygeny, które w warunkach prawidłowych pozostają nieme (to znaczy, nie ulegają ekspresji) w komórkach prawidłowych, antygeny, które ulegają ekspresji tylko na niskim poziomie lub w pewnych stadiach różnicowania oraz antygeny ulegające ekspresji czasowo, takie jak antygeny zarodkowe i płodowe. Inne antygeny nowotworowe są kodowane przez zmutowane geny komórkowe, takie jak onkogeny (na przykład aktywowany onkogen ras), geny supresorowe (na przykład mutant p3), białka fuzyjne powstające na drodze delecji wewnętrznych lub translokacji chromosomowych. Jeszcze inne antygeny nowotworowe mogą być kodowane przez geny wirusowe, takie jak antygeny znajdujące się na wirusach nowotworowych RNA i DNA. Do nieograniczających przykładów antygenów swoistych wobec nowotworów lub związanych z nowotworami należą MART-1/Melan-A, gp0, peptydaza dipeptydylowa IV (DPPIV), białko wiążące deaminazę adenozyny (ADAbp), cyklofilina b, antygen związany z nowotworami jelita
- 17-1 2 grubego (ang. Colorectal - CRC) - C017-1A/GA733, antygen rakowo-płodowy (ang. Carcinoembryonic Antigen - CEA) i jego epitopy immunogenne CAP-1 i CAP-2, etv6, aml1, antygen swoisty dla prostaty (ang. Prostate Specific Antigen (PSA) i jego epitopy immunogenne PSA- 1, PSA-2 i PSA-3, antygen błonowy swoisty dla prostaty (PS-MA), receptor komórki T/łańcuch CD3-zeta, rodzina MAGE antygenów nowotworowych (na przykład MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE- Xp2 (MAGE-82), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C), rodzina GAGE antygenów nowotworowych (na przykład GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-, GAGE-6, GAGE-7, GAGE- 8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tyrozynaza, p3, rodzina MUC (na przykład MUC- 1), HER2/neu, p21ras, RCAS1, alfa-fetoproteina, E- kadheryna, alfa-katenina, beta-katenina i gammakatenina, p1ctn, gp0.sup.pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, białko polipowatości gruczolakowatej okrężnicy (ang. adenomatous polyposis coli - APC), fodryna, koneksyna 37, idiotyp Ig, p1, gp7, gangliozydy GM2 i GD2, produkty wirusowe, takie jak białka ludzkiego wirusa brodawczaka, rodzina Smad antygenów nowotworowych, lmp-1, P1A, antygen jądrowy kodowany przez EBV (EBNA-1); fosforylaza glikogenu mózgu, SSX- 1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-, SCP-1 i CT-7 i c-erbb-2; - do antygenów bakteryjnych należą na przykład antygeny Mycobacteria wywołujące gruźlicę i trąd, pneumokoki, tlenowe laseczki Gram-ujemne, mykoplazmy, gronkowce, paciorkowce, Salmonellae, chlamydie, Neisseriae;
- 18-1 2 - do innych antygenów należą na przykład antygeny zarodźca malarii oraz pasożytów wywołujących leiszmaniozę, trypanosomiazę, toksoplasmozę, schistosomatozę, filariozę. [0046] Wspomniany antygen kodowany jest przez heterologiczną sekwencję nukleotydową i ulega ekspresji in vivo z udziałem rekombinowanego wektora wirusowego. [0047] W szczególnie korzystnym przykładzie wykonania heterologiczna sekwencja nukleotydowa koduje jeden lub więcej spośród wszystkich lub części następujących antygenów: HBV - PreS1, PreS2, białka powierzchniowe env, białko rdzeniowe i polhiv-gp1 gp40, gp160, p24, gag, pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev, nef; HPV - E1, E2, E3, E4, E, E6, E7, E8, L1, L2 (zob. na przykład WO 90/49, WO 98/0470, WO 99/0388); HPV - białko env E1 lub E2, białko rdzeniowe, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NSa, NSb, p7 (zob. na przykład WO041182, WO0014); Muc-1 (zob. na przykład US,861,381: US6,04,438; WO98/04727; WO98/3709). [0048] Według wariantów wynalazku kompozycja immunogenna zawiera rekombinowany wektor wirusowy, kodujący co najmniej dwa antygeny, to znaczy zawierający heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą co najmniej dwa antygeny, lub co najmniej dwie heterologiczne sekwencje nukleotydowe, kodujące co najmniej dwa antygeny. [0049] Według innego szczególnego przykładu wykonania heterologiczna sekwencja nukleotydowa koduje całość lub część antygenu lub antygenów HPV wybranych z grupy obejmującej wczesny region kodujący E6 HPV, wczesny region kodujący E7 HPV oraz ich pochodne lub kombinację.
