Analiza ilościowa aminokwasów za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Analiza ilościowa aminokwasów za pomocą chromatografii cienkowarstwowej WSTĘP Chromatografia cienkowarstwowa jest odmianą chromatografii cieczowej, w której fazą ruchomą jest rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników, natomiast fazą stacjonarną jest naniesiona na aluminiową lub szklaną płytkę cienka warstwa adsorbentu (najczęściej stosowany jest żel krzemionkowy). Podstawowym parametrem charakteryzującym rozdzielone związki jest współczynnik opóźnienia (Rf) każdego z nich, który wyrażany jest jako stosunek drogi przebytej przez tę substancję do całkowitej drogi przebytej przez czoło rozpuszczalnika. Jeżeli po przeprowadzonym rozdzielaniu chromatograficznym otrzymane płytki są bezbarwne, należy je zwizualizować, aby uwidocznić uzyskane plamki. Jest kilka metod wizualizacji otrzymanych chromatogramów. Do najważniejszych zalicza się: naświetlanie światłem nadfioletowym uwidaczniają się substancje, które fluoryzują pod wpływem światła UV, chyba że użyto płytki ze wskaźnikiem fluoryzującym (F254). Wtedy fluoryzuje cała płytka, zaś związki wygaszające fluorescencję lub emitujące światło o innej długości fali, uwidoczniają się przeważnie w postaci ciemnych plam; wizualizację chemiczną wykorzystuje się specyficzne odczynniki chemiczne, które wchodzą w reakcje z rozdzielonymi substancjami. W wyniku tego na płytce powstają kolorowe plamy będące produktami barwnych reakcji chemicznych zachodzących pomiędzy rozdzielonymi związkami a odczynnikiem wizualizującym. Specyficznymi reakcjami używanymi w chromatografii cienkowarstwowej do wizualizacji chemicznej chromatogramów są reakcje indukowane. Przykładem reakcji indukowanej, wykorzystywanej w tym ćwiczeniu do wizualizacji chromatogramów, jest reakcja jodo-azydkowa, której schematyczny przebieg przedstawiono poniżej: induktor 2N 3 + I 3 3N 2 + 3I Warunkiem koniecznym zajścia powyższej reakcji jest obecność odpowiedniego induktora w układzie, którym może być np. związek zawierający w swojej strukturze dwuwiązalną siarkę. Kwas 2-aminoetanosulfonowy (tauryna) pomaga transportować kreatynę do mięśni, co powoduje jej efektywniejsze wykorzystanie, a także przyśpiesza regenerację mięśni po wysiłku. Kolejną ważną funkcją tauryny w organizmie jest sprzęganie kwasów żółciowych przed ich wypuszczeniem" z wątroby. W efekcie dochodzi do wzrostu ich rozpuszczalności, co oznacza, że sprzyja ona emulgacji tłuszczów w obrębie przewodu pokarmowego. Kwas 2-aminoetanosulfonowy jest składnikiem napojów energetyzujących, mleka modyfikowanego w proszku dla dzieci, karmy dla zwierząt (m.in. kotów) oraz odżywek dla sportowców. Kwas γ-aminomasłowy (GABA) jest jednym z najistotniejszych spośród obecnych w ludzkich organizmach neuroprzekaźników hamujących. Podstawowymi efektami działania GABA są zmniejszenie pobudliwości komórek nerwowych oraz relaksacja komórek mięśniowych. Substancja ta może także działać uspokajająco oraz ułatwiać zasypianie. W związku z tym jest bardzo często dodawana do suplementów diety na sen. 1

O S H N H 2 N OH 2 OH O Rys. 1. Wzory strukturalne: kwas 2-aminoetanosulfonowy (tauryna) po lewej i kwas γ-aminomasłowy (GABA) po prawej. Tauryna i GABA są substancjami o białej barwie. Dodatkowo ich roztwory są bezbarwne, dlatego wizualizacja chromatogramów plamkowych może być utrudniona. Związki te nie posiadają również atomów dwuwiązalnej siarki, w związku z czym niemożliwym staje się zastosowanie reakcji jodo-azydkowej do wizualizacji chemicznej płytek. Aby można było oznaczyć taurynę i GABA techniką chromatografii cienkowarstwowej z jodo-azydkową metodą detekcji, konieczne jest przeprowadzenie derywatyzacji tych substancji. W ćwiczeniu do tego celu będzie wykorzystywany izotiocyjanian fenylu. Równania reakcji derywatyzacji tauryny i GABA za pomocą izotiocyjanianu fenylu przedstawiono poniżej. O O S O N C S + S H 2 N OH S O NH NH OH O Rys. 2. Równanie reakcji derywatyzacji kwasu 2-aminoetanosulfonowego za pomocą izotiocyjanianu fenylu. N C S + N H 2 O OH NH S NH O OH Rys. 3. Równanie reakcji derywatyzacji kwasu γ-aminomasłowego za pomocą izotiocyjanianu fenylu. CEL ĆWICZENIA Ćwiczenie podzielone jest na dwie części: 1. Dobór optymalnej fazy ruchomej do wykonania analizy tauryny i GABA. 2. Analiza ilościowa substancji aktywnych w napojach spożywczych i suplementach diety. WYKONANIE ĆWICZENIA Aparatura i sprzęt laboratoryjny: Elektroniczny moduł sterujący evol XR; Analityczna strzykawka XCHANGE do evol XR o pojemności 5 µl; Komory chromatograficzne (DESAGA); Komora jodowa; Płytki chromatograficzne TLC SilicaGel F254 (MERCK); Kolby miarowe o pojemności 5 ml, 25 ml, 50 ml i 100 ml; Zlewki; Suszarka; Naczynka wagowe; Waga analityczna; Mikropipeta automatyczna nastawna 100-1000 µl; 2

