Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 3, str

PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2007, 38, Nr 3, str. 325 330 TOMASZ DZIECIĄTKOWSKI 1,2, MACIEJ PRZYBYLSKI 1,2, TIGRAN TOROSIAN 3, AGATA SULOWSKA 2, MIROSŁAW ŁUCZAK 1,2 ZakaŜenia cytomegalowirusem (HHV-5, CMV) u biorców allogenicznych przeszczepów komórek krwiotwórczych w Klinice Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych Akademii Medycznej w Warszawie w latach 2004 2006 Cytomegalovirus (HHV-5, CMV) infections in allogeneic hematopoietic stem cells recipients in Department of Hematology, Oncology and Internal Medicine, Medical University of Warsaw in years 2004 2006 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Akademia Medyczna w Warszawie Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Mirosław Łuczak 2 Zakład Mikrobiologii, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Mirosław Łuczak 3 Klinika Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych, Akademia Medyczna w Warszawie Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Wiesław Wiktor Jędrzejczak STRESZCZENIE ZakaŜenia ludzkim cytomegalowirusem są powszechne wśród osób z zaburzeniami odporności, zwłaszcza u biorców allogenicznych przeszczepów komórek krwiotwórczych. Wykrywanie wirusowego DNA jest podstawowym narzędziem diagnostycznym w wykrywaniu chorób o etiologii HHV-5. Zbadano grupę 52 pacjentów poddanych allogenicznym przeszczepom komórek krwiotwórczych, którzy mieli dodatni poziom przeciwciał anty-hhv-5 lub mieli dodatnich dawców. DNA cytomegalowirusa wykryto u 7 z badanych osób (13,5%). Wczesne rozpoznanie zakaŝenia za pomocą metod biologii molekularnej jest podstawą do rozpoczęcia skutecznego leczenia przeciwwirusowego. SŁOWA KLUCZOWE: Ludzki herpeswirus typu 5 Immunosupresja Allogeniczny przeszczep komórek krwiotwórczych SUMMARY Human herpesvirus type 5 (HHV-5, CMV) has been a major cause of morbidity and mortality after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Detection of its DNA in clinical specimens is considered a cornerstone in the diagnosis of cytomegalovirus disease. We studied 52 patients after allogeneic HSCT, who were HHV-5 seropositive or had HHV-5 seropositive donors. Viral DNA was detected in 7 of the 52 patients (13,5%). Early detection of cytomegalovirus infection with molecular biology methods is favorable for the efficacy of antiviral chemotherapy. KEY WORDS: Human herpesvirus 5 Immunosuppression Allogeneic hematopoietic stem cells transplantation

326 T. DZIECIĄTKOWSKI WSTĘP Ludzki herpeswirus typu 5 (Human Herpesvirus 5; HHV-5 znany powszechnie jako CMV) jest przedstawicielem podrodziny β-herpesvirinae o niezwykle szerokim rozpowszechnieniu w populacji (1). Stwierdzono, Ŝe ponad 60% osób w państwach rozwiniętych ma dodatni wynik przeciwciał anty-hhv-5 w klasie IgG, zaś w krajach Trzeciego Świata poziom ten wzrasta do prawie 95% (2). Po często bezobjawowym zakaŝeniu pierwotnym wirus ustala stan latencji w makrofagach oraz prawdopodobnie w subpopulacji CD8 + limfocytów T i w komórkach gruczołów wydzielania wewnętrznego (1). Nasilenie objawów klinicznych wynikających z reaktywacji ludzkiego cytomegalowirusa uzaleŝnione jest od wieku i stanu ogólnego pacjenta, wydolności układu odpornościowego oraz wieku, w którym pacjent przebył zakaŝenie pierwotne. Do najczęściej obserwowanych objawów zaliczane jest wirusowe zapalenie płuc, zespół mielosupresyjny, powikłania ze strony układu pokarmowego (3), nasilenie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) (2). ZakaŜenie HHV-5 jest takŝe czynnikiem ryzyka wtórnych zakaŝeń bakteryjnych i grzybiczych (4). Z tego teŝ powodu zakaŝenia HHV-5 stanowią istotny problem wśród pacjentów z niedoborami immunologicznymi (2). Przeszczep allogenicznych komórek krwiotwórczych jest postępowaniem z wyboru w leczeniu wielu chorób rozrostowych układu krwiotwórczego, chorób limfoproliferacyjnych, zespołów niewydolności szpiku i wrodzonych zespołów niedoboru odporności (5, 6) w przypadkach braku zgodnego dawcy spokrewnionego. NajpowaŜniejszym powikłaniem zabiegów przeszczepiania komórek krwiotwórczych pochodzących ze szpiku, zwłaszcza od dawców niespokrewnionych, są zakaŝenia wirusowe i grzybicze (7). UwaŜa się natomiast, Ŝe transplantacja komórek krwiotwórczych pochodzących z krwi pępowinowej związana jest z mniejszym ryzykiem zakaŝenia związanego z przeniesieniem wirusa drogą wszczepienną (zwłaszcza cytomegalowirusa i wirusa Epsteina-Barr) (8). CEL PRACY Celem pracy było określenie częstości występowania DNA ludzkiego cytomegalowirusa u pacjentów poddanych w latach 2004-2006 allogenicznym przeszczepom komórek krwiotwórczych wykonanych w Klinice Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych Akademii Medycznej w Warszawie. MATERIAŁY I METODY Przed przeprowadzeniem transplantacji w surowicy 52 pacjentów (33 męŝczyzn i 19 kobiet) i dawców oznaczano metodami serologicznymi poziom przeciwciał anty- HHV-5 w klasach IgM i IgG. 34 osoby były biorcami przeszczepu od dawcy spokrewnionego, 14 otrzymało przeszczep od dawcy niespokrewnionego, zaś 4 poddano transplantacji komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej.

