RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1942198 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 16.07.200 07123761.4 (13) (1) T3 Int.Cl. C12Q 1/68 (2006.01) C07K 14/34 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 02.11.2011 Europejski Biuletyn Patentowy 2011/44 EP 1942198 B1 (4) Tytuł wynalazku: Jednostki ekspresji PEF-TS u Corynebacterium glutamicum (30) Pierwszeństwo: 20.07.2004 DE 1020040306 (43) Zgłoszenie ogłoszono: 09.07.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/28 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: 30.04.2012 Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/04 (73) Uprawniony z patentu: BASF SE, Ludwigshafen, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 1942198 T3 OSKAR ZELDER, Speyer, DE CORINNA KLOPPROGGE, Mannheim, DE BURKHARD KRÖGER, Limburgerhof, DE HARTWIG SCHRÖDER, Nussloch, DE STEFAN HAEFNER, Speyer, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Jan Dobrzański LDS ŁAZEWSKI DEPO I WSPÓLNICY SP. K. ul. Mysłowicka 1 01-612 Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
1 Z-8929 EP 1 942 198 B1 10 1 20 2 30 3 Jednostki ekspresji PEF-TS u Corynebacterium glutamicum Opis [0001] Ten wynalazek dotyczy sposoby zmiany lub wywołania szybkości transkrypcji genów i genetycznie zmienionych mikroorganizmów ze zmienioną lub wywołaną szybkością transkrypcji. [0002] Różne produkty biosyntetyczne, jak na przykład wysokiej jakości związki chemiczne, jak między innymi aminokwasy, witaminy ale także białka są produkowane przez naturalne procesy przemiany materii w komórkach i są stosowane w gałęziach przemysłu, włączając przemysł spożywczy, pasz, kosmetyków, karmy i pokarmu i farmaceutycznego. Te substancje określane razem jako wysokiej jakości związki chemiczne/białka obejmują między innymi kwasy organiczne, jak i aminokwasy białkowe i niebiałkowe, nukleotydy i nukleozydy, lipidy i kwasy tłuszczowe, diole, węglowodany, związki aromatyczne, witaminy i kofaktory, jak i białka i enzymy. Ich produkcja zachodzi najbardziej celowo na dużą skalę z hodowlą bakterii, które opracowano by produkowały i wydzielały duże ilości odpowiedniej pożądanej substancji. W tym celu szczególnie odpowiednimi organizmami są bakterie z grupy maczugowców, niepatogennych bakterii gram-dodatnich. [0003] Wiadomo, że uzyskuje się aminokwasy przez fermentację szczepów maczugowców, w szczególności Corynebacterium glutamicum. Ze względu na duże znaczenie pracuje się ciągle nad poprawą sposobu produkcji. Poprawa sposobu może dotyczyć techniki fermentacji, jak na przykład mieszanie i dostarczanie tlenu, lub skład podłoży odżywczych, jak na przykład stężenie cukru w czasie fermentacji, lub obróbka produktu, na przykład przez chromatografię jonowymienną, lub też suszenie rozpyłowe, lub może dotyczyć właściwości samego mikroorganizmu. [0004] Od kilku lat do poprawy szczepów Corynebacterium produkujących związki chemiczne wysokiej jakości/białka stosowane są także techniki rekombinacji DNA, tak, że amplifikuje się pojedyncze geny i bada wpływ tego na produkcję związków chemicznych wysokiej jakości/białek. [000] Inne drogi opracowania sposobu produkcji związków chemicznych wysokiej jakości, aminokwasów lub białek, lub by podwyższyć lub poprawić produktywność już istniejącego sposobu produkcji związków chemicznych wysokiej jakości, aminokwasów lub białek to ekspresja jednego lub więcej genów i lub wpływanie na translację mrna przez odpowiednie sekwencje polinukleotydowe. Wpływ może tutaj obejmować podwyższenie, zmniejszenie lub też inne parametry ekspresji genów jak wzór ekspresji w czasie.
2 10 1 20 2 30 3 [0006] Specjaliście są znane różne składniki bakteryjnych sekwencji regulatorowych. Rozróżnia się miejsca wiązania regulatorów, także zwane operatorami, miejsca wiązania holoenzymów polimerazy RNA, zwane także regionami -3 i - 10, i miejsce wiązania rybosomalnego 16S-RNA, zwane także miejscem wiązania rybosomów lub też sekwencją Shine-Dalgarno. [0007] Jako sekwencja wiązania rybosomów także zwana sekwencją Shine-Dalgarno, w znaczeniu tego wynalazku są rozumiane sekwencje polinukleotydowe, które znajdują się do 20 zasad powyżej kodonu inicjacji translacji. [0008] W literaturze (E. coli and S. typhimurium, Neidhardt F.C. 199 ASM Press) opisano, że zarówno skład sekwencji polinukleotydowej Shine-Dalgarno, kolejność zasad w sekwencji ale także odległość zawartej w sekwencji Shine-Dalgarno sekwencji polinukleotydowej ma znaczący wpływ na szybkość inicjacji translacji. [0009] Sekwencje kwasu nukleinowego z aktywnością promotora mogą na najróżniejsze sposoby wpływać na tworzenie mrna. Promotory, których aktywność jest niezależna od fizjologicznej fazy wzrostu organizmu nazywa się konstytutywnymi. Z kolei inne promotory reagują na zewnętrzne bodźce chemiczne, jak i fizyczne jak tlen, metabolity, ciepło, ph, itd. Z kolei inne wykazują w różnych fazach wzrostu silną zależność ich aktywności. Przykładowo w literaturze opisano promotory, które w czasie eksponencjalnej fazy wzrostu mikroorganizmów wykazują szczególnie wyraźną aktywność, lub też dokładnie w fazie stacjonarnej wzrostu mikroorganizmów. Obie cechy promotorów mogą mieć korzystny wpływ na produktywność dla produkcji związków chemicznych wysokiej jakości i białek w zależności od szlaku metabolizmu. [0010] Na przykład można wykorzystać promotory, które wyłączają ekspresję genu w czasie wzrostu, ale włączają ją po optymalnym wzroście do regulacji genu, który kontroluje produkcję metabolitu. Zmieniony szczep wykazuje wówczas takie parametry wzrostu jak szczep wyjściowy, ale produkuje więcej produktu na komórkę. Ten sposób modyfikacji może podwyższyć zarówno miano (g produktu/litr) jak i też wydajność C (g produktu Jgźródła węgla). [0011] W gatunkach Corynebacterium wyizolowano już takie sekwencje nukleotydowe, które mogą być stosowane do podwyższenia lub osłabienia ekspresji genów. Te regulowane promotory mogą podwyższać lub obniżać szybkość, z jaką transkrybowany jest gen w zależności od wewnętrznych i/lub zewnętrznych warunków komórki. Częściowo obecność określonego czynnika, znanego jako induktor, może wpływać na szybkość transkrypcji promotora. Induktory mogą wpływać na transkrypcję promotora bezpośrednio lub też pośrednio. Inna klasa czynników, znanych jako supresory, jest w stanie obniżać lub zahamować transkrypcję z promotora. Podobnie jak induktory, supresory też mogą działać bezpośrednio lub pośrednio. Znane są także promotory, które są regulowane przez
3 10 1 20 2 30 3 temperaturę. Tak poziom transkrypcji z takich promotorów może na przykład być podwyższony lub osłabiony przez podwyższenie normalnej temperatury wzrostu komórki. [0012] Dotychczas opisano niewielką liczbę promotorów z C. glutamicum. Promotor genu syntazy jabłczanowej z C. glutamicum opisano w DE 4440118. Ten promotor był połączony z genem kodującym białko. Po transformacji takiego konstruktu do maczugowca była regulowana ekspresja genu struktury przyłączonego do promotora. Ekspresja genu struktury była indukowana jak tylko dodawano odpowiedni induktor do podłoża. [0013] Reinscheid i wsp., Microbiology 14:03 (1999) opisali transkrypcyjną fuzję pomiędzy promotorem pta-ack z C. glutamicum i genem reporterowym (acetylotransferaza chloramfenikolu). Komórki C. glutamicum, które zawierają taką fuzję transkrypcyjną, wykazują podwyższoną ekspresję genu reporterowego przy wzroście na podłożu zawierającym octan. W porównaniu z tym transformowane komórki, które rosły na glukozie, nie wykazały podwyższonej ekspresji tego genu reporterowego. [0014] W Pa'tek i wsp., Microbiology 142:1297 (1996) opisano pewne sekwencje DNA z C. glutamicum, które mogą wzmacniać ekspresję genu reporterowego w komórkach C. glutamicum. Te sekwencje porównano ze sobą, aby zdefiniować sekwencje konsensusową dla promotorów C. glutamicum. [001] Dalsze sekwencje DNA z C. glutamicum, które mogą być stosowane do regulacji ekspresji genów są opisane w patencie WO 02/40679. Te wyizolowane polinukleotydy stanowią jednostki ekspresji z Corynebacterium glutamicum, które mogą być użyte do podwyższenia lub też do obniżenia ekspresji genów. Dalej w tym patencie są opisane zrekombinowane plazmidy, na których znajdują się jednostki ekspresji z Corynebacterium glutamicum z heterologicznymi genami. Tu opisana metoda, fuzja promotora z Corynebacterium glutamicum z heterologicznym genem, może być między innymi zastosowana do regulacji genów biosyntezy aminokwasów. [0016] U podstaw wynalazku leżało zadanie przygotowania kolejnych sposobów do zmiany lub wywołania szybkości transkrypcji genów u mikroorganizmu w porównaniu z typem dzikim. [0017] W tym celu znaleziono sposób zmiany lub wywołania szybkości transkrypcji genów w mikroorganizmach w porównaniu z typem dzikim przez regulację transkrypcji genów u mikroorganizmu przez kwasy nukleinowe z aktywnością promotora, zawierające A) sekwencję kwasu nukleinowego SEK NR ID 1 lub B) sekwencję pochodzącą od tej sekwencji przez podstawienie, insercję lub delecję nukleotydów, która wykazuje identyczność przynajmniej 90 % na poziomie kwasu nukleinowego z sekwencją SEK NR ID 1 lub C) sekwencję kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje z sekwencją kwasu nukleinowego SEK NR ID 1 w warunkach ostrych,
4 10 1 20 2 30 3 gdzie geny są heterologiczne w stosunku do kwasów nukleinowych z aktywnością promotora. [0018] Jako transkrypcję według wynalazku rozumie się proces, w którym wychodząc z matrycy DNA produkowana jest komplementarna cząsteczka RNA. W tym procesie biorą udział białka jak polimeraza RNA, tak zwane czynniki sigma i białka regulujące transkrypcję. Syntetyzowany RNA służy następnie jako matryca w procesie translacji, który prowadzi do biosyntetycznie aktywnego białka. [0019] Szybkość syntezy biosyntetycznie aktywnego białka jest efektem szybkości transkrypcji i translacji. Na obie szybkości można wpływać według wynalazku i w ten sposób wpływa się na szybkość tworzenia produktów w mikroorganizmie. [0020] Jako promotor lub kwas nukleinowy z aktywnością promotora rozumie się według wynalazku kwas nukleinowy, który jest funkcjonalnie połączony z kwasem nukleinowym, który reguluje transkrypcję tego kwasu nukleinowego. [0021] Jako funkcjonalne połączenie rozumie się tutaj przykładowo sekwencyjne uporządkowanie kwasu nukleinowego z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1 i mającej ulec transkrypcji sekwencji kwasu nukleinowego i ewentualnie dalszych elementów regulatorowych, jak na przykład sekwencji kwasu nukleinowego, które umożliwiają transkrypcję kwasu nukleinowego, jak na przykład terminator takiego typu, że każdy z elementów regulatorowych może wypełniać swoją funkcję przy transkrypcji sekwencji kwasu nukleinowego. W tym celu niekoniecznie jest wymagane bezpośrednie połączenie w znaczeniu chemicznym. Genetyczne sekwencje kontrolne, jak na przykład sekwencje enhancera, mogą działać także z bardziej oddalonych pozycji lub nawet z innych cząsteczek DNA na sekwencję docelową. Korzystne są uporządkowania, w których mająca ulec transkrypcji sekwencja kwasu nukleinowego jest umieszczona za (tzn. na końcu 3') sekwencji promotora według wynalazku, tak że obie sekwencje są ze sobą połączone kowalencyjnie. Korzystna przy tym jest odległość pomiędzy sekwencją promotora i sekwencją kwasu nukleinowego mającą wyrażać transgen mniejsza od 200 par zasad, szczególnie korzystnie mniejsza od 100 par zasad, bardzo szczególnie korzystnie mniejsza od 0 par zasad. [0022] Jako aktywność promotora według wynalazku jest rozumiana tworzona w określonym czasie przez promotor ilość RNA, czyli szybkość transkrypcji. [0023] Jako specyficzna aktywność promotora" rozumiana jest według wynalazku tworzona w określonym czasie przez promotor ilość RNA na promotor. [0024] Jako typ dziki według wynalazku jest rozumiany odpowiedni mikroorganizm wyjściowy. [002] W zależności od kontekstu pod pojęciem mikroorganizm może być rozumiany mikroorganizm wyjściowy (typ dziki) lub genetycznie zmieniony mikroorganizm według
10 1 20 2 30 3 wynalazku lub oba. [0026] Korzystnie i w szczególności w przypadkach, w których mikroorganizm lub typ dziki nie może być jednoznacznie przyporządkowany, jako typ dziki dla zmiany lub wywołania aktywności promotora lub szybkości transkrypcji, za zmianę lub wywołanie aktywności ekspresji lub szybkości ekspresji, za podwyższenie zawartości produktów biosyntetycznych, odpowiednio, jest rozumiany organizm referencyjny. [0027] W korzystnym wykonaniu ten organizm referencyjny jest Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. [0028] W korzystnym wykonaniu stosowane są mikroorganizmy wyjściowe, które już są w stanie produkować pożądane związki chemiczne wysokiej jakości. Szczególnie korzystne są przy tym wśród szczególnie korzystnych mikroorganizmów bakterie rodzaju Corynebacterium i szczególnie korzystnych związków chemicznych wysokiej jakości L- lizyna, L-metionina i L-treonina, te mikroorganizmy wyjściowe, które już są w stanie produkować L-lizynę, L-metioninę i/lub L-treoninę. Są to szczególnie korzystnie maczugowce, u których na przykład gen kodujący aspartokinazę (gen ask) jest deregulowany lub inhibicja zwrotna jest zniesiona lub obniżona. Na przykład takie bakterie wykazują mutację w genie ask, która powoduje obniżenie lub zniesienie hamowania zwrotnego, jak na przykład mutacja T3111. [0029] Przy wywołanej aktywności promotora lub szybkości transkrypcji w odniesieniu do genu w porównaniu z typem dzikim jest powodowane w porównaniu z typem dzikim tworzenie RNA, które nie było obecne w typie dzikim. [0030] Przy zmienionej aktywności promotora lub szybkości transkrypcji w odniesieniu do genu w porównaniu z typem dzikim jest tworzona ilość RNA zmieniona w porównaniu z typem dzikim w określonym czasie. [0031] Przez zmieniony tutaj jest rozumiane korzystnie podwyższony lub obniżony. [0032] To może być uzyskane na przykład przez podwyższoną aktywność promotora lub szybkość transkrypcji na przykład przez regulację transkrypcji genów u mikroorganizmu przez kwas nukleinowy z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1, gdzie geny są heterologicznie w stosunku do kwasu nukleinowego z aktywnością promotora. [0033] Korzystnie regulacja transkrypcji genów u mikroorganizmu przez kwas nukleinowy z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1 jest osiągana przez to, że wprowadza się do genomu mikroorganizmu jeden lub większą liczbę kwasów nukleinowych z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora, tak, że transkrypcja jednego lub więcej endogennych genów zachodzi pod kontrolą wprowadzonego kwasu nukleinowego z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1 ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora, lub wprowadza jeden lub większą liczbę genów do genomu mikroorganizmu, tak że
