W XIX wieku... WITAMY NA KURSIE HISTOLOGII Histologia to nauka o mikroskopowej budowie komórek, tkanek i narządów W XXI wieku... Nasz kurs: Histologia to nauka o powiązaniach struktury mikroskopowej, submikroskopowej i molekularnej komórek, tkanek i narządów z ich funkcją Dział: techniki mikroskopowe Poprzez badanie funkcji komórek i tkanek, histologia jest częściowo zintegrowana z: fizjologią immunologią biochemią biologią molekularną Dział: podstawy histologii tkanek i narządów Podstawowe narzędzie badawcze: mikroskop Źródła wiedzy... METODY PRZYGOTOWANIA MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO DO BADAŃ W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM cz. I www.histologia.cm-uj.krakow.pl regulamin kursu prezentacje wykładowe materiały uzupełniające ogłoszenia wyniki egzaminu repetytorium praktyczne (obrazy preparatów) wydanie z 2011 r. 1
. TYPY PREPARATÓW: PREPARAT MIKROSKOPOWY: przejrzysty (cienki) zabarwiony (skontrastowany) dobrze zachowana struktura skrawki szlify (z tkanek zmineralizowanych) rozmazy (z płynów ustrojowych i zawiesin komórkowych) rozgnioty odciski preparaty całościowe hodowle komórkowe PIERWSZY CEL: UTRWALENIE (dobre zachowanie struktury) Przygotowanie materiału biologicznego do badań mikroskopowych obejmuje kilka etapów, z których każdy służy osiągnięciu pewnego celu Co osiągamy przez utrwalenie materiału: zapobieżenie autolizie poprzez inaktywację enzymów wytrącenie i zachowanie niektórych substancji rozpuszczalnych wstępne utwardzenie materiału UTRWALANIE: Chemiczne aldehydy (formalina, ald. glutarowy) alkohole (metanol, etanol) ketony (aceton) kwasy (octowy, pikrynowy) związki metali ciężkich (sublimat, czterotlenek osmu) Utrwalacze proste i złożone Fizyczne: mikrofale (często w kombinacji z utrwalaczem chemicznym) immersyjne perfuzyjne DRUGI CEL: UTWARDZENIE I KROJENIE (tylko dla skrawków) Przepojenie substancją utwardzającą (zatapianie) parafina celoidyna żywice akrylowe Zamrożenie 2
Parafina, celoidyna i część żywic to substancje niepolarne (nie rozpuszczają się w wodzie). Przygotowywany materiał trzeba zatem stopniowo przeprowadzić ze środowiska polarnego (wodny roztwór utrwalacza) do niepolarnego (1) Odwadnianie (alkohol etylowy lub aceton szereg roztworów o wzrastającym stężeniu) (2) Płyny pośrednie rozpuszczalne zarówno w środowisku odwadniającym jak i w substancji używanej do zatapiania - dla parafiny: rozpuszczalniki organiczne (ksylen, benzen, chloroform) - dla celoidyny: roztwór alkoholu i eteru, octan amylu (3) Zatapianie Utrwalone próbki tkanek umieszcza się w specjalnych kasetkach i przeprowadza przez kolejne płyny albo ręcznie, albo automatycznie w tzw. procesorach tkankowych Zestalenie zatopionego materiału: parafina ochłodzenie celoidyna odparowanie rozpuszczalnika żywice polimeryzacja Tworzy się bloczek z zatopionym materiałem, który można kroić na skrawki ZAMRAŻANIE (technika mrożeniowa) Podczas zamrażania woda w materiale biologicznym ulega krystalizacji. Najmniejsze kryształki, nie uszkadzające struktury komórek i tkanek tworzą się przy bardzo szybkim zamrożeniu do bardzo niskiej temperatury. Dlatego do zamrażania stosujemy: ciekłe gazy (azot, hel) zestalony CO2 (tzw. suchy lód) zamrożoną listwę metalową w kriostacie Można zamrażać i kroić materiał nieutrwalony technika mrożeniowa umożliwia najszybsze uzyskanie preparatów DO KROJENIA SKRAWKÓW SŁUŻĄ MIKROTOMY Podczas krojenia skrawków parafinowych tworzy się wstęga Mikrotom rotacyjny do skrawków parafinowych stolik przedmiotowy nóż mechanizm przesuwu stolika względem noża skrawki parafinowe: 2-10 µm skrawki z żywic: 0.5-2.0 µm 3