- 19-1 2 [000] Antygen HPV kodowany przez rekombinowany wektor wirusowy dobiera się z grupy obejmującej polipeptyd E6HPV, polipeptyd E7 HPV lub oba z nich jednocześnie. Niniejszy wynalazek obejmuje zastosowanie dowolnego polipeptydu E6 HPV, którego wiązanie z p3 jest zaburzone lub przynajmniej znamiennie zmniejszone i(lub) zastosowanie dowolnego polipeptydu E7 HPV, którego wiązanie z Rb jest zaburzone lub przynajmniej znamiennie zmniejszone (Munger i wsp., 1989, EMBO J. 8, 4099-4; Crook i wsp., 1991, Cell 67, 47-6; Heck i wsp., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4442-4446; Phelps i wsp., 1992, J. Virol. 66, 2148-2427). Z nieonkogennego wariantu E6 HPV-16, odpowiedniego do celów według niniejszego wynalazku, dokonuje się delecji jednej lub więcej niż jednej reszty aminokwasowej, przy czym są to reszty położone mniej więcej od pozycji 118 do mniej więcej pozycji 122 (przy czym +1 oznacza pierwszą resztę metioninową natywnego polipeptydu E6 HPV-16), a szczególnie korzystna jest całkowita delecja reszt 118-122 (CPEEK). W nieonkogennnym wariancie E7 HPV-16, odpowiednim do celów według niniejszego wynalazku, dokonuje się delecji jednej lub więcej reszt aminokwasowych, położonych mniej więcej od pozycji 21 do mniej więcej pozycji 26 (przy czym +1 oznacza pierwszy aminokwas natywnego polipeptydu E7 HPV-16, a szczególnie korzystna jest całkowita delecja reszt 21-26 (DLYCYE). Według korzystnego przykładu wykonania, jeden lub więcej niż jeden wczesny polipeptyd HPV-16 stosowany w niniejszym wynalazku jest poddany dalszym modyfikacjom, ulepszającym prezentację klasy I MHC i(lub) klasy II MHC, i(lub) służącym stymulowaniu odporności anty-hpv. Polipeptydy E6 i E7 HPV są białkami jądrowymi; uprzednio
- - 1 2 wykazano, że prezentacja błonowa umożliwia zwiększenie ich skuteczności terapeutycznej (zob. na przykład WO99/0388). Korzystne może być zatem zmodyfikowanie co najmniej jednego z wczesnych polipeptydów HPV, tak aby był on zakotwiczony w błonie komórkowej. Zakotwiczenie w błonie można łatwo uzyskać przez włączenie do wczesnego polipeptydu HPV sekwencji zakotwiczających w błonie, jeżeli polipeptyd natywny będzie pozbawiony sekwencji wydzielniczej (to znaczy peptydu sygnałowego). Sekwencje zakotwiczające w błonie i sekwencje wydzielnicze są znane w stanie techniki. Pokrótce, sekwencje wydzielnicze są obecne na końcu N polipeptydów prezentowanych w błonie lub wydzielanych w błonie i zapoczątkowują ich przejście do siateczki śródplazmatycznej (ER). Zawierają one zwykle od 1 do 3 zasadniczo hydrofobowych aminokwasów, które są następnie usuwane przez swoistą, zlokalizowaną na ER endopeptydazę, dając dojrzały polipeptyd. Sekwencje zakotwiczające w błonie są zazwyczaj bardzo hydrofobowe i służą do zakotwiczenia