6 10 1 20 2 30 3 transkrypcja jednego lub więcej wprowadzonych genów zachodzi pod kontrolą endogennego kwasu nukleinowego z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora lub wprowadza się do mikroorganizmu jeden lub większą liczbę konstruktów kwasu nukleinowego, zawierających kwas nukleinowy z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora, i funkcjonalnie połączone jeden lub większa liczba mających ulec transkrypcji kwasów nukleinowych. Sekwencja kwasu nukleinowego SEK NR ID1 przedstawia sekwencję promotora czynnika elongacji TS (P EF-TS ) z Corynebacterium glutamicum. SEK NR ID1 odpowiada sekwencji promotora typu dzikiego. [0034] Dalsze naturalne przykłady promotorów według zastrzeżenia 1 można łatwo znaleźć przykładowo z różnych organizmów, których sekwencja genomowa jest znana, przez porównania identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z baz danych z opisaną uprzednio sekwencją SEK NR ID: 1. [003] Syntetyczne sekwencje promotora według zastrzeżenia 1 można łatwo uzyskać wychodząc z sekwencji SEK NR ID: 1 przez sztuczne zmiany i mutacje, na przykład przez podstawienie, insercję lub delecję nukleotydów. [0036] Pod pojęciem podstawienie w opisie rozumiana jest wymiana jednego lub więcej nukleotydów przez jeden lub większą liczbę nukleotydów. Delecja jest zastąpieniem jednego nukleotydu przez bezpośrednie wiązanie. Insercje są wprowadzeniem nukleotydów do sekwencji kwasu nukleinowego, gdzie formalnie bezpośrednie wiązanie jest zastąpione przez jeden lub większą liczbę nukleotydów. [0037] Przez identyczność pomiędzy dwoma kwasami nukleinowymi rozumie się identyczność nukleotydów na całej długości kwasu nukleinowego, w szczególności identyczność, która jest wyliczona przez porównanie za pomocą Vector NTI Suite 7.1 Software firmy Informax (USA) z zastosowaniem metody Clustal (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;(2):11-1) z ustaleniem następujących parametrów: Multiple alignment parameter: Gap opening penalty 10 Gap extension penalty 10 Gap separation penalty range 8 Gap separation penalty off % identity for alignment delay 40 Residue specific gaps off Hydrophilic residue gap off Transition weighing 0
7 10 1 20 2 30 3 Pairwise alignment parameter: FAST algorithm on K-tuplesize 1 Gap penalty 3 Window size Number of best diagonals [0038] Jako sekwencja kwasu nukleinowego, która wykazuje identyczność przynajmniej 90 % z sekwencją SEK NR ID: 1, rozumiana jest odpowiednio sekwencja kwasu nukleinowego, która przy porównaniu jej sekwencji z sekwencją SEK NR ID: 1, w szczególności według algorytmu powyższego programu z powyższymi parametrami, wykazuje identyczność przynajmniej 90 %. [0039] Szczególnie korzystne promotory wykazują identyczność z sekwencją kwasu nukleinowego SEK NR ID1 91%, korzystniej 92%, 93%, 94%, 9%, 96%, 97%, 98%, szczególnie korzystnie 99%. [0040] Dalsze naturalne przykłady promotorów można łatwo znaleźć wychodząc z uprzednio opisanych sekwencji kwasu nukleinowego, szczególnie wychodząc z sekwencji SEK NR ID: 1 z różnych organizmów, których sekwencja genomowa nie jest znana, przez techniki hybrydyzacji w znany jako taki sposób. [0041] Kwas nukleinowy z aktywnością promotora, zawierający sekwencję kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje z sekwencją kwasu nukleinowego SEK NR ID1 w warunkach ostrych obejmuje przynajmniej 10, korzystniej ponad 12,1,30,0 lub szczególnie korzystnie więcej niż 10 nukleotydów. [0042] Hybrydyzacja zachodzi według wynalazku w warunkach ostrych. Takie warunki hybrydyzacji są opisane w Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Wyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, strony 9.31-9.7 lub w Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6: [0043] Pod ostrymi warunkami hybrydyzacji są w szczególności rozumiane: inkubacja przez noc w 42 C w roztworze złożonym z 0 % formamidu, x SSC (70 mm NaCl, 7 mm cytrynian trójsodowy), 0 mm fosforan sodu (ph 7,6), x roztwór Denhardta, 10% siarczan dekstranu i 20 g/ml denaturowanego, pofragmentowanego DNA ze spermy łososia, a następnie płukanie filtru 0,1x SSC w 6 C. [0044] SEK NR ID1 jest opisana jako wpis AP00283 w Genbank bez opisania funkcji. [004] Wszystkie uprzednio wymienione kwasy nukleinowe z aktywnością promotora są poza tym w możliwe do przygotowania, w znany jako taki sposób przez chemiczną syntezę z jednostek nukleotydowych jak na przykład przez kondensację pojedynczych zachodzących na siebie komplementarnych jednostek kwasów nukleinowych podwójnej helisy. Chemiczna synteza oligonukleotydów może być prowadzona na przykład w znany
8 10 1 20 2 30 3 sposób według metody fosfoamidytowej (Voet, Voet, 2. Wyd., Wiley Press New York, str. 896-897). Połączenie syntetycznych oligonukleotydów i wypełnianie luk za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy DNA i reakcje ligacji jak i ogólne metody klonowania są opisane w Sambrook i wsp. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. [0046] Jako jednostka ekspresji rozumiany jest kwas nukleinowy z aktywnością ekspresyjną, czyli kwas nukleinowy, który jest funkcjonalnie połączony z kwasem nukleinowym lub genem, który ma ulec ekspresji, czyli reguluje transkrypcję i translację tego kwasu nukleinowego lub tego genu. [0047] Jako funkcjonalne połączenie rozumie się tutaj na przykład kolejne uporządkowanie jednostki ekspresji i mającej ulec ekspresji transgenicznie sekwencji kwasu nukleinowego i ewentualnie dalszych elementów regulatorowych jak na przykład terminatora tak, że każdy z elementów regulatorowych może spełniać swoją rolę przy transgenicznej ekspresji sekwencji kwasu nukleinowego. W tym celu nie jest konieczne bezwzględnie bezpośrednie połączenie w znaczeniu chemicznym. Genetyczne sekwencje kontrolne, jak na przykład sekwencje enhancera, mogą także działać z bardziej odległych pozycji lub nawet z innych cząsteczek DNA na sekwencję docelową. Korzystne są uporządkowania, w których mająca ulec transkrypcji sekwencja kwasu nukleinowego jest umieszczona za (tzn. na końcu 3') sekwencji promotora według wynalazku, tak że obie sekwencje są ze sobą połączone kowalencyjnie. Korzystna przy tym jest odległość pomiędzy sekwencją promotora i sekwencją kwasu nukleinowego mającą wyrażać transgen mniejsza od 200 par zasad, szczególnie korzystnie mniejsza od 100 par zasad, bardzo szczególnie korzystnie mniejsza od 0 par zasad. [0048] Jako aktywność ekspresji według wynalazku rozumie się tworzoną w określonym czasie przez jednostkę ekspresji ilość białka, czyli szybkość ekspresji. [0049] Jako specyficzna aktywność ekspresji rozumiana jest według wynalazku ilość białka tworzona przez jednostkę ekspresji na określoną jednostkę ekspresji. [000] Przy wywołanej aktywność ekspresji lub szybkości ekspresji w stosunku do genu w porównaniu z typem dzikim jest w porównaniu z typem dzikim powodowane tworzenie białka, które nie było obecne w typie dzikim. [001] Przy zmienionej aktywności ekspresji lub szybkości ekspresji w stosunku do genu w porównaniu z typem dzikim, w porównaniu z typem dzikim ilość białka tworzonego w określonym czasie jest zmieniona. [002] Przez zmieniony jest tu korzystnie rozumiane podwyższony lub obniżony. [003] To może zachodzić na przykład przez podwyższenie lub obniżenie specyficznej aktywności endogennej jednostki ekspresji, na przykład przez mutację jednostki ekspresji lub przez stymulację lub hamowanie jednostki ekspresji. Dalej podwyższona aktywność
9 10 1 20 2 30 3 ekspresji lub szybkość ekspresji może być uzyskana na przykład przez regulację ekspresji genów u mikroorganizmu przez jednostki ekspresji lub przez jednostki ekspresji z podwyższoną specyficzną aktywnością ekspresji, gdzie geny są heterologiczne w odniesieniu do jednostki ekspresji. [004] Korzystnie regulacja ekspresji genów u mikroorganizmu przez jednostki ekspresji lub przez jednostki ekspresji z podwyższoną aktywnością specyficzną ekspresji jest uzyskana przez to, że wprowadza się jedną lub więcej jednostek ekspresji według wynalazku, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji, do genomu mikroorganizmu, tak, że ekspresja jednego lub więcej endogennych genów zachodzi pod kontrolą wprowadzonej jednostki ekspresji, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji, lub wprowadza się jeden lub większą liczbę genów do genomu mikroorganizmu, tak że ekspresja jednego lub więcej z wprowadzonych genów zachodzi pod kontrolą endogennych jednostek ekspresji, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji, lub wprowadza się do mikroorganizmu konstrukty kwasu nukleinowego zawierające jednostkę ekspresji, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji, i funkcjonalnie połączone jeden lub większą liczbę mających ulec ekspresji kwasów nukleinowych. [00] Jednostka ekspresji zawiera uprzednio opisany kwas nukleinowy z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1 i dodatkowo połączoną funkcjonalnie sekwencję kwasu nukleinowego, która zapewnia translację kwasów rybonukleinowych. [006] Korzystnie ta sekwencja kwasu nukleinowego, która zapewnia translację kwasów rybonukleinowych zawiera sekwencję kwasu nukleinowego SEK NR ID42 jako miejsce wiązania rybosomów. [007] Jednostka ekspresji zawiera: E) sekwencję kwasu nukleinowego SEK NR ID 2 lub F) sekwencję pochodzącą od tej sekwencji przez podstawienie, insercję lub delecję nukleotydów, która wykazuje identyczność przynajmniej 90 % na poziomie kwasu nukleinowego z sekwencją SEK NR ID 2 lub G) sekwencję kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje w ostrych warunkach z sekwencją kwasu nukleinowego SEK NR ID2. [008] Sekwencja kwasu nukleinowego SEK NR ID 2 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego jednostki ekspresji czynnika elongacji TS (P EF-TS ) z Corynebacterium glutamicum. SEK NR ID2 odpowiada sekwencji jednostki ekspresji typu dzikiego. [009] Dalsze naturalne przykłady dla jednostki ekspresji można łatwo znaleźć przykładowo z różnych organizmów, których sekwencja genomowa jest znana, przez porównania identyczności sekwencji kwasu nukleinowego z baz danych z opisaną uprzednio sekwencją SEK NR ID: 2.
10 10 1 20 2 30 3 [0060] Syntetyczne sekwencje jednostki ekspresji można łatwo uzyskać wychodząc z sekwencji SEK NR ID: 2 przez sztuczne zmiany i mutacje, na przykład przez podstawienie, insercję lub delecję nukleotydów. [0061] Jako sekwencja kwasu nukleinowego, która wykazuje identyczność przynajmniej 90 % z sekwencją SEK NR ID: 2, rozumiana jest odpowiednio sekwencja kwasu nukleinowego, która przy porównaniu jej sekwencji z sekwencją SEK NR ID: 2, w szczególności według algorytmu powyższego programu z powyższymi parametrami, wykazuje identyczność przynajmniej 90 %. [0062] Dalsze naturalne przykłady jednostki ekspresji dają się łatwo znaleźć wychodząc z uprzednio opisanych sekwencji kwasu nukleinowego, szczególnie wychodząc z sekwencji SEK NR ID: 2 z różnych organizmów, których sekwencja genomowa nie jest znana, przez techniki hybrydyzacji w znany jako taki sposób. [0063] Przez hybrydyzację rozumie się zdolność poli- lub oligonukleotydu w warunkach ostrych do wiązania się do prawie komplementarnej sekwencji, podczas gdy w tych warunkach niespecyficzne wiązania między niekomplementarnymi partnerami nie zachodzą. W tym celu sekwencje powinny być korzystnie komplementarne w 90-100%. Właściwość komplementarnych sekwencji, do specyficznego wiązania się na sobą jest na przykład wykorzystywana w technikach Northern lub Southem blot lub przy wiązaniu starterów w PCR lub RT-PCR. [0064] Hybrydyzacja zachodzi w warunkach ostrych. Takie warunki hybrydyzacji są opisane na przykład w Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.: Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Wyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, strony 9.31-9.7 lub w Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6: [006] Pod ostrymi warunkami hybrydyzacji w szczególności rozumiane są: [0066] Inkubacja przez noc w 42 C w roztworze złożonym z 0 % formamidu, x SSC (70 mm NaCl, 7 mm cytrynian trójsodowy), 0 mm fosforan sodu (ph 7,6), x roztwór Denhardta, 10% siarczan dekstranu i 20 g/ml denaturowanego, pofragmentowanego DNA ze spermy łososia, a następnie płukanie filtru 0,1x SSC w 6 C. [0067] Sekwencje nukleotydowe według zastrzeżenia 1 dalej umożliwiają przygotowanie sond i starterów, które mogą być stosowane do identyfikacji i/lub klonowania homologicznych sekwencji w innych typach komórek i mikroorganizmów. Takie sondy lub startery obejmują zazwyczaj obszar sekwencji nukleotydowej, która w warunkach ostrych hybrydyzuje do przynajmniej około 12, korzystnie przynajmniej około 2, jak np. około 40, 0 lub 7 kolejnych nukleotydów nici sensownej sekwencji kwasu nukleinowego według zastrzeżenia 1 lub odpowiedniej nici antysensownej. [0068] Objęte są także takie sekwencje kwasu nukleinowego, które obejmują tak zwane milczące mutacje lub są zmienione pod w stosunku do wykorzystania kodonów organizmu
11 10 1 20 2 30 3 o specjalnym pochodzeniu lub organizmu gospodarza w porównaniu z konkretną sekwencją, jak i naturalnie występujące warianty, jak np. warianty splicingu lub alleliczne. [0069] Sekwencja kwasu nukleinowego SEK NR ID2 może być stosowana jako jednostka ekspresji, tzn. do ekspresji genów. [0070] Jednostka ekspresji zawiera kwas nukleinowy z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1 dodatkowo funkcjonalnie połączony z sekwencją kwasu nukleinowego, która zapewnia translację kwasów rybonukleinowych. Jednostki ekspresji obejmują jeden lub większą liczbę spośród następujących elementów genetycznych: sekwencję minus 10 ( - 10 ); sekwencję minus 3 ( -3 ); start transkrypcji, region enhancera; i region operatora. [0071] Korzystnie te elementy są specyficzne dla rodzaju Corynebacterium, szczególnie dla Corynebacterium glutamicum. [0072] Wszystkie uprzednio wymienione jednostki ekspresji są poza tym możliwe do przygotowania w znany jako taki sposób przez chemiczną syntezę z jednostek nukleotydowych, jak na przykład przez kondensację pojedynczych zachodzących na siebie komplementarnych jednostek kwasów nukleinowych podwójnej helisy. Chemiczna synteza oligonukleotydów może być prowadzona na przykład w znany sposób według metody fosfoamidytowej (Voet, Voet, 2. Wyd., Wiley Press New York, str. 896-897). Połączenie syntetycznych oligonukleotydów i wypełnianie luk za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy DNA i reakcje ligacji jak i ogólne metody klonowania są opisane w Sambrook i wsp. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. [0073] Do wynalazków w tym patencie stosowane są metody i techniki, które są znane specjaliście, który jest biegły w technikach mikrobiologicznych i rekombinacji DNA. Metody i techniki wzrostu komórek bakterii, wprowadzania izolowanych cząsteczek DNA do komórki gospodarza, i izolacja, klonowanie i sekwencjonowanie izolowanych cząsteczek kwasu nukleinowego itd. są przykładami takich technik i metod. Te metody są opisane w wielu standardowych pozycjach literatury: Davis i wsp., Basic Methods In Molecular Biology (1986); J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972); J.H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992); M. Singer i P. Berg, Genes & Genomes, University Science Books, Mill Valley, California (1991); J. Sambrook, E.F. Fritsch i T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); P.B. Kaufmann i wsp., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida (199); Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B.R. Glick i J.E. Thompson, red., CRC Press, Boca Raton, Florida (1993); i P.F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989). [0074] Wszystkie cząsteczki kwasu nukleinowego tego wynalazku są w postaci izolowanej