Kriostat służy do krojenia skrawków z zamrożonego materiału HISTOLOGIA OGÓLNA (TKANKI) Mikrotom umieszczony w komorze o regulowanej temperaturze ujemnej Temperatura krojenia: od -15 C do -25 C Elementy składowe tkanki: komórki (o podobnym pochodzeniu, zbliżonej strukturze i funkcji) substancja międzykomórkowa (produkowana przez komórki) skrawki mrożeniowe: 4-10 µm Główne rodzaje tkanek zwierzęcych: tkanka nabłonkowa tkanka łączna tkanka mięśniowa tkanka nerwowa FORMY: wyściółki (pokrywające zewnętrzne i wewnętrzne powierzchnie organizmu) Tkanka nabłonkowa gruczoły (zespoły komórek nabłonkowych pełniących funkcje wydzielnicze) Nabłonki nie zawierają naczyń krwionośnych! FUNKCJE: ochronna (np. naskórek) resorbcyjna (np. nabłonek jelitowy) wydzielnicza (np. gruczoły) regulacja transportu przez nabłonek (np. śródbłonek wyścielający naczynia krwionośne) zmysłowa (np. kubki smakowe) W obrębie jednego nabłonka mogą występować różne typy komórek pełniące różne funkcje KLASYFIKACJA NABŁONKÓW Nabłonek jednowarstwowy płaski liczba warstw: - jednowarstwowe - wielowarstwowe kształt komórek: - płaskie - sześcienne - walcowate W klasyfikacji należy zawsze uwzględniać oba kryteria W nabłonkach wielowarstwowych kształt komórek dotyczy warstwy powierzchniowej kontrola transportu Przykładowa lokalizacja: naczynia (śródbłonek), pęcherzyki płucne (pneumocyty), opłucna i otrzewna (międzybłonek) 4
Nabłonek jednowarstwowy sześcienny Nabłonek jednowarstwowy walcowaty wchłanianie, wydzielanie Przykładowa lokalizacja: kanaliki nerkowe, gruczoły i ich przewody wchłanianie, wydzielanie, kontrola transportu, ochrona Przykładowa lokalizacja: przewód pokarmowy, drogi żółciowe, żeńskie drogi rozrodcze, duże przewody wyprowadzające gruczołów Nabłonek wieloszeregowy (wielorzędowy) Odmiana nabłonka jednowarstwowego walcowatego - komórki różnej wysokości (niekiedy różne typy komórek) i/lub jądra na różnych poziomach, ale wszystkie komórki mają podstawy na tym samym poziomie (przylegają do blaszki podstawnej) ochrona, wydzielanie, funkcja zmysłowa Przykładowa lokalizacja: drogi oddechowe, najądrze, kubki smakowe Nabłonek wielowarstwowy płaski Odmiany: nierogowaciejący (wszystkie komórki nabłonka żywe) rogowaciejący (komórki warstwy powierzchniowej martwe, przekształcone w sztywne płytki) ochrona Przykładowa lokalizacja: nierogowaciejący: jama ustna, przełyk, rogówka oka rogowaciejący: naskórek Nabłonek przejściowy (urotelium) Inne nabłonki wielowarstwowe (rzadkie) wielowarstwowy na powierzchni komórki baldaszkowate: niekiedy dwujądrzaste połączenia ścisłe i mechaniczne specyficzna szczytowa błona komórkowa zawierająca sztywne białkowe płytki (białko uroplakina) ochrona (szczelny - bariera osmotyczna, bardzo rozciągliwy) Lokalizacja: drogi moczowe TYP FUNKCJA PRZYKŁADY LOKALIZACJI dwuwarstwowy kontrola przewody wyprowadzające gruczołów sześcienny transportu potowych wielowarstwowy ochronna, rejony przejściowe pomiędzy nabłonkiem sześcienny lub wydzielnicza wielowarstwowym płaskim a jednowarstwowym, walcowaty walcowatym (nagłośnia, odbyt), spojówka, męska cewka moczowa, przewody wyprowadzające dużych gruczołów 5