ZakaŜenia cytomegalowirusem (HHV-5, CMV) 327 W okresie poprzeszczepowym do badań metodami biologii molekularnej w kierunku DNA cytomegalowirusa uŝyto 770 próbek krwi pełnej. Krew pełną do badań pobierano z uŝyciem wersenianiu potasu jako antykoagulantu, przez okres 1 18 miesięcy od przeszczepu w odstępach 7 10 dni, poczynając od drugiego dnia po transplantacji. Izolacji całkowitego DNA dokonywano z 200 µl krwi pełnej przy uŝyciu zestawu kolumienkowego DNA Mini Kit (Qiagen ), zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta. Do amplifikacji sekwencji cytomegalowirusa zastosowano reakcję PCR z uŝyciem starterów swoistych dla regionu MIE HHV-5 (9) w końcowej objętości 50 µl. Mieszanina reakcyjna w buforze PCR (20 mm Tris-HCl, ph 8,4, 50 mm KCl) zawierała 0,3 µm obu starterów, 3 mm MgCl 2, po 0,2 mm kaŝdego dntp, 1,25 U polimerazy Taq (Invitrogen ) oraz 10 µl wyizolowanego DNA. PCR obejmował 40 cykli składających się z: denaturacji - 2 min, przyłączania starterów w temp. 65 o C - 1,5 min i wydłuŝania łańcuchów - 1 min. Amplifikacja kończyła się elongacją nici DNA trwającą 10 min (9). Kontrolą dodatnią było DNA szczepu wzorcowego HHV-5 AD169, zaś ujemną stanowiło całkowite DNA niezakaŝonej ustalonej linii komórkowej HFFF-2. Wizualizacji dokonywano poprzez rozdział elektroforetyczny w 1% Ŝelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny w świetle UV. W próbkach dodatnich bądź wątpliwych oznaczano dodatkowo ilość kopii wirusa techniką real-time PCR na aparacie LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics ), uŝywając komercyjnego zestawu CMV LC PCR Kit firmy Artus jako testu potwierdzenia. Oznaczenia prowadzono w dwukrotnych powtórzeniach według zaleceń producenta. OMÓWIENIE WYNIKÓW W okresie przedprzeszczepowym nie stwierdzono przeciwciał w klasie IgM skierowanych przeciwko HHV-5 u Ŝadnego badanego dawcy ani pacjenta. Swoiste przeciwciała klasy IgG wykryto natomiast u 40 biorców (77%) i 39 dawców (75%). Podczas badań technikami biologii molekularnej obecność specyficznych sekwencji cytomegalowirusa stwierdzono ogółem u 7 pacjentów (13,5%), którzy poddani byli transplantacji komórek krwiotwórczych w latach 2004 2006 (Tabela 1). Dwóch spośród nich było biorcami komórek krwiotwórczych pochodzących z krwi pępowinowej, u dwóch innych przeszczep pochodził od dawcy spokrewnionego, a u trzech pozostałych od dawcy niespokrewnionego. Po porównaniu markerów serologicznych zakaŝenia HHV-5 dawcy i biorcy stwierdzono, iŝ w 6 przypadkach (86%) zakaŝenie miało charakter reaktywacji endogennego wirusa ze stanu latencji pod wpływem zastosowanej terapii immunosupresyjnej. Etiologia pozostałego jednego przypadku, gdzie wykryto przeciwciała anty-hhv-5 zarówno u pacjenta i dawcy, nie była jasna i wymagałaby szczegółowej analizy sekwencji badanego wirusa. Badany za pomocą metody real-time PCR poziom wiremii u większości osób wynosił zazwyczaj ok. 1200 1700 kopii/ml krwi, choć sporadycznie osiągał wartości powyŝej 6500 (u 3 badanych) Tabela 2. DNA HHV-5 stwierdzano najczęściej

328 T. DZIECIĄTKOWSKI w pierwszym półroczu po transplantacji (od 45 do 130 dnia), rzadziej w okresie późniejszym. Wiremia na poziomie wykrywalnym technikami biologii molekularnej utrzymywała się przez okres 3 5 tygodni. Tabela 1. Częstość występowania zakaŝeń HHV-5 u pacjentów po allogenicznych przeszczepach komórek krwiotwórczych Table 1. Incidence of HHV-5 infections in allogeneic hematopoietic stem cells recipients Rok Ilość pacjentów Liczba pacjentów dodatnich Procent pacjentów dodatnich 2004 12 1 8,3% 2005 20 3 15% 2006 20 3 15% Razem 52 7 13,5% Tabela 2. Poziom