12 10 1 20 2 30 3 cząsteczki kwas nukleinowego. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego jest oddzielona od innych cząsteczek kwasu nukleinowego, które są obecne w naturalnym źródle kwasu nukleinowego i może ponadto być zasadniczo wolna od innego materiału komórkowego lub podłoża hodowlanego, gdy jest przygotowana technikami rekombinacji, lub wolna od chemicznych prekursorów lub innych chemikaliów, gdy jest syntetyzowana chemicznie. [007] Wynalazek obejmuje także cząsteczki kwasu nukleinowego komplementarne do konkretnie opisanej sekwencji nukleotydowej lub jej fragmentu. [0076] Promotory i/lub jednostki ekspresji można na przykład szczególnie korzystnie przygotować w ulepszonym sposobie fermentacyjnego przygotowania produktów biosyntetycznych jak opisano tu dalej. [0077] Promotory i/lub jednostki ekspresji wykazują przede wszystkim zaletę, że są indukowane w mikroorganizmach przez stres. Przez odpowiednie sterowanie procesem fermentacji można sterować tą indukcją przez stres celowo do podwyższenia transkrypcji/szybkości ekspresji pożądanych genów. W szczególności przy produkcji L-lizyny ta faza stresu jest osiągana bardzo wcześnie, tak, że tu można uzyskać bardzo wcześnie podwyższoną transkrypcję/szybkość ekspresji pożądanych genów. [0078] Kwasy nukleinowe z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1 mogą być stosowane do zmiany, czyli do podwyższenia lub obniżenia, lub do wywołania szybkości transkrypcji genów w mikroorganizmach w porównaniu do typu dzikiego. [0079] Jednostki ekspresji mogą być stosowane do zmiany, czyli do podwyższenia lub obniżenia, lub do wywołania szybkości ekspresji genów w mikroorganizmach w porównaniu do typu dzikiego. [0080] Dalej kwas nukleinowy z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1 i jednostka ekspresji mogą służyć do regulacji i wzmocnienia tworzenia różnych produktów biosyntetycznych, jak na przykład związków chemicznych wysokiej jakości, białek, w szczególności aminokwasów, w mikroorganizmach, w szczególności w gatunkach Corynebacterium. [0081] Zmiana lub wywołanie szybkości transkrypcji genów w mikroorganizmach w porównaniu do typu dzikiego zachodzi przez to, że reguluje się transkrypcję genów u mikroorganizmu przez kwasy nukleinowe z aktywnością promotora A) sekwencję kwasu nukleinowego SEK NR ID 1 lub B) sekwencję pochodzącą od tej sekwencji przez podstawienie, insercję lub delecję nukleotydów, która wykazuje identyczność przynajmniej 90 % na poziomie kwasu nukleinowego z sekwencją SEK NR ID 1 lub C) sekwencję kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje z sekwencją kwasu nukleinowego SEK NR ID 1 w warunkach ostrych,
13 10 1 20 2 30 3 gdzie geny są heterologiczne w stosunku do kwasów nukleinowych z aktywnością promotora. [0082] Jest to uzyskane korzystnie przez to, że b1) wprowadza się do genomu mikroorganizmu jeden lub większą liczbę kwasów nukleinowych z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora, tak, że transkrypcja jednego lub więcej endogennych genów zachodzi pod kontrolą wprowadzonego kwasu nukleinowego z aktywnością promotora, lub b2) wprowadza się jeden lub większą liczbę genów do genomu mikroorganizmu, tak że transkrypcja jednego lub więcej wprowadzonych genów zachodzi pod kontrolą endogennych kwasów nukleinowych z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora lub b3) wprowadza się jeden lub większą liczbę konstruktów kwasu nukleinowego, zawierających kwas nukleinowy z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora, i funkcjonalnie połączone jeden lub większą liczbę mających ulec transkrypcji kwasów nukleinowych. [0083] Jest więc możliwa zmiana szybkości transkrypcji endogennego genu typu dzikiego, przez podwyższenie lub obniżenie przez to, że według wykonania b1) wprowadza się jeden lub większą liczbę kwasów nukleinowych z aktywnością promotora, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora, do genomu mikroorganizmu, tak że transkrypcja jednego lub więcej endogennych genów zachodzi pod kontrolą wprowadzonego kwasu nukleinowego z aktywnością promotora lub [0084] według wykonania b2) wprowadza się jeden lub większą liczbę genów do genomu mikroorganizmu, tak że transkrypcja jednego lub więcej wprowadzonych endogennych genów zachodzi pod kontrolą endogennych kwasów nukleinowych z aktywnością promotora, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora lub [008] według wykonania b3) wprowadza się do mikroorganizmu jeden lub większą liczbę konstruktów kwasu nukleinowego, zawierających kwas nukleinowy z aktywnością promotora, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora, i funkcjonalnie połączone z jednym lub więcej mających ulec transkrypcji kwasów nukleinowych. [0086] Dalej jest w ten sposób możliwe wywołanie szybkości transkrypcji egzogennego genu w porównaniu z typem dzikim, przez [0087] wprowadzenie według wykonania b2) jednego lub więcej egzogennych genów do genomu mikroorganizmu, tak że transkrypcja jednego lub więcej wprowadzonych egzogennych genów zachodzi pod kontrolą endogennych kwasów nukleinowych z aktywnością promotora, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora, lub [0088] według wykonania b3) wprowadza się do mikroorganizmu jeden lub większą
14 10 1 20 2 30 3 liczbę konstruktów kwasu nukleinowego, zawierających kwas nukleinowy z aktywnością promotora, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora, i funkcjonalnie połączone z jednym lub więcej mających ulec transkrypcji kwasów nukleinowych. [0089] Wstawianie genów według wykonania b2) może przy tym zachodzić tak, że gen jest integrowany w obszarach kodujących lub w obszarach niekodujących. Korzystnie insercja zachodzi w obszary niekodujące. [0090] Wstawianie konstruktów kwasu nukleinowego według wykonania b3) może przy tym zachodzić chromosomalnie lub pozachromosomalnie. Korzystnie insercja konstruktów kwasu nukleinowego zachodzi chromosomalnie. Chromosomalna integracja jest wstawieniem egzogennego DNA do chromosomu komórki gospodarza. To pojęcie jest też stosowane do homologicznej rekombinacji pomiędzy egzogennym fragmentem DNA i odpowiednim regionem na chromosomie komórki gospodarza. [0091] Jako endogenna jest rozumiana genetyczna informacja, jak na przykład geny, która już są zawarte w genomie typu dzikiego. [0092] Jako egzogenna jest rozumiana genetyczna informacja, jak na przykład geny, która nie są zawarte w genomie typu dzikiego. [0093] Pod pojęciem geny w odniesieniu do regulacji transkrypcji przez kwasy nukleinowe z aktywnością promotora są korzystnie rozumiane kwasy nukleinowe, które regulują obszar mający ulec transkrypcji, czyli zawierają na przykład obszar translacji, obszar kodujący jak i ewentualnie dalsze elementy regulatorowe, jak na przykład terminator. [0094] Pod pojęciem geny w odniesieniu do dalej opisanej regulacji ekspresji przez jednostkę ekspresji są korzystnie rozumiane kwasy nukleinowe, które zawierają obszar kodujący, jak i ewentualnie dalsze elementy regulatorowe, jak na przykład terminator. [009] Jako obszar kodujący rozumiana jest sekwencja kwasu nukleinowego, która koduje białko. [0096] Jako heterologiczny w odniesieniu do kwasów nukleinowych z aktywnością promotora i genów jest rozumiane, że stosowane geny w typie dzikim nie są transkrybowane pod regulacją przez kwas nukleinowy z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1, ale że powstaje nowe, nie występujące w typie dzikim funkcjonalne połączenie i że funkcjonalna kombinacja kwasu nukleinowego z aktywnością promotora i specyficznym genem nie występuje w typie dzikim. [0097] Jako heterologiczny w odniesieniu do jednostki ekspresji i genów jest rozumiane, że stosowane geny w typie dzikim nie są wyrażane pod regulacją wymienionej jednostki ekspresji, ale że powstaje nowe, nie występujące w typie dzikim funkcjonalne połączenie i że funkcjonalna kombinacja z jednostki ekspresji i specyficznego genu nie występuje w typie dzikim.
1 10 1 20 2 30 3 [0098] Wynalazek dotyczy dalej w korzystnym wykonaniu sposobu podwyższenia lub wywołania szybkości transkrypcji genów w mikroorganizmach w porównaniu z typem dzikim gdzie transkrypcja genów mikroorganizmu jest regulowana przez kwasy nukleinowe z aktywnością promotora A) sekwencję kwasu nukleinowego SEK NR ID 1 lub B) sekwencję pochodzącą od tej sekwencji przez podstawienie, insercję lub delecję nukleotydów, która wykazuje identyczność przynajmniej 90 % na poziomie kwasu nukleinowego z sekwencją SEK NR ID 1 lub C) sekwencję kwasu nukleinowego, która hybrydyzuje z sekwencją kwasu nukleinowego SEK NR ID 1 w warunkach ostrych, gdzie geny są heterologiczne w stosunku do kwasów nukleinowych z aktywnością promotora. [0099] Zmiana lub wywołanie szybkości ekspresji genu w mikroorganizmie w porównaniu z typem dzikim może zachodzić przez regulację ekspresji genów u mikroorganizmu przez wymienione uprzednio jednostki ekspresji, gdzie geny są heterologiczne względem jednostek ekspresji. [0100] Zmiana lub wywołanie szybkości ekspresji genów w mikroorganizmie w porównaniu z typem dzikim może zachodzić przez regulację ekspresji genów u mikroorganizmu przez jednostki ekspresji w taki sposób, gdzie geny są heterologiczne względem jednostek ekspresji. [0101] Uzyskuje się to korzystnie przez to, że d1) wprowadza się do genomu mikroorganizmu jedną lub więcej jednostek ekspresji, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji, tak, że ekspresja jednego lub więcej endogennych genów zachodzi pod kontrolą wprowadzonych jednostek ekspresji lub d2) wprowadza się jeden lub większą liczbę genów do genomu mikroorganizmu, tak że transkrypcja jednego lub większej liczby wprowadzonych genów zachodzi pod kontrolą endogennych jednostek ekspresji, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji lub d3) wprowadza się do mikroorganizmu jeden lub większą liczbę konstruktów kwasu nukleinowego, zawierających jednostkę ekspresji ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji, i funkcjonalnie połączone jeden lub większą liczbę kwasów nukleinowych mających ulec ekspresji, [0102] W ten sposób jest możliwa zmiana szybkości ekspresji endogennego genu typu dzikiego, czyli podwyższenie lub obniżenie przez to, że według wykonania d1) wprowadza się do genomu mikroorganizmu jedną lub więcej jednostek ekspresji, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji, tak, że ekspresja jednego lub większej liczby endogennych genów zachodzi pod kontrolą
16 10 1 20 2 30 3 wprowadzonych jednostek ekspresji, lub według wykonania d2) wprowadza się jeden lub większą liczbę genów do genomu mikroorganizmu, tak że transkrypcja jednego lub więcej wprowadzonych genów zachodzi pod kontrolą endogennych jednostek ekspresji, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji lub według wykonania d3) wprowadza się do mikroorganizmu jeden lub większą liczbę konstruktów kwasu nukleinowego, zawierających jednostkę ekspresji ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji, i funkcjonalnie połączone jeden lub większą liczbę kwasów nukleinowych mających ulec ekspresji. [0103] Dalej jest w ten sposób możliwe wywołanie szybkości ekspresji egzogennego genu w porównaniu z typem dzikim, przez wprowadzenie według wykonania d2) jednego lub więcej egzogennych genów do genomu mikroorganizmu, tak, że ekspresja jednego lub więcej wprowadzonych genów zachodzi pod kontrolą endogennych jednostek ekspresji, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji, lub według wykonania d3) wprowadza się do mikroorganizmu jeden lub większą liczbę konstruktów kwasu nukleinowego, zawierających jednostkę ekspresji ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji, i funkcjonalnie połączone jeden lub większą liczbę egzogennych kwasów nukleinowych mających ulec ekspresji, [0104] Wstawianie genów według wykonania d2) może przy tym zachodzić tak, że gen jest integrowany w obszarach kodujących lub w obszarach niekodujących. Korzystnie insercja zachodzi w obszary niekodujące. [010] Wstawianie konstruktów kwasu nukleinowego według wykonania d3) może przy tym zachodzić chromosomalnie lub pozachromosomalnie. Korzystnie insercja konstruktów kwasu nukleinowego zachodzi chromosomalnie. [0106] Konstrukty kwasu nukleinowego są dalej także określane jako kasety ekspresyjne. [0107] Podwyższenie lub wywołanie szybkości ekspresji genu w mikroorganizmie w porównaniu z typem dzikim zachodzi gdy ch) podwyższa się specyficzną aktywność ekspresji u mikroorganizmu endogennych jednostek ekspresji, które regulują ekspresję endogennych genów w porównaniu z typem dzikim lub dh) ekspresję genów u mikroorganizmu przez jednostki ekspresji według wynalazku gdzie geny są heterologiczne w stosunku do jednostek ekspresji. [0108] Korzystnie regulacja ekspresji genów u mikroorganizmu przez jednostki ekspresji jest osiągana przez to, że dh1) wprowadza się do genomu mikroorganizmu jedną lub więcej jednostek ekspresji, ewentualnie z podwyższoną specyficzną aktywnością ekspresji, tak, że ekspresja jednego lub więcej endogennych genów zachodzi pod kontrolą wprowadzonych jednostek ekspresji,