Pipeta wielowymiarowa o pojemności 25 cm 3 ; Mieszadło magnetyczne z funkcją grzania; Spryskiwacz do TLC; Bączki; Lejek Schotta; Płuczka ultradźwiękowa; Skaner EPSON Perfection V850 Pro; Komputer z oprogramowaniem ImageJ. Odczynniki: Kwas 2-aminoetanosulfonowy (tauryna); Kwas γ-aminomasłowy (GABA); Izotiocyjanian fenylu (PITC); Roztwór buforu fosforanowego (c = 0,1 mol/l; ph = 12); Dichlorometan; Metanol; Propan-2-ol; Tetrahydrofuran; Azydek sodu; Skrobia; Jodek potasu; Krystaliczny jod; Kwas solny; Woda destylowana; Napój RedBull; Napój Tiger; Tabletki Forsen. Procedura postępowania CZĘŚĆ 1. 1. Przygotowanie roztworów a. Roztwór odczynnika derywatyzującego (izotiocyjanianu fenylu) o stężeniu c = 0,5 mol/l Do kolbki miarowej o pojemności 10 ml dodać po kolei 500 µl izotiocyjanianu fenylu, 1 ml buforu fosforanowego (c = 0,1 mol/l; ph = 12) oraz 7 ml propan-2-olu. Całość dokładnie wymieszać (nie uzupełniać do kreski! v = 8,5 ml) b. Roztwór skrobi o stężeniu c = 5% Na wadze analitycznej odważyć 2,5 g skrobi, dodać około 30 ml wody destylowanej, a następnie otrzymaną mieszaninę ogrzewać na mieszadle magnetycznym z funkcją grzania, stale mieszając, aż do rozpuszczenia się skrobi. Po rozpuszczeniu się skrobi roztwór doprowadzić do wrzenia i utrzymywać w tym stanie przez 2 min. Następnie roztwór ostudzić, a na koniec przenieść go ilościowo do kolbki miarowej o pojemności 50 ml i uzupełnić ją do kreski wodą destylowaną. 3

c. Roztwór wizualizujący dla GABA (cskrobia = 3%; cazydek = 4%; cjodek = 0,01 mol/l; ph = 6,0) Na wadze analitycznej odważyć 1,00 g azydku sodu oraz 0,0415 g jodku potasu, dodać około 5 ml wody destylowanej, a następnie wprowadzić 15 ml roztworu skrobi o stężeniu 5%. Do uzyskanych roztworów dodać kroplami takie objętości rozcieńczonego kwasu solnego, aby końcowe ph wynosiło 6,0. Tak otrzymane roztwory przenieść ilościowo do kolbki miarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić ją do kreski wodą destylowaną. d. Roztwór wizualizujący dla tauryny (cskrobia = 2%; cazydek = 3%; cjodek = 0,01 mol/l; ph = 6,0) Na wadze analitycznej odważyć 0,75 g azydku sodu oraz 0,0415 g jodku potasu, dodać około 5 ml wody destylowanej, a następnie wprowadzić 10 ml roztworu skrobi o stężeniu 5%. Do uzyskanych roztworów dodać kroplami takie objętości rozcieńczonego kwasu solnego, aby końcowe ph wynosiło 6,0. Tak otrzymane roztwory przenieść ilościowo do kolbki miarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić ją do kreski wodą destylowaną. e. Mieszanina do przygotowania roztworów GABA i tauryny Do kolby miarowej o pojemności 100 ml dodać po kolei 40 ml propan-2-olu, 40 ml wody destylowanej i 20 ml buforu fosforanowego o stężeniu c = 0,1 mol/l i ph = 12. f. Roztwór GABA o stężeniu c = 0,01 mol/l Na wadze analitycznej odważyć 0,0052 g GABA, a następnie całość przenieść ilościowo do kolbki miarowej o pojemności 5 ml i uzupełnić ją do kreski wodą destylowaną. g. Roztwór tauryny o stężeniu c = 0,01 mol/l Na wadze analitycznej odważyć 0,0063 g tauryny, a następnie całość przenieść ilościowo do kolbki miarowej o pojemności 5 ml i uzupełnić ją do kreski wodą destylowaną. h. Roztwór GABA o stężeniu c = 2 10-3 mol/l Do kolbki miarowej o objętości 5 ml wprowadzić 1 ml roztworu GABA o stężeniu 0,01 mol/l, a następnie uzupełnić ją do kreski roztworem z punktu 1e. i. Roztwór tauryny o stężeniu c = 2 10-3 mol/l Do kolbki miarowej o objętości 5 ml wprowadzić 1 ml roztworu tauryny o stężeniu 0,01 mol/l, a następnie uzupełnić ją do kreski roztworem z punktu 1e. j. Roztwory pochodnej GABA Do kolbek miarowych o pojemności 5 ml wprowadzić następujące ilości roztworów, przedstawionych w poniższej tabeli: Nr kolbki Objętość roztworu GABA (z punktu 1h.) [ml] Objętość roztworu izotiocyjanianu fenylu (z punktu 1a.) [ml] 1 0,5 1,0 2 1,0 1,0 3 1,5 1,0 Uzyskane roztwory mieszać na mieszadle magnetycznym przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie uzupełnić kolbki metanolem do kreski. 4

