Załącznik nr 2 do wniosku o przeprowadzenie postępowania habilitacyjnego AUTOREFERAT PRZEDSTAWIAJĄCY OPIS DOROBKU NAUKOWEGO I OSIĄGNIĘĆ NAUKOWYCH, ZE SZCZEGÓLNYM UWZGLĘDNIENIEM OSIĄGNIĘCIA OKREŚLONEGO W ART. 16 UST. 2 Z DNIA 14 MARCA 2003 R. O STOPNIACH NAUKOWYCH I TYTULE NAUKOWYM ORAZ O STOPNIACH I TYTULE W ZAKRESIE SZTUKI dr inż. Justyna Rosicka-Kaczmarek Politechnika Łódzka Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności Instytut Technologii i Analizy Żywności Łódź 2018
1. Dane osobowe Imię i nazwisko: Justyna Rosicka-Kaczmarek (z domu Rosicka) Adres zamieszkania: ul. Gałczyńskiego 27a/100, 95-100 Zgierz Miejsce pracy: Politechnika Łódzka Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności Instytut Technologii i Analizy Żywności ul. Stefanowskiego 4/10, 90-924 Łódź tel. +48 42 631 27 75 e-mail: justyna.rosicka-kaczmarek@p.lodz.pl Data i miejsce urodzenia: 27 kwietnia 1972, Żary 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej 2.1. Stopień: doktor nauk technicznych uzyskany w specjalności technologia chemiczna Miejsce: Politechnika Łódzka, Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Łódź 2003 Tytuł rozprawy: Rozpad kompleksu amylozowo-lipidowego w procesie enzymatycznej hydrolizy skrobi pszennej. Promotor: prof. dr hab. inż. Ewa Nebesny Recenzenci: prof. dr hab. Teresa Fortuna, prof. dr hab. Wacław Leszczyński 2.2. Tytuł: magistra inżyniera nauk technicznych w specjalności technologia chemiczna Miejsce: Politechnika Łódzka, Wydział Chemii Spożywczej i Biotechnologii (obecnie Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności), Łódź 1996. Tytuł pracy magisterskiej: Enzymatyczna hydroliza skrobi pszennej i kukurydzianej w celu otrzymania syropów skrobiowych Promotor: prof. dr hab. inż. Ewa Nebesny 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/ artystycznych 3.1. Od 01.09. 2006r. do chwili obecnej: adiunkt w Instytucie Chemicznej Technologii Żywności (od października 2015r. zmieniony na Instytut Technologii i Analizy Żywności) na Wydziale Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej. 3.2. w latach 2005-2006 na stanowisku asystenta w Instytucie Chemicznej Technologii Żywności (obecnie Instytut Technologii i Analizy Żywności) na Wydziale Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej. 2
3.3. w latach 2003-2005 na stanowisku pracownika inżynieryjno-technicznego w Instytucie Chemicznej Technologii Żywności (obecnie Instytut Technologii i Analizy Żywności) na Wydziale Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej. 4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. 2016 r. poz. 882 ze zm. w Dz. U. z 2016 r. poz. 1311.): a) tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego Wpływ nieskrobiowych składników na właściwości skrobi pszennej oraz jej enzymatycznych hydrolizatów b) Podstawę ubiegania się o stopień doktora habilitowanego stanowi cykl 5 oryginalnych publikacji oraz rozdziału w monografii o zasięgu międzynarodowym, opublikowanych w latach 2013 2018. 1. Rosicka-Kaczmarek J., Kwaśniewska-Karolak I., Nebesny E., Komisarczyk A.: The functionality of wheat starch, in: Starch in Food. Structure, Function and Applications. A volume in Woodhead Publishing in Food Science and Technology & CRC Press, Cambridge, England, 2018, 325-352 (second edition). (IF brak, MNiSW = 7 pkt.; liczba cytowań wg.: Web of Science = 0, Scopus = 0) Mój udział w pracy 85 %. 2. Rosicka-Kaczmarek J., Makowski B., Nebesny E., Tkaczyk M., Komisarczyk A., Nita Z.: Composition and thermodynamic properties of starches from facultative wheat varieties. Food Hydrocolloids, 2016, 54, 66-76. (IF = 4,747*; 5,459**, MNiSW = 45 pkt.; liczba cytowań wg.: Web of Science = 6, Scopus = 6) Mój udział w pracy 80%. 3. Rosicka-Kaczmarek J., Tkaczyk M., Makowski B., Komisarczyk A., Nebesny E.: The influence of non - starch polysaccharides (arabinoxylans) on thermodynamic properties of starches from facultative wheat varieties. European Food Research and Technology 2017, 243, 12, 2243-2253. 3
(IF = 1,919*; 1,940**, MNiSW = 30 pkt.; liczba cytowań wg.: Web of Science = 0, Scopus = 0) Mój udział w pracy 80%. 4. Rosicka-Kaczmarek J., Kwaśniewska-Karolak I., Nebesny E., Miśkiewicz K.: Influence of variety and year of wheat cultivation on the chemical composition of starch and properties of glucose hydrolysates. Journal of Cereal Science, 2013, 57, 98-106. (IF = 1,943*; 2,712**, MNiSW = 35 pkt.; liczba cytowań wg.: Web of Science = 7, Scopus = 7) Mój udział w pracy 85 %. 5. Kwaśniewska-Karolak I., Rosicka-Kaczmarek J., Nebesny E., Stasiuk M.: Noncarbohydrate components on the surface of starch granules according to the hardness of wheat. Food and Nutrition Sciences, 2015, 6, 112-123. (MNiSW = 15 pkt., liczba cytowań wg.: Web of Science =brak w bazie, Scopus =brak w bazie) Mój udział w pracy 60 %. 6. Rosicka-Kaczmarek J., Stasiuk M., Nebesny E., Komisarczyk A.: Fluorimetric studies of the interactions of wheat puroindolines with polar lipids on the surface starch granules. Journal of Cereal Science, 2015, 56, 53-58. (IF = 2,402*; 2,699**; MNiSW = 35 pkt.; liczba cytowań wg.: Web of Science = 2, Scopus = 2) Mój udział w pracy 80 %. Całkowita punktacja MNiSW: 167* pkt. Całkowity IF: 11,011*; 12,810** Impact factor (IF)* dotyczy roku wydania pracy; Impact factor (IF)**pięcioletni, zgodnie z aktualnymi danymi w bazie Journal Citation Reports, punktację MNiSW podano zgodnie z wykazem z roku wydania publikacji. Liczba cytowań z dnia 28.09.2018. Oświadczenia współautorów prac wraz z określeniem wkładu każdego z nich w powstanie poszczególnych prac znajdują się w załączniku 4. 4
