Struktura, funkcjonowanie i regulacja systemów metabolizmu cukrów u bakterii fermentacji mlekowej.

Tamara Aleksandrzak-Piekarczyk Struktura, funkcjonowanie i regulacja systemów metabolizmu cukrów u bakterii fermentacji mlekowej. AUTOREFERAT 1

1. Imię i Nazwisko: Tamara Aleksandrzak-Piekarczyk 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe / artystyczne z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej. 2004 Doktor Nauk Biologicznych w zakresie biochemii (z wyróżnieniem) Instytut Biochemii i Biofizyki, Polska Akademia Nauk, Warszawa Tytuł rozprawy doktorskiej: Lactose and -glucosides catabolism in Lactococcus lactis biochemistry and genetic regulation. Promotor: Prof. dr hab. Jacek Bardowski 1997 Magister biologii, specjalizacja biologia molekularna Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego Tytuł pracy magisterskiej: Nowe geny katabolizmu laktozy u Lacococcus lactis. Promotor: Prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych / artystycznych. 05/2005 - obecnie IBB PAN na stanowisku asystenta w Zakładzie Biochemii Drobnoustrojów 04/2004-04/2005 IBB PAN na stanowisku biologa w Zakładzie Biochemii Drobnoustrojów 4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. 2016 r. poz. 882 ze zm. w Dz. U. z 2016 r. poz. 1311.): a) tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego: Struktura, funkcjonowanie i regulacja systemów metabolizmu cukrów u bakterii fermentacji mlekowej. b) publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego Na osiągnięcie naukowe składa się cykl siedmiu prac eksperymentalnych, czterech monografii naukowych oraz jednego doniesienia konferencyjnego. IF czasopisma i liczbę cytowań podano wg wskazań WoS Core Collection. W przypadku braku czasopisma w bazie WOS liczbę cytowań podano za bazą Scopus i wskazano to właściwą informacją. IF, impact factor podano dla pięciu lat (IF5) oraz dla roku publikacji, z wyjątkiem najnowszych prac, dla których podano IF z roku 2017 (IF2017). Przy wydawnictwach konferencyjnych pominięto IF czasopisma (zgodnie z Oświadczeniem Ministra Nauki I Szkolnictwa Wyższego w sprawie naruszania zasad dobrej praktyki naukowej przy stosowaniu bibliometrycznego wskaźnika impact factor do oceny dorobku jednostek naukowych z 11.07.2008). * - autor korespondencyjny 2

1. Tymoszewska A, Diep DB, Aleksandrzak-Piekarczyk T* The extracellular loop of Man-PTS subunit IID is responsible for the sensitivity of Lactococcus garvieae to garvicins A, B and C. Scientific Reports. 2018. 8:15790 IF2017: 4,122; IF5: 4,609; Liczba cytowań: 0 2. Aleksandrzak-Piekarczyk T*, Szatraj K, Kosiorek K GlaR (YugA)-a novel RpiR-family transcription activator of the Leloir pathway of galactose utilization in Lactococcus lactis IL1403. Microbiologyopen. 2018. 11:e00714. IF2017: 2,682 IF5: 2,722; Liczba cytowań: 0 3. Tymoszewska A, Diep DB, Wirtek P, Aleksandrzak-Piekarczyk T* The non-lantibiotic bacteriocin Garvicin Q targets Man-PTS in a broad spectrum of sensitive bacterial genera. Scientific Reports. 2017. 7:8359 IF2017: 4,122; IF5: 4,609; Liczba cytowań: 5 4. Aleksandrzak-Piekarczyk T*, Stasiak-Różańska L, Cieśla J, Bardowski J ClaR a novel key regulator of cellobiose and lactose metabolism in Lactococcus lactis IL1403. Applied Microbiology and Biotechnology. 2015. 99(1):337-47 IF2015: 3,376; IF5: 3,602; Liczba cytowań: 5 5. Koryszewska-Baginska A, Bardowski J, Aleksandrzak-Piekarczyk T* Genome sequence of the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus (formerly Lactobacillus casei) LOCK908. Genome Announcements. 2014. Feb 20:2(1) Brak IF; Liczba cytowań: 12 cytowań wg bazy Scopus; brak czasopisma w bazie WoS Core Collection 6. Aleksandrzak-Piekarczyk T*, Koryszewska-Baginska A, Bardowski J Genome sequence of the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus (formerly Lactobacillus casei) LOCK900. Genome Announcements. 2013. Aug 15;1(4) Brak IF; Liczba cytowań: 17 cytowań wg bazy Scopus; brak cytowań czasopisma w bazie WoS Core Collection 3