k. Roztwory pochodnej tauryny Do kolbek miarowych o pojemności 5 ml wprowadzić następujące ilości roztworów, przedstawionych w poniższej tabeli: Nr kolbki Objętość roztworu tauryny (z punktu 1i.) [ml] Objętość roztworu izotiocyjanianu fenylu (z punktu 1a.) [ml] 4 0,5 1,0 5 1,0 1,0 6 1,5 1,0 Uzyskane roztwory mieszać na mieszadle magnetycznym przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie uzupełnić kolbki metanolem do kreski. 2. Przygotowanie płytek chromatograficznych TLC SilicaGel F254 UWAGA: NIE DOTYKAĆ POWIERZCHNI SORBENTU! Z aluminiowych arkuszy wyciąć osiemnaście płytek o wymiarach 4 cm x 5,5 cm (9 płytek dla roztworów GABA i 9 dla roztworów tauryny). W odległości 0,5 cm od jednego z krótszych brzegów płytki narysować delikatnie ołówkiem linię startu, a następnie trzy kropki co 1 cm. 3. Przygotowanie faz ruchomych Do zlewek o pojemności 50 cm 3 odmierzyć za pomocą pipet wielowymiarowych ilości rozpuszczalników podane w tabeli poniżej. Roztwory dobrze wymieszać. Nr zlewki Rozpuszczalnik A Objętość rozpuszczalnika A [ml] Rozpuszczalnik B Objętość rozpuszczalnika B [ml] 1 dichlorometan 4 metanol 16 2 dichlorometan 10 metanol 10 3 dichlorometan 16 metanol 4 4 dichlorometan 4 acetonitryl 16 5 dichlorometan 16 acetonitryl 4 6 tetrahydrofuran 4 acetonitryl 4 7 tetrahydrofuran 16 acetonitryl 16 8 tetrahydrofuran 4 metanol 4 9 tetrahydrofuran 16 metanol 16 4. Naniesienie próbek na płytki chromatograficzne TLC SilicaGel F254 Do elektronicznego modułu sterującego evol XR zamontować analityczną strzykawkę XCHANGE o pojemności 5 µl, zaprogramować metodę wielokrotnego dozowania i przepłukać strzykawkę. UWAGA: POSTĘPOWAĆ ZGODNIE Z INSTRUKCJĄ OBSŁUGI evol XR ZAMIESZCZONĄ NA STRONIE 11. W metodzie wielokrotnego dozowania ustawić następujące parametry: Parametr Wartość Dispense (Obj. Dozowania); 0,2 µl 5

Last Dispense (Obj. Ostatniego Dozowania); 0,2 µl Count (Ilość Powtórzeń); 9 Asp Speed (Prędkość Pobierania) 5 Disp Speed (Prędkość Dozowania) 10 Pobrać roztwór nr 1 z punktu 1j i ostrożnie nanieść na pierwszą kropkę na każdą z dziewięciu płytek chromatograficznych. Czynność powtórzyć dla roztworów 2 i 3, nanosząc je odpowiednio na drugą i trzecią kropkę. Przepłukać strzykawkę. Nie zmieniając zaprogramowanych parametrów, powtórzyć te same czynności dla roztworów 4, 5 i 6 z punktu 1k i pozostałych dziewięciu płytek chromatograficznych. Ponownie przepłukać strzykawkę. 5. Rozwinięcie chromatogramów Przygotować dwie komory chromatograficzne pierwsza dla płytek z naniesionymi roztworami pochodnej GABA, druga dla płytek z naniesionymi roztworami pochodnej tauryny. Umieścić po jednej płytce w komorach chromatograficznych zawierających fazę ruchomą, po czym rozwinąć chromatogramy. Obserwować czoło rozpuszczalnika. Kiedy dotrze ono końca płytek chromatograficznych, wyjąć je z komory i delikatnie wysuszyć. Z komór ostrożnie usunąć pozostałości fazy ruchomej, nalać nową fazę ruchomą z punktu 3, umieścić jeszcze nierozwinięte płytki chromatograficzne itd. Czynność powtarzać aż do momentu rozwinięcia wszystkich płytek we wszystkich fazach ruchomych z punktu 3. 6. Wizualizacja chromatogramów UWAGA: WIZUALIZACJĘ CHROMATOGRAMÓW KONIECZNIE PRZEPROWADZIĆ POD WŁĄCZONYM WYCIĄGIEM! Do spryskiwacza wlać wcześniej przygotowany roztwór wizualizujący z punktu 1c i spryskać nim równomiernie płytki z naniesionymi roztworami pochodnej GABA. Odczekać do momentu odparowania nadmiaru roztworu. UWAGA: NIE SUSZYĆ PŁYTKI AŻ DO JEJ CAŁKOWITEGO WYSCHNIĘCIA. POWINNA BYĆ LEKKO WILGOTNA! Czynność tę powtórzyć dla roztworu wizualizującego z punktu 1d i płytek z naniesionymi roztworami pochodnej tauryny. Następnie wilgotne płytki umieścić za pomocą pęsety w komorze jodowej wypełnionej krystalicznym jodem na 10 sekund. Po wyjęciu płytek chromatograficznych z komory odłożyć je na bok na 10 minut jest to czas przeznaczony na zajście reakcji wizualizacji. 7. Analiza chromatogramów Obrysować delikatnie ołówkiem wszystkie otrzymane plamki na zwizualizowanych chromatogramach i dokonać końcowej analizy zgodnie z punktami na stronie 10. 6

1. Przygotowanie roztworów CZĘŚĆ 2. a. Roztwór odczynnika derywatyzującego (izotiocyjanianu fenylu) o stężeniu c = 0,5 mol/l Do kolbki miarowej o pojemności 25 ml dodać po kolei 1 ml izotiocyjanianu fenylu, 2 ml buforu fosforanowego (c = 0,1 mol/l; ph = 12) oraz 14 ml propan-2-olu. Całość dokładnie wymieszać (nie uzupełniać do kreski! v = 17 ml) b. Roztwór GABA o stężeniu c = 2 10-3 mol/l Do kolbki miarowej o objętości 10 ml wprowadzić 2 ml roztworu GABA o stężeniu 0,01 mol/l z punktu 1f (z części 1.), a następnie uzupełnić ją do kreski roztworem z punktu 1e (z części 1.). c. Roztwór tauryny o stężeniu c = 2 10-3 mol/l Do kolbki miarowej o objętości 10 ml wprowadzić 2 ml roztworu tauryny o stężeniu 0,01 mol/l z punktu 1g (z części 1.), a następnie uzupełnić ją do kreski roztworem z punktu 1e (z części 1.). d. Roztwory pochodnej GABA Do kolbek miarowych o pojemności 5 ml wprowadzić następujące ilości roztworów, przedstawionych w poniższej tabeli: Nr kolbki Objętość roztworu GABA (z punktu 1b.) [ml] Objętość roztworu izotiocyjanianu fenylu (z punktu 1a.) [ml] 1 0,2 1,0 2 0,5 1,0 3 1,0 1,0 4 1,5 1,0 5 2,0 1,0 6 3,0 1,0 Uzyskane roztwory mieszać na mieszadle magnetycznym przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie uzupełnić kolbki metanolem do kreski. e. Roztwory pochodnej tauryny Do kolbek miarowych o pojemności 5 ml wprowadzić następujące ilości roztworów, przedstawionych w poniższej tabeli: Nr kolbki Objętość roztworu tauryny (z punktu 1c.) [ml] Objętość roztworu izotiocyjanianu fenylu (z punktu 1a.) [ml] 7 0,2 1,0 8 0,5 1,0 9 1,0 1,0 10 1,5 1,0 11 2,0 1,0 12 3,0 1,0 7