cytomegalowirusowego DNA stwierdzany u pacjentów po alogenicznych przeszczepach komórek krwiotwórczych Table 2. HHV-5 viral loads in patients after allogeneic HSCT Rok Minimalna stwierdzona ilość kopii HHV-5 (kopie/ml krwi) Maksymalna stwierdzona ilość kopii HHV-5 (kopie/ml krwi) Średnia ilość kopii (kopie/ml krwi) 2004 400 1300 1300 2005 400 15800 1750 2006 600 6700 1450 Aktywne zakaŝenie wirusem cytomegalii u większości pacjentów przebiegało zazwyczaj bez wyraźnie zaznaczonych objawów klinicznych tylko u dwóch osób stwierdzono pełnoobjawową chorobę cytomegalowirusową rozpoznawaną według kryteriów opisanych przez Ljungmana et al. (10), przebiegającą z zapaleniem płuc o prawdopodobnej etiologii HHV-5, zaś u jednej z nich nastąpiło dodatkowo zaostrzenie choroby przeszczep przeciw gospodarzowi (GvHD). U jednego z pacjentów wykryto jednocześnie w badaniu PCR sekwencje charakterystyczne dla wirusa Epsteina- Barr, a w badaniu retrospektywnym u innej osoby współistniejące krótkotrwałe zaka- Ŝenie ludzkim herpeswirusem typu 6 (HHV-6). DYSKUSJA ZakaŜenia herpeswirusem typu 5 pozostają jedną z głównych przyczyn zgonów u pacjentów z immunosupresją (11). Ryzyko wystąpienia pełnoobjawowej choroby cytomegalowirusowej zaleŝne jest wówczas od statusu immunologicznego dawcy i biorcy, rodzaju przeszczepu oraz typu zastosowanej immunosupresji. U biorców allogenicznych przeszczepów komórek krwiotwórczych wynosi ono od 15 do 80% (12). Zobserwowana wśród pacjentów Kliniki Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych Akademii Medycznej w Warszawie częstotliwość wykrywania wirusowego DNA naleŝy więc do wyjątkowo niskich (Tabela 1).

ZakaŜenia cytomegalowirusem (HHV-5, CMV) 329 Częstotliwość ta ma prawdopodobny związek z rutynowym uŝyciem w diagnostyce poprzeszczepowej czułych metod biologii molekularnej, a zwłaszcza real-time PCR. Czułość testów real-time PCR gwarantuje wykrycie wirusa przy niskiej liczbie kopii (13), co umoŝliwia wczesne zastosowanie odpowiedniego leczenia przeciwwirusowego. Skuteczność chemioterapii zaleŝy w duŝej mierze od poziomu replikacji wirusa we krwi (14) i spada wraz z upływem czasu od początku zakaŝenia. Stosowana rutynowo terapia gancyklowirem, prócz swego działania mielotoksycznego, coraz częściej nie przynosi poŝądanych rezultatów ze względu na rosnący odsetek szczepów HHV-5 opornych na ten lek (15), jednak nadal jest terapią z wyboru w tzw. leczeniu wyprzedzającym (pre-emptive strategy). Wstępne leczenie powinno trwać minimum 2 tygodnie, dopiero po tym czasie moŝna rozwaŝać oporność wirusa na stosowany preparat. Lekiem równowaŝnym w leczeniu wyprzedzającym u pacjentów z reaktywacją zaka- Ŝenia HHV-5 po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych jest foskarnet, który choć powoduje wolniejsze narastanie oporności i ma mniejszą mielotoksyczność, niesie za sobą zwiększone ryzyko nefrotoksyczności (15). Istotne jest więc jak najszybsze ograniczenie podawanych dawek w miarę spadku liczby wykrywanych kopii wirusa. Uwzględniając jednak częstość reaktywacji HHV-5 u pacjentów po przeszczepieniach oraz potencjalne koszty leczenia, wskazane jest opracowanie skutecznej metody biologii molekularnej do wykrywania mutacji cytomegalowirusa warunkujących oporność na stosowane obecnie analogi nukleozydów. WNIOSKI 1. Testy biologii molekularnej są uŝytecznym narzędziem do wykrywania zaka- Ŝeń o etiologii cytomegalowirusowej u osób z upośledzoną odpornością. Metody ilościowego PCR umoŝliwiają wczesne wykrycie zakaŝenia i odpowiednie zastosowanie leczenia wyprzedzającego (pre-emptive therapy). 