17 10 1 20 2 30 3 ewentualnie z podwyższoną specyficzną aktywnością ekspresji lub dh2) wprowadza się jeden lub większą liczbę genów do genomu mikroorganizmu, tak że ekspresja jednego lub więcej wprowadzonych genów zachodzi pod kontrolą endogennych jednostek ekspresji, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji lub dh3) wprowadza się do mikroorganizmu jeden lub większą liczbę konstruktów kwasu nukleinowego, zawierających jednostkę ekspresji ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji, i funkcjonalnie połączone jeden lub większa liczba kwasów nukleinowych mających ulec ekspresji, [0109] W korzystnym wykonaniu uprzednio opisanego sposobu według wynalazku do zmiany lub wywołania szybkości transkrypcji genów w mikroorganizmach stosowane są geny wybrane z grupy kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy związków chemicznych wysokiej jakości, gdzie geny mogą ewentualnie zawierać dalsze elementy regulatorowe. [0110] W szczególnie korzystnym wykonaniu uprzednio opisanego sposobu według wynalazku do zmiany lub wywołania szybkości transkrypcji genów w mikroorganizmach są geny wybrane z grupy kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy aminokwasów białkowych i niebiałkowych, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy nukleotydów i nukleozydów, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy kwasów organicznych, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy lipidów i kwasów tłuszczowych, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy dioli, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy węglowodanów, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy związków aromatycznych, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy witamin, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy kofaktorów i kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy enzymów, gdzie geny mogą ewentualnie zawierać dalsze elementy regulatorowe. [0111] W szczególnie korzystnym wykonaniu białka ze szlaku biosyntezy aminokwasów są wybrane z grupy obejmującej kinazę asparaginianową, dehydrogenazę semialdehydu asparaginianu, dehydrogenazę diaminopimelinianu, dekarboksylazę diaminopimelinianu, syntetazę dihydrodipikolinianu, reduktazę dihydrodipikolinianu, dehydrogenazę aldehydu 3- fosfoglicerynowego, kinazę 3-fosfoglicerynianu, karboksylazę pirogronianową, izomerazę triozofosforanu, regulator transkrypcji LuxR, regulator transkrypcji LysR1, regulator transkrypcji LysR2, oksydoreduktazę maleinian-chinon, dehydrogenazę glukozo-6- fosforanu, dehydrogenazę 6-fosfoglukonianu, transketolazę, transaldolazę, O- acylotransferazę homoseryny, gamma syntazę cystationiny, beta liazę cystationiny, hydroksymetylotransferazę seryny, sulfhydrylazę O-acetylohomoseryny, reduktazę metyleno-tetrahydrofolianową, aminotransferazę fosfoseryny, fosfatazę fosfoseryny,
18 10 1 20 transerazę acetyloseryny, dehydrogenazę homoseryny, kinazę homoseryny, syntazę treoniny, eksporter-nośnik treoniny, dehydratazę treoniny, oksydazę pirogronianu, eksporter lizyny, ligazę biotyny, syntazę cysteiny I, syntazę cysteiny II, syntazę metioniny zależną od koenzymu B12, syntazę metioniny niezależną od koenzymu B12, siarczan adenylotransferazy podjednostki 1 i 2, reduktazę fosfosiarczanu fosfoadenozyny, reduktazę siarczyn-ferredoksyna, reduktazę ferredoksyna-nadp, dehydrogenazę 3-fosfoglicerynianu, regulator RXA006, regulator RXN2910, syntetazę arginylo-trna, karboksylazę fosfoenolopirogronianu, białko wypierające treoninę, hydroksymetylotransferazę seryny, fruktozo-1,6-bifosfatazę, białko redukcji siarczanów RXA077, białko redukcji siarczanów RXA248, białko redukcji siarczanów RXA247, białko OpcA, 1-fosfofruktokinazę i 6- fosfofruktokinazę. [0112] Korzystne białka i kwasy nukleinowe kodujące te białka uprzednio opisanych białek ze szlaku biosyntezy aminokwasów są sekwencjami białka lub sekwencjami kwasu nukleinowego pochodzącymi od mikroorganizmów, korzystnie z bakterii z rodzaju Corynebacterium lub Brevibacterium, korzystnie z maczugowców, szczególnie korzystnie z Corynebacterium glutamicum. [0113] Przykłady szczególnie korzystnych sewkencji białek i odpowiednich sekwencji kwasu nukleinowego kodujących te białka ze szlaku biosyntezy aminokwasów, ich dokument odniesienia jak i ich określenie w dokumencie odniesienia są wyliczone w Tabeli 1: Tabela 1 Białko kwas nukleinowy Dokument SEK NR ID kodujący białko odniesienia w dokumencie odniesienia kinaza asparaginianowa ask lub lysc EP1108790 DNA: 281 białko: 3781 dehydrogenaza Asd EP1108790 DNA: 331 semialdehydu białko: 3831 asparaginianu syntetaza dapa WO 0100843 DNA: dihydrodipikolinianu białko: 6 reduktaza dapb WO 0100843 DNA: 3 dihydrodipikolinianu białko: 36 dehydrogenaza meso- Ddh EP1108790 DNA : 3494 diaminopimelinianu-d- białko : 6944 Dekarboksylaza lysa EP1108790 DNA: 341
19 diaminopikolinianu białko:691 eksporter lizyny lyse EP1108790 DNA: 34 białko: 69 Syntetaza arginylo-t-rna args EP1108790 DNA: 340 białko: 690 dehydrogenaza glukozo-6- fosforanu zwf WO 0100844 DNA: 243 białko: 244 dehydrogenaza aldehydu 3- fosfoglicerynowego gap WO 0100844 DNA: 187 białko: 188 Kinaza 3-fosfoglicerynianu pgk WO 0100844 DNA: 69 białko: 70 karboksylaza pirogronianowa pyca EP1108790 DNA 76 białko: 426 izomeraza triozofosforanu tpi WO 0100844 DNA: 61 białko: 62 ligaza biotyny bira EP1108790 DNA: 786 białko: 4286 Karboksylaza PEP pck EP1108790 DNA: 3470 białko: 6970 Kinaza homoseryny thrb WO 0100843 DNA: 173 białko: 174 Syntaza treoniny thrc WO 0100843 DNA: 17 białko: 176 Nośnik eksportu treoniny thre WO 021231 DNA: 41 białko: 42 Białko wypierające treoninę RXA2390 WO 0100843 DNA: 7 białko: 8 Dehydrataza treoniny ilva EP 1108790 DNA: 2328 białko: 828 O-acylotransferaza homoseryny meta EP 1108790 DNA:727 Prot: 4227 Gamma syntaza cystationiny metb EP 1108790 DNA:3491 Prot: 6991
20 Beta liaza cystationiny metc EP 1108790 DNA:23 Prot: 603 syntaza metioniny zależna od koenzymu B12, meth EP 1108790 DNA:1663 Prot: 163 sulfhydylaza O- acetylohomoseryny mety EP 1108790 DNA:726 Prot: 4226 Reduktaza metylenotetrahydrofolianu metf EP 1108790 DNA:2379 Prot: 879 Dehydrogenaza D-3- fosfoglicerynianu sera EP 1108790 DNA:141 Prot: 491 fosfataza fosfoseryny 1 serb WO 0100843 DNA: 13 białko:14 fosfataza fosfoseryny 2 serb EP 1108790 DNA: 467 Prot: 3967 fosfataza fosfoseryny 3 serb EP 1108790 DNA: 334 białko: 3834 aminotransferaza fosfoseryny serc WO 0100843 DNA: 11 białko: 12 acetylo-transferaza seryny cyse WO 0100843 DNA: 243 białko: 244 Syntaza cysteiny I cysk EP 1108790 DNA: 2817 białko: 6317 Syntaza cysteiny II CysM EP 1108790 DNA: 2338 białko: 838 dehydrogenaza homoseryny hom EP 1108790 DNA: 342 białko: 692 syntaza metioniny niezależna od koenzymu B12 mete WO 0100843 DNA:7 białko: 76 hydroksymetylotransferaza seryny glya WO 0100843 DNA: 143 białko: 144 białko w redukcji siarczanu RXA247 EP 1108790 DNA: 3089
21 białko: 689 białko w redukcji siarczanu RXA248 EP 1108790 DNA: 3090 białko: 690 siarczan adenylotransferazy podjednostka 1 CysN EP 1108790 DNA: 3092 białko: 692 siarczan adenylotransferazy podjednostka 2 CysD EP 1108790 DNA: 3093 białko: 693 reduktaza fosfosiarczanu fosfoadenozyny CysH WO 02729029 DNA: 7 białko: 8 reduktaza siarczynferredoksyna RXA073 WO 0100842 DNA: 329 białko: 330 reduktaza ferredoksyna- NADP RXA076 WO 0100843 DNA: 79 białko: 80 regulator transkrypcji LuxR luxr WO 0100842 DNA: 297 białko: 298 regulator transkrypcji LysR1 lysr1 EP 1108790 DNA: 676 białko: 4176 regulator transkrypcji LysR2 lysr2 EP 1108790 DNA: 3228 białko: 6728 regulator transkrypcji LysR3 lysr3 EP 1108790 DNA: 2200 białko: 700 Oksydoreduktaza jabłczan chinon mqo WO 0100844 DNA: 69 białko: 70 Transketolaza RXA2739 EP 1108790 DNA: 1740 Prot: 240 Transaldolaza RXA2738 WO 0100844 DNA: 24 Prot: 246 OPCA opca WO 0100804 DNA: 79 Prot: 80 1-fosfofruktokinaza 1 pfk1 WO0100844 DNA: białko: 6 1-fosfofruktokinaza 2 pfk2 WO0100844 DNA: 7 białko: 8 6-fosfofruktokinaza 1 6-pfk1 EP 1108790 DNA: 1383
22 białko: 4883 6-fosfofruktokinaza 2 6-pfk2 DE 10112992 DNA: 1 białko: 2 Fruktozo-1,6-bisfosfataaq 1 fbr1 EP1108790 DNA:1136 białko: 4636 Oksydaza pirogronianu poxb WO 0100844 DNA : 8 białko: 86 Regulator RXA006 RXA6 US2003162267.2 DNA: 1 białko: 2 Regulator RXN02910 RXN2910 US2003162267.2 DNA: białko: 6 6-fosfoglukonolaktonaza RXA273 WO 0100844 DNA: 1 białko: 2 10 1 20 [0114] Dalszym przykładem szczególnie korzystnej sekwencji białka i odpowiedniej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej to białko ze szlaku biosyntezy aminokwasów, jest sekwencja fruktozo-1,6-bisfosfatazy 2, zwana także fbr2, (SEK. NR ID20) i odpowiednia sekwencja kwasu nukleinowego kodująca fruktozo-1,6-bisfosfatazę 2 (SEK. NR ID19). [011] Dalszym przykładem szczególnie korzystnej sekwencji białka i odpowiedniej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej to białko ze szlaku biosyntezy aminokwasów, jest sekwencja białek redukcji siarczanu, zwanych też RXA077, (SEK NR ID3) i odpowiednia sekwencja kwasu nukleinowego kodująca białko redukcji siarczanu (SEK NR ID4) [0116] Dalsze szczególnie korzystne sekwencje białek ze szlaku biosyntezy aminokwasów, podaje Tabela 1 gdzie przedstawia się podaną dla białka sekwencję aminokwasów, gdzie odpowiednie białko w przynajmniej jednej z podanych w Tabeli 2/kolumna 2 dla tej sekwencji aminokwasów pozycji aminokwasów wykazuje inny aminokwas białkowy niż podany w Tabeli 2/kolumna 3 w tej samej komórce aminokwas. W dalszym korzystnym wykonaniu, białka wykazują w przynajmniej jednej z podanych w Tabeli 2/kolumna 2 dla sekwencji aminokwasów pozycji aminokwasu, która jest podana w Tabela 2/kolumna 4 w tej samej komórce ten sam aminokwas. Przy białkach podanych w Tabeli 2 chodzi o zmutowane białka szlaku biosyntezy aminokwasów, które wykazują szczególnie korzystne właściwości i dlatego też szczególnie nadają się do ekspresji odpowiedniego kwasu nukleinowego przez promotor według wynalazku i do przygotowania aminokwasów. Przykładowo mutacja T3111 prowadzi do wyłączenia hamowania zwrotnego ask. [0117] Odpowiednie kwasy nukleinowe, które kodują uprzednio opisane zmutowane
23 10 1 20 2 30 3 białko z Tabeli 2, można przygotować za pomocą zwyczajowych sposobów. [0118] Jako punkt wyjścia przygotowania sekwencji kwasu nukleinowego kodującej zmutowane białko odpowiedni jest na przykład genom szczepu Corynebacterium glutamicum, który można uzyskać od American Type Culture Collection pod określeniem ATCC 13032 lub uwzględnione w Tabeli 1 sekwencje kwasu nukleinowego. Dla przełożenia sekwencji aminokwasów zmutowanego białka na sekwencję kwasu nukleinowego kodującą to białko jest korzystne użycie wykorzystania kodonów danego organizmu, do którego ma być wprowadzona sekwencja kwasu nukleinowego lub w którym jest obecna sekwencja kwasu nukleinowego. Przykładowo dla Corynebacterium glutamicum jest korzystne stosowanie wykorzystania kodonów Corynebacterium glutamicum. Wykorzystanie kodonów danego organizmu można uzyskać w znany jako taki sposób z banków danych lub zgłoszeń patentowych, które opisują przynajmniej jedno białko i jeden gen, który koduje to białko, z pożądanego organizmu. [0119] Dane z Tabeli 2 należy rozumieć w następujący sposób: [0120] W kolumnie 1 identyfikacja podane jest jednoznaczne określenie dla każdej sekwencji w odniesieniu do Tabeli 1. [0121] W kolumnie 2 AS-POS odpowiednia liczba dotyczy pozycji aminokwasu odpowiedniej sekwencji polipeptydu z Tabeli 1. 26 w kolumnie AS-POS oznacza więc pozycję aminokwasu 26 odpowiedniej sekwencji polipeptydu. Liczenie pozycji zaczyna się na N-końcu od +1. [0122] W kolumnie 3 AS-typ dziki litera oznacza aminokwas przedstawiony w kodzie jednoliterowym podanej w kolumnie 2 pozycji w odpowiedniej sekwencji typu dzikiego w Tabeli 1. [0123] W kolumnie 4 AS-Mutant litera oznacza aminokwas - przedstawiony w kodzie jednoliterowym podanej w kolumnie 2 pozycji w odpowiedniej sekwencji szczepu mutanta. [0124] W kolumnie funkcja podana jest fizjologiczna funkcja odpowiedniej sekwencji polipeptydu. [012] Dla zmutowanego białka z określoną funkcją (kolumna ) i określoną wyjściową sekwencją aminokwasów (Tabela 1) w kolumnach 2,3 i 4 opisana jest przynajmniej jedna mutacja, dla niektórych sekwencji także szereg mutacji. Ten szereg mutacji dotyczy zawsze odpowiedniej podanej powyżej najbliższej wyjściowej sekwencji aminokwasów (Tabela 1). Pod pojęciem przynajmniej jedna z pozycji aminokwasów określonej sekwencji aminokwasów rozumiana jest korzystnie przynajmniej jedna z opisanych dla tej sekwencji aminokwasów w kolumnach 2, 3 i 4 mutacji. [0126] Jednoliterowy kod aminokwasów białkowych: A alanina C cysteina
24 10 1 D asparaginian E glutaminian F fenyloalanina G glicyna H his I izoleucyna K lizyna L leucyna M metionina N asparagina P prolina Q glutamina R arginina S seryna T treonina V walina W tryptofan Y tyrozyna Tabela 2 kolumna 1 kolumna 2 kolumna 3 kolumna 4 kolumna Identyfikacja AS pozycja AS typ dziki AS mutant Funkcja Ask 317 S A kinaza asparaginianowa 311 T I 279 A T Asd 66 D G dehydrogenaza semialdehydu asparaginianu 234 R H 272 D E 28 K E 20 L F dapa 2 S A Syntetaza dihydrodipikolinianu 84 K N 8 L V
2 dapb 91 D A Reduktaza dihydrodipikolinianu 83 D N Ddh 174 D E Dehydrogenaza mezodiaminopimelinianu 23 F L 237 S A IysA 26 A D Dekarboksylaza diaminopikolinianu 320 D N 332 I V args 3 G D syntetaza arginylotrna 16 A S 13 V A 40 H R Zwf 8 S T Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu 10 T A 321 1 G S Gap 264 G S dehydrogenaza aldehydu 3- fosfoglicerynowego pyca 7 S L Karboksylaza pirogronianowa 13 E D 182 A S 206 A S 227 H R 4 A G 48 P S 639 S T 1008 R H 109 S P 1120 D E
26 Pck 162 H Y Karboksylaza PEP 241 G D 829 T R thrb 103 S A Kinaza homoseryny 190 T A 133 A V 138 P S thrc 69 G R Syntaza treoniny 478 T I RXA330 8 I M Białko wypierające treoninę 161 F I 19 G D Hom 104 V I Dehydrogenaza homoseryny 116 T I 148 G A 9 V A 270 T S 34 R P 268 K N 61 D H 72 E Q lysr1 80 R H regulator transkrypcji LysR1 lysr3 142 R W regulator transkrypcji LysR3 179 A T RXA2739 7 N D Transketolaza 329 A T 332 A T 6 V I RXA2738 242 K M Transaldolaza opca 107 Y H OpcA 219 K N
27 233 P S 261 Y H 312 S F 6 G R 1-dekarboksylaza asparaginianu 33 G S 6- fosfoglukonolaktonaza 10 1 20 2 [0127] W uprzednio opisanym sposobie według wynalazku zmiany lub wywołania szybkości transkrypcji genów w mikroorganizmach jak i dalej opisanym sposobie przygotowania genetycznie zmienionych mikroorganizmów i dalej opisanym sposobie przygotowania biosyntetycznych produktów zachodzi wprowadzanie kwasu nukleinowego z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1, jednostki ekspresji, uprzednio opisanych genów i uprzednio opisanych konstruktów kwasu nukleinowego lub kaset ekspresyjnych do mikroorganizmu, w szczególności do maczugowców, korzystnie za pomocą metody SacB. [0128] Metoda SacB jest znana specjaliście i opisana na przykład w Schäfer A, Tauch A, Jäger W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A.; Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pk18 and pk19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene. 1994 Jul 22;14(1):69-73 i Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein BI; Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacb gene and a temperature-sensitive psc101 replicon; Mol Microbiol. 1991 Jun;(6):1447-7. [0129] W korzystnym wykonaniu uprzednio opisanego sposobu według wynalazku zmiana lub wywołanie szybkości transkrypcji genów w mikroorganizmach przez wprowadzenie kwasu nukleinowego z aktywnością promotora według zastrz. 1 lub jednostki ekspresji do mikroorganizmu. [0130] W dalszym korzystnym wykonaniu uprzednio opisanego sposobu według wynalazku zmiana lub wywołanie szybkości transkrypcji genów w mikroorganizmach zachodzi przez wprowadzenie uprzednio opisanych konstruktów kwasów nukleinowych lub kaset ekspresyjnych do mikroorganizmu. [0131] Wektory są znane dobrze specjaliście i mogą być na przykład wzięte z Cloning Vectors (Pouwels P. H. i wsp., wyd. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 198. Wśród wektorów poza plazmidami należy też rozumieć wszystkie inne znane specjaliście wektory, jak na przykład fagi, transpozony, elementy IS, fasmidy, kosmidy, i liniowe lub koliste DNA. Te wektory mogą się replikować autonomicznie w organizmie gospodarza lub być replikowane chromosomalnie.