5. Przedstawienie celu naukowego i uzyskanych wyników badań zawartych w serii publikacji stanowiących osiągnięcie naukowe zatytułowane: Wpływ nieskrobiowych składników na właściwości skrobi pszennej oraz jej enzymatycznych hydrolizatów 5.1 Wprowadzenie Skrobia jako węglowodan zapasowy wielu roślin jest tanim, rokrocznie odnawialnym surowcem dla wielu dziedzin gospodarki. Obok tradycyjnego wykorzystania skrobi do celów spożywczych, ma ona coraz szersze zastosowanie w procesach nowoczesnej biotechnologii i chemii (Shevkani i wsp., 2017). Skład chemiczny skrobi i jej właściwości fizyczne kształtują się różnie, w zależności od jej pochodzenia i są dość znacznie zróżnicowane. Wyróżniono trzy grupy skrobi o zbliżonych cechach. Pierwsza obejmuje skrobie zbożowe (kukurydzianą, pszenną, ryżową). Drugą grupę stanowią skrobie izolowane z bulw (ziemniaczana) i korzeni (tapiokowa, batatowa). Trzecia grupa, to skrobie woskowe (z kukurydzy, sorgo i ryżu) (Swinkels, 1985). Skrobia jest głównym węglowodanem zapasowym w ziarnie pszenicy. Stanowi około 70-80% suchej masy mąki. Jest ważnym surowcem, znajdującym zastosowanie w przemyśle spożywczym, papierniczym, włókienniczym, chemicznym i farmaceutycznym. Między innymi, jako substancja zagęszczająca, stabilizująca, pochłaniająca wodę i wypełniająca (Farmakis i wsp., 2007, Lu i wsp., 2009; Maningat i wsp., 2009, Basiak i wsp., 2015; Blake i wsp., 2015; Shevkani i Singh, 2015; Wang i wsp., 2015; Shevkani i wsp., 2017). Polisacharyd ten, odgrywa ważną rolę w kształtowaniu właściwości fizykochemicznych produktu, w którym występuje, wpływając jednocześnie na jego jakość. Większość cech funkcjonalnych skrobi może być wynikiem jej interakcji z wodą podczas kleikowania i retrogradacji (interakcje te są zależne od temperatury). Zachowanie ziarenek skrobi w różnych przedziałach temperaturowych zależy od jej pochodzenia i właściwości fizykochemicznych, tj. ich wielkości i kształtu, zawartości amylozy i amylopektyny, stopnia polimeryzacji amylopektyny, długości rozgałęzień, stopnia krystaliczności (Shevkani i wsp., 2017). Ponadto, kierunek tych zachowań w dużym stopniu wynika ze składu chemicznego, 5
zarówno powierzchni, jak i wnętrza, ziarenek skrobi. Do grupy tych składników należą zarówno składniki niewęglowodanowe, tj. lipidy (w tym wolne i w postaci kompleksu z amylozą AML) i białka, jak również węglowodanowe/nieskrobiowe, tj. pentozany (arabinoksylany) (Shevkani i wsp., 2017; Brites i wsp., 2008; Baldwin, 2001). Skład chemiczny skrobi, jednego z głównych składników mąki otrzymywanej z pszenicy zależy zarówno od czynników genetycznych (tj. odmiany zboża), jak i środowiskowych (klimat, gleba, nawożenie i zabiegi agrotechniczne, temperatura w czasie wzrostu i kwitnienia pszenicy, nasłonecznienia, daty siewu, intensywności opadów) (Tester i wsp., 1995; Zeng i wsp.,1997; Wootton i wsp., 1998; Matsuki i wsp., 2003; Thitisaksakul i wsp., 2012; Yu i wsp., 2015; Minh i Copeland, 2016; 2017 ). Decyduje on w istotnym stopniu, oprócz takich czynników jak, wielkość granul skrobi, zawartość amylozy, struktura i krystaliczność amylopektyny, o zdolności skrobi, izolowanych z różnych typów i odmian pszenicy, do pęcznienia, kleikowania, retrogradacji, czy podatności na strawność (Shevkani i wsp., 2017). Jednakże, zarówno na podstawie doniesień literatury naukowej, jak również własnych wyników badań, wskazuje się genotyp pszenicy, jako ten czynnik który, odgrywa bardziej znaczącą rolę w kształtowaniu zarówno składu chemicznego granul skrobi, jak i wynikających z niego w dużym stopniu właściwości funkcjonalnych skrobi (Kwaśniewska- Karolak i wsp., 2008; 2010; Shevkani i wsp., 2017). Warunki pogodowe panujące w czasie wzrostu i dojrzewania rośliny mają również duży wpływ na wielkość i ilość syntetyzowanych ziarenek skrobi. Różnice temperatur, to jest zarówno jej wzrost, jak i obniżenie, są przyczyną zmniejszania rozmiaru i ilości ziarenek skrobiowych w bielmie zbóż pszenicy (Park i wsp., 2009; Yu i wsp., 2015). Podwyższona temperatura podczas wzrostu pszenicy powoduje spadek ilości małych ziarenek typu B, przy jednoczesnym wzroście ilości dużych ziarenek typu A (MacLeod i Duffus, 1988; Tester i wsp., 1991). Z wielkością ziarenek skrobi ściśle związany jest ich skład chemiczny, zarówno ten na powierzchni, jak i we wnętrzu ziarenek, jak również ich właściwości funkcjonalne. Należą do nich reaktywność chemiczna oraz podatność na rozpad pod wpływem enzymów amylolitycznych. Małe ziarenka skrobi tupu B zawierają więcej związków lipidowych i fosforu, co powoduje m.in., że charakteryzują się wyższą temperaturą kleikowania (więcej kompleksów amylozowo lipidowych AML utrudniających wnikanie cząsteczek wody do ziarenek), są bardziej oporne na działanie czynników zewnętrznych i mniej skłonne do przekształceń, w zależności od zastosowanych warunków procesu technologicznego (Lindeboom i wsp., 2004; Kim i Huber, 2010; Tao i wsp., 2016). 6
Na ilość i wielkość syntetyzowanych granul skrobi w surowcu roślinnym, tj. w pszenicy wpływa również twardość jej ziarna, która jest determinowana zarówno przez czynnik genetyczny, jak również warunki środowiskowe. I tak na przykład skrobia izolowana z ziarna twardych odmian pszenicy zawiera więcej małych granul skrobi typu B i mniej większych granul typu A, w porównaniu do skrobi izolowanej z ziarna miękkich odmian pszenicy (Shevkani i wsp. 2017; Singh i wsp., 2016). Zmiany składu chemicznego powierzchni ziarenek skrobi ściśle wiążą się ze stopniem ich uszkodzenia, który jest uzależniony od twardości ziarna pszenicy, w zależności od jej odmiany. Ponadto przy różnym stopniu uszkodzenia skrobi możemy otrzymać różny stosunek lipidów powierzchniowych do wewnętrznych (co wiąże się z ilością kompleksu AML w takiej skrobi) i również białek powierzchniowych z grupy SGAPs (friabiliny/puroindoliny). Będzie to miało swoje odzwierciedlenie w podatności ziarenek skrobi na warunki hydrolizy w procesie enzymatycznej reakcji otrzymywania hydrolizatów glukozowych. Brites i wsp. (2008) wykazali również wpływ twardości ziarna pszenicy na właściwości termiczne granul skrobi oraz na istnienie istotnej negatywnej korelacji między tymi wielkościami. Jednym z kierunków wykorzystania skrobi jest wytwarzanie enzymatycznych hydrolizatów glukozowych, obok szerokiej gamy innych produktów jej hydrolizy. Należy w tym miejscu wymienić maltodekstryny, syropy skrobiowe i glukozowo-fruktozowe (Cornel, 2004). Surowcem do ich wytwarzania jest skrobia różnego pochodzenia, głównie kukurydziana, ziemniaczana i pszenna. Różnice występujące w zawartości białka, lipidów i nieskrobiowych polisacharydów w surowcu skrobiowym poddawanym hydrolizie, w zależności od jego pochodzenia, mają duży wpływ na technologię otrzymywania i jakość hydrolizatów. Porównując technologię produkcji hydrolizatów z różnych surowców, należy stwierdzić, że odmienny skład chemiczny skrobi pszennej, a szczególnie obecność większej ilości lizofosfolipidów, tworzących kompleksy żelujące z amylozą, a także obecność nieskrobiowych polisacharydów (arabinoksylanów/pentozanów) oraz zwiększonej ilości białka, w tym również na powierzchni ziarenek skrobi, wpływają niekorzystnie na właściwości fizykochemiczne uzyskiwanych z niej enzymatycznych hydrolizatów. Ponadto obniżają one wydajność procesu technologicznego, pogarszając zdolności filtracyjne hydrolizatów glukozowych. Z pochodzeniem skrobi ściśle związana jest ilość w niej składników lipidowych. Najmniejszą ich ilość zawiera skrobia ziemniaczana, tj. 0,09%, natomiast skrobia kukurydziana zawiera około 0,87% lipidów, w tym 17% stanowi udział lecytyny. Skrobia pszenna zawiera około 1% lipidów, głównie w postaci lizofosfolipidów (LPL), z których 7