Odnowa i regeneracja nabłonków Komórki nabłonkowe są spolaryzowane (biegunowe): mają powierzchnię szczytową, boczną i przypodstawną Powierzchnia szczytowa: - mikrokosmki, - migawki, - białka transportowe Powierzchnia boczna: - połączenia międzykomórkowe - kanaliki międzykomórkowe Wszystkie nabłonki mają zdolność do szybkiej odnowy i zawierają niezróżnicowane komórki macierzyste w nabłonkach jednowarstwowych stare komórki obumierają na drodze apoptozy i są zastępowane przez komórki różnicujące się z komórek macierzystych w nabłonkach wielowarstwowych komórki stale migrują z warstw podstawnych do powierzchniowych, gdzie ulegają złuszczeniu Powierzchnia przypodstawna: - połączenia komórka substancja międzykomórkowa - białka transportowe - prążkowanie przypodstawne Struktury występujące na szczytowej powierzchni komórek nabłonkowych: mikrokosmki stereocylia Mikrokosmki nieregularne zawierają wiązki filamentów aktynowych bardzo liczne, regularne = brzeżek szczoteczkowy filamenty aktynowe rzęski (migawki) to wypustki cytoplazmy pokryte błoną komórkową i zawierające elementy cytoszkieletu Funkcja: zwiększają powierzchnię błony, ułatwiając wchłanianie (brzeżek szczoteczkowy jest typowy dla nabłonków resorbcyjnych) sieć krańcowa Stereocylia to długie i grube mikrokosmki występujące na powierzchni niektórych komórek nabłonkowych (w najądrzu, nasieniowodzie i uchu wewnętrznym) Rzęski (migawki) ciałko podstawne korzonek łodyga - część wystająca ponad powierzchnię, zawiera aksonemę (układ mikrotubul) ciałko podstawne (= centriola) korzonek - wiązka włókienek białkowych 6
Układ mikrotubul w aksonemie: neksyna 9 obwodowych dubletów 2 mikrotubule centralne Skoordynowany ruch (metachronia) licznych rzęsek tworzących tzw. brzeżek migawkowy transportuje po powierzchni nabłonka różne obiekty: śluz z przylepionymi cząstkami pyłów w drogach oddechowych oocyty w jajowodzie plemniki w męskich drogach rozrodczych Ruch rzęsek generuje mechanoenzym dyneina, która przesuwa względem siebie pary mikrotubul, powodując czynne zgięcie rzęski. Elastyczna neksyna odpowiada za fazę bierną ruchu (powrót). Połączenia międzykomórkowe Strefa zamykająca (połączenie ścisłe) Strefa zamykająca Strefa przylegania Desmosom Połączenie szczelinowe - połączenia ścisłe: strefa zamykająca (zonula occludens) - połączenia mechaniczne: strefa przylegania (zonula adhaerens) desmosom - połączenia komunikacyjne: połączenie szczelinowe (neksus) Błony sąsiadujących komórek są połączone za pośrednictwem stykających się ze sobą białek transbłonowych (białka łączące) Połączenia mogą występować między komórkami wszystkich tkanek Białka łączące: klaudyny i okludyny Strefa: połączenie w formie ciągłego pasa otaczającego komórkę Strefa zamykająca jest wzmocniona poprzez połączenie z filamentami aktynowymi W mechanicznych połączeniach międzykomórkowych połączone są nie tylko błony komórkowe, ale również elementy cytoszkieletu (poprzez białka pośredniczące) (pośredniczące) jony uczestniczące w połączeniu filament białko ZO klaudyna aktynowy lub okludyna Funkcje: uszczelnienie przestrzeni międzykomórkowych (kontrola transportu) bariera dla ruchu białek błonowych (polaryzacja komórki) transbłonowe białka łączące 7
Strefa przylegania Desmosom filamenty aktynowe białka pośredniczące strefa przylegania białka łączące białka łączące: kadheryny białka łączące: desmogleiny płytka desmosomowa zbudowana z białek pośredniczących filamenty pośrednie Forma lokalna: punkt przylegania Komórki tworzą również połączenia mechaniczne z substancją międzykomórkową (kontakty lokalne, półdesmosomy) Połączenie szczelinowe (neksus) filamenty aktynowe filamenty pośrednie białka pośredniczące jednostka: konekson białka łączące: koneksyny białka łączące: integryny Kontakt lokalny Półdesmosomy Funkcja: umożliwia bezpośrednie