7. Koryszewska-Baginska A, Aleksandrzak-Piekarczyk T, Bardowski J Complete genome sequence of the probiotic strain Lactobacillus casei (formerly Lactobacillus paracasei) LOCK919. Genome Announcements. 2013. 26(1):5 Brak IF; Liczba cytowań: 19 cytowań wg bazy Scopus; brak cytowań czasopisma w bazie WoS Core Collection. Prace monograficzne (rozdziały w książkach): 8. Kowalczyk M, Mayo B, Fernández M, Aleksandrzak-Piekarczyk T* Updates on metabolism in lactic acid bacteria in light of omic technologies. In: Biotechnology of Lactic Acid Bacteria - second edition. Mozzi F, Raya RR and Vignolo GM (eds). 2016. Liczba cytowań w bazie WoS: 2 9. Aleksandrzak-Piekarczyk T* Lactose and β-glucosides metabolism and its regulation in Lactococcus lactis: a review. In: Lactic acid bacteria - R & D for food, health and livestock purposes. J. Marcelino Kongo (ed.). 2013. 10. Aleksandrzak-Piekarczyk T, Kowalczyk M, Bardowski JK Bacteriocins - alternatives to antibiotics. Chapter in: Biotechnology and Animal Food Quality, Part III, Biotechnology and Quality of Animal Products, (p.160). Peter Chrenek et al., Slovak University of Agriculture in Nitra, Animal Production Research Centre Nitra, ISBN 978-80-552-0965-4. 2013. Strony:99-108. 11. Mayo B, Aleksandrzak-Piekarczyk T, Fernández M, Kowalczyk M, Álvarez-Martín and Bardowski J Updates in the metabolism of lactic acid bacteria. In: Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. Mozzi F, Raya RR and Vignolo GM (eds). Blackwell Publishing, San Miguel de Tucumán, Argentina. 2010. Liczba cytowań wg bazy Scopus: 63 Recenzowane doniesienia konferencyjne: 12. Szatraj K, Bardowski J, Aleksandrzak-Piekarczyk T* The hypothetical YugA protein is involved in the positive regulation of galactose and maltose assimilation in L. lactis IL1403. New Biotechnology. 2016. 3: S211-S211. DOI: 10.1016/j.nbt.2016.06.1449 4

c) omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia wyróżniono niebieskim drukiem. Bakterie mlekowe LAB (ang. lactic acid bacteria) to heterogenna grupa mikroorganizmów, których wspólną cechą jest zdolność do przeprowadzania procesu fermentacji mlekowej, czyli fermentacji różnych węglowodanów z wytworzeniem kwasu mlekowego, jako głównego produktu. Do tej fizjologicznej grupy bakterii zalicza się Gramdodatnie, niesporulujące ziarenkowce lub pałeczki, obejmujące takie rodzaje, jak Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus Tetragenococcus, Vagococcus i Weissella (Stiles and Holzapfel, 1997). Są wszechobecne w wielu bogatych w składniki odżywcze środowiskach, takich jak mleko, mięso, materiał roślinny, a niektóre z nich są stałymi lub czasowymi mieszkańcami przewodu pokarmowego ssaków i innych organizmów. Ze względu na ich zróżnicowany potencjał metaboliczny obejmujący m.in. zdolność do katabolizowania różnych źródeł węgla z wytworzeniem kwasu mlekowego, hydrolizy białek oraz produkcji związków aromatycznych, bakterie mlekowe są stosowane jako kultury starterowe w różnych procesach fermentacji żywności. Znaczenie LAB dla przemysłu spożywczego i społeczeństwa można docenić na podstawie szacunków, że około 8,5 miliarda kg fermentowanego mleka jest rocznie wytwarzanych w Europie, co prowadzi do spożycia przez ludzi 8,5 10 20 LAB (Franz et al., 2010). Zrozumienie mechanizmów metabolizmu węglowodanów i ich regulacji w komórkach LAB ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich ekologii i ewolucji, a także racjonalnego doboru szczepów o znaczeniu przemysłowym i ukierunkowanej modyfikacji właściwości tych mikroorganizmów dla celów biotechnologicznych. Pierwszym etapem metabolizmu węglowodanów jest zazwyczaj ich transport do komórki. W przypadku bakterii, dyfuzja prosta lub ułatwiona mają dużo mniejsze znaczenie niż transport aktywny, w obrębie którego wyróżniamy transport pierwotny, wtórny oraz translokację grupową. W każdym z tych procesów przemieszczenie zachodzi wbrew gradientowi stężeń transportowanych związków, z nakładem energii i udziałem białka transportowego (permeazy). 5