28 10 1 20 2 30 3 [0132] Jako plazmidy odpowiednie są szczególnie korzystnie takie, które ulegają replikacji w maczugowcach. Liczne znane wektory plazmidowe jak np. pz1 (Menkel i wsp., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 49-4), pekex1 (Eikmanns i wsp., Gene 102: 93-98 (1991)) lub phs2-1 (Sonnen i wsp., Gene 107: 69-74 (1991)) opierają się na kryptycznych plazmidach phm119, pbl1 lub pga1. Inne wektory plazmidowe, jak np. B. pclikmcs, lub takie, które opierają się na pcg4 (US-A 4,489,160) lub png2 (Serwold- Davis i wsp., FEMS Microbiology Letters 66,119-124 (1990)) lub pag1 (US-A,18,891) mogą być stosowane w taki sam sposób. [0133] Dalej także odpowiednie są wektory plazmidowe, za pomocą których można przeprowadzić sposób amplifikacji genów przez integrację do chromosomu, jak opisano na przykład w Remscheid i wsp. (Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994)) do duplikacji lub amplifikacji operonu hom-thrb. Przy tej metodzie cały gen jest klonowany do wektora plazmidowego, który może replikować w pewnym gospodarzu (typowo E. coli), ale nie w C. glutamicum. Jako wektory można brać pod uwagę na przykład psup301 (Simon i wsp., Bio/ Technology 1,784-791 (1983)), pk18mob lub pk19mob (Schäfer i wsp., Gene 14,69-73 (1994)), Bernard i wsp., Journal of Molecular Biology, 234: 34-41 (1993)), pem1 (Schrumpf i wsp. 1991, Journal of Bacteriology 173: 410-416) lub pbgs8 (Spratt i wsp., 1986, Gene 41: 337-342). Wektor plazmidowy, który zawiera gen mający ulec amplifikacji, jest następnie wprowadzany do pożądanego szczepu C. glutamicum przez transformację. Metody transformacji są opisane na przykład w Thierbach i wsp. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 36-362 (1988)), Dunican i Shivnan (Biotechnology 7, 1067-1070 (1989)) i Tauch i wsp. (FEMS Microbiological Letters 123,343-347 (1994)). [0134] Wynalazek dalej dotyczy genetycznie zmienionego mikroorganizmu, gdzie zmiana genetyczna powoduje zmianę lub wywołanie szybkości transkrypcji przynajmniej jednego genu w porównaniu z typem dzikim i jest warunkowana przez [013] regulację transkrypcji genów mikroorganizmu przez kwasy nukleinowe z aktywnością promotora według zastrzeżenia 7 gdzie geny są heterologiczne w stosunku do kwasów nukleinowych z aktywnością promotora. [0136] Jak opisano uprzednio przy sposobie, regulacja transkrypcji genów u mikroorganizmu przez jednostkę ekspresji jest uzyskiwana przez kwasy nukleinowe z aktywnością promotora według zastrzeżenia 7 tak, że b1) wprowadza się do genomu mikroorganizmu jeden lub większą liczbę kwasów nukleinowych z aktywnością promotora według zastrzeżenia 7, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora, tak, że transkrypcja jednego lub więcej endogennych genów zachodzi pod kontrolą wprowadzonego kwasu nukleinowego z aktywnością promotora według zastrzeżenia 7 ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora, lub
29 10 1 20 2 30 3 b2) wprowadza jeden lub większą liczbę genów do genomu mikroorganizmu, tak że transkrypcja jednego lub więcej wprowadzonych genów zachodzi pod kontrolą endogennych kwasów nukleinowych z aktywnością promotora według zastrzeżenia 7, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora lub b3) wprowadza się do mikroorganizmu jeden lub większą liczbę konstruktów kwasu nukleinowego, zawierających kwas nukleinowy z aktywnością promotora według zastrzeżenia 7, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością promotora, i funkcjonalnie połączone jeden lub większa liczba mających ulec transkrypcji kwasów nukleinowych. [0137] Wynalazek dotyczy dalej genetycznie zmienionego mikroorganizmu z podwyższoną lub wywołaną szybkością transkrypcji przynajmniej jednego genu w porównaniu z typem dzikim, gdzie transkrypcja genów u mikroorganizmu jest regulowana przez kwas nukleinowy z aktywnością promotora według zastrzeżenia 7, gdzie geny są heterologiczne w stosunku do kwasu nukleinowego z aktywnością promotora [0138] Jak opisano uprzednio przy sposobie, regulacja ekspresji genów u mikroorganizmu przez kwas nukleinowy z aktywnością promotora według zastrzeżenia 7 jest uzyskiwana przez to, że bh1) wprowadza się do genomu mikroorganizmu jeden lub większą liczbę kwasów nukleinowych z aktywnością promotora według zastrzeżenia 7, ewentualnie z podwyższoną specyficzną aktywnością promotora, tak, że transkrypcja jednego lub więcej endogennych genów zachodzi pod kontrolą wprowadzonego kwasu nukleinowego z aktywnością promotora, ewentualnie z podwyższoną specyficzną aktywnością promotora, lub bh2) wprowadza jeden lub większą liczbę genów do genomu mikroorganizmu, tak że transkrypcja jednego lub więcej wprowadzonych genów zachodzi pod kontrolą endogennych kwasów nukleinowych z aktywnością promotora według zastrzeżenia 7, ewentualnie z podwyższoną specyficzną aktywnością promotora lub bh3) wprowadza się do mikroorganizmu jeden lub większą liczbę konstruktów kwasu nukleinowego, zawierających kwas nukleinowy z aktywnością promotora według zastrzeżenia 7, ewentualnie z podwyższoną specyficzną aktywnością promotora, i funkcjonalnie połączone jeden lub większa liczba mających ulec transkrypcji kwasów nukleinowych. [0139] Genetycznie zmienione mikroorganizmy mogą także zawierać zmiany genetyczne, które prowadzą do zmiany lub wywołania szybkości ekspresji przynajmniej jednego genu w porównaniu z typem dzikim i są warunkowane przez regulację ekspresji genów u mikroorganizmu przez jednostki ekspresji, gdzie geny są heterologiczne w stosunku do jednostek ekspresji. [0140] Jak opisano uprzednio przy sposobie, regulacja ekspresji genów u
30 10 1 20 2 30 3 mikroorganizmu przez jednostki ekspresji jest uzyskiwana przez to, że d1) wprowadza się do genomu mikroorganizmu jedną lub więcej jednostek ekspresji, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji, tak, że ekspresja jednego lub więcej endogennych genów zachodzi pod kontrolą wprowadzonych jednostek ekspresji, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji lub d2) wprowadza jeden lub większą liczbę genów do genomu mikroorganizmu, tak że ekspresja jednego lub więcej wprowadzonych genów zachodzi pod kontrolą endogennych jednostek ekspresji, ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji lub d3) wprowadza się do mikroorganizmu jeden lub większą liczbę konstruktów kwasu nukleinowego, zawierających jednostkę ekspresji ewentualnie ze zmienioną specyficzną aktywnością ekspresji, i funkcjonalnie połączone jeden lub większą liczbę kwasów nukleinowych mających ulec ekspresji, [0141] Szczególnie korzystnie przedstawiony wynalazek dotyczy genetycznie zmienionych mikroorganizmów, w szczególności maczugowców, które zawierają wektor, w szczególności wektor wahadłowy lub wektor plazmidowy, który niesie przynajmniej jeden zrekombinowany konstrukt kwasu nukleinowego według definicji wynalazku. [0142] W korzystnym wykonaniu genetycznie zmienionych organizmów uprzednio opisane geny obejmują przynajmniej jeden kwas nukleinowy kodujący białko ze szlaku biosyntezy związków chemicznych wysokiej jakości. [0143] W szczególnie korzystnym wykonaniu genetycznie zmienionych mikroorganizmów uprzednio opisane geny są wybrane z grupy kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy aminokwasów białkowych i niebiałkowych, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy nukleotydów i nukleozydów, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy kwasów organicznych, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy lipidów i kwasów tłuszczowych, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy dioli, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy węglowodanów, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy związku aromatycznego, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy witamin, kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy kofaktorów i kwasów nukleinowych kodujących białko ze szlaku biosyntezy enzymów, gdzie geny ewentualnie mogą zawierać dalsze elementy regulacyjne. [0144] Korzystne białka ze szlaku biosyntezy aminokwasów są wybrane z grupy obejmującej kinazę asparaginianową, dehydrogenazę semialdehydu asparaginianu, dehydrogenazę diaminopimelinianu, dekarboksylazę diaminopimelinianu, syntetazę dihydrodipikolinianu, reduktazę dihydrodipikolinianu, dehydrogenazę aldehydu 3- fosfoglicerynowego, kinazę 3-fosfoglicerynianu, karboksylazę pirogronianową, izomerazę triozofosforanu, regulator transkrypcji LuxR, regulator transkrypcji LysR1, regulator
31 10 1 20 2 30 3 transkrypcji LysR2, oksydoreduktazę maleinian-chinon, dehydrogenazę glukozo-6- fosforanu, dehydrogenazę 6-fosfoglukonianu, transketolazę, transaldolazę, O- acylotransferazę homoseryny, gamma syntazę cystationiny, beta liazę cystationiny, hydroksymetylotransferazę seryny, sulfhydrylazę O-acetylohomoseryny, reduktazę metyleno-tetrahydrofolianową, aminotransferazę fosfoseryny, fosfatazę fosfoseryny, transerazę acetyloseryny, dehydrogenazę homoseryny, kinazę homoseryny, syntazę treoniny, eksporter-nośnik treoniny, dehydratazę treoniny, oksydazę pirogronianu, eksporter lizyny, ligazę biotyny, syntazę cysteiny I, syntazę cysteiny II, syntazę metioniny zależną od koenzymu B12, syntazę metioniny niezależną od koenzymu B12, siarczan adenylotransferazy podjednostki 1 i 2, reduktazę fosfosiarczanu fosfoadenozyny, reduktazę siarczyn-ferredoksyna, reduktazę ferredoksyna-nadp, dehydrogenazę 3-fosfoglicerynianu, regulator RXA006, regulator RXN2910, syntetazę arginylo-trna, karboksylazę fosfoenolopirogronianu, białko wypierające treoninę, hydroksymetylotransferazę seryny, fruktozo-1,6-bifosfatazę, białko redukcji siarczanów RXA077, białko redukcji siarczanów RXA248, białko redukcji siarczanów RXA247, białko OpcA, 1-fosfofruktokinazę i 6- fosfofruktokinazę. [014] Szczególnie korzystne przykłady białek i genów ze szlaku biosyntezy aminokwasów są opisane uprzednio w Tabeli 1 i Tabeli 2. [0146] Korzystne mikroorganizmy lub genetycznie zmienione mikroorganizmy są bakteriami, glonami, grzybami lub drożdżami. [0147] Szczególnie korzystne mikroorganizmy są w szczególności maczugowcami. [0148] Korzystne maczugowce są bakteriami rodzaju Corynebacterium, w szczególności gatunków Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium melassecola i Corynebacterium efficiens lub rodzaju Brevibacterium, w szczególności gatunków Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum i Brevibacterium divaricatum. [0149] Szczególnie korzystne bakterie z rodzajów Corynebacterium i Brevibacterium są wybrane z grupy Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 1806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-139, Corynebacterium melassecola ATCC 1796, Corynebacterium efficiens DSM 4447, Corynebacterium efficiens DSM 4448. Corynebacterium efficiens DSM 4449, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium divaricatum ATCC 14020, Corynebacterium glutamicum KFCC1006 i Corynebacterium glutamicum ATCC21608. [010] Skrót KFCC oznacza Korean Federation of Culture Collection, skrót ATCC American type strain culture collection, skrót DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen.
32 [011] Dalsze szczególnie korzystne bakterie rodzajów Corynebacterium i Brevibacterium są wyliczone w Tabeli 3: Bakteria Numer depozytu Rodzaj Gatunek ATCC FER NRRL CEC T NCIMB CBS NCTC DS MZ Brevibacterium ammoniagenes 2104 Brevibacterium ammoniagenes 1930 Brevibacterium ammoniagenes 1931 Brevibacterium ammoniagenes 1932 Brevibacterium ammoniagenes 1933 Brevibacterium ammoniagenes 1934 Brevibacterium ammoniagenes 193 Brevibacterium ammoniagenes 1936 Brevibacterium ammoniagenes 210 Brevibacterium ammoniagenes 21077 Brevibacterium ammoniagenes 213 Brevibacterium ammoniagenes 2180 Brevibacterium ammoniagenes 39101 Brevibacterium butanicum 21196 Brevibacterium divaricatum 21792 P928 Brevibacterium flavum 21474 Brevibacterium flavum 21129 Brevibacterium flavum 2118 Brevibacterium flavum B11474 Brevibacterium flavum B11472 Brevibacterium flavum 21127 Brevibacterium flavum 21128 Brevibacterium flavum 21427 Brevibacterium flavum 2147 Brevibacterium flavum 2117 Brevibacterium flavum 2128 Brevibacterium flavum 2129 Brevibacterium flavum B11477 Brevibacterium flavum B11478 Brevibacterium flavum 21127 Brevibacterium flavum B11474 Brevibacterium healii 127 Brevibacterium ketoglutamicum 21004 Brevibacterium ketoglutamicum 21089 Brevibacterium ketosoreductum 21914
33 Brevibacterium lactofermentum 70 Brevibacterium lactofermentum 74 Brevibacterium lactofermentum 77 Brevibacterium lactofermentum 21798 Brevibacterium lactofermentum 21799 Brevibacterium lactofermentum 21800 Brevibacterium lactofermentum 21801 Brevibacterium lactofermentum B11470 Brevibacterium lactofermentum B11471 Brevibacterium lactofermentum 21086 Brevibacterium lactofermentum 21420 Brevibacterium lactofermentum 21086 Brevibacterium lactofermentum 31269 Brevibacterium linens 9174 Brevibacterium linens 19391 Brevibacterium linens 8377 Brevibacterium paraffinolyticum 11160 Brevibacterium spec. 717. 7 3 Brevibacterium spec. 717. 7 3 Brevibacterium spec. 14604 Brevibacterium spec. 21860 Brevibacterium spec. 21864 Brevibacterium spec. 2186 Brevibacterium spec. 21866 Brevibacterium spec. 19240 Corynebacterium acetoacidophilum 21476 Corynebacterium acetoacidophilum 13870 Corynebacterium acetoglutamicum B11473 Corynebacterium acetoglutamicum B1147 Corynebacterium acetoglutamicum 1806 Corynebacterium acetoglutamicum 21491 Corynebacterium acetoglutamicu 31270 Corynebacterium acetophilum B3671 Corynebacterium ammoniagenes 6872 2399 Corynebacterium ammoniagenes 111 Corynebacterium fujiokense 21496 Corynebacterium glutamicum 14067 Corynebacterium glutamicum 39137
34 Corynebacterium glutamicum 2124 Corynebacterium glutamicum 212 Corynebacterium glutamicum 31830 Corynebacterium glutamicum 13032 Corynebacterium glutamicum 1430 Corynebacterium glutamicum 14 Corynebacterium glutamicum 1308 Corynebacterium glutamicum 1309 Corynebacterium glutamicum 13060 Corynebacterium glutamicum 21492 Corynebacterium glutamicum 2113 Corynebacterium glutamicum 2126 Corynebacterium glutamicum 2143 Corynebacterium glutamicum 13287 Corynebacterium glutamicum 2181 Corynebacterium glutamicum 2123 Corynebacterium glutamicum 2114 Corynebacterium glutamicum 2116 Corynebacterium glutamicum 21299 Corynebacterium glutamicum 21300 Corynebacterium glutamicum 39684 Corynebacterium glutamicum 21488 Corynebacterium glutamicum 21649 Corynebacterium glutamicum 2160 Corynebacterium glutamicum 19223 Corynebacterium glutamicum 13869 Corynebacterium glutamicum 2117 Corynebacterium glutamicum 2118 Corynebacterium glutamicum 2119 Corynebacterium glutamicum 213 Corynebacterium glutamicum 31808 Corynebacterium glutamicum 21674 Corynebacterium glutamicum 2162 Corynebacterium glutamicum 2163 Corynebacterium glutamicum 2164 Corynebacterium glutamicum 216 Corynebacterium glutamicum 2166 Corynebacterium glutamicum 2167 Corynebacterium glutamicum 2168
3 Corynebacterium glutamicum 2169 Corynebacterium glutamicum 2170 Corynebacterium glutamicum 2171 Corynebacterium glutamicum 2172 Corynebacterium glutamicum 2173 Corynebacterium glutamicum 2179 Corynebacterium glutamicum 19049 Corynebacterium glutamicum 1900 Corynebacterium glutamicum 1901 Corynebacterium glutamicum 1902 Corynebacterium glutamicum 1903 Corynebacterium glutamicum 1904 Corynebacterium glutamicum 190 Corynebacterium glutamicum 1906 Corynebacterium glutamicum 1907 Corynebacterium glutamicum 1908 Corynebacterium glutamicum 1909 Corynebacterium glutamicum 19060 Corynebacterium glutamicum 1918 Corynebacterium glutamicum 13286 Corynebacterium glutamicum 211 Corynebacterium glutamicum 2127 Corynebacterium glutamicum 2144 Corynebacterium glutamicum 21492 Corynebacterium glutamicum B8183 Corynebacterium glutamicum B8182 Corynebacterium glutamicum B12416 Corynebacterium glutamicum B12417 Corynebacterium glutamicum 812418 Corynebacterium glutamicum B11476 Corynebacterium glutamicum 21608 Corynebacterium Lilium P973 Corynebacterium Nitrilophilus 21419 1194 Corynebacterium spec. P444 Corynebacterium spec. P4446 Corynebacterium spec. 31088 Corynebacterium spec. 31089 Corynebacterium spec. 31090 Corynebacterium spec. 31090 Corynebacterium spec. 31090