2. Ze względu na rozpowszechnienie HHV-5 w populacji i potencjalne ryzyko dla pacjentów poddanych immunosupresji wskazane jest ciągłe monitorowanie cytomegalowirusa w tej grupie chorych. 3. Obserwowane równoczesne zakaŝenia pozostałymi herpeswirusami mogą wskazywać na istniejące pomiędzy nimi oddziaływania synergistyczne. PIŚMIENNICTWO 1. Minson A C, Davison A, Eberle R et al: Rozdział: Herpesviruses; w Virus taxonomy clasification and nomenclature of viruses. Seventh report of ICTV. Red. Van Regenmortel MHV, Faquet CM, Bishop DHL. Wyd: Academic Press, San Diego 2000; 203-225. 2. Griffiths PD, Clark DA, Emery VC: Betaherpesviruses in transplant recipients. J Microb Chem 2000; 45: 29-34 3. Torok-Storb B, Boeckh M, Hoy C, Leisenring W, Myerson D, Gooley T: Association of specific cytomegalovirus genotypes with death from myelosuppression after marrow transplantation. Blood 1997; 90: 2097-2102.

330 T. DZIECIĄTKOWSKI 4. George MJ, Snydman DR, Werner BG, Griffith J, Falagas ME, Dougherty NN: The independent role of cytomegalovirus as a risk factor for invasive fungal disease in orthotopic liver transplant recipients. Am J Med 1997; 103: 106-113. 5. Niederwieser D: Rozdział: Chronic disorders; w Haemopoetic stem cell transplantation. The EBMT Handbook 2004. Red. Apperley J, Carreras E, Gluckman E, Gratwohl A, Masszi T. Wyd: Forum Service Editore, Genoa 2004; 257-268. 6. Ljungman P, Urbano-Ispizua A, Cavazzana-Calvo M at al: Allogeneic and autologous transplantation for haematological disaeses, solid tumours and immune disorders: definitions and current practice in Europe. Bone Marrow Transplant 2006; 37: 439-449. 7. Parody R, Martino R, Rovira M et al: Severe infections after unrelated donor allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in adults: comparison of cord blood transplantation with peripheral blood and bone marrow transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 2006; 12: 734-748. 8. Tse W, Laughlin MJ: Umbilical cord blood transplantation: a new alternative option. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2005, 377-383. 9. Demmler GJ, Buffone GJ, Schimbor CM, May RA: Detection of cytomegalovirus in urine from newborns by using polymerase chain reaction DNA amplification. J Infect Dis 1988; 185: 1177-1184. 10. Ljungman P, Griffiths P, Paya C: Definitions of cytomegalovirus infection and disease in transplant recipients. Clin Infect Dis 2002; 34: 1094-1097. 11. Hebart H, Jahn G, Sinzger Ch, Kanz L, Hermann Einsele H: CMV Infection in Bone Marrow and Solid Organ Transplant Patients in the Era of Antiviral Prophylaxis. Herpes 2000; 7: 13-17. 12. Ng AP, Worth L, Chen L et al: Cytomegalovirus DNAemia and disease: incidence, natural history and management in settings other than allogeneic stem cell transplantation. Haematologica 2005; 90, 1672-1679. 13. Schaade L, Knockelkorn P, Ritter K, Kleines M: Detection of Cytomegalovirus DNA in Human Specimens by LightCycler PCR. J Clin Microb 2000; 38: 4006-4009. 14. Emery VC: Investigation of CMV disease in immunocompromised patients. J Clin Pathol 2001; 54: 84-88. 15. Reusser P, Einsele H, Lee J et al: Randomized multicenter trial of foscarnet versus ganciclovir for preemptive therapy of cytomegalovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. Blood 2002; 99: 1159-1164. Praca wpłynęła do Redakcji 1.06.2007 r. i została zakwalifikowana do druku 18.09.2007 r. Adres do korespondencji: dr n. wet. Tomasz Dzieciątkowski Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Akademia Medyczna w Warszawie ul. Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa fax: 022 599 17 78 e-mail: dzieciatkowski@wp.pl