Uzyskane roztwory mieszać na mieszadle magnetycznym przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie uzupełnić kolbki metanolem do kreski. f. Roztwór tabletki Forsen Do zlewki o objętości 100 ml wsypać całą zawartość kapsułki, następnie dodać około 35 ml wody destylowanej i mieszać na mieszadle magnetycznym 5 minut w celu rozpuszczenia zawartości. Otrzymaną mieszaninę przesączyć na lejku Schotta wprost do kolby miarowej o objętości 50 ml i uzupełnić ją wodą destylowaną do kreski. 1 ml tak przygotowanego roztworu wprowadzić do kolbki miarowej o pojemności 5 ml a następnie uzupełnić ją do kreski roztworem z punktu 1e (z części 1.). Ponownie pobrać 1 ml roztworu, wprowadzić do kolbki o pojemności 5 ml, a następnie dodać 1 ml roztworu z punktu 1a. Roztwór mieszać na mieszadle magnetycznym przez 15 minut a następnie uzupełnić kolbki metanolem do kreski. g. Roztwór RedBulla i Tigera Do kolbek miarowych o pojemności 5 ml wprowadzić po 313 µl odgazowanego roztworu napoju RedBull i Tiger i uzupełnić je do kreski roztworem z punktu 1e (z części 1.). 1 ml tak przygotowanych roztworów przenieść do kolbek miarowych o pojemności 5 ml, wprowadzić 1 ml roztworu z punktu 1a i mieszać na mieszadle magnetycznym przez 15 minut. Na koniec kolbki uzupełnić do kreski metanolem. 2. Przygotowanie płytek chromatograficznych TLC SilicaGel F254 UWAGA: NIE DOTYKAĆ POWIERZCHNI SORBENTU! Z aluminiowego arkusza wyciąć dwie płytki pierwszą o wymiarach 8 cm x 5,5 cm, drugą o wymiarach 9 cm x 5,5 cm. W odległości 0,5 cm od jednego z dłuższych brzegów płytki narysować delikatnie ołówkiem linię startu, a następnie siedem lub osiem kropek (w zależności od płytki) co 1 cm. 3. Przygotowanie fazy ruchomej Do zlewki o pojemności 50 cm 3 odmierzyć za pomocą pipety wielowymiarowej odpowiednie ilości rozpuszczalników wybrane z punktu 3 (z części 1.). Roztwór dobrze wymieszać. 4. Naniesienie próbek na płytki chromatograficzne TLC SilicaGel F254 W elektronicznym module sterującym evol XR zaprogramować metodę pojedynczego dozowania i przepłukać strzykawkę. UWAGA: POSTĘPOWAĆ ZGODNIE Z INSTRUKCJĄ OBSŁUGI evol XR ZAMIESZCZONĄ NA STRONIE 11. W metodzie pojedynczego dozowania ustawić następujące parametry: Parametr Wartość Aspirate 0,2 µl Dispense 0,2 µl Speed 5 Pobrać roztwór nr 1 z punktu 1d i ostrożnie nanieść na pierwszą kropkę. Czynność powtórzyć dla roztworów 2-6 i pozostałych kropek na płytce. Przepłukać strzykawkę. Nanieść roztwór tabletki Forsen z punktu 1f na siódmą kropkę. Przepłukać strzykawkę. Wykonać te same 8

czynności na drugiej płytce dla roztworów 7-12 z punktu 1e i dla roztworów napojów energetycznych z punktu 1g. 5. Rozwinięcie chromatogramów Po naniesieniu próbek umieścić płytki chromatograficzne w komorach chromatograficznych zawierających fazę ruchomą (po jednej komorze na płytkę). Odczekać 10 minut (jest to czas, w którym komora chromatograficzna nasyca się parami eluentu), po czym rozwinąć chromatogram. Obserwować czoło rozpuszczalnika. Kiedy dotrze ono końca płytek chromatograficznych, wyjąć je z komory i delikatnie wysuszyć. 6. Wizualizacja chromatogramów UWAGA: WIZUALIZACJĘ CHROMATOGRAMÓW KONIECZNIE PRZEPROWADZIĆ POD WŁĄCZONYM WYCIĄGIEM! Do spryskiwacza wlać wcześniej przygotowany roztwór wizualizujący z punktu 1c (z części 1.) i spryskać nim równomiernie płytkę z naniesionymi roztworami pochodnej GABA. Odczekać do momentu odparowania nadmiaru roztworu. UWAGA: NIE SUSZYĆ PŁYTKI AŻ DO JEJ CAŁKOWITEGO WYSCHNIĘCIA. POWINNA BYĆ LEKKO WILGOTNA! Czynność tę powtórzyć dla roztworu wizualizującego z punktu 1d (z części 1.) i płytki z naniesionymi roztworami pochodnej tauryny. Następnie wilgotne płytki umieścić za pomocą pęsety w komorze jodowej wypełnionej krystalicznym jodem na 10 sekund. Po wyjęciu płytek chromatograficznych z komory odłożyć je na bok na 10 minut jest to czas przeznaczony na zajście reakcji wizualizacji. 7. Skanowanie płytek chromatograficznych z rozwiniętymi i zwizualizowanymi chromatogramami Postępując zgodnie z instrukcją na stronie 13 zeskanować otrzymane chromatogramy. Ustawić następujące parametry skanowania: Parametr Tryb skanowania Typ dokumentu Kolor Rozdzielczość skanowania Format Resztę dostępnych parametrów zostawić bez zmian. Wartość domowy fotografia kolorowy 600 dpi.jpg 8. Przeprowadzenie analizy uzyskanych chromatogramów przy użyciu programu ImageJ. Postępując zgodnie z instrukcją na stronie 15 przekonwertować chromatogramy plamkowe na pikowe i dokonać analizy otrzymanych chromatogramów przy użyciu programu ImageJ. Wyniki opracować na podstawie wytycznych umieszczonych na stronie 10. 9