polipeptydów w błonie komórkowej (zob. na przykład Branden i Tooze, 1991, w: Introduction to Protein Structure, str. 2-214, NY Garland). [001] Wybór sekwencji zakotwiczających w błonie i sekwencji wydzielniczych, które można zastosować w kontekście niniejszego wynalazku, jest szeroki. Można je uzyskać z dowolnego zawierającego je polipeptydu zakotwiczonego w błonie i(lub) wydzielanego w błonie (na przykład z polipeptydów komórkowych lub wirusowych), takich jak glikoproteina wścieklizny, z glikoproteiny otoczki wirusa HIV lub z białka wirusa F odry, albo mogą to być sekwencje syntetyczne. Sekwencje zakotwiczające w błonie i(lub) sekwencje wydzielnicze wprowadzane do każdego z wczesnych polipeptydów HPV-16 stosowanych
- 21-1 2 według niniejszego wynalazku mogą być tego samego lub różnego pochodzenia. Korzystnymi miejscem insercji sekwencji wydzielniczej jest koniec N w dół od kodonu inicjacji translacji, a korzystnym miejscem insercji sekwencji zakotwiczającej w błonie jest koniec C, położony na przykład bezpośrednio w górę od kodonu stop. [002] Polipeptyd E6 HPV do zastosowania według niniejszego wynalazku jest korzystnie zmodyfikowany przez wprowadzenie sygnałów wydzielniczych i zakotwiczających w błonie białka F odry. Opcjonalnie lub w kombinacji, polipeptyd E7 HPV do zastosowania według niniejszego wynalazku jest korzystnie zmodyfikowany przez wprowadzenie sygnałów wydzielniczych i zakotwiczających w błonie glikoproteiny wścieklizny. [003] Skuteczność terapeutyczną rekombinowanego wektora wirusowego można również ulepszyć przez zastosowanie jednego lub więcej kwasu nukleinowego kodującego polipeptyd lub polipeptydy nasilające właściwości immunologiczne. Korzystne może być na przykład powiązanie wczesnego polipeptydu HPV (lub wczesnych polipeptydów HPV) z polipeptydem takim, jak kalretikulina (Cheng i wsp., 01, J. Clin. Invest. 8, 669-678), białko wstrząsu cieplnego Mycobacterium tuberculosis 70 (HSP70) (Chen i wsp., 00, Cancer Res. 60, 3-42), ubikwityna (Rodriguez i wsp., 1997, J. Virol. 71, 8497-803) lub domena translokacji toksyny bakteryjnej, takiej jak egzotoksyna A Pseudomonas aeruginosa (ETA(dIII)) (Hung i wsp., 01 Cancer Res. 61, 3698-3703). [004] Według innego przykładu wykonania rekombinowany wektor wirusowy stosowany w wynalazku zawiera kwas nukleinowy kodujący jeden lub więcej wyżej zdefiniowanych
- 22-1 2 polipeptydów wczesnych, konkretniej wczesne polipeptydy E6 i(lub) E7 HPV-16 i(lub) HPV-18. [00] Według innego szczególnego i korzystnego przykładu wykonania heterologiczna sekwencja nukleotydowa koduje całość lub część antygenu MUC 1 lub jego pochodnych. [006] Według innego szczególnego przykładu wykonania heterologiczna sekwencja nukleotydowa koduje jeden lub więcej całości lub części spośród następujących: białko E1 lub E2 env, białko rdzeniowe, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NSa, NSb, p7 HCV [wirusa zapalenia wątroby typu C] lub jego pochodne. Według innego szczególnego przykładu wykonania heterologiczna sekwencja nukleotydowa koduje jedno lub więcej białko fuzyjne, którego konfiguracja nie jest natywna w tym sensie, że co najmniej jeden z polipeptydów NS pojawia się w kolejności innej niż w konfiguracji natywnej. Jeżeli zatem białko fuzyjne zawiera polipeptyd NS3, polipeptyd NS4A i polipeptyd NSB, konfiguracją natywną byłoby NS3-NS4A-NSB z NS3 na końcu N i NSB na końcu C. Konfiguracją nienatywną byłoby natomiast NSB-NS3-NS4A, NSB-NS4A-NS3, NS4A-NS3-NSB, NS4A-NSB-NS3 lub NS3-NSB-NS4A. W szczególności, białko fuzyjne zawiera co najmniej jeden z następujących: o Polipeptyd NS4A poddany fuzji bezpośrednio lub poprzez łącznik z końcem N polipeptydu NS3; o Polipeptyd NS3 poddany fuzji bezpośrednio lub poprzez łącznik z końcem N polipeptydu NSB; o Polipeptyd NS4B poddany fuzji bezpośrednio lub poprzez łącznik z końcem N polipeptydu NSB; o Polipeptyd NS4A poddany fuzji bezpośrednio lub poprzez łącznik z końcem N polipeptydu NS3,
- 23 - który jest poddany fuzji bezpośrednio lub poprzez łącznik z końcem N polipeptydu NS4B; 1 2 o i(lub) polipeptyd NS3 poddany fuzji bezpośrednio lub poprzez łącznik z końcem N polipeptydu NS4B, który jest poddany fuzji bezpośrednio lub poprzez łącznik z końcem N polipeptydu NSB. [007] W takich swoistych częściach białka fuzyjnego każdy z polipeptydów NS może być niezależnie polipeptydem natywnym lub zmodyfikowanym. Polipeptyd NS4A wchodzący w skład części NS4A-NS3 może być na przykład natywny, natomiast polipeptyd NS3 może zawierać co najmniej jedną z modyfikacji opisanych poniżej. [008] Jeżeli jest to konieczne, cząsteczkę kwasu nukleinowego stosowaną w niniejszym wynalazku można optymalizować, żeby zapewnić wysoki poziom ekspresji stanowiącego cel antygenu (takiego jak na przykład wczesny polipeptyd HPV lub wczesne polipeptydy HPV) w konkretnej komórce gospodarza lub organizmie gospodarza, na przykład w ludzkiej komórce gospodarza lub w organizmie człowieka. Typowo, optymalizację kodonów przeprowadza się przez zastąpienie jednego lub więcej kodonu natywnego (na przykład HPV) odpowiadającego kodonowi rzadko wykorzystywanemu w komórce gospodarzassaka jednym lub więcej niż jednym kodonem kodującym ten sam aminokwas, a częściej wykorzystywanym. Można to osiągnąć na drodze konwencjonalnej mutagenezy lub metodami syntezy chemicznej (z uzyskaniem na przykład syntetycznego kwasu nukleinowego). Nie jest konieczne zastąpienie wszystkich kodonów natywnych, odpowiadających rzadko wykorzystywanym kodonom, ponieważ zwiększenie ekspresji można osiągnąć nawet zastąpieniem częściowym.