największą część stanowi lizofosfatydylocholina (LPC). Ilość jej dochodzi nawet do 70-90% ogólnej ilości lipidów w skrobi (Finnie i wsp., 2010, Pareyt i wsp., 2011). W naturalnej skrobi pszennej amyloza występuje przypuszczalnie w dwóch postaciach amorficznych, jako pozbawiona lipidów (FAM lipid free amylose) oraz połączona z lipidem (AML lipid complexed amylose), gdzie polisacharyd tworzy pojedynczy spiralny lipidowy związek włączeniowy (Putseys i wsp., 2010). Lipidy skrobiowe tworząc kompleksy z amylozą wpływają na szereg fizykochemicznych właściwości skrobi. W procesie enzymatycznej hydrolizy skrobi pszennej do glukozy kompleksy amylozowo-lipidowe wpływają niekorzystnie na właściwości otrzymywanych hydrolizatów, tj. utrudniają proces ich filtracji, powodując tym samym zmniejszenie wydajności w procesie produkcji hydrolizatów, pogarszają ich barwę, przezroczystość oraz zapach. Kompleksy AML obniżają stopień pęcznienia ziarenek skrobi, utrudniając tym samym dostęp do nich enzymom amylolitycznym, co powoduje niższy stopień scukrzenia hydrolizatów. Ponadto lizofosfolipidy, ze względu na to, że zawierają w swej cząsteczce jedną resztę kwasu tłuszczowego mogą tworzyć micelle, które z kolei mogą zatykać pory filtrów w czasie filtracji hydrolizatów otrzymanych ze skrobi pszennej i powodować zmniejszenie wydajności w procesie technologicznym produkcji hydrolizatów glukozowych (Bowler 1985; Konieczny- Janda,1991; Matser i Steeneken, 1998a; 1998b). W odróżnieniu od skrobi ziemniaczanej i kukurydzianej, skład chemiczny skrobi pszennej charakteryzuje obecność nieskrobiowych polisacharydów. Należą do nich głównie pentozany polimery -1,4 ksylozy z rozgałęzieniami -1,3 arabinozy. W procesie wymywania skrobi pszennej z mąki część pentozanów (arabinoksylanów) może być adsorbowana na powierzchni jej ziarenek i podczas ich enzymatycznej hydrolizy może ujemnie wpływać na wydajność i jakość uzyskiwanych hydrolizatów glukozowych. Obserwować to można, między innymi przez obniżanie stopnia ich scukrzenia i szybkości filtracji. W literaturze naukowej znajdują się doniesienia wskazujące na negatywny wpływ obecności pentozanów na ograniczanie prędkości filtracji hydrolizatów otrzymywanych ze skrobi pszennej (Bowler i wsp., 1985; Pomeranz, 1988; Słomińska, 1997; Słomińska i Garbacik, 2002, Nebesny i wsp., 2005a). Za zdolności filtracyjne hydrolizatów głównie odpowiedzialna jest frakcja pentozanów rozpuszczalnych w wodzie WEAX. Frakcja WEAX posiada większą zdolność absorbowania wody, niż frakcja nierozpuszczalna w wodzie WUAX. Dlatego jej wodne roztwory wykazują większą lepkość i tendencję do tworzenia galaretowatych osadów, nawet przy małym stężeniu, zapychających pory filtrów w procesie oczyszczania hydrolizatów glukozowych. Ponadto frakcja ta jest bardziej reaktywna i może 8
tworzyć kompleksy z rozpuszczalną frakcją skrobi i białkami. Związki te stają się wówczas niedostępne dla enzymów amylolitycznych, co negatywnie wpływa na kleikowanie ziarenek skrobi i obniża jakość uzyskiwanych produktów enzymatycznej hydrolizy skrobi ( Konieczny-Janda i Richter, 1991; Nebesny i wsp., 2005a). Skrobia ziemniaczana charakteryzuje się najmniejszą ilością białka (0,06%), natomiast kilkakrotnie większą zawartość białka wykazują skrobie kukurydziana (0,35%) oraz skrobia pszenna (0,40%). Duża zawartość białka w skrobi pszennej jest niekorzystna pod wieloma względami, tj. tworzenia się nadmiernej ilości piany w zawiesinie skrobi, możliwości zajścia reakcji Maillarda, wpływającej ujemnie na barwę hydrolizatów i na ich zapach (nieprzyjemny, mączny), który przy długim przechowywaniu nasila się w wyniku psucia i rozkładu białek. Mimo tego, że białka i lipidy występują w niewielkich ilościach w skrobi pszennej, to ich obecność istotnie wpływa na właściwości samych ziarenek skrobi oraz otrzymywanych z jej udziałem produktów. Białka (friabiliny/puroindoliny) i lipidy, które mogą występować również na powierzchni granul skrobi znacząco wpływają na charakterystykę jej kleikowania (Han i Hamaker, 2002). Lipidy nieskrobiowe (tzw. free lipids) mogą modyfikować właściwości skrobi, a powierzchniowe, po adsorpcji na powierzchni węglowodanowej, mogą łączyć się w kompleksy z amylozą i modyfikować jej właściwości, szczególnie zdolność chłonięcia wody i podatność na działanie enzymów amylolitycznych (Morrison, 1981;1995). Literatura naukowa podaje, iż zdolność puroindolin do oddziaływania z lipidami może kształtować właściwości mąki i właściwości otrzymywanych z niej wyrobów piekarskich, poprzez produkcję stabilnych pian i właściwą ekspansję gazów w ciastach (Brites i wsp., 2008). Na tej podstawie można więc przypuszczać, iż wzajemne interakcje friabilin/puroindolin i lipidów na powierzchni ziarenek skrobi pszennej mogą mieć istotny wpływ na podatność skrobi pszennej na warunki procesu kleikowania i enzymatycznej hydrolizy. Może to mieć swoje odzwierciedlenie we właściwościach otrzymywanych enzymatycznych hydrolizatów glukozowych, tj. zdolności filtracji, stopniu scukrzenia, barwie i przezroczystości. W literaturze naukowej brak jest danych dotyczących tego zagadnienia. 5.2. Cel badań Określenie współzależności między twardością ziarna pszenicy, składem i ilością składników niewęglowodanowych, tj. lipidów polarnych i frakcji friabilin/puroindolin oraz składników nieskrobiowych (pentozanów/arabinoksylanów) adsorbowanych na powierzchni izolowanych wodą ziarenek skrobi z mąki oraz sposobem oddziaływania tych składników 9