Do części pierwszej: OPRACOWANIE WYNIKÓW 1. Obliczyć współczynniki opóźnienia każdej plamki we wszystkich rozwiniętych chromatogramach korzystając ze wzoru: R f = a b gdzie: a odległość środka plamki od linii startu [mm]; b droga przebyta przez czoło rozpuszczalnika [mm]. 2. Na podstawie obliczonych współczynników opóźnienia, kształtu plamek i ogólnej analizy wizualnej chromatogramów ustalić, która faza ruchoma jest najlepsza do analizy GABA i tauryny. Do części drugiej: 1. Na podstawie równań reakcji na stronie 2 i tabelek na stronie 7 oraz 8 obliczyć, ile moli poszczególnej pochodnej powinno znajdować się w każdej naniesionej plamce (przyjąć wydajność reakcji równą 100%). Wyniki podać w pmol/plamka. 2. Wykonać wykresy zależności powierzchni plamek od obliczonych ilości [pmol/plamka] naniesionych na płytkę substancji. Metodą najmniejszych kwadratów ustalić równania prostych i współczynniki R 2. 3. Na podstawie parametrów prostej obliczyć, jaką ilość tauryny i GABA zawierają analizowane próbki. Wyniki porównać z danymi pochodzącymi od poszczególnych producentów. Wysnuć wnioski z przeprowadzonych analiz. Dodatkowo: 1. Analizując całą procedurę analizy za pomocą chromatografii cienkowarstwowej napisać i krótko uzasadnić, co (oprócz fazy ruchomej) może mieć wpływ na uzyskiwane chromatogramy w TLC. 2. Przedstawić najważniejsze zalety i wady TLC względem HPLC. 10

Instrukcja obsługi elektronicznego modułu sterującego evol XR Obsługa modułu sterującego evol XR evol XR jest obsługiwany za pomocą pierścienia dotykowego zawierającego 5 przycisków: 1. Przycisk powrotu; 2. Przycisk OK (zatwierdzenie wyboru); 3. Przyciski nawigacji, i, służące do wyboru; 4. Przycisk napełniania/opróżniania/przemywania strzykawki; 5. Przycisk RUN (START). Pierścień dotykowy jest obsługiwany za pomocą jednej dłoni. Obrotowe ruchy palcem po pierścieniu dotykowym, pozwalają na przesuwanie kursora w górę i w dół wyświetlacza. Montowanie strzykawki analitycznej XCHANGE do elektronicznego modułu sterującego evol XR Używając pierścienia dotykowego wybrać Toolbox z Main Menu. Z opcji Toolbox wybrać Syringe, a następnie Change. Zostanie wyświetlona lista strzykawek. Używając pierścienia dotykowego wybrać strzykawkę o nazwie 5 µl TLC i wcisnąć przycisk. Na ekranie wyświetli się komunikat Change Syringe Now. Press RUN To Continue. W tym momencie należy podnieść czarny kołnierz łącznika XCHANGE (jak pokazano po lewej stronie) i utrzymując go w tej pozycji, wmontować strzykawkę. Po zamontowaniu strzykawki nacisnąć przycisk RUN na pierścieniu dotykowym i poczekać, aż moduł sterujący przestanie wibrować. Programowanie metody wielokrotnego dozowania Z Main Menu wybrać tryb Repeat Dispense. Następnie wybrać Function Edit. Wyświetlona zostaje lista dostępnych edytowalnych opcji: Dispense (Objętość Dozowania); Last Dispense (Objętość Ostatniego Dozowania); Count (Ilość Powtórzeń); Asp Speed (Prędkość Pobierania); Disp Speed (Prędkość Dozowania). Za pomocą okrężnych ruchów palcem na pierścieniu dotykowym podświetlić na czarno pierwszą opcję a następnie kliknąć OK na pierścieniu dotykowym. Wyświetli się niebieska tarcza (pokazana na następnej stronie), w której za pomocą okrężnych ruchów na pierścieniu dotykowym można wybrać żądaną wartość danego parametru. Po dobraniu optymalnej wartości kliknąć OK na pierścieniu dotykowym. Pozostałe parametry ustala się analogicznie. UWAGA: W PRZYPADKU ILOŚCI POWTÓRZEŃ, URZĄDZENIE DODAJE SOBIE DODATKOWE 1 POWTÓRZENIE! 11