przechodzenie substancji niskocząsteczkowych (jonów, cząsteczek sygnałowych, ATP) pomiędzy połączonymi komórkami Kompleksy połączeń międzykomórkowych Połączenia szczelinowe umożliwiają: bezpośrednie przewodzenie bodźców elektrycznych między komórkami szybką wymianę sygnałów chemicznych między komórkami synchronizację procesów metabolicznych i różnicowania (sprzężenie metaboliczne) Listewki graniczne (w niektórych nabłonkach jednowarstwowych): strefa zamykająca strefa przylegania desmosom Zamknięcie koneksonów i przerwanie komunikacji między komórkami następuje w warunkach zagrażających komórce (spadek ph, nadmierny wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca 2+ ). Wstawki (pomiędzy komórkami mięśnia sercowego): strefy przylegania desmosomy neksusy 8
Prążkowanie przypodstawne Blaszka podstawna - jedyna forma substancji międzykomórkowej w tkance nabłonkowej komórka nabłonkowa głębokie fałdy przypodstawnej błony komórkowej, zwiększające jej powierzchnię w fałdach pionowo ułożone mitochondria Funkcja: aktywny transport jonów przez błonę komórkową Białka: laminina kolagen IV entaktyna Proteoglikany: perlekan błona komórkowa blaszka jasna blaszka ciemna integryny Składniki blaszki podstawnej tworzą molekularną sieć kolagen IV laminina entaktyna perlekan Funkcje blaszki podstawnej: przytwierdza nabłonek do podłoża (poprzez połączenie z integrynami komórek nabłonkowych) uczestniczy w regulacji przechodzenia substancji wysokocząsteczkowych do rejonu podnabłonkowego (filtr) ukierunkowuje migrację komórek w procesach rozwoju i regeneracji Blaszki podstawne są też wytwarzane przez komórki innych tkanek Błona podstawna (w niektórych nabłonkach): blaszka podstawna + dodatkowa warstwa włóknisto-siatkowata wytworzona przez tkankę łączna (fibryle z kolagenu III, VII, fibryliny) komórka nabłonkowa blaszka podstawna błona podstawna Gruczoły - zespoły komórek nabłonkowych o specjalizacji wydzielniczej Klasyfikacja: zewnątrzwydzielnicze: kierują wydzielinę do określonego miejsca przez przewody wyprowadzające (np. ślinianki, trzustka, małe gruczoły w ścianie przewodu pokarmowego, dróg oddechowych, w skórze). Posiadają jednostki (odcinki) wydzielnicze i przewody wyprowadzające. Od każdego odcinka wydzielniczego odchodzi przewód wyprowadzający. wewnątrzwydzielnicze: wydzielają do przestrzeni międzykomórkowej, skąd wydzielina (hormon) dostaje się do naczyń krwionośnych, a z krwią do odległych narządów (np. przysadka, tarczyca, nadnercza) Nie posiadają przewodów wyprowadzających, nie są podzielone na jednostki wydzielnicze (wyjątek: tarczyca) Morfologiczna klasyfikacja gruczołów zewnątrzwydzielniczych 1. Ze względu na kształt jednostek (odcinków) wydzielniczych: cewkowe pęcherzykowe cewkowy pęcherzykowy 2. Ze względu na układ odcinków wydzielniczych i przewodów wyprowadzających: proste (nierozgałęziony odcinek wydzielniczy, pojedynczy przewód wyprowadzający) rozgałęzione (rozgałęziony odcinek wydzielniczy) złożone (rozgałęziony układ przewodów proste rozgałęziony złożony wyprowadzających) 9
Klasyfikacja gruczołów zewnątrzwydzielniczych ze względu na sposób wydzielania 1. Wydzielanie merokrynowe (ekrynowe) = egzocytoza Tak wydziela większość gruczołów 2. Wydzielanie apokrynowe Wydzielina lipidowa, nieotoczona błoną. Od szczytowych części komórek odrywają się pęcherzyki zawierające wydzielinę. Gruczoły apokrynowe (zapachowe) skóry, gruczoł mlekowy 3. Wydzielanie holokrynowe Komórki gromadzą wydzielinę, obumierają i rozpadają się na fragmenty. Gruczoły łojowe 10