Motorem napędowym transportu pierwotnego jest przekształcanie energii świetlnej lub chemicznej (np. zmagazynowanej w ATP lub innych związkach wysokoenergetycznych) w elektrochemiczną. Transport wtórny napędzany działaniem siły protonomotorycznej. Ze względu na funkcję białka transportującego wyróżnia się uniport, symport i antyport. Uniport to system transportu, w którym do wnętrza komórki przenoszone są cząsteczki tylko jednego typu. W symporcie dochodzi do przenoszenia dwóch (lub więcej) rodzajów cząsteczek w jednym kierunku elektrochemiczny gradient jednej cząsteczki (zazwyczaj protonu lub Na + ), wykorzystywany jest do transportu innej. W antyporcie następuje równoczesne przemieszczanie dwóch cząsteczek w przeciwnych kierunkach (Poolman and Konings, 1993). Ostatni rodzaj transportu ma zupełnie inny charakter. Translokacja grupowa związana jest z chemiczną modyfikacją substratu podczas przechodzenia przez błonę cytoplazmatyczną. Przykład takiego transportu to system fosfotransferazy zależny od fosfoenolopirogronianu (PTS:PEP). Jest to prawdopodobnie najbardziej korzystny pod względem bioenergetycznym system transportu występujący u bakterii. Cukier ulega przeniesieniu przez błonę komórkową i jednoczesnej fosforylacji. Źródłem energii i zarazem dawcą grupy fosforanowej jest jedna cząsteczka PEP (Poolman, 1993). Reszta fosforanowa z PEP przenoszona jest przez kolejne białka: EI, HPr, EII (EIIA, EIIB), a następnie przekazywana do ostatecznego akceptora cukru połączonego z permeazą (EIIC) (Lorca et al., 2015). Podstawowe składniki systemu PTS EI i HPr - są strukturalnie identyczne u wszystkich zbadanych mikroorganizmów i występują w cytoplazmie. Białko EII ma zmienną strukturę w różnego typu systemach PTS. Zazwyczaj składa się z trzech podjednostek (EIIA, EIIB, EIIC), które mogą występować pojedynczo lub łączyć się po dwie, w każdej możliwej kombinacji, lub po trzy. Białko EIIC (permeaza) zakotwiczone jest w błonie komórkowej i umożliwia specyficzny transport węglowodanów (Postma et al., 1993). Większość mikroorganizmów zaadaptowała się do wzrostu w środowisku mleka poprzez nabycie zdolności do wykorzystywania jako źródła węgla najłatwiej dostępnego tam cukru, laktozy. Ten disacharyd, zbudowany z D-galaktozy i D-glukozy połączonych wiązaniem β-1,4-glikozydowym, występuje w mleku ssaków (Fox and McSweeney, 1998). Ze względu na znaczną wydajność i ekonomiczne znaczenie jego fermentacji, wiele badań skupiło się na wykorzystaniu laktozy przez LAB. U bakterii mlekowych efektywne wykorzystanie laktozy jako źródła węgla związane jest z obecnością odpowiednich genów, kodujących poszczególne 6