z powierzchnią granul, jest zagadnieniem nie do końca poznanym. Prowadzone w tym kierunku badania i uzyskane wyniki, będą stanowiły uzupełnienie literatury naukowej, zarówno o zasięgu krajowym, jak i światowym, niosąc ze sobą duży potencjał zarówno poznawczy, jak i aplikacyjny. Dane literatury naukowej wskazują na niejednoznaczność i wielokierunkowość oddziaływań wymienionych składników ziarenek skrobi pszennej z ich powierzchnią. Fakt ten, jednocześnie ma swoje odzwierciedlenie w kształtowaniu zmiennych właściwości fizykochemicznych skrobi. Decydują one o kierunkach przeznaczenia skrobi i podatności na przemiany, w zależności od warunków procesów technologicznych, w tym szczególnie enzymatycznej hydrolizy skrobi do hydrolizatów glukozowych. Wobec powyższego celem badań monotematycznych prac przedstawionych do oceny, a jednocześnie składających się na osiągnięcie naukowe, było określenie interakcji składników lipidowych i białkowych, jak również nieskrobiowych polisacharydów (pentozanów/arabinoksylanów) z powierzchnią granul skrobi pszennej i ich wpływu na kształtowanie właściwości fizykochemicznych skrobi i otrzymywanych z niej hydrolizatów glukozowych. Zakres badań obejmował określenie wpływu zarówno twardości, jak również okresu wegetacji (w tym wchodzących na rynek zbóż odmian fakultatywnych, tzw. przewódkowych) ziarna pszenicy na ilość adsorbowanych na powierzchni skrobi, w czasie jej wymywania z mąki, związków jej towarzyszących, zarówno niewęglowodanowych, jak i węglowodanowych i ich wpływu na podatność skrobi na kleikowanie oraz hydrolizę pod wpływem enzymów amylolitycznych. W ramach realizacji postawionego wyżej celu dokonano: ustalenia w jakim stopniu obecność frakcji lipidów powierzchniowych (ilość i jakość ), jak również frakcji friabilin/puroindolin determinuje właściwości fizykochemiczne skrobi z różnych odmian pszenicy, z uwzględnieniem ich twardości oraz okresu wegetacji. Badania obejmowały głównie analizę skrobi w kierunku jej podatności na kleikowanie i działanie enzymów amylolitycznych oraz przemiany kompleksu amylozowo-lipidowego AML, związane z obecnością niewęglowodanowych składników na powierzchni ziarenek skrobi; określenie w jakim stopniu obecność frakcji arabinoksylanów (ilość i jakość) adsorbowanych na powierzchni ziaren skrobi w procesie ich izolowania z mąki, otrzymanej z ziarna o różnej twardości, w zależności od odmiany pszenicy i okresu wegetacji, wpływa na kształtowanie właściwości fizykochemicznych skrobi; 10
określenie ilości i jakości arabinoksylanów adsorbowanych na powierzchni granul skrobi pszennej, w zależności od twardości, odmiany i okresu wegetacji pszenicy (z uwzględnieniem odmian przewódkowych), z której pozyskiwano skrobię; wyjaśnienia wpływu struktury (stopnia rozgałęzienia) i koncentracji nieskrobiowych polisacharydów na powierzchni ziarenek skrobi na właściwości fizykochemiczne enzymatycznych hydrolizatów glukozowych, tj. głównie zdolność do filtracji oraz stopień scukrzenia; określenia wpływu odmiany pszenicy i roku jej uprawy na właściwości fizykochemiczne skrobi oraz uzyskiwanych z niej hydrolizatów glukozowych. opracowania metody pośredniego określenia wpływu wzajemnej interakcji białek z grupy friabilin/puroindolin i lipidów na powierzchni granul skrobi na jakość uzyskiwanych hydrolizatów glukozowych, w zależności od twardości i odmiany pszenicy, z której skrobia jest pozyskiwana. Ponadto dokonano wskazania lipidów na powierzchni ziarenek skrobi, jako markera pozwalającego na w miarę szybkie przewidywanie podatności skrobi pszennej, w zależności od rodzaju ziarna pszenicy, z którego jest izolowana, na przebieg i jakość uzyskiwanych hydrolizatów glukozowych; podjęcia próby wyjaśnienia wpływu domeny tryptofanowej na rodzaj oddziaływań lipidy polarne/puroindoliny na powierzchni ziarenek skrobi pszennej. Badania były realizowane między innymi przy zastosowaniu szerokiego spektrum nowoczesnych technik analitycznych, tj. techniki analizy termicznej (różnicowej kalorymetrii skaningowej DSC), techniki z wykorzystaniem promieni rentgenowskich X-ray, spektroskopii rezonansu magnetycznego NMR, chromatograficznych, fluorescencyjnych i techniki liposomowej. 5.3. Omówienie wyników badań wchodzących w zakres monotematycznego cyklu prac poddanych ocenie Z dokonanego przeze mnie syntetycznego przeglądu literatury (zamieszczonego w postaci rozdziału w monografii o zasięgu światowym; pozycja nr 1), obejmującego kierunki badań z wykorzystaniem skrobi pszennej, jej właściwości funkcjonalne, zależne w dużym stopniu od składu chemicznego zarówno powierzchni, jak i wnętrza granul skrobi, 11
wynika, że jest niewiele doniesień dotyczących tego obszaru badań. Istnieje wiele kontrowersyjnych hipotez, dotyczących zarówno wzajemnego oddziaływania lipidów polarnych i białek z grupy friabilin/puroindolin, jak również mechanizmu ich interakcji z powierzchnią granul skrobi pszennej. Podobnie jest przy pentozanach/arabinoksylanach adsorbowanych na powierzchni granul skrobi w procesie jej wymywania z mąki. Wskazuje to na potrzebę weryfikacji hipotezy, zgodnie z którą, nie ilość arabinoksylanów, ale ich struktura i masa molekularna oraz właściwości wpływają na twardość ziarna pszenicy, w zależności od odmiany i okresu wegetacji rośliny oraz na właściwości enzymatycznych hydrolizatów glukozowych, otrzymywanych z izolowanych, z mąki tych zbóż ziarenek skrobi. Z doniesień literatury naukowej wynika, że powierzchnia granul skrobi (jej skład chemiczny) pełni fundamentalną rolę, stanowiąc pierwszą barierę, w procesach ich hydratacji i ataku enzymów amylolitycznych (Baldwin 2001). W związku z tym wskazuje to na potrzebę rozwoju tego kierunku badań. Składniki skrobi (kształtujące się zależnie od genotypu i warunków pogodowych panujących w okresie wegetacji zboża), głównie lipidy i białka, występujące też na jej powierzchni, wpływają na przebieg procesów technologicznych i jakość produktów końcowych otrzymywanych z ich udziałem. Dlatego podjęłam badania (pozycja nr 2), których celem było określenie wpływu okresu wysiewu przewódkowych (alternatywnych) odmian pszenicy, tj. jarych z jednoczesną możliwością wysiewu ich jako odmiany ozime i jare, na skład chemiczny i termodynamiczne właściwości izolowanych z nich skrobi, tj. kleikowanie i rozpad kompleksu amylozowo-lipidowego AML. Właściwości te, w kluczowy sposób determinują przebieg procesu technologicznego otrzymywania hydrolizatów glukozowych. Materiał badawczy, z którego pozyskiwano preparaty skrobiowe stanowiły ziarna 3 odmian pszenicy tzw. przewódkowych, tj. Nawra, Cytra i Koksa. Do badań wykorzystano 6 prób ziarna, dla każdej odmiany po 2 próby, tj. każda odmiana wysiana jako jara i ozima. Ziarno pochodziło z Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Strzelcach, oddział Kończewice (Polska) ze zbiorów w 2010, 2011 i 2012 r. Pszenice uprawiane były na obszarze eksperymentalnym w tych samych warunkach klimatycznych i agrotechnicznych. Wszystkie badane odmiany przewódkowe znajdują się w krajowym rejestrze odmian COBORU. Cytra została wpisana w 2004 roku (odmiana jakościowa B), natomiast odmiany Nawra i Koksa w 2008 roku (odmiany jakościowe A). Badane odmiany pszenic na podstawie pomiaru twardości wykonanego metodą Single-Kernel Characterization System 4100 (Perten Instruments) SKCS zakwalifikowano do grupy średniotwardych. Ziarno pszenic z trzech 12