- 24-1 2 Można ponadto dokonywać pewnych odstępstw, niekoniecznie trzymając się optymalizowanego wykorzystania kodonów, tak, żeby możliwe było wprowadzenie miejsca lub miejsc restrykcyjnych. [009] Jk użyto w niniejszym opisie termin rekombinowany wektor wirusowy oznacza wektory pozachromosomalne (na przykład episom), występujące w wielu kopiach i integrujące się (to znaczy przeznaczone do włączenia do chromosomów gospodarza). Szczególnie ważne w kontekście wynalazku są wektory do zastosowania w terapii genowej (to znaczy wektory zdolne do dostarczania kwasu nukleinowego do organizmu gospodarza), jak również wektory ekspresyjne do zastosowania w różnych układach ekspresji. [0060] Odpowiednie wektory wirusowe mogą pochodzić z szeregu różnych wirusów (takich jak na przykład retrowirusy, adenowirusy, AAV, pokswirusy, wirusy opryszczki, wirus odry, wirusy piankowate i tym podobne). W rozumieniu niniejszego opisu termin wektor wirusowy obejmuje wektory DNA/RNA, jak również powstające z nich cząstki wirusowe. Wektor wirusowy może być kompetentny replikacyjnie lub może być genetycznie uszkodzony, przez co staje się replikacyjnie defektywny lub jego replikacja jest upośledzona. Termin kompetentny replikacyjnie w rozumieniu niniejszego opisu obejmuje wektory wirusowe replikacyjnie selektywne i o replikacji warunkowej, które wytwarza się metodami inżynierii genetycznej tak, żeby replikowały lepiej lub selektywnie w swoistych limfocytach gospodarza (na przykład w komórkach nowotworowych). [0061] W jednym z aspektów rekombinowany wektor wirusowy do zastosowania w wynalazku jest rekombinowanym wektorem
- 2-1 2 adenowirusowym (przegląd można znaleźć w: Adenoviral vectors for gene therapy, 02, red. D. Curiel i J. Douglas, Academic Press). Może on pochodzić z rozmaitych źródeł ludzkich lub zwierzęcych; można wykorzystywać dowolny serotyp spośród serotypów adenowirusowych od 1 do 1. Szczególnie korzystne są adenowirusy ludzkie 2 (Ad2), (Ad), 6 (Ad6), 11 (Ad11), 24 (Ad24) i 3 (Ad3). Takie adenowirusy są dostępne w American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md., Stany Zjednoczone) i są przedmiotem wielu publikacji, w których opisano ich sekwencję, organizację oraz sposoby ich wytwarzania, co umożliwia specjaliście ich wykorzystanie (zob. na przykład US 6,133,028; US 6,1,73; WO 02/4066; WO 00/073; EP 16711; Vogels i wsp., 03, J. Virol. 77, 8263-8271). [0062] Wektor adenowirusowy do zastosowania według niniejszego wynalazku może być kompetentny replikacyjnie. Specjalistom dostępne są liczne przykłady kompetentnych replikacyjnie wektorów adenowirusowych (zob. na przykład Hernandez-Alcoceba i wsp., 00, Human Gene Ther. 11, 09-24; Nemunaitis i wsp., 01, Gene Ther. 8, 746-79; Alemany i wsp., 00, Nature Biotechnology 18, 723-727). Można je wytwarzać metodami inżynierii genetycznej na przykład z genomu adenowirusa typu dzikiego przez delecję w domenie CR2 E1A (zob. na przykład WO00/24408) i(lub) przez zastąpienie natywnych promotorów E1 i(lub) E4 promotorami swoistymi dla tkanek nowotworów lub dla stanu komórki (zob. na przykład US,998,, WO99/2860, US,698,443, WO00/463, WO00/18 i WO01/3660). [0063] Zamiast tego wektor adenowirusowy do zastosowania według niniejszego wynalazku może być replikacyjnie defektywny (zob. na przykład WO94/2812; Lusky i wsp.,