Po wybraniu wszystkich wartości dla każdego parametru kliknąć SAVE. Płukanie strzykawki Płukanie strzykawki może odbywać się tylko wtedy, kiedy z Main Menu wybrana jest opcja Dispense lub Repeat Dispense. Po wybraniu jednej z tych dwóch opcji, na pierścieniu dotykowym należy kliknąć PURGE/PRIME, następnie zanurzyć strzykawkę w odpowiednim rozpuszczalniku, a na koniec kliknąć przycisk RUN. Strzykawka w tym czasie automatycznie pobiera i wypuszcza kilkukrotnie porcje rozpuszczalnika, przez cały czas delikatnie wibrując. UWAGA: W TRAKCIE PŁUKANIA NIE NALEŻY WYCIĄGAĆ ZANUŻONEJ W ROZPUSZCZALNIKU STRZYKAWKI! Strzykawkę należy przepłukać przed analizą, po zmianie pobieranej substancji i po zakończonej pracy co najmniej raz wodą dejonizowaną i co najmniej 3 razy metanolem. Aplikacja roztworów na płytki chromatograficzne Po zaprogramowaniu metody wielokrotnego dozowania i przepłukaniu strzykawki można pobrać roztwór do strzykawki. W tym celu należy zanurzyć strzykawkę w odpowiednim roztworze i nacisnąć na pierścieniu dotykowym RUN. Urządzenie zacznie pobierać odpowiednią ilość roztworu. Aby zaaplikować roztwór na płytkę chromatograficzną, należy ponownie kliknąć RUN. Czynność aplikacji jednego roztworu można powtarzać tyle razy, ile ustawiło się w punkcie Count (podczas programowania metody). Przykładowo: Po wybraniu opcji Dispense 0,2 µl; Last Dispense 0,2 µl i Count 10, evol XR pobierze 2,2 µl roztworu, dzięki czemu możliwe będzie 10-krotne naniesienie roztworu w objętości 0,2 µl bez potrzeby ciągłego pobierania. Każde naniesienie roztworu wymaga wciśnięcia RUN na pierścieniu dotykowym. 12

Instrukcja obsługi skanera EPSON Perfection V850 Pro 1. Uruchomić skaner, a następnie program EpsonScan przez podwójnie kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony znajdującej się na pulpicie. 2. W otwartym oknie skanowania wybrać odpowiednie warunki skanowania: Tryb skanowania Typ dokumentu Kolor Rozdzielczość skanowania 3. Po wybraniu parametrów, umieścić chromatogram w skanerze, a następnie kliknąć Podgląd (Preview). Otworzy się nowe okno zawierające podgląd chromatogramu: Następnie powrócić do pierwszego otwartego okna i wybrać Skanowanie (Scan). Otworzy się kolejne okno: 13

Lokalizacja pliku Nazwa skanu Format skanu Wybrać odpowiednią lokalizację pliku, nazwę i format obrazu a następnie kliknąć OK. Po wykonaniu wszystkich czynności skaner zeskanuje chromatogram. 14

Instrukcja obsługi programu ImageJ 4. Uruchomić program ImageJ przez podwójnie kliknięcie lewym przyciskiem myszy ikony znajdującej się na pulpicie. 5. Zeskanowaną płytkę otworzyć w programie Paint i odwrócić jej kolory. 6. Otrzymany chromatogram z odwróconymi kolorami przeciągnąć na okienko programu: Otworzy się nowe okno zawierające chromatogram. 7. W otwartym okienku programu wybrać kwadrat: a następnie w oknie z chromatogramem zaznaczyć pierwsze pasmo, czyli drogę migracji plamek oraz fazy ruchomej od linii startu aż do końca płytki tak, aby wszystkie plamki mieściły się między żółtymi ogranicznikami: 15

8. Po zaznaczeniu pierwszego pasma kliknąć kombinację klawiszy ctrl i 1. W zaznaczonym obszarze pojawi się cyfra 1: kliknąć 1 (pojawi się następny prostokąt) i przesunąć kolejne pasmo : 16

kliknąć kombinację klawiszy ctrl i 2. Postępować tak do momentu, aż wszystkie plamki zostaną umieszczone pomiędzy żółtymi ogranicznikami. 9. Po zaznaczeniu wszystkich pasm program automatycznie włączy następne okno zawierające chromatogramy pikowe: 10. W otwartym okienku programu wybrać linię: a następnie na chromatogramach pikowych zaznaczyć podstawy wszystkich pików: 17

11. Po zaznaczeniu na chromatogramach podstaw wszystkich pików w okienku programu wybrać różdżkę : i kliknąć na wszystkie otrzymane pliki: Po kliknięciu na dany pik, wyświetli się automatycznie okienko zawierające powierzchnię tego piku: Spisać powierzchnie wszystkich. 18