kolejnych lat uprawy (ze względu na brak istotnych statystyczne różnic w ich składzie chemicznym) łączono ze sobą, poddawano przemiałowi i izolowano skrobię, którą następnie wykorzystywano do badań. W badaniach określono między innymi wielkość granul skrobi, zawartość w nich białka i lipidów ogółem, amylozy pozornej oraz fosforu. Analizie poddano również ilość wolnych kwasów tłuszczowych we frakcji lipidów na powierzchni granul skrobi. Ponadto scharakteryzowano udział białka i lipidów (w tym frakcji wolnej FL i związanej z powierzchnią skrobi SSL) obecnych na powierzchni granul skrobi we frakcji ogółem tych składników i zbadano ich wpływ na charakterystykę kleikowania skrobi i proces rozpadu oraz odbudowy kompleksu AML z wykorzystaniem metody różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC). W celu pośredniego określania siły oddziaływania białek (friabilin/puroindolin) i lipidów na powierzchni badanych granul skrobi w zależności od okresu wysiewu ziarna pszenicy, stosowano metodę ich usuwania przy zastosowaniu selektywnych rozpuszczalników dla poszczególnych składników. Z różnicy uzyskanych mas składników przed i po procesie ekstrakcji wyliczano ich udział ilościowy. W świetle publikacji naukowych jedyną cechą ziarna pszenicy determinującą przydatność danej odmiany do otrzymywania skrobi jest twardość ziarna. Wynika ona ze spójności skrobi z białkiem (im większa twardość, tym białko jest silniej związane ze skrobią). Dlatego też, do otrzymywania skrobi lepiej nadają się pszenice miękkie, z których izoluje się skrobie o mniejszym stopniu uszkodzenia, w porównaniu do skrobi izolowanych z pszenic twardych. W obrębie pszenicy tej samej odmiany, w zależności od okresu wysiewu, wykazano statystycznie istotne różnice w wartości twardości ziarna. Wykazano również wpływ, obok okresu wegetacji zboża, genotypu na zróżnicowanie twardości ziarna. Twardość ziaren badanych odmian pszenicy, wegetujących w tym samym okresie istotnie się różniła. Ziarno pszenic wysianych jesienią wykazywało tendencję do mniejszej twardości. Podobne zależności wykazano przy ocenie wielkości granul skrobi izolowanych z mąki badanych odmian pszenicy. Widoczna była tendencja, że granule skrobi izolowanych z mąki pszenic wysianych wiosną były większe. Wielkość granul skrobi jest ważnym parametrem determinującym ilość składników niewęglowodanowych na ich powierzchni, tj. białek i lipidów. Analiza zawartości frakcji białka i lipidów ogółem (odpowiednio total protein TP i total lipids TL) w badanych skrobiach nie wykazała statystyczne istotnych różnic w ilości tych składników, w sytuacji kiedy skrobie były izolowane z tej samej odmiany pszenicy, ale 13
wysianej w różnym czasie. Podobnie było, kiedy skrobie izolowano z różnych odmian, ale wysianych w tym samym okresie, tj. jesienią lub wiosną. Warto podkreślić, że skrobie izolowane z przewódkowych odmian pszenicy wykazywały statystyczne istotne różnice w zawartości amylozy. Tendencja ta była widoczna zarówno dla skrobi wyizolowanej z tej samej odmiany pszenicy, ale wysianej w różnym okresie, jak również w obrębie różnych genotypów, ale wysianych w tym samym czasie, czyli jako rośliny jare lub ozime. Ilość amylozy w skrobiach wyizolowanych z wszystkich badanych odmian pszenicy, niezależnie od czasu wysiewu, mieściła się w zakresie od 22,65 % s.s. do 27,05 % s.s.. Skrobie izolowane z jarych odmian pszenicy charakteryzowały się statystycznie istotną wyższą zawartością amylozy, w porównaniu do skrobi izolowanych z odmian ozimych. Amyloza jest jednym z ważniejszych składników granul skrobi, który wpływa na jej zdolność do pęcznienia, kleikowania, lepkość i retrogradację ( Uaritta i wsp., 2013; Li i wsp., 2014). W literaturze naukowej brak jest danych dotyczących wpływu okresu wegetacji przewódkowych odmian pszenicy, na kształtowanie ilości frakcji lipidów występujących na powierzchni granul skrobi z nich izolowanych. Skłoniło mnie to do przeprowadzenia dokładnych badań w tym zakresie. Na całkowitą frakcję lipidów powierzchniowych granul skrobi (total starch surface lipids TSSL) składają się lipidy wolne (free lipids FL), tj. nie związane z powierzchnią i lipidy związane z powierzchnią granul (starch surface lipids SSL) (Greenblatt i wsp.,1995). Lipidy powierzchniowe różnicowano ze względu na rodzaj rozpuszczalnika, zastosowanego do ich usuwania z powierzchni granul skrobi. Do ekstrakcji lipidów wolnych (FL) używano heksanu, dla związanych z powierzchnią skrobi 90 %-ego wodnego roztworu izopropanolu. Oznaczano również ogólną ilość lipidów powierzchniowych skrobi po ekstrakcji roztworem izopropanolu i chlorku sodu (mieszanina ekstrakcyjna selektywna dla białek powierzchniowych friabiliny/puroindoliny), oznaczanych jako TSSL. Eksperyment wykonano w celu stwierdzenia wpływu okresu wysiewu pszenicy na siłę interakcji lipidów i białek na powierzchni granul skrobi. Było to moim autorskim pomysłem na pośrednie określenie w ten sposób siły oddziaływania między friabilinami a lipidami na powierzchni granul skrobi. Biorąc pod uwagę ogólną zawartość lipidów powierzchniowych TSSL, wykazałam, że okres wysiewu istotnie różnicuje ilość tej frakcji lipidowej w skrobi. Skrobie izolowane z pszenic przewódkowych wysianych jako jare posiadają na swej powierzchni statystycznie istotnie mniej TSSL, w porównaniu do tych, które otrzymano z pszenic wysianych jako 14