- 26-1 2 1998, J. Virol 72, 22-32). Korzystnymi wektorami adenowirusowymi replikacyjnie defektywnymi są wektor E1- defektywny (zob. na przykład US 6,136,94 i US 6,013,638), z delecją E1 rozciągającą się w przybliżeniu od pozycji 49 do 3328 lub w przybliżeniu od pozycji 49 do 3 (w odniesieniu do sekwencji ludzkiego adenowirusa typu, ujawnionego w GenBank pod nr. akcesyjnym M 73260 i w Chroboczek i wsp., 1992, Virol. 186, 280-28). Zdolność do klonowania można jeszcze ulepszyć przez delecję dodatkowej części lub dodatkowych części genomu adenowirusa (całość lub część nieniezbędnego regionu E3 lub innych niezbędnych regionów E2, E4). Insercji kwasu nukleinowego do dowolnego miejsca wektora adenowirusowego można dokonać poprzez rekombinację homologiczną, jak opisano w Chartier i wsp. (1996, J. Virol. 70, 480-48). Kwas nukleinowy kodujący polipeptyd E6 HPV-16 można na przykład wprowadzać zamiast regionu E1, a kwas nukleinowy kodujący polipeptyd E7 HPV-16 zamiast regionu E3 lub odwrotnie. [0064] W innym, korzystnym aspekcie, wektorem do zastosowania według niniejszego wynalazku jest wektor pokswirusowy (zob. na przykład Cox i wsp. w Viruses in Human Gene Therapy pod red. J. M. Hos, Carolina Academic Press). Według innego korzystnego przykładu wykonania dobiera się go z grupy obejmującej wirus krowianki: do odpowiednich wirusów krowianki należą między innymi szczep kopenhaski (Goebel i wsp., 1990, Virol. 179, 247-266 i 17-63; Johnson i wsp., 1993, Virol. 196, 381-401), szczep Wyeth i pochodzący z niego wirus wysoce atenuowany, w tym MVA (przegląd - zob. Mayr, A., i wsp., 197, Infection 3, 6-14) oraz ich pochodne (takie jak szczep MVA 7 wirusa krowianki (ECACC V001707 - US
- 27-1 2 6,913,72), NYVAC (zob. WO 92/1672 - Tartaglia i wsp., 1992, Virology, 188, 217-232). Ustalenie pełnej sekwencji genomu MVA i porównanie z genomem szczepu kopenhaskiego VV [wirusa krowianki] umożliwiło dokładne zidentyfikowanie siedmiu delecji (od I do VII), do których doszło w genomie MVA (Antoine i wsp., 1998, Virology 244, 36-396); każdą z nich można wykorzystać do wprowadzenia kwasu nukleinowego kodującego antygen. Wektor można również uzyskać z dowolnego innego wirusa spośród Poxviridae, zwłaszcza z wirusa ospy ptasiej (na przykład TROVAC, zob. Paoletti i wsp, 199, Dev Biol Stand., 84, 19-163), wirusa ospy kanarków (na przykład ALVAC, WO 9/27780, Paoletti i wsp, 199, Dev Biol Stand., 84, 19-163), wirusa ospy gołębiej, wirusa ospy świń i tym podobnych. Specjalista może przykładowo odnieść się do WO 92 1672 (tę publikację włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie); opisano tam wytwarzanie wektorów ekspresyjnych opartych na pokswirusach zdolnych do ekspresji takiej heterologicznej sekwencji nukleotydowej, zwłaszcza sekwencji nukleotydowej kodującej antygen. [006] Podstawową metodę wprowadzania kwasu nukleinowego i związanych z nim elementów regulacyjnych, niezbędnych do ekspresji w genomie pokswirusa, opisano w licznych dokumentach, które są dostępne dla specjalisty (Paul i wsp., 02, Cancer Gene Ther. 9, 470-477; Piccini i wsp., 1987, Methods of Enzymology 13, 4-63; US 4,769,3; US 4,772,848; US 4,603,112; US,0,87 i US,179,993). Zazwyczaj dokonuje się homologicznej rekombinacji pomiędzy częściowo nakładającymi się sekwencjami (to znaczy pożądanym miejscem insercji),