Środki ostrożności Dichlorometan Działa szkodliwie po połknięciu. Działa drażniąco na skórę. Działa drażniąco na oczy. Podejrzewa się, że powoduje raka. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. Może powodować uszkodzenie narządów w przypadku długotrwałego lub powtarzającego się połykania. Kontakt z okiem Natychmiast przepłukać oczy dużą ilością wody, od czasu do czasu podnosząc górna i dolna powiekę. Usunąć szkła kontaktowe, jeżeli są. Należy kontynuować płukanie przez co najmniej 10 minut. Zasięgnąć porady medycznej. Wdychanie Wynieść narażoną osobę na świeże powietrze. Zapewnić osobie ciepło i spokój. Jeżeli osoba nie oddycha, oddycha nieregularnie lub gdy oddychanie ustało, wykwalifikowany personel powinien wykonać sztuczne oddychanie lub podać tlen. Zasięgnąć porady medycznej. W przypadku utraty przytomności, należy ułożyć w pozycji bocznej ustalonej i natychmiast wezwać pomoc medyczną. Zapewnić otwartą wentylację. Rozluźnić ciasną odzież, na przykład kołnierz, krawat lub pasek. W razie wdychania produktów rozkładu powstających podczas pożaru, wystąpienie objawów może być opóźnione. Narażona osoba może wymagać nadzoru lekarskiego przez 48 godzin. Kontakt ze skórą Spłukać skażoną skórę dużą ilością wody. Zdjąć skażoną odzież i buty. Należy kontynuować płukanie przez co najmniej 10 minut. Zasięgnąć porady medycznej. Spożycie Przemyć usta wodą. Wynieść narażoną osobę na świeże powietrze. Zapewnić osobie ciepło i spokój. Jeżeli materiał został połknięty a narażona osoba jest przytomna, należy podać do wypicia małą ilość wody. Przerwać, jeżeli narażona osoba ma mdłości, ponieważ wymioty mogą być niebezpieczne. Nie wywoływać wymiotów, jeśli nie jest to zalecane przez personel medyczny. W przypadku wystąpienia wymiotów, głowa powinna być utrzymywana nisko, tak aby wymiociny nie dostały się do płuc. Zasięgnąć porady medycznej. Nigdy nie podawać niczego doustnie osobie nieprzytomnej. W przypadku utraty przytomności, należy ułożyć w pozycji bocznej ustalonej i natychmiast wezwać pomoc medyczną. Zapewnić otwartą wentylację. Rozluźnić ciasną odzież, na przykład kołnierz, krawat lub pasek. Metanol Wysoce łatwopalna ciecz i pary. Działa toksycznie po połknięciu. Działa toksycznie w kontakcie ze skórą. Działa toksycznie w następstwie wdychania. Powoduje uszkodzenie narządów. Kontakt z okiem Bezzwłocznie zasięgnąć porady medycznej. Natychmiast przepłukać oczy dużą ilością wody przy szeroko odchylonej powiece i kontynuować płukanie przez min 15 minut. Usunąć szkła kontaktowe, jeżeli są i można je łatwo usunąć. Wdychanie Wynieść narażoną osobę na świeże powietrze. Zapewnić ciepło i spokój. Jeżeli osoba nie oddycha, oddycha nieregularnie lub gdy oddychanie ustało, wykwalifikowany personel powinien wykonać sztuczne oddychanie lub podawać tlen. W przypadku utraty przytomności, należy ułożyć w pozycji bocznej ustalonej i natychmiast wezwać pomoc medyczną. Kontakt ze skórą Jeżeli pojawią się jakiekolwiek podrażniania lub inne dolegliwości zasięgnąć porady dermatologicznej. Spłukać skażoną skórę dużą ilością wody z mydłem. Zdjąć skażoną odzież. Spożycie W razie spożycia wywołać wymioty. Natychmiast zapewnić pomoc medyczną. Przemyć usta wodą i następnie wypić dużą ilość wody. Podać do wypicia alkohol etylowy (wódkę 40%) w ilości 100 ml. Nigdy nie podawać niczego doustnie osobie nieprzytomnej. Poszkodowanego ułożyć w bezpiecznej pozycji, przykryć i utrzymać ciepło. Propan-2-ol Wysoce łatwopalna ciecz i pary. Działa drażniąco na oczy. Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. Kontakt z okiem Natychmiast przepłukać oczy dużą ilością wody, od czasu do czasu podnosząc górna i dolna powiekę. Usunąć szkła kontaktowe, jeżeli są. Należy kontynuować płukanie przez co najmniej 10 minut. Zasięgnąć porady medycznej. Wdychanie Wynieść narażoną osobę na świeże powietrze. Zapewnić osobie ciepło i spokój. Jeżeli osoba nie oddycha, oddycha nieregularnie lub gdy oddychanie ustało, wykwalifikowany personel powinien wykonać sztuczne oddychanie lub podać tlen. Zasięgnąć porady medycznej. W przypadku utraty przytomności, należy ułożyć w pozycji bocznej ustalonej i natychmiast wezwać pomoc medyczną. Zapewnić otwartą wentylację. Rozluźnić ciasną odzież, na przykład kołnierz, krawat lub pasek. Kontakt ze skórą Spłukać skażoną skórę dużą ilością wody. Zdjąć skażoną odzież i buty. Jeśli pojawią się objawy, zasięgnąć porady lekarskiej. 19