ozime. Wykazano, że frakcja lipidów TSSL stanowiła znacząco większy udział procentowy, we frakcji lipidów ogółem (TL) w skrobi izolowanej z odmian pszenicy wysianych jako ozime. Mając na uwadze fakt, że na powierzchni granul skrobi mogą występować zarówno lipidy wolne FL, jak i lipidy związane z jej powierzchnią SSL (Greenblatt i wsp., 1995), również w tym przypadku wykazano, że czas wysiewu danej odmiany pszenicy istotnie wpływa na zróżnicowanie ilości danej frakcji lipidowej na powierzchni granul skrobi. Istotną różnicę wykazano w udziałach procentowych tych frakcji lipidów zarówno we frakcji TSSL, jak i TL. W skrobiach z odmian pszenicy wysianych jako jare udział procentowy FL w TSSL był znacząco wyższy niż w tych samych odmianach, ale ozimych. Natomiast w przypadku wielkości udziału procentowego FL w TL miała miejsce odwrotna zależność. Analizując frakcję lipidów związanych z powierzchnią skrobi SSL, wykazano, że podobnie jak we frakcji FL, tak i w tym przypadku lipidy te stanowiły większy udział procentowy w TSSL, jak również TL w skrobiach izolowanych z pszenic wysianych jako ozime. Wartości stosunku SSL/FL mieszczące się w zakresie od 1.5 do 3.2 w skrobi z odmian jarych i od 2.7 do 3.8 w skrobi z odmian ozimych, potwierdzają również większe udziały procentowe FL w ogólnej frakcji lipidów powierzchniowych TSSL w skrobi z odmian pszenic jarych, w stosunku do frakcji lipidów związanych z powierzchnią SSL. W podjętych badaniach analizowałam również zawartość ogólnej frakcji lipidów powierzchniowych TSSL po ekstrakcji granul skrobi rozpuszczalnikiem selektywnym dla frakcji białek na powierzchni skrobi z grupy friabiliny/puroindoliny. Wykazałam, że po takim procesie ekstrakcji, lipidów na powierzchni badanych skrobi było mniej. Może to wynikać z faktu, istnienia na powierzchni ziarenek skrobi połączeń białek z lipidami i ich wzajemnych oddziaływań. Podobną hipotezę postawili między innymi Feiz i wsp. (2009) oraz Wall i wsp. (2010). Potwierdzono jednocześnie małą selektywność rozpuszczalnika jakim jest mieszanina 50 % wodnego roztworu izopropanolu i 0,05 N roztworu NaCl w stosunku 1:1. Zauważono, że ilość lipidów powierzchniowych TSSL w skrobiach z odmian pszenic ozimych była większa, niż w skrobiach z odmian jarych. Może to sugerować, wpływ okresu wysiewu pszenicy na siłę oddziaływania składników, tj. lipidów i białek z grupy friabilin/puroindolin na powierzchni granul skrobi. Na podstawie otrzymanych wyników wykazano, że te oddziaływania są silniejsze na powierzchni granul skrobi izolowanych z tych samych odmian pszenic, ale wysianych jako jare. Otrzymane przeze mnie wyniki wyraźnie wskazują na ważny fakt, iż w ilości frakcji lipidów ogółem nie ma wyraźnego statystycznie istotnego zróżnicowania w skrobiach otrzymanych z pszenic wysianych w różnym okresie. Natomiast znacznie 15
większe zróżnicowanie między skrobiami wyizolowanymi z ziarna pszenicy ozimej i jarej w obrębie tej samej odmiany, widoczne jest we frakcji lipidów adsorbowanych na powierzchni ziarenek skrobi. Widać zatem, że sama znajomość całkowitej ilości frakcji lipidów w skrobi, nie odzwierciedla w pełni wpływu okresu wegetacji pszenicy, na zróżnicowanie tej wielkości i może wpływać na błędną interpretację wyników, szczególnie w kierunku przewidywania podatności skrobi na kleikowanie. Dopiero parametr, jakim są udziały procentowe poszczególnych frakcji lipidów na powierzchni granul, potwierdza duży wpływ okresu wysiewu pszenicy, z której izoluje się skrobię, na zróżnicowanie tego składnika. Wyniki badań opublikowane przez Nebesny i wsp. (2005b, c), których byłam współautorem wskazywały na to, iż w zależności od odmiany pszenicy, ilość i jakość związków lipidowych w skrobiach, ma znaczący wpływ na kształtowanie fizykochemicznych właściwości otrzymywanych z nich hydrolizatów glukozowych. Głównie na ich zdolność filtracji, stopień scukrzenia, barwę i przezroczystość. Obecność lipidów w skrobi, ma wpływ na jej podatność na działanie enzymów amylolitycznych, z czym ściśle związana jest jakość otrzymywanych hydrolizatów. Na tej podstawie można się zatem spodziewać, że zróżnicowany skład lipidowy na powierzchni granul skrobi badanych przewódkowych odmian pszenicy, będzie miał swoje odzwierciedlenie w ich podatności na kleikowanie, tj. w wartości temperatury i entalpii kleikowania. Ponadto różnica w ilości i udziale procentowym frakcji lipidów wolnych FL, będzie miała wpływ na przemiany kompleksu amylozowo-lipidowego w tych skrobiach. Brak danych w literaturze naukowej odnośnie wpływu okresu wysiewu tzw. pszenic odmian przewódkowych na właściwości izolowanej z ich ziaren skrobi uniemożliwia porównanie otrzymanych wyników z badaniami innych autorów. Najczęściej prowadzono badania wpływu okresu wegetacji pszenicy, ale nie w obrębie tej samej odmiany, na kształtowanie się ilości lipidów, między innymi FL w mąkach. Konopka i współpracownicy (2006) wykazali, że mąka jarych odmian pszenicy jest bogatsza we frakcję FL, głównie niepolarnych, w stosunku do ich ilości w mąkach ozimych odmian pszenicy. Ponadto, zawiera ona więcej fosfolipidów, co wynika z większej zawartości sferosomów w endospermie tej klasy pszenic. W przeprowadzonych przeze mnie badaniach, również wykazałam podobne zależności, w skrobi izolowanej z przewódkowych jarych odmian pszenicy. Sposób oddziaływania białka z powierzchnią granul skrobi nie został do tej pory dokładnie wyjaśniony. Twierdzi się, że większość białka powierzchniowego jest zwyczajnie adsorbowana na powierzchni granul skrobi (Baldwin, 2001). Dlatego też istotne również było 16
sprawdzenie, jak okres wysiewu pszenicy wpływa na ilość adsorbowanego na powierzchni granul skrobi białka z grupy friabiliny/puroindoliny. Ilość białka powierzchniowego SSP oznaczonego w skrobiach po ekstrakcji mieszaniną 50 % wodnego roztworu izopropanolu i 0,05 N NaCl była istotnie zróżnicowana w zależności od okresu wysiewu pszenicy, niezależnie od jej odmiany. Granule skrobi z odmian jarych pszenicy posiadały na swej powierzchni mniej tego białka. Podobnie było przy wielkości udziału procentowego tej frakcji białka w białku ogółem TP. Średnio o 5 % do 10 % był większy udział tego białka we frakcji białka ogółem w skrobi z ozimych odmian pszenicy. Podjęłam również, podobnie jak przy analizie frakcji lipidowych, próbę określenia siły oddziaływania białek powierzchniowych z grupy friabilin/puroindolin SSP z lipidami na powierzchni granul skrobi, analizując ich ilość i udział procentowy we frakcji białka ogółem po ekstrakcji skrobi 65 % wodnym roztworem propanolu (rozpuszczalnikiem przeznaczonym do usuwania lipidów na powierzchni skrobi TSSL). Na powierzchni granul skrobi