- 28-1 2 które są obecne w genomie wirusa, a plazmidem zawierającym kwas nukleinowy, który ma być wprowadzony. [0066] Kwas nukleinowy kodujący antygen stosowany w niniejszym wynalazku korzystnie wprowadza się w locus nieniezbędnym genomu pokswirusa, aby rekombinowany pokswirus utrzymał swą żywotność i zakaźność. Regiony nieniezbędne są to niekodujące regiony intergenowe lub dowolny gen, którego inaktywacja lub delecja nie wpływa istotnie na wzrost, replikację ani zakaźność wirusa. Można również rozważyć insercję do niezbędnego locus wirusowego, pod warunkiem, że defektywną funkcję zapewnia się in trans w czasie wytwarzania cząstek wirusowych, poprzez na przykład zastosowanie linii komórek pomocniczych, zawierających sekwencje uzupełniające, odpowiadające sekwencjom, które poddano delecji z genomu pokswirusa. [0067] Gdy stosuje się szczep kopenhaski wirusa krowianki, kwas nukleinowy kodujący antygen korzystnie wprowadza się do genu kinazy tymidynowej (tk) (Hruby i wsp., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80, 3411-341; Weir i wsp., 1983, J. Virol. 46, -37). Odpowiednie są jednak także inne miejsca insercji, na przykład w genie hemaglutyniny (Guo i wsp., 1989, J. Virol. 63, 4189-4198), w locus K1L, w genie u (Zhou i wsp., 1990, J. Gen. Virol. 71, 218-2190) lub na lewym końcu genomu wirusa krowianki: w piśmiennictwie opisuje się wiele delecji w tym miejscu (spontanicznych lub uzyskiwanych metodami inżynierii genetycznej) (Altenburger i wsp., 1989, Archives Virol., 1-27; Moss i wsp. 1981, J. Virol. 40, 387-39; Panicali i wsp., 1981, J. Virol. 37, 00- ; Perkus i wsp, 1989, J. Virol. 63, 3829-3836; Perkus
- 29-1 2 i wsp, 1990, Virol. 179, 276-286; Perkus i wsp, 1991, Virol. 180, 406-4). [0068] Gdy stosuje się MVA, kwas nukleinowy kodujący antygen można wprowadzać do dowolnej ze zidentyfikowanych delecji I-VII, jak również do locus D4R, korzystna jest jednak insercja w delecji II lub III (Meyer i wsp., 1991, J. Gen. Virol. 72, 31-38; Sutter i wsp., 1994, Vaccine 12, 32-40). [0069] Gdy stosuje się wirusa ospy ptasiej, to, jakkolwiek można rozważyć insercję w obrębie genu kinazy tymidynowej, kwas nukleinowy kodujący antygen korzystnie wprowadza się do regionu intergenowego, znajdującego się między ORF 7 a 9 (zob. na przykład EP 314 69 i US,180,67). [0070] Według szczególnego przykładu wykonania rekombinowanym wektorem wirusowym jest rekombinowany wektor adenowirusowy. [0071] Według innego szczególnego przykładu wykonania rekombinowanym wektorem wirusowym jest rekombinowany wektor krowianki. [0072] Według jednego z korzystnych przykładów wykonania rekombinowanym wektorem krowianki jest rekombinowany wektor MVA. [0073] Korzystnie, kwas nukleinowy kodujący antygen do zastosowania według wynalazku jest obecny w postaci korzystnej do ekspresji w komórce gospodarza lub w organizmie gospodarza, co oznacza, że sekwencję kwasu nukleinowego kodującą antygen umieszcza się pod kontrolą jednej lub więcej niż jednej sekwencji regulacyjnej, niezbędnej do jej ekspresji w komórce gospodarza lub w organizmie gospodarza. W rozumieniu niniejszego opisu termin sekwencja regulacyjna odnosi się do dowolnej