36 Corynebacterium spec. 194 201 4 Corynebacterium spec. 2187 Corynebacterium spec. 21862 Corynebacterium spec. 21863 10 1 20 2 30 [012] Skróty mają następujące znaczenie: ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA FERM: Fermentation Research Institute, Chiba, Japonia NRRL: ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA CECT: Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Walencia, Hiszpania NCIMB: National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, Zjednoczone Królestwo CBS: Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, NL NCTC: National Collection of Type Cultures, Londyn, UK DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen i Zellkulturen, Braunschweig, Niemcy [013] Przez kwasy nukleinowe z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1 jest możliwa regulacja za pomocą uprzednio opisanego sposobu wynalazku w genetycznie zmienionych mikroorganizmach według wynalazku szlaków przemiany materii do specyficznych produktów biosyntetycznych. [014] W tym celu na przykład szlaki metabolizmu, które prowadzą do specyficznego produktu biosyntezy przez wywołanie lub podwyższenie szybkości transkrypcji lub szybkości ekspresji genów tego szlaku biosyntezy wzmocnione w tym, że zwiększona ilość białka prowadzi do podwyższonej łącznej aktywności tych białek pożądanego szlaku biosyntezy i przez to do zwiększonego przepływu metabolizmu do pożądanego produktu biosyntetycznego. [01] Dalej szlaki metabolizmu prowadzące od specyficznego produktu biosyntetycznego przez redukcję szybkości transkrypcji lub szybkości ekspresji genów tego szlaku biosyntezy mogą być osłabione przez to, że obniżona ilość białka prowadzi do obniżonej łącznej aktywności tych białek niepożądanego szlaku biosyntezy i przez to dodatkowo do wzmocnionego przepływu metabolizmu do pożądanego produktu biosyntetycznego. [016] Genetycznie zmienione mikroorganizmy według wynalazku są na przykład w stanie przygotować produkty biosyntetyczne z glukozy, sacharozy, laktozy, fruktozy, maltozy, melasy, skrobi, celulozy lub z gliceryny i etanolu. [017] W zależności od pożądanego biosyntetycznego produktu szybkość transkrypcji różnych genów musi być podwyższona lub obniżona. Z reguły jest korzystna zmiana
37 10 1 20 2 30 3 szybkości transkrypcji szeregu genów, podwyższenie szybkości transkrypcji kombinacji genów i/lub zmniejszenie szybkości transkrypcji kombinacji genów. [018] W genetycznie zmienionym mikroorganizmie według wynalazku jest przynajmniej jedna zmieniona, to znaczy podwyższona lub zmniejszona szybkość transkrypcji jednego genu wynikająca z kwasu nukleinowego z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1. [019] Dalsza dodatkowo zmieniona, tzn. dodatkowo podwyższona lub dodatkowo obniżona szybkość transkrypcji dalszych genów w genetycznie zmienionych mikroorganizmach może, ale nie musi być efektem kwasu nukleinowego z aktywnością promotora według zastrzeżenia 1. [0160] Genetycznie zmienione mikroorganizmy według wynalazku mogą być zastosowane w sposobie przygotowania biosyntetycznych produktów. [0161] Korzystne biosyntetyczne produkty są związkami chemicznymi wysokiej jakości. [0162] Pojęcie związki chemiczne wysokiej jakości jest znane w dziedzinie i obejmuje związki, które są produkowane przez organizm i znajdują zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu, jak na przykład, ale bez ograniczenia do, przemysł farmaceutyczny, rolnictwo, przemysł kosmetyczny, spożywczy i paszowy. Te związki obejmują kwasy organiczne, jak na przykład kwas winowy, kwas itakonowy i kwas diaminopimelinowy jak i aminokwasy białkowe i niebiałkowe, zasady purynowe i pirymidynowe, nukleozydy i nukleotydy (jak np. opisano w Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, str. 61-612, w Biotechnology Tom 6, Rehm i wsp., wyd. VCH: Weinheim i tam zawarte cytaty), lipidy, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe (np. kwas arachidonowy), diole (np. propanodiol i butanodiol), węglowodany (np. kwas hialuronowy i trehaloza), związki aromatyczne (np. aromatyczne aminy, wanilina i indygo), witaminy i kofaktory (jak opisano w Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, tom A27, Vitamins, str. 443-613 (1996) VCH: Weinheim i tam zawarte cytaty; i Ong, A.S., Niki, E. i Packer, L. (199) Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Azja, która odbyła się 1-3 września 1994 w Penang, Malezja, AOCS Press (199)), enzymy i różne opisane przez Gutcho (1983) w Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 081880086 i podane tam pozycje literaturowe, opisane związki chemiczne. Metabolizm i zastosowania określonych związków chemicznych wysokiej jakości są dalej dokładniej wyjaśnione. I. Metabolizm aminokwasów i zastosowania [0163] Aminokwasy obejmują podstawowe jednostki strukturalne wszystkich białek i są więc niezbędne do normalnego funkcjonowania komórki. Pojęcie aminokwas jest znane w dziedzinie. Aminokwasy białkowe, których jest 20 rodzajów, służą jako jednostki strukturalne dla białek, w których są połączone ze sobą przez wiązania peptydowe, gdzie
38 10 1 20 2 30 3 niebiałkowe aminokwasy (których są znane setki) zazwyczaj nie występują w białkach (patrz Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, tom A2, str. 7-97 VCH: Weinheim (198)). Aminokwasy mogą występować w konfiguracji D- lub L-, choć L-aminokwasy zazwyczaj są jedynym typem, który występuje w naturalnie występujących białkach. Szlaki biosyntezy i degradacji dla każdego z 20 aminokwasów białkowych są dobrze scharakteryzowane zarówno w komórkach prokariotycznych jak i eukariotycznych (patrz np. Stryer, L. Biochemistry, 3. wyd., str. 78-90 (1988)). Niezbędne aminokwasy (histydyna, izoleucyna, leucyna, lizyna, metionina, fenyloalanina, treonina, tryptofan i walina), tak określone ponieważ ze względu na swoją złożoną biosyntezę muszą być przyjmowane z pożywienie są przekształcane za pomocą prostych szlaków biosyntezy do pozostałych 11 nieniezbędnych aminokwasów (alanina, arginina, asparagina, asparaginian, cysteina, glutaminian, glutamina, glicyna, prolina, seryna i tyrozyna). Wyższe zwierzęta są w stanie syntetyzować niektóre z tych aminokwasów, jednak niezbędne aminokwasy muszą być przyjmowane z pokarmem, aby mogła zachodzić normalna synteza białka. [0164] Poza ich funkcją przy biosyntezie białka te aminokwasy są same w sobie interesującymi chemikaliami, i odkryto że wiele z nich może być stosowanych w różnych zastosowaniach w przemyśle spożywczym, paszowym, kosmetycznym, rolnym i farmaceutycznym. Lizyna jest ważnym aminokwasem nie tylko w żywieniu ludzi, ale także zwierząt monogastrycznych, jak drób i świnie. Glutaminian jest najczęściej stosowany jako dodatek smakowy (glutaminian jednosodowy, MSG) zarówno szeroko w przemyśle spożywczym, jak i asparaginian, fenyloalanina, glicyna i cysteina. Glicyna, L-metionina i tryptofan są wszystkie stosowane w przemyśle farmaceutycznym. Glutamina, walina, leucyna, izoleucyna, histydyna, arginina, prolina, seryna i alanina są stosowane w przemyśle farmaceutycznym i przemyśle kosmetycznym. Treonina, tryptofan i D-/Lmetionina są szeroko rozpowszechnionymi dodatkami do pasz (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, str. 466-02 w Rehm i wsp., (wyd.) Biotechnology tom 6, rozdział 14a, VCH: Weinheim). Odkryto, że te aminokwasy także służą jako prekursory do syntezy syntetycznych aminokwasów i białek, jak N- acetylocysteina, S-karboksymetylo-L-cysteina, (S)--hydroksytryptofanan i inne, te substancje są opisane w Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, tom A2, str. 7-97, VCH, Weinheim, 198. [016] Biosynteza tych naturalnych aminokwasów w organizmach, które potrafią je produkować, np. bakteriach, została dobrze scharakteryzowana (przegląd biosyntezy aminokwasów u bakterii i jej regulacja, patrz Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 33-606). Glutaminian jest syntetyzowany przez redukcyjną aminację - ketoglutaranu, produktu pośredniego w cyklu kwasu cytrynowego.
39 10 1 20 2 30 3 Glutamina, prolina i arginina są odpowiednio po kolei uzyskiwane z glutaminianu. Biosynteza seryny zachodzi w trójetapowym sposobie i rozpoczyna się od 3- fosfoglicerynianu (produktu pośredniego przy glikolizie) i daje po etapach oksydacji, transaminacjii i hydrolizy ten aminokwas. Cysteina i glicyna są odpowiednio produkowane z seryny, i ten pierwszy przez kondensację homocysteiny z seryną, i ten drugi przez przeniesienie łańcuchów bocznych atomów węgla na tetrahydrofolian, w reakcji katalizowanej przez transhydroksymetylazę seryny. Fenyloalanina i tyrozyna są syntetyzowane z prekursorów ze szlaków glikolizy i szlaku pentozofosforanu. Erytrozo-4- fosforan i fosfoenolopirogronian są syntetyzowane w 9-etapowym szlaku biosyntezy, który różni się dopiero w dwóch ostatnich etapach od syntezy prefenianu. Tryptofan jest też produkowany z tych dwóch cząsteczek wyjściowych, jednak ta synteza zachodzi w szlaku z 11 etapów. Tyrozyna jest też produkowana w katalizowanej przez hydroksylazę fenyloalaniny reakcji z fenyloalaniny. Alanina, walina i leucyna są odpowiednio produktami biosyntezy pirogronianu, produktu końcowego glikolizy. Asparaginian jest produkowany ze szczawiooctanu, produktu pośredniego cyklu kwasu cytrynowego. Asparagina, metionina, treonina i lizyna są odpowiednio produkowane przez przekształcenie asparaginianu. Izoleucyna jest tworzona z treoniny. W złożonym 9-etapowym szlaku zachodzi tworzenie histydyny z -fosforybozylo-1-pirofosforanu, aktywowanego cukru. [0166] Aminokwasy, których ilość przekracza zapotrzebowanie do syntezy białka komórki nie mogą być magazynowane, i zamiast tego są degradowane, tak że przygotowywane są produkty pośrednie do głównych szlaków metabolizmu komórki (przegląd patrz Stryer, L., Biochemistry, 3. wyd. rozdz. 21 Amino Acid Degradation and the Urea Cycle ; str. 49-16 (1988)). Choć komórka jest w stanie przerabiać niepożądane aminokwasy w pożyteczne produkty pośrednie metabolizmu, jednak produkcja aminokwasów ze względu na energię, cząsteczki prekursorów i potrzebne do ich syntezy enzymy jest wymagająca. Nie jest więc niespodzianką, że biosynteza aminokwasów jest regulowana przez sprzężenie zwrotne, gdzie obecność konkretnego aminokwasu zwalnia lub całkowicie kończy jego produkcję (przegląd o mechanizmie hamowania zwrotnego przy szlakach syntezy aminokwasów patrz Stryer, L., Biochemistry, 3. wyd, rozdz. 24, Biosynthesis of Amino Acids and Heme, str. 7-600 (1988)). Wydajność danego aminokwasu jest więc ograniczana przez ilość tego aminokwasu w komórce. II. Metabolizm witamin, kofaktorów i nutriceutyków oraz zastosowania [0167] Witaminy, kofaktory i nutriceutyki obejmują kolejną grupę cząsteczek. Wyższe zwierzęta utraciły zdolność do ich syntezy i muszą je więc pobierać, choć są bezproblemowo syntetyzowane przez inne organizmy, takie jak bakterie. Te cząsteczki są albo biologicznie czynnymi cząsteczkami jako takie lub prekursorami biologicznie czynnych substancji, które służą jako nośniki elektronów lub produkty pośrednie w szeregu szlaków
40 10 1 20 2 30 3 metabolizmu. Te związki mają oprócz swojej wartości odżywczej także istotne znaczenie przemysłowe jako barwniki, antyoksydanty i katalizatory lub inne środki pomocnicze do obróbki (Przegląd struktury, aktywności i zastosowań przemysłowych tych związków patrz np. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vitamins, tom A27, str. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Pojęcie witamina jest znane w dziedzinie i obejmuje substancje odżywcze, które są wymagane przez organizm do normalnego działania, jednak nie mogą być syntetyzowane przez ten organizm. Grupa witamin może obejmować kofaktory i związki nutriceutyczne. Pojęcie kofaktor obejmuje niebiałkowe związki, które są potrzebne do wystąpienia normalnej aktywności enzymatycznej. Te związki mogą być organiczne lub nieorganiczne; cząsteczki kofaktora według wynalazku są korzystnie organiczne. Pojęcie nutriceutyk obejmuje dodatki spożywcze, które u roślin i zwierząt, w szczególności u ludzi, sprzyjają zdrowiu. Przykładami takich cząsteczek są witaminy, antyoksydanty i także pewne lipidy (np. wielokrotnie nienasycone kwasy tłuszczowe). [0168] Biosynteza tych cząsteczek w organizmach, które są zdolne do ich produkcji, jak bakterie, została szeroko scharakteryzowana (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vitamins, tom A27, str. 443-613, VCH: Weinheim, 1996, Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons: Ong, A.S., Niki, E. i Packer, L. (199) Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research - Azja, który odbył się 1.-3. września 1994 w Penang, Malezja, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S). [0169] Tiamina (witamina B 1 ) jest tworzona przez chemiczne połączenie jednostek pirymidyny i tiazolu. Ryboflawina (witamina B 2 ) jest tworzona z guanozyno-'-trifosforanu (GTP) i rybozo-'-fosforanu. Ryboflawina jest z kolei stosowana do syntezy mononukleotydu flawinowego (FMN) i flawinoadeninodinukleotydu (FAD). Rodzina związków, które razem są określane jako witamina B6 (np. pirydoksyna, pirydoksamina, -fosforan pirydoksalu i stosowany handlowo chlorowodorek pirydoksyny) wszystkie są pochodnymi wspólnej jednostki strukturalnej -hydroksy-6-metylopirydyny. Pantotenian (kwas pantotenowy, R-(+)-N-(2,4-dihydroksy-3,3-dimetylo-1-oksobutylo)- -alanina) może być przygotowany albo przez syntezę chemiczną albo przez fermentację. Ostatnie etapy przy biosyntezie pantotenianu składają się ze sterowanej przez ATP kondensacji -alaniny i kwasu pantoinowego. Enzymy odpowiedzialne za przekształcenie w kwas pantoinowy, w - alaninę i do kondensacji w kwas pantotenowy są znane. Metabolicznie aktywną formą pantotenianu jest koenzym A, którego biosynteza zachodzi przez etapów enzymatycznych. Pantotenian, '-fosforan pirydoksalu, cysteina i ATP są prekursorami koenzymu A. Te enzymy katalizują nie tylko tworzenie pantotenianu ale także produkcję kwasu (R)-pantoinowego, (R)-pantolaktonu, (R)-pantenolu (prowitamina B ), panteteiny (i
41 10 1 20 2 30 3 jej pochodnych) i koenzymu A. [0170] Biosynteza biotyny z cząsteczki prekursora pimeloilo-coa w mikroorganizmach była dokładnie przebadana i zidentyfikowano szereg biorących w tym udział genów. Okazało się, że wiele z odpowiednich białek bierze udział w syntezie klastrów Fe i należą do klasy białek nifs. Kwas liponowy pochodzi od kwasu oktanonowego i służy jako koenzym przy metabolizmie energii, gdzie staje się składnikiem kompleksu dehydrogenazy pirogronianu i kompleksu dehydrogenazy -ketoglutaranu. Foliany są grupą substancji, które wszystkie pochodzą od kwasu foliowego, który z kolei pochodzi od kwasu L- glutaminowego, kwasu p-aminobenzoesowego i 6-metylopteryny. Biosynteza kwasu foliowego i jego pochodnych wychodząca z produktów pośrednich metabolizmu guanozyno- '-trifosforanu (GTP), kwasu L-glutaminowego i kwasu p-aminobenzoesowego była dokładnie badana u określonych mikroorganizmów. [0171] Korynoidy (jak kobalamina i w szczególności witamina B 12 ) i porfiryny należą do grupy związków chemicznych, które charakteryzują się układem tetrapirolowym pierścieni. Biosynteza witamina B 12 jest na tyle złożona, że jeszcze nie została w pełni scharakteryzowana, jednak w międzyczasie poznano większa część biorących w tym udział enzymów i substratów. Kwas nikotynowy (nikotynian) i nikotynamid są pochodnymi pirydyny, które są także określane jako niacyna. Niacyna jest prekursorem ważnego koenzymu NAD (dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy) i NADP (fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego) i ich zredukowanych postaci. [0172] Produkcja tych związków na dużą skalę opiera się w znacznej części na bezkomórkowej syntezie chemicznej, choć niektóre z tych związków chemicznych są także produkowane przez hodowlę na dużą skalę mikroorganizmów, jak ryboflawina, witamina B 6, pantotenian i biotyna. Tylko witamina B 12 ze względu na złożoność swojej syntezy jest produkowana wyłącznie przez fermentację. Metody in vitro wymagają znacznego nakładu materiałów i czasu i często wysokich kosztów. III. Metabolizm puryn, pirymidyn, nukleozydów i nukleotydów i zastosowania [0173] Geny metabolizmu puryn i pirymidyn i ich odpowiednie białka są ważnymi celami dla terapii chorób nowotworowych i zakażeń wirusami. Pojęcie puryna lub pirymidyna obejmuje zawierające azot zasady, które są składnikami kwasów nukleinowych, koenzymów i nukleotydów. Pojęcie nukleotyd obejmuje podstawowe elementy strukturalne cząsteczki kwasu nukleinowego, które obejmują zasadę zawierającą azot, cukier pentozę (dla RNA ten cukier jest rybozą, dla DNA cukier jest D-deoksyrybozą) i kwas fosforowy, Pojęcie nukleozyd obejmuje cząsteczki, które służą jako prekursory nukleotydów, ale które w przeciwieństwie do nukleotydów nie wykazują jednostki kwasu fosforowego. Przez hamowanie biosyntezy tych cząsteczek lub ich mobilizację do tworzenia cząsteczek kwasu nukleinowego jest możliwe hamowanie syntezy RNA i DNA; jeśli tak