izolowanej z ziarna pszenic odmian jarych obserwowałam silniejsze oddziaływania tych białek z lipidami. Świadczą o tym większe wartości udziału procentowego białka, usuwanego wraz z lipidami powierzchniowymi, przy zastosowaniu 65% wodnego roztworu propanolu. Potwierdza to, tę samą tendencję, jaką obserwowano przy analizie lipidów na powierzchni granul badanych skrobi. Uzyskane wyniki silniejszego oddziaływania lipidów i białka na powierzchni skrobi izolowanych z przewódkowych jarych odmian pszenic mają swoje odzwierciedlenie w gorszej podatności tych skrobi na kleikowanie. Wskazywały na to, uzyskane wyniki analizy właściwości termodynamicznych (DSC) badanych skrobi. Do lipidów powierzchniowych, znajdujących się na powierzchni granul skrobi zaliczane się: triglicerydy, wolne kwasy tłuszczowe, glikolipidy i fosfolipidy. Zawierają one większą ilość lipidów monoacylowych, w porównaniu z lipidami nieskrobiowymi, co ułatwia im tworzenie kompleksów amylozowo lipidowych na powierzchni ziarenek skrobiowych (Ellis i wsp., 1998). Z tego też względu, ważna była znajomość składu ilościowego i jakościowego wolnych kwasów tłuszczowych FFA we frakcji lipidów powierzchniowych TSSL, granul skrobi izolowanych z przewódkowych odmian pszenicy, czego się również podjęłam w prowadzonych przeze mnie badaniach. Dominującymi kwasami były kwas palmitynowy, oleinowy, linolowy. Ponadto wykazałam obecność znaczącej ilość kwasu stearynowego i linolenowego. Istotną frakcję stanowiły również kwasy erukowy i trikozanowy, których występowania w znacznych ilościach dotychczas nie stwierdzono w mąkach z pszenicy (Konopka i wsp., 2006). Na podstawie przeprowadzonych badań wykazałam, że spośród 17
oznaczonych kwasów tłuszczowych w największej ilości występował nienasycony kwas linolowy i nasycony palmitynowy. Wykazałam także, statystycznie istotne różnice w ilości tych kwasów na powierzchni granul skrobi, w zależności od okresu w jakim była wysiana pszenica. Ponadto, stwierdziłam wyższą zawartości tych dwóch, należy podkreślić dominujących, kwasów w skrobi izolowanej z odmian jarych analizowanych pszenic przewódkowych. Istotne różnice w ilości tych dwóch FFA miały również miejsce w różnych genotypach badanych pszenic. Stwierdziłam również statystycznie istotne wyższe ilości kwasu erukowego i trikozanowego na powierzchni granul skrobi izolowanych z przewódkowych jarych odmian badanych pszenic. Natomiast w przypadku kwasów linolenowego i stearynowego, mniej dominujących pod względem zawartości we frakcji lipidów powierzchniowych badanych skrobi, wykazałam, że jest ich statystycznie istotnie więcej w skrobiach ozimych odmian pszenic. Z analizy składu wolnych kwasów tłuszczowych we frakcji TSSL wynika, że na skutek większej ilości dominujących kwasów tłuszczowych, tj. linolowego, palmitynowego oraz erukowego i trikozanowego w skrobiach jarych, mogą one wykazywać mniejszą podatność na kleikowanie i działanie enzymów amylolitycznych. Kwasy te mają zdolność tworzenia w procesie kleikowania skrobi dodatkowych ilości kompleksu amylozowo-lipidowego AML, oprócz tego, który występuje w skrobiach naturalnych (Ellis i wsp., 1998; Nebesny i wsp., 2005c). Uzyskane wyniki analizy FFA na powierzchni granul skrobi wykazywały nieco inną tendencję, niż te otrzymane przez Konopkę i wsp. (2006) dla mąk z pszenic jarych i ozimych. Autorzy ci wykazali, że mąka z pszenic jarych zawiera więcej kwasu oleinowego, a nieznacznie mniej linolowego i linolenowego. Na podstawie przeprowadzonych w pracy badań autorka stwierdziła, że to kwas oleinowy wykazywał tendencję do występowania w mniejszej ilości w skrobiach z przewódkowych pszenic jarych, natomiast kwas linolowy występował w odmianach jarych w największych ilościach. Należy w tym miejscu podkreślić, że jest on głównym prekursorem, zaraz po lizofosfatydylocholinie do tworzenia inkluzyjnego kompleksu z amylozą AML, który ogranicza w znacznym stopniu zdolność pęcznienia i kleikowania skrobi pszennej. Znajomość właściwości termodynamicznych skrobi pozwala na przewidywanie jej podatności na kleikowanie, jak również podatności na depolimeryzację pod wpływem enzymów amylolitycznych. Dlatego też podjęłam się scharakteryzowania tych przemian w badanych skrobiach, w zależności od czasu wysiewu pszenicy, z której były izolowane, przy zastosowaniu metody różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC). Badania umożliwiły określenie przebiegu procesu kleikowania skrobi naturalnych (entalpii i temperatury 18
kleikowania) oraz prześledzenie w nich procesu rozpadu i odbudowy kompleksu amylozowolipidowego (AML) w zależności od terminu wysiewu pszenicy. W skrobiach naturalnych wykazałam statystycznie istotne różnice w wartościach entalpii i temperatur ich kleikowania oraz entalpii i temperatur rozpadu i odbudowy kompleksu AML, w zależności od okresu wysiewu przewódkowej pszenicy, z której izolowano skrobie. Pozyskiwane z przewódkowych pszenic jarych skrobie wykazywały mniejszą podatność na kleikowanie, na co wskazywały statystycznie istotne niższe wartości entalpii kleikowania ( H) i wyższe wartości temperatur początku To, maksimum piku Tp i końca kleikowania Tc. Istotnym parametrem decydującym o podatności danej skrobi na kleikowanie jest także wartość Tr., tj. zakres temperatury kleikowania. Odnotowane wartości tego parametru w skrobi z jarych odmian pszenicy były mniejsze, co wskazuje na lepsze uporządkowanie krystaliczne danej skrobi, a tym samym jednocześnie może obniżać jej podatność na kleikowanie. Wiadomo, że temperatura kleikowania skrobi jest związana ze strukturą polimorficzną skrobi zbożowych (Kiseleva i wsp., 2003). Im mniejsza jest różnica pomiędzy temperaturami końca i początku kleikowania (To-Tc, tj. Tr), tym stopień uporządkowania struktury krystalicznej skrobi jest wyższy. Analiza danych wskazywała na wyższą krystaliczność skrobi pochodzących z jarych odmian pszenicy. Ma to jednocześnie przełożenie na cechę skrobi, jaką jest jej kleikowanie, tj. będzie gorzej ulegała temu procesowi. Na podstawie uzyskanych wyników badań wykazałam, że czas wysiewu pszenicy ma istotne znaczenie na kształtowanie ilości i właściwości kompleksu AML w skrobiach izolowanych z tych pszenic. Wskazują na to takie parametry jak entalpia i temperatury zarówno w procesie jego rozpadu, co ma miejsce w etapie ogrzewania wodnej zawiesiny skrobi do temperatury 120 C, jak i jego odbudowy w etapie chłodzenia skleikowanej skrobi do 20 C. Stwierdziłam, iż statystycznie istotnie wyższą wartość entalpii rozpadu kompleksu AML wykazują skrobie jarych przewódkowych odmian pszenicy. Słuszne zatem jest stwierdzenie, iż skrobie z odmian ozimych zawierają mniej kompleksu AML. Koreluje to jednocześnie z niższymi wartościami temperatur To, Tp i Tc kleikowania oraz wyższymi entalpiami kleikowania dla tych skrobi, co tym samym wskazuje na większą podatność tych skrobi na kleikowanie. Mniejsze wartości Tr dla procesu rozpadu kompleksu AML uzyskane dla skrobi odmian pszenic przewódkowych jarych, wskazują na bardziej uporządkowaną i bardziej krystaliczną postać polimorficzną tego kompleksu. Wiąże się to z gorszą podatnością tego związku na rozpad w warunkach hydrolizy skrobi. 19