- - 1 2 sekwencji, która umożliwia ekspresję, przyczynia się do ekspresji lub moduluje ekspresję kwasu nukleinowego w danej komórce gospodarza, co obejmuje replikację, duplikację, transkrypcję, splicing, translację, stabilność i(lub) transport kwasu nukleinowego lub jednej z jego pochodnych (to znaczy mrna) do komórki gospodarza. Specjaliści zauważą, że dobór sekwencji regulacyjnych może zależeć od czynników takich, jak komórka gospodarza, wektor i pożądany poziom ekspresji. Kwas nukleinowy kodujący antygen jest połączony w sposób umożliwiający działanie z sekwencją ekspresji genu, kierującą ekspresją kwasu nukleinowego antygenu w obrębie komórki eukariotycznej. Sekwencja ekspresji genu jest to dowolna regulacyjna sekwencja nukleotydowa, taka jak sekwencja promotorowa lub kombinacja promotor-wzmacniacz, ułatwiająca skuteczną transkrypcję i translację kwasu nukleinowego antygenu, z którym jest połączona w sposób umożliwiający działanie. Sekwencja ekspresji genu może być na przykład promotorem pochodzącym od ssaka lub wirusa, takim jak promotor konstytutywny lub indukowalny. Do konstytutywnych promotorów pochodzących od ssaków należą między innymi promotory następujących genów: transferaza fosforybozylowa hipoksantyny (HPRT), deaminaza adenozyny, kinaza pirogronianu, promotor b- aktyny i inne promotory konstytutywne. Do przykładowych promotorów wirusowych, które działają konstytutywnie w komórkach eukariotycznych, należą na przykład promotory pochodzące z cytomegalowirusa (CMV), wirusa małpiego (na przykład SV40), wirusa brodawczaka, adenowirusa, ludzkiego wirusa braku odporności (HIV), wirusa mięsaka Rousa, cytomegalowirusa, długich powtórzeń końcowych (ang. long terminal repeat - LTR) wirusa białaczki
- 31-1 2 Moloneya i z innych retrowirusów oraz promotor kinazy tymidynowej wirusa opryszczki zwyczajnej. Inne promotory konstytutywne są znane specjalistom. Do promotorów użytecznych jako sekwencje ekspresji genów według niniejszego wynalazku należą także promotory indukowalne. Promotory indukowalne ulegają ekspresji w obecności czynnika indukującego. Promotor metalotioneiny jest na przykład indukowany w kierunku sprzyjania transkrypcji i translacji w obecności jonów pewnych metali. Inne promotory indukowalne są znane specjalistom. Sekwencja ekspresji genu powinna ogólnie zawierać, w miarę potrzeby, sekwencje '-nieulegające transkrypcji i '- nieulegające translacji, zaangażowane, odpowiednio, w inicjacji transkrypcji i translacji, takie jak sekwencja TATA, sekwencja tworząca czapeczkę, sekwencja CAAT i tym podobne. Korzystnie, takie sekwencje '-nieulegające transkrypcji będą zawierać region promotora, obejmujący sekwencję promotora do regulacji transkrypcji kwasu nukleinowego antygenu połączonego w sposób umożliwiający działanie. Sekwencje ekspresji genu obejmują opcjonalnie sekwencje wzmacniaczowe lub położone w górę od nich sekwencje aktywujące, jeżeli jest to pożądane. Do korzystnych promotorów do zastosowania w wektorze pokswirusowym (zob. poniżej) należą między innymi promotory krowianki 7.K, HR, TK, p28, p11 i K1L, promotory chimerowe pomiędzy wczesnymi a późnymi promotorami pokswirusowymi, jak również promotory syntetyczne, takie jak promotory opisane w Chakrabarti i wsp. (1997, Biotechniques 23, 94-97), Hammond i wsp. (1997, J. Virological Methods 66, 13-138) i Kumar i Boyle (1990, Virology 179, 11-18).