42 10 1 20 2 30 3 aktywność jest w celowy sposób hamowana w komórkach rakowych, daje się hamować zdolność komórek rakowych do podziału i replikacji. [0174] Poza tym istnieją nukleotydy, które nie tworzą cząsteczek kwasu nukleinowego, ale służą jako magazyny energii (tzn. AMP) lub jako koenzymy (tzn. FAD i NAD). [017] Szereg publikacji opisało zastosowanie tych związków chemicznych do tych wskazań medycznych, gdzie wpływa się na metabolizm puryn i/lub pirymidyn (np. Christopherson, R.I. i Lyons, S.D. (1990) Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents, Med. Res. Reviews 10: 0-48). Badania enzymów, które biorą udział w metabolizmie puryn i pirymidyn, były skoncentrowane na opracowaniu nowych leków, które mogły być stosowane np. jako środki do immunosupresji lub antyproliferacyjne (Smith, J.L. Enzymes in Nucleotide Synthesis" Curr. Opin. Struct. Biol. (199) 72-77; Biochem. Soc. Transact. 23 (199) 877-902). Są też inne możliwości zastosowania zasad purynowych i pirymidynowych, nukleozydów i nukleotydów: jako produkty pośrednie przy biosyntezie różnych związków chemicznych wysokiej jakości (np. tiamina, S-adenozylo-metionina, folian lub ryboflawina), jako nośniki energii dla komórki (np. ATP lub GTP) i jako chemikalia, są często stosowane jako wzmacniacze smaku (np. IMP lub GMP) lub dla wielu zastosowań medycznych (patrz np. Kuninaka, A., (1996) Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology tom 6, Rehm i wsp., wyd. VCH: Weinheim, S. 61-612). Enzymy, które biorą udział w metabolizmie puryn, pirymidyn, nukleozydów lub nukleotydów, służą także coraz częściej jako cele, przeciw którym opracowywane są chemikalia do ochrony roślin, w tym fungicydy, herbicydy i insektycydy. [0176] Metabolizm tych związków u bakterii został scharakteryzowany (przegląd patrz np. Zalkin, H. i Dixon, J.E. (1992) De novo purin nucleotide biosynthesis w Progress in Nucleic Acids Research and Molecular biology, tom 42, Academic Press, str. 29-287; i Michal, G. (1999) Nucleotides and Nucleosides ; rozdz. 8 w: Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York). Metabolizm puryn, który jest obiektem intensywnych badań, jest niezbędny dla normalnego funkcjonowania komórki. Zaburzony metabolizm puryn u wyższych zwierząt może powodować ciężkie choroby np. gościec. Nukleotydy purynowe są syntetyzowane przez szereg etapów przez związek pośredni inozyno-'-fosforan (IMP) z rybozo--fosforanu, co prowadzi do produkcji guanozyno-'-monofosforanu (GMP) lub adenozyno-'-monofosforanu (AMP), z których łatwo można uzyskać stosowane jako nukleotydy formy trifosforanowe. Te związki są także stosowane do magazynowania energii, tak, że ich degradacja dostarcza energię do wielu różnych procesów biochemicznych w komórce. Biosynteza pirymidyn zachodzi przez tworzenie urydyno-'-monofosforanu (UMP) z rybozo--fosforanu. Z kolei UMP jest przekształcany do cytydyno-'-trifosforanu (CTP). Formy deoksy różnych nukleotydów
43 10 1 20 2 30 3 powstają w jednoetapowej reakcji redukcji z formy difosforanu rybozy nukleotydów do formy difosforanu-deoksyrybozy nukleotydu. Po fosforylacji te cząsteczki mogą brać udział w syntezie DNA. IV. Metabolizm trehalozy i zastosowania [0177] Trehaloza składa się z dwóch cząsteczek glukozy, które są ze sobą połączone wiązaniem -1,1-. Są zazwyczaj stosowane w przemyśle spożywczym jako środek słodzący, dodatek do suszonych lub mrożonych pokarmów jak i w napojach. Jest jednak także stosowana w przemyśle farmaceutycznym, przemyśle kosmetycznym i biotechnologicznym (patrz np. Nishimoto i wsp., (1998) Patent US Nr 79 610; Singer, M.A. i Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, C.L.A. i Panek, A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; i Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102). Trehaloza jest produkowana przez enzymy wielu mikroorganizmów i w naturalny sposób oddawana do otaczającego podłoża, z którego może być uzyskana za pomocą metod znanych w dziedzinie. [0178] Szczególnie korzystne biosyntetyczne produkty są wybrane z grupy kwasów organicznych, białek, nukleotydów i nukleozydów, aminokwasów białkowych i niebiałkowych, lipidów i kwasów tłuszczowych, dioli, węglowodanów, związków aromatycznych, witamin i kofaktorów, enzymów i białek. [0179] Korzystnymi kwasami organicznymi są kwas winowy, kwas itakonowy i kwas diaminopimelinowy. [0180] Korzystne nukleozydy i nukleotydy są na przykład opisane w Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, S. 61-612, w Biotechnology tom 6, Rehm i wsp., wyd. VCH: Weinheim i tam zawarte cytaty. [0181] Korzystnymi biosyntetycznymi produktami są dalej lipidy, nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, jak na przykład kwas arachidonowy, diole jak na przykład propanodiol i butanodiol, węglowodany jak na przykład kwas hialuronowy i trehaloza, związki aromatyczne jak na przykład aromatyczne aminy, wanilina i indygo, witaminy i kofaktory, jak na przykład opisano w Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, tom A27, Vitamins, str. 443-613 (1996) VCH: Weinheim i tam zawarte cytaty; i Ong, A.S., Niki, E. i Packer, L. (199) Nutrition, Lipids, Health and Disease Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Azja, który odbył się 1.-3. września 1994 w Penang, Malezja, AOCS Press (199)), enzymy poliketydowe (Cane i wsp. (1998) Science 282: 63-68), i różne inne opisane przez Gutcho (1983) w Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 081880086 i tam podane pozycje literaturowe, chemikalia. [0182] Szczególnie korzystnymi biosyntetycznymi produktami są aminokwasy, szczególnie korzystnie niezbędne aminokwasy, w szczególności L-glicyna, L-alanina, L-leucyna, L- metionina, L-fenyloalanina, L-tryptofan, L-lizyna, L-glutamina, kwas L-glutaminowy, L-
44 10 1 20 2 30 3 seryna, L-prolina, L-walina, L-izoleucyna, L-cysteina, L-tyrozyna, L-histydyna, L-arginina, L- asparagina, kwas L-asparaginowy i L-treonina, L-homoseryna, w szczególności L-lizyna, L- metionina i L-treonina. Dalej jako aminokwas, jak na przykład lizyna, metionina i treonina, rozumiana jest zarówno forma L i D aminokwasu, korzystnie forma L, czyli na przykład L- lizyna, L-metionina i L-treonina. [0183] W sposobie przygotowania biosyntetycznych produktów korzystnie włączony jest etap hodowli genetycznie zmienionych mikroorganizmów i izolacja biosyntetycznych produktów z mikroorganizmów lub/i z bulionu fermentacyjnego. Te etapy mogą zachodzić równocześnie i/lub korzystnie po etapie hodowli. [0184] Zmienione genetycznie mikroorganizmy według wynalazku mogą być hodowane w sposób ciągły lub nieciągły w metodzie hodowli partiami lub uzupełnianymi partiami lub powtarzanymi uzupełnianymi partiami do produkcji produktów biosyntetycznych, w szczególności L-lizyny, L-metioniny i L-treoniny. Zestaw znanych metod hodowli można znależć w podręczniku Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) lub w podręczniku (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)). [018] Stosowane podłoże hodowlane ma w odpowiedni sposób spełniać wymagania danego szczepu. Opisy podłoży hodowlanych dla różnych mikroorganizmów są zawarte w podręczniku Manual of Methods für General Bacteriology" American Society für Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981). [0186] Te możliwe do stosowania podłoża obejmują zazwyczaj jedno lub więcej źródeł węgla, sole nieorganiczne, witaminy i/lub pierwiastki śladowe. [0187] Korzystnymi źródłami węgla są cukry, jak mono-, di- lub polisacharydy. Bardzo dobrymi źródłami węgla są na przykład glukoza, fruktoza, mannoza, galaktoza, ryboza, sorboza, rybuloza, laktoza, maltoza, sacharoza, rafinoza, skrobia lub celuloza. Można też dostarczać cukier przez złożone związki jak melasa lub inne produkty uboczne przemysłu rafinacji cukru do podłoża. Może też być korzystne dodawanie mieszanin różnych źródeł węgla. Innymi możliwymi źródłami węgla są oleje i tłuszcze jak np. olej sojowy, olej słonecznikowy, olej arachidowy i tłuszcz kokosowy, kwasy tłuszczowe jak np. kwas palmitynowy, kwas stearynowy lub kwas linolowy, alkohole jak np. gliceryna, metanol lub etanol i kwasy organiczne jak np. kwas octowy lub kwas mlekowy. [0188] Źródłami azotu są zazwyczaj organiczne lub nieorganiczne związki azotowe, lub materiały, które zawierają te związki. Przykładowe źródła azotu obejmują gazowy amoniak, sole amonowe jak siarczan amonu, chlorek amonu, fosforan amonu, węglan amonu lub azotan amonu, azotany, mocznik, aminokwasy lub złożone źródła azotu jak woda z pęcznienia kukurydzy, mączka sojowa, białko sojowe, ekstrakt drożdżowy, ekstrakt mięsny i inne. Źródła azotu mogą być stosowane pojedynczo lub jako mieszanina.
4 10 1 20 2 30 3 [0189] Nieorganiczne sole, które mogą być zawarte w podłożach obejmują sole chlorkowe, fosforowe lub siarczanowe wapnia, magnezu, sodu, kobaltu, molibdenu, potasu, manganu, cynku, miedzi i żelaza. [0190] Jako źródło siarki do przygotowania związków chemicznych wysokiej jakości, w szczególności metioniny, mogą być stosowane nieorganiczne związki jak na przykład siarczany, siarczyny, ditioniany, tetrationiany, tiosiarczany, siarczki, ale także organiczne związki siarkowe jak merkaptany i tiole. [0191] Jako źródło fosforu mogą być stosowane kwas fosforowy, fosforan potasu jednozasadowy lub fosforan potasu dwuzasadowy lub odpowiednie sole zawierające sód. [0192] Do podłoża mogą być dodane czynniki chelatujące do utrzymania jonów metali w roztworze. Szczególnie odpowiednie czynniki chelatujące obejmują dihydroksyfenole jak katechol lub protokatechuan, lub kwasy organiczne jak kwas cytrynowy. [0193] Stosowane podłoża fermentacyjne zawierają zazwyczaj także inne czynniki wzrostowe jak witaminy lub czynniki sprzyjające wzrostowi, do których należą na przykład biotyna, ryboflawina, tiamina, kwas foliowy, kwas nikotynowy, pantotenian i pirydoksyna. Czynniki wzrostowe często pochodzą ze złożonych składników podłoża jak ekstrakt drożdżowy, melasa, woda z pęcznienia kukurydzy i tym podobne. Ponadto do podłoża hodowlanego mogą być dodawane odpowiednie prekursory. Dokładny skład związków podłoża zależy od danego eksperymentu i jest ustalany indywidualnie dla każdego określonego przypadku. Informację o optymalizacji podłoży można uzyskać z podręcznika Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (wyd. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) str. 3-73, ISBN 0 19 96377 3). Podłoża wzrostowe można też otrzymać ze źródeł komercyjnych jak na przykład Standard 1 (Merck) lub BHI (Brain heart infusion, DIFCO) i tym podobne. [0194] Różne składniki podłoży są sterylizowane, przez ciepło (20 min przy 1, bar i 121 C) lub przez sterylne sączenie. Składniki mogą być sterylizowane razem lub jeśli to potrzebne oddzielnie. Różne składniki podłoża mogą być obecne na początku hodowli lub ewentualnie być dodawane w sposób ciągły lub partiami. [019] Temperatura hodowli jest normalnie pomiędzy 1 C i 4 C, korzystnie 2 C do 40 C i może być utrzymywana na stałym poziomie w czasie eksperymentu lub być zmieniana. Wartość ph powinna być w zakresie do 8,, korzystnie koło 7,0. Wartości ph hodowli można kontrolować w czasie hodowli przez dodatek zasadowych związków jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, amoniak lub woda amoniakalna lub kwaśnych związków jak kwas fosforowy lub kwas siarkowy. Do kontroli powstawania piany mogą być dodane środki przeciw pienieniu jak np. estry poliglikolowe kwasów tłuszczowych. Dla utrzymania stabilności plazmidów do podłoża mogą być dodane odpowiednie selektywnie działające związki jak np. antybiotyki. Dla utrzymania warunków tlenowych, do hodowli jest
46 10 1 20 2 30 3 wprowadzany tlen lub mieszaniny gazów zwierające tlen jak np. powietrze otoczenia. Temperatura hodowli wynosi normalnie 20 C do 4 C. Hodowla prowadzona jest tak długo, aż tworzy się maksimum pożądanego produktu. Ten cel jest normalnie osiągany w ciągu 10 godzin do 160 godzin. [0196] Tak uzyskane buliony fermentacyjne mają zazwyczaj suchą masę 7, do 2 % wagowych. [0197] Korzystne jest ponadto także, gdy fermentacja jest prowadzona przynajmniej na końcu, w szczególności jednak przez przynajmniej 30% czasu trwania fermentacji przy ograniczeniu cukru. To znaczy, że w czasie tego czasu stężenie metabolizowalnego cukru w podłożu fermentacyjnym jest trzymane na poziomie 0 do 3 g/l, ewentualnie jest obniżane. Izolacja produktów biosyntetycznych z bulionu fermentacyjnego i/lub mikroorganizmów zachodzi w znany jako taki sposób odpowiadający właściwościom fizykochemicznym wartościowego produktu i biosyntetycznych produktów ubocznych. [0198] Bulion fermentacyjny może następnie być na przykład dalej obrabiany. W zależności od wymagań biomasa może być całkowicie lub częściowo usuwana z bulionu fermentacyjnego za pomocą metod rozdziału jak np. wirowanie, sączenie, dekantacja lub kombinacja tych metod lub całkowicie w nim zostawiona. [0199] Następnie bulion fermentacyjny można za pomocą znanych metod, np. za pomocą wyparki rotacyjnej, wyparki cienkowarstwowej, wyparki ze spływającą warstewką cieczy, przez odwrotną osmozę lub przez nanosączenie być zagęszczony lub zatężony. Ten zatężony bulion fermentacyjny może następnie być obrabiany przez liofilizację, suszenie rozpyłowe lub inne sposoby. [0200] Jest też możliwe by produkty biosyntetyczne, w szczególności L-lizyna, L- metionina i L-treonina, były dalej czyszczone. W tym celu bulion zawierający produkty po oddzieleniu biomasy jest poddawany chromatografii z odpowiednią żywicą, przy czym pożądany produkt lub zanieczyszczenia są całkowicie lub częściowo zatrzymywane na żywicy do chromatografii. Te etapy chromatografii mogą być w razie potrzeby powtórzone, gdzie są stosowane te same lub inne żywice do chromatografii. Specjalista zna wybór odpowiednich żywic do chromatografii i ich efektywne zastosowanie. Oczyszczony produkt może być zatężony przez sączenie lub ultrasączenie i przechowywany w temperaturze, w której stabilność produktu jest maksymalna. [0201] Produkty biosyntetyczne mogą występować w najróżniejszych postaciach, na przykład w postaci ich soli lub estrów. [0202] Identyczność i czystość izolowanego związku (związków) może być określona za pomocą technik stanu wiedzy. Obejmują one wysokowydajną chromatografię cieczową (HPLC), metody spektroskopowe, metody barwienia, chromatografię cienkowarstwową, NIRS, testy enzymatyczne lub testy mikrobiologiczne. Te metody analizy są zebrane łącznie