Z uzyskanych danych termodynamiki odbudowy kompleksu AML wynikało, że w skrobi z odmian przewódkowych jarych, wartości entalpii odbudowy kompleksu AML były znacząco większe, niż te w skrobiach izolowanych z mąki pszenic wysianych jako ozime. Ponadto temperatury Tp odbudowy kompleksu AML osiągały również w tych skrobiach wyższe wartości. Wskazywało to jednocześnie na wyższą stabilność struktury krystalicznej kompleksu w skrobiach z jarych odmian pszenicy i jednocześnie mniejszą podatność na rozpad w warunkach hydrolizy. Potwierdzała to również wielkość wartości zakresu Tr w etapie odbudowy kompleksu, które były statystycznie istotnie mniejsze dla kompleksu AML skrobi izolowanych z jarych odmian pszenicy. Według Tufvesson i wsp. (2003b) szerokość piku mierzona różnicą temperatur To i Tc jest odwrotnie skorelowana ze stopniem uporządkowania struktury krystalicznej kompleksu AML. Szerszy pik (większa różnica temperatur) wskazuje na gorszą organizację struktur krystalicznych. Mierzony efekt cieplny rozpadu kompleksu AML odzwierciedla nie tylko jego ilość, ale również strukturę i postać krystalograficzną. Skrobie z różnych odmian pszenicy mogą posiadać kompleksy o różnej strukturze i postaci krystalograficznej. Zróżnicowanie wartości entalpii może wynikać z udziału ilościowego postaci krystalicznej i amorficznej w całkowitej ilości kompleksu. Uzyskane różnice wartości entalpii rozpadu kompleksów między poszczególnymi skrobiami mogą być wynikiem zarówno zmienności genetycznej, wynikającej z różnic odmianowych jak i różnych warunków pogodowych panujących w okresie wegetacji zbóż. Wykazałam, że w sytuacji, kiedy usuwamy lipidy z powierzchni granul skrobi, obserwujemy jednocześnie mniejszą ilość kompleksu AML w takich skrobiach. W ten sposób potwierdziłam hipotezę, że lipidy powierzchniowe biorą udział w tworzeniu dodatkowej ilości kompleksu, oprócz tego, który powstaje w procesie syntezy granul skrobi w ziarnie zbóż. Ponadto wykazałam, że w przypadku skrobi z ozimych przewódkowych odmian pszenic, tworzy się mniejsza ilość kompleksu AML przy udziale lipidów powierzchniowych, niż w przypadku skrobi z odmian pszenic jarych. Wskazywały na to mniejsze różnice w wartościach entalpii rozpadu kompleksu AML w skrobiach natywnych, w stosunku do tych, które uzyskiwano po usunięciu lipidów powierzchniowych w skrobiach z ozimych przewódkowych odmian pszenic. Zaobserwowano tu pewną zależność pomiędzy ilością lipidów wolnych (FL) we frakcji lipidów na powierzchni skrobi (TSSL) a ilością tworzącego się kompleksu AML. W skrobiach z odmian jarych pszenic lipidy wolne (FL) stanowiły większy udział procentowy we frakcji ogółem lipidów powierzchniowych (TSSL). W skrobiach tych też wykazałam większą ilość kompleksu tworzącego się dodatkowo przy udziale lipidów powierzchniowych, 20
w procesie ich kleikowania. Ponadto skrobie te charakteryzowały się większą ilością FFA na powierzchni swoich granul, tj. prekursorów do tworzenia dodatkowej ilości kompleksu AML. Istotne znaczenie dla zobrazowania udziału lipidów adsorbowanych na powierzchni granul skrobi w ilości tworzącego się dodatkowo kompleksu AML, miało określenie wielkości stosunku entalpii rozpadu kompleksu AML w skrobiach naturalnych i po usunięciu z ich powierzchni lipidów powierzchniowych ( Ha/ Hb) oraz po usunięciu białka powierzchniowego ( Ha/ Hc). Wyrażałam w ten sposób ilość tworzącego się dodatkowo, przy udziale lipidów powierzchniowych, kompleksu AML w procesie kleikowania tych skrobi. Wykazałam w tej kwestii znaczące statystyczne różnice, zależne od czasu wysiewu przewódkowych odmian pszenicy. W przypadku gdy usuwałam z powierzchni granul skrobi głównie frakcje lipidów, to wartości tych stosunków ( Ha/ Hb) były większe w skrobiach, które wyizolowałam z ziarna pszenic jarych. Wskazuje to, na istotnie większą ilość tworzącego się dodatkowo kompleksu AML przy udziale lipidów powierzchniowych, niż w przypadku skrobi z ziarna pszenic odmian ozimych. Dla nich wartości Ha/ Hb były niższe. Natomiast, gdy skrobie poddawano działaniu rozpuszczalnika selektywnego dla białek, tj. mieszaninie izopropanolu i NaCl, wówczas sytuacja była odwrotna. Na tej podstawie stwierdzono, że w przypadku skrobi z przewódkowych pszenic wysianych wiosną tworzy się dodatkowo 3.0, 1.8 oraz 3.8 razy więcej kompleksu AML niż w przypadku odmian wysianych jesienią (odpowiednio dla pszenic odmian Koksa, Nawra, Cytra). Kiedy z powierzchni skrobi usunięto białko powierzchniowe z grupy friabiliny/ puroindoliny, to wówczas miał miejsce wzrost wartości entalpii rozpadu kompleksu AML, w stosunku do tych skrobi, które traktowano rozpuszczalnikiem selektywnym tylko dla lipidów powierzchniowych. Ponadto obserwowano odwrotną sytuację, do tej przedstawionej powyżej. W skrobiach izolowanych z przewódkowych pszenic wysianych wiosną tworzy się dodatkowo odpowiednio 2.4, 1.2 oraz 4.0 razy mniej kompleksu AML niż w odmianach wysianych jesienią. W takiej sytuacji, kiedy z powierzchni skrobi usuwałano głównie białko i tylko niewielką ilość lipidów, to te pozostałe lipidy miały lepsze warunki do tworzenia dodatkowej ilości kompleksu AML z uwalnianą w czasie kleikowania amylozą. Podsumowując ten etap badań uzyskałam wyniki wskazujące, na wpływ obecności niewęglowodanowych składników na powierzchni granul skrobi, tj. lipidów i białek na kształtowanie podatności skrobi na kleikowanie. Wykazałam, że istotny wpływ na kształtowanie ilości tych składników na powierzchni granul skrobi ma okres wysiewu przewódkowych odmian pszenicy. Osiągnięciem poznawczym tego kierunku 21