Spożycie Przemyć usta wodą. Wynieść narażoną osobę na świeże powietrze. Zapewnić osobie ciepło i spokój. Jeżeli materiał został połknięty a narażona osoba jest przytomna, należy podać do wypicia małą ilość wody. Przerwać, jeżeli narażona osoba ma mdłości, ponieważ wymioty mogą być niebezpieczne. Nie wywoływać wymiotów, jeśli nie jest to zalecane przez personel medyczny. W przypadku wystąpienia wymiotów, głowa powinna być utrzymywana nisko, tak aby wymiociny nie dostały się do płuc. Należy wezwać pomoc medyczną w przypadku dalszego występowania objawów lub w przypadku ich nasilania się. Nigdy nie podawać niczego doustnie osobie nieprzytomnej. W przypadku utraty przytomności, należy ułożyć w pozycji bocznej ustalonej i natychmiast wezwać pomoc medyczną. Zapewnić otwartą wentylację. Rozluźnić ciasną odzież, na przykład kołnierz, krawat lub pasek. Azydek sod Połknięcie grozi śmiercią. Działa bardzo toksycznie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. W kontakcie z kwasami uwalnia bardzo toksyczne gazy. Kontakt z okiem Natychmiast przepłukać oczy dużą ilością wody, od czasu do czasu podnosząc górna i dolna powiekę. Usunąć szkła kontaktowe, jeżeli są. Zasięgnąć porady lekarskiej, jeśli pojawi się podrażnienie. Wdychanie Bezzwłocznie zasięgnąć porady medycznej. Wynieść narażoną osobę na świeże powietrze. Zapewnić osobie ciepło i spokój. Jeżeli osoba nie oddycha, oddycha nieregularnie lub gdy oddychanie ustało, wykwalifikowany personel powinien wykonać sztuczne oddychanie lub podać tlen. W przypadku utraty przytomności, należy ułożyć w pozycji bocznej ustalonej i natychmiast wezwać pomoc medyczną. Zapewnić otwartą wentylację. Rozluźnić ciasną odzież, na przykład kołnierz, krawat lub pasek. W razie wdychania produktów rozkładu powstających podczas pożaru, wystąpienie objawów może być opóźnione. Narażona osoba może wymagać nadzoru lekarskiego przez 48 godzin. Kontakt ze skórą Bezzwłocznie zasięgnąć porady medycznej. Spłukać skażoną skórę dużą ilością wody. Zdjąć skażoną odzież i buty. Spożycie Bezzwłocznie zasięgnąć porady medycznej. Przemyć usta wodą. Wynieść narażoną osobę na świeże powietrze. Zapewnić osobie ciepło i spokój. Jeżeli materiał został połknięty a narażona osoba jest przytomna, należy podać do wypicia małą ilość wody. Przerwać, jeżeli narażona osoba ma mdłości, ponieważ wymioty mogą być niebezpieczne. Nie wywoływać wymiotów, jeśli nie jest to zalecane przez personel medyczny. W przypadku wystąpienia wymiotów, głowa powinna być utrzymywana nisko, tak aby wymiociny nie dostały się do płuc. Nigdy nie podawać niczego doustnie osobie nieprzytomnej. W przypadku utraty przytomności, należy ułożyć w pozycji bocznej ustalonej i natychmiast wezwać pomoc medyczną. Rozluźnić ciasną odzież, na przykład kołnierz, krawat lub pasek. Jod Działa szkodliwie po połknięciu. Działa szkodliwie w kontakcie ze skórą. Działa szkodliwie w następstwie wdychania. Działa drażniąco na skórę. Działa drażniąco na oczy. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Powoduje uszkodzenie narządów poprzez długotrwałe lub powtarzane narażenie. Działa bardzo toksycznie na organizmy wodne. Kontakt z okiem Natychmiast przepłukać oczy dużą ilością wody, od czasu do czasu podnosząc górna i dolna powiekę. Usunąć szkła kontaktowe, jeżeli są. Należy kontynuować płukanie przez co najmniej 10 minut. Zasięgnąć porady medycznej. Wdychanie Wynieść narażoną osobę na świeże powietrze. Zapewnić osobie ciepło i spokój. Jeżeli osoba nie oddycha, oddycha nieregularnie lub gdy oddychanie ustało, wykwalifikowany personel powinien wykonać sztuczne oddychanie lub podać tlen. Zasięgnąć porady medycznej. W przypadku utraty przytomności, należy ułożyć w pozycji bocznej ustalonej i natychmiast wezwać pomoc medyczną. Zapewnić otwartą wentylację. Rozluźnić ciasną odzież, na przykład kołnierz, krawat lub pasek. Kontakt ze skórą Spłukać skażoną skórę dużą ilością wody. Zdjąć skażoną odzież i buty. Należy kontynuować płukanie przez co najmniej 10 minut. Zasięgnąć porady medycznej. Spożycie Przemyć usta wodą. Wynieść narażoną osobę na świeże powietrze. Zapewnić osobie ciepło i spokój. Jeżeli materiał został połknięty a narażona osoba jest przytomna, należy podać do wypicia małą ilość wody. Przerwać, jeżeli narażona osoba ma mdłości, ponieważ wymioty mogą być niebezpieczne. Nie wywoływać wymiotów, jeśli nie jest to zalecane przez personel medyczny. W przypadku wystąpienia wymiotów, głowa powinna być utrzymywana nisko, tak aby wymiociny nie dostały się do płuc. Należy wezwać pomoc medyczną w przypadku dalszego występowania objawów lub w przypadku ich nasilania się. Nigdy nie podawać niczego doustnie osobie nieprzytomnej. W przypadku utraty przytomności, należy ułożyć w pozycji bocznej ustalonej i natychmiast wezwać pomoc medyczną. Rozluźnić ciasną odzież, na przykład kołnierz, krawat lub pasek. 20

Wodorotlenek sodu Powoduje poważne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. Kontakt z okiem Natychmiast przepłukać oczy dużą ilością wody, od czasu do czasu podnosząc górna i dolna powiekę. Usunąć szkła kontaktowe, jeżeli są. Należy kontynuować płukanie przez co najmniej 10 minut. Zasięgnąć porady lekarskiej, jeśli pojawi się podrażnienie. Oparzenia chemikaliami powinny być niezwłocznie opatrzone przez lekarza. Wdychanie Bezzwłocznie zasięgnąć porady medycznej. Wynieść narażoną osobę na świeże powietrze. Zapewnić osobie ciepło i spokój. Jeżeli osoba nie oddycha, oddycha nieregularnie lub gdy oddychanie ustało, wykwalifikowany personel powinien wykonać sztuczne oddychanie lub podać tlen. W przypadku utraty przytomności, należy ułożyć w pozycji bocznej ustalonej i natychmiast wezwać pomoc medyczną. Zapewnić otwartą wentylację. Rozluźnić ciasną odzież, na przykład kołnierz, krawat lub pasek. Kontakt ze skórą Spłukać skażoną skórę dużą ilością wody. Zdjąć skażoną odzież i buty. Należy kontynuować płukanie przez co najmniej 10 minut. Jeśli pojawią się objawy, zasięgnąć porady lekarskiej. Oparzenia chemikaliami powinny być niezwłocznie opatrzone przez lekarza. Spożycie Przemyć usta wodą. Wynieść narażoną osobę na świeże powietrze. Zapewnić osobie ciepło i spokój. Jeżeli materiał został połknięty a narażona osoba jest przytomna, należy podać do wypicia małą ilość wody. Przerwać, jeżeli narażona osoba ma mdłości, ponieważ wymioty mogą być niebezpieczne. Nie wywoływać wymiotów, jeśli nie jest to zalecane przez personel medyczny. W przypadku wystąpienia wymiotów, głowa powinna być utrzymywana nisko, tak aby wymiociny nie dostały się do płuc. Należy wezwać pomoc medyczną w przypadku dalszego występowania objawów lub w przypadku ich nasilania się. Oparzenia chemikaliami powinny być niezwłocznie opatrzone przez lekarza. Nigdy nie podawać niczego doustnie osobie nieprzytomnej. W przypadku utraty przytomności, należy ułożyć w pozycji bocznej ustalonej i natychmiast wezwać pomoc medyczną. Rozluźnić ciasną odzież, na przykład kołnierz, krawat lub pasek. 21 Opracował: mgr Arkadiusz Nowicki