47 10 1 20 2 30 3 w: Patek i wsp. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova i wsp. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; i Schmidt i wsp. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) tom A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, str. 21-40, str. 40-47, str. 9-66, 7-81 i str. 81-87; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. i wsp. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, tom 17. [0203] Wynalazek będzie obecnie bliżej opisany na podstawie następujących nieograniczających przykładów: Przykład 1 Przygotowanie wektora pclikmcs [0204] Najpierw amplifikowano oporność na ampicylinę i początek replikacji wektora pbr322 ze starterami oligonukleotydowymi SEK NR ID : i SEK NR ID 6 za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). SEK NR ID : '-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACA G-3' SEK NR ID 6: '-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTC G-3' [020] Oprócz sekwencji komplementarnych do pbr322, starter oligonukleotydowy SEK NR ID zawiera w kierunku '-3' miejsca cięcia dla endonukleaz restrykcyjnych SmaI, BamHI, NheI i AscI i starter oligonukleotydowy SEK NR ID 6 zawiera w kierunku '-3' miejsca cięcia dla endonukleaz restrykcyjnych XbaI, XhoI, NotI i Dral. Reakcję PCR przeprowadzono metodą standardową według Innis i wsp. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) z polimerazą PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, USA). Uzyskany fragment DNA o wielkości około 2,1 kb oczyszczono za GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) według zaleceń producenta. Tępe końce fragmentu DNA zligowano ze sobą za pomocą Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) według zaleceń producenta i mieszaniną ligacyjną za pomocą metod standardowych jak opisano w Sambrook i wsp. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), transformowano kompetentne E.coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA).Selekcję komórek niosących plazmid przeprowadzono przez wysianie na płytki z agarem LB zawierającym ampicylinę (0µg/ml) (Lennox, 19, Virology, 1:190). [0206] Plazmidowy DNA pojedynczego klonu izolowano za pomocą Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) według zaleceń producenta i sprawdzono za pomocą trawienia enzymem restrykcyjnym. Tak uzyskany plazmid nazwano pclik1. [0207] Wychodząc z plazmidu pwlt1 (Liebl i wsp.,1992) jako matrycy dla reakcji PCR
48 10 1 20 2 30 3 amplifikowano kasetę oporności na kanamycynę za pomocą starterów oligonukleotydowych SEK NR ID:7 i SEK NR ID:8. SEK NR ID:7: '-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3' SEK NR ID:8 '-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3' [0208] Oprócz sekwencji komplementarnych do pwlt1, starter oligonukleotydowy SEK NR ID: 7 zawiera w kierunku '-3' miejsca cięcia dla endonukleaz restrykcyjnych XbaI, SmaI, BamHI, NheI i starter oligonukleotydowy SEK NR ID:8 zawiera w kierunku '-3' miejsca cięcia dla endonukleaz restrykcyjnych AscI i NheI. Reakcję PCR przeprowadzono standardową metodą według Innis i wsp. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) z polimerazą PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, USA). Uzyskany fragment DNA z wielkością około 1,3 kb oczyszczono za pomocą GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) według zaleceń producenta. Fragment DNA strawiono endonukleazami restrykcyjnymi XbaI i AscI (New England Biolabs, Beverly, USA) i następnie ponownie oczyszczono za pomocą GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) według zaleceń producenta. Wektor pclik1 także strawiono endonukleazami restrykcyjnymi XbaI i AscI i defosforylowano fosfatazą alkaliczną (1 (Roche Diagnostics, Mannheim)) według zaleceń producenta. Po elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym zlinearyzowany wektor (ok. 2,1 kb) izolowano zestawem GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) według zaleceń producenta. Ten fragment wektora ligowano za pomocą Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) według zaleceń producenta z przeciętym fragmentem PCR i mieszaniną ligacyjną według standardowych metod jak opisano w Sambrook i wsp. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)), transformowano kompetentne E.coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA). Selekcję na komórki niosące plazmid przeprowadzono przez wysianie na płytki z agarem LB zawierającym ampicylinę (0µg/ml) i kanamycynę (20µg/ml) r (Lennox, 19, Virology, 1:190). [0209] Plazmidowy DNA pojedynczego klonu izolowano za pomocą Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) według zaleceń producenta i sprawdzono za pomocą trawienia enzymem restrykcyjnym. Tak uzyskany plazmid nazwano pclik2. [0210] Wektor pclik2 strawiono endonukleazą restrykcyjną Dral (New England Biolabs, Beverly, USA). Po elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym fragment wektora o wielkości około 2,3 kb izolowano za pomocą GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) według zaleceń producenta. Ten fragment wektora ligowano za pomocą Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) według
49 10 1 20 2 30 3 zaleceń producenta i mieszaniną ligacyjną według standardowych metod jak opisano w Sambrook i wsp. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,(1989)), transformowano kompetentne E.coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA). Selekcję na komórki niosące plazmid przeprowadzono przez wysianie na płytki z agarem LB zawierającym ampicylinę (0µg/ml) i kanamycynę (20µg/ml) (Lennox, 19, Virology, 1:190). [0211] Plazmidowy DNA pojedynczego klonu izolowano za pomocą Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) według zaleceń producenta i sprawdzono za pomocą trawienia enzymem restrykcyjnym. Tak uzyskany plazmid nazwano pclik3. [0212] Wychodząc z plazmidu pwlq2 (Liebl i wsp., 1992) jako matrycy dla reakcji PCR amplifikowano ze starterami oligonukleotydowymi SEK NR ID:9 i SEK NR ID:10 początek replikacji phm119. SEK NR ID:9: '-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3' SEK NR ID:10: '-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3' [0213] Oprócz sekwencji komplementarnych do pwlq2, startery oligonukleotydowe SEK NR ID:9 i SEK NR ID :10 zawierają miejsce cięcia dla endonukleazy restrykcyjnej NotI. Reakcję PCR przeprowadzono standardową metodą według Innis i wsp. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) z polimerazą PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, USA). Uzyskany fragment DNA o wielkości około 2,7 kb oczyszczono za pomocą GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) według zaleceń producenta. Fragment DNA przecięto endonukleazą restrykcyjną NotI (New England Biolabs, Beverly, USA) następnie ponownie oczyszczono za pomocą GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) według zaleceń producenta. Wektor pclik3 także strawiono endonukleazą restrykcyjną NotI i defosforylowano fosfatazą alkaliczną (1 (Roche Diagnostics, Mannheim)) według zaleceń producenta. Po elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym zlinearyzowany wektor (ok. 2,3kb) izolowano za pomocą GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) według zaleceń producenta. Ten fragment wektora zligowano za pomocą Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) według zaleceń producenta z przeciętym fragmentem PCR i mieszaniną ligacyjną według standardowych metod jak opisano w Sambrook i wsp. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor(1989)), transformowano kompetentne E.coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA). Selekcję na komórki niosące plazmid przeprowadzono przez wysianie na płytki z agarem LB zawierającym kanamycynę (20µg/ml) (Lennox, 19, Virology, 1:190). [0214] Plazmidowy DNA pojedynczego klonu izolowano za pomocą Qiaprep Spin Miniprep
0 Kit (Qiagen, Hilden) według zaleceń producenta i sprawdzono za pomocą trawienia enzymem restrykcyjnym. Tak uzyskany plazmid nazwano pclik. [021] W celu wprowadzenia do pclik multiple cloning site" (MCS) oba syntetyczne, maksymalnie komplementarne oligonukleotydy SEK NR ID:11 i SEK NR ID:12, które zawierają miejsca cięcia dla endonukleaz restrykcyjnych Swal, XhoI, AatI, Apal, Asp718, MluI, NdeI, SpeI, EcoRV, SalI, ClaI, BamHI, XbaI i SmaI, przez podgrzanie razem do 9 C i powolne schłodzenie połączono do dwuniciowego fragmentu DNA. SEK NR ID:11: 10 SEK NR ID:12: 1 20 2 30 [0216] Wektor pclik strawiono endonukleazami restrykcyjnymi XhoI i BamHI (New England Biolabs, Beverly, USA) i defosforylowano fosfatazą alkaliczną (1 (Roche Diagnostics, Mannheim)) według zaleceń producenta. Po elektroforezie w 0,8% żelu agarozowym zlinearyzowany wektor (ok.,0 kb) izolowano za pomocą GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) według zaleceń producenta.ten fragment wektora zligowano za pomocą Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) według zaleceń producenta z syntetycznym dwuniciowym fragmentem DNA i mieszaniną ligacyjną według standardowych metod jak opisano w Sambrook i wsp. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor(1989)), transformowano kompetentne E.coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA). Selekcję na komórki niosące plazmid przeprowadzono przez wysianie na płytki z agarem LB zawierającym kanamycynę (20µg/ml) (Lennox, 19, Virology, 1:190). [0217] Plazmidowy DNA pojedynczego klonu izolowano za pomocą Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) według zaleceń producenta i sprawdzono za pomocą trawienia enzymem restrykcyjnym. Tak uzyskany plazmid nazwano pclikmcs. [0218] Reakcje sekwencjonowania prowadzono według Sanger i wsp. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:463-467. Reakcje sekwencjonowania rozdzielono i oceniono za pomocą ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt). [0219] Powstały plazmid pclikmcs jest podany jako SEK NR ID:13. Przykład 2 Przygotowanie plazmidu P EF-TS meta [0220] Chromosomalny DNA z C. glutamicum ATCC 13032 przygotowano według Tauch i
1 10 1 20 2 30 3 wsp. (199) Plasmid 33:168-179 lub Eikmanns i wsp. (1994) Microbiology 140:1817-1828. Za pomocą starterów oligonukleotydowych BK 1849 SEK NR ID 14 i BK 1862 SEK NR ID 1 33, chromosomalnego DNA jako matrycy i polimerazy Pfu Turbo (firma Stratagene) za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) według standardowych metod jak opisano w Innis i wsp. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, zamplifikowano gen meta, który koduje O-acylotransferazę homoseryny. BK 1849 SEK NR ID 14'- gtgtgtcgacttagatgtagaactcgatgtag -3' i BK 1862 SEK NR ID 1'-atgcccaccctcgcgcc -3' [0221] Uzyskany fragment DNA o wielkości ok. 1134 bp oczyszczono za pomocą GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) według zaleceń producenta. [0222] Za pomocą starterów oligonukleotydowych Haf 26 SEK NR ID 16 i Haf 27 SEK NR ID 17, chromosomalnego DNA jako matrycy i polimerazy Pfu Turbo (firma Stratagene) za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) według standardowych metod jak opisano w Innis i wsp. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press, zamplifikowano jednostkę ekspresji genu (SEK NR ID 2), który koduje czynnik elongacji TS. Haf 26 SEK NR ID 16'-gagaggatcccccccacgacaatggaac-3'i Haf 27 SEK NR ID 17'-cctgaaggcgcgagggtgggcattacggggcgatcctccttatg -3' [0223] Uzyskany fragment DNA o wielkości ok. 19 bp oczyszczono za pomocą GFX PCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) według zaleceń producenta. [0224] Startery Haf 27 i BK 1862 zawierają zachodzącą na siebie sekwencję i są homologiczne do siebie na swoich końcach. [022] Uzyskane powyżej produkty PCR zastosowano jako matryce do kolejnego PCR, w którym stosowano startery BK 1849 (SEK NR ID14) i Haf 26 (SEK NR ID16). [0226] W tej reakcji zamplifikowano fragment DNA, który odpowiadał oczekiwanej wielkości 1329 bp. Ta fuzja P EF-TS/metA została następnie sklonowana przez miejsca restrykcyjne BamH1 i Sall w wektorze pclik a MCS (SEK NR ID13). [0227] Fragment wektora ligowano razem z fragmentem PCR za pomocą Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) według zaleceń producenta i transformowano mieszaniną po ligacji za pomocą metod standardowych jak opisano w Sambrook i wsp. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), kompetentne E.coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA).Selekcję komórek niosących plazmid przeprowadzono przez wysianie na płytki z agarem LB zawierającym kanamycynę (20µg/ml) (Lennox, 19, Virology, 1:190). [0228] Przygotowanie plazmidowego DNA przeprowadzono metodami i z materiałami firmy Quiagen. Reakcje sekwencjonowania przeprowadzono według Sanger i wsp. (1977)
2 10 1 20 2 30 Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:463-467. Reakcje sekwencjonowania rozdzielono i oceniono za pomocą ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt). [0229] Powstały plazmid określono jako pclik a MCS P EF-TS meta (SEK NR ID18). Przykład 3 Aktywności MetA [0230] Szczep Corynebacterium glutamicum ATCC13032 transformowano plazmidami pcliks MCS, pclik MCS EF-TS meta według opisanej metody (Liebl, i wsp. (1989) FEMS Microbiology Letters 3:299-303). Mieszaninę po transformacji wysiano na płytki CM, które zawierały dodatkowo 20mg/l, kanamycyny aby uzyskać selekcję na komórki zawierające plazmidy. Pobrano oporne na kan klony i wysiano na pojedyncze kolonie. [0231] Szczepy C. glutamicum, które zawierały jeden z tych konstruktów plazmidowych hodowano w podłożu MMA ((40 g/l sacharozy, 20 g/l (NH 4 ) 2 SO 4, 1 g/l KH 2 PO 4, 1 g/l K 2 HPO 4, 0,2g/l MgSO 4 x 7H 2 O, 4 g Aces, 1 ml CaCl2 (10 g/l), 1 ml protokatechoanu (300 mg/10 ml), 1 ml roztworu pierwiastków śladowych (10 g/l FeSO 4 x /H 2 O,10 g/l MnSO 4 x H 2 O, 2 g/l ZnSO 4 x 7 H 2 O, 0,2 g/l CUSO 4, 0,02 g/l NiCl 2 x 6 H 2 O),100 µg/l witamina B 12, 0,3 mg/l tiamina, 1mM leucyna, 1 mg/l pirydoksal HCI, 1 ml biotyna (100 mg/l), ph 7,0) w 30 C przez noc. Komórki odwirowano w 4 C i przepłukano dwukrotnie zimnym buforem Tris-HCI (0,1 %, ph 8,0). Po ponownym wirowaniu komórki zawieszono w zimnym buforze Tris-HCI (0,1%, ph 8,0) i ustawiono OD 600 równe 160. W celu otwarcia komórek 1 ml tej zawiesiny komórek przeniesiono do 2 ml probówki do rybolizy firmy Hybaid i w Ribolyser firmy Hybaid przy ustawieniu rotacji 6,0 lizowano trzy razy po 30 sek. Lizat klarowano przez wirowanie przez 30 minut przy 1.000 rpm w 4 C wirówce Eppendorfa i supernatant przenoszono do nowej probówki Eppendorfa. Zawartość białka oznaczano według Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72:248-24. [0232] Pomiar aktywności enzymatycznej MetA przeprowadzono jak następuje. Próbki reakcyjne po 1 ml zawierały 100 mm bufor fosforan potasu (ph 7,), mm MgCl2, 100 µm Acetylo CoA, mm L-homoserynę, 00 µm DTNB (odczynnik Ellmana) i ekstrakt komórkowy. Test startowano przez dodatek odpowiedniego lizatu białkowego i inkubowano w temperaturze pokojowej. Następnie oznaczano kinetykę w 412 nm przez 10 min. [0233] Wyniki przedstawiono w Tabeli 4. Tabela 4 Szczep aktywność specyficzna [nmol/mg/min] ATCC 13032 pclikmcs 12,6 ATCC 13032 pclikmcs P EF-TS meta 2339,1
3 10 1 [0234] Aktywność MetA mogła być znacząco zwiększona przez zastosowanie heterologicznej jednostki ekspresyjnej P EF-TS. LISTA SEKWENCJI [023] <110> BASF Aktiengesellschaft <120> Jednostki ekspresyjne PEF-TS <130> 2004009 <160> 20 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 178 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> Promotor <222> (1)..(178) <223> <400> 1 20 2 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Jednostka ekspresyjna <400> 2 30 <210> 3 <211> 136
4 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (1)..(136) <223> <400> 3
<213> Corynebacterium glutamicum <400> 4
6
7 sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja
8 sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja
9 sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja Plazmid
60
61
sztuczna sekwencja 62
63 sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja Plazmid
64
6
66
67
68
69 LISTA SEKWENCJI [0236] Jednostki ekspresyjne PEF-TS
Jednostki ekspresyjne 70
71
72
73
74 sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja
7 sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja
76 sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja Plazmid
77
78
sztuczna sekwencja 79
80 sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja sztuczna sekwencja Plazmid
81
82
83