enzymy laktozo-specyficznego systemu PTS:PEP oraz szlaku tagatozo-6-fosforanowego. W transporcie laktozy do komórki bakteryjnej może uczestniczyć kilka systemów, takich jak fosfotransferaza specyficzna dla laktozy (lac-pts), systemy zależne od białka ABC i wtórne transportery, takie jak antyportery laktozo-galaktozowe i symportery laktozo-h + (de Vos i Vaughan, 1994). Podczas gdy transport laktozy zależny od białka ABC został zidentyfikowany tylko w nienależącej do grupy LAB Gram-ujemnej bakterii Agrobacterium radiobacter (Williams et al., 1992), systemy lac-pts, jak również wtórne systemy transportu laktozy zostały opisane w wielu gatunkach LAB. Lac-PTS ma bardzo wysokie powinowactwo do laktozy i jest bioenergetycznie najbardziej wydajnym systemem transportu, ponieważ jedna cząsteczka tego cukru jest przemieszczana i fosforylowana na jednym etapie, kosztem pojedynczej cząsteczki ATP. Po translokacji przez lac-pts, ufosforylowana laktoza jest hydrolizowana przez P-β-galaktozydazę do glukozy i galaktozy-6-p. Podczas gdy po fosforylacji przez glukokinazę glukoza wchodzi do szlaku glikolitycznego (szlak Embden-Meyerhof-Parnas; EMP), galaktoza-6-p jest metabolizowana w szlaku D-tagatozo-6-P (Tag-6-P). Jego działanie warunkuje obecność trzech enzymów: (i) izomerazy galaktozy-6-p (LacAB); (ii) kinazy tagatozo-6-p (LacC); i (iii) aldolazy tagatozo-1,6-difosforanowej (LacD) (van Rooijen et al., 1991). Uważa się, że opisana zdolność do szybkiej fermentacji laktozy, charakterystyczna dla szczepów mlecznych, została wtórnie nabyta przez szczepy roślinne typu dzikiego, w wyniku ich adaptacji do środowiska mlecznego (Kelly et al., 2010). Inna strategia metabolizmu laktozy przez LAB związana jest z jej pobieraniem przy udziale wtórnych systemów transportu. Systemy te przenoszą laktozę w postaci nieufosforylowanej przez specyficzne permeazy należące do podrodziny LacS (nr TC 2.A.2.2.3) z rodziny GPH (2.A.2 - glycoside-pentoside-hexuronide). W zależności od gatunku bakterii, LacS może pośredniczyć w sprzężonym z H + symporcie laktozy lub w antyporcie laktozy z galaktozą. Wewnątrz komórki laktoza jest hydrolizowana przez β-galaktozydazę (David et al., 1992; Vaughan et al., 1996), w wyniku czego powstaje glukoza i galaktoza. Glukoza jest następnie metabolizowana w szlaku glikolitycznym, podczas gdy galaktoza ulega przemianom różnymi drogami w zależności od konkretnej LAB. I tak, niektóre termofilne LAB (np. Lactobacillus bulgaricus i Streptococcus thermophilus) eksportują powstałą z laktozy galaktozę na zewnątrz komórki, inne LAB (np. Lactobacillus helveticus, Leuconostoc lactis i Streptococcus salivarius) metabolizują ten cukier w szlaku Leloir a (de Vos, 1996; Poolman, 1993; Vaughan 7

et al., 2001). Szlak ten był jednym z pierwszych odkrytych centralnych szlaków metabolicznych i została opisana przez L. F. Leloir a i współpracowników na początku lat 50. XX wieku. Obejmuje ona kluczowy enzym galaktokinazę (GalK), urydylotransferazę galaktozo-1- fosforanową (GalT) oraz 4-epimerazę UDP-galaktozową (GalE), które biorą udział w konwersji galaktozy do glukozo-1-p. Wytworzony glukozo-1-p, po konwersji do glukozo-6-p przez fosfoglukomutazę, wchodzi do szlaku glikolitycznego. Epimeraza-1-aldozy, (mutarotaza; GalM), jest dodatkowym, enzymem niezbędnym do szybkiego metabolizmu galaktozy (Bouffard et al., 1994), który katalizuje interkonwersję α- i β-anomerów galaktozy. Prowadzone przez naszą grupę badawczą poszukiwania genów kodujących wtórne systemy transportu galaktozy wśród szczepów L. lactis wykazały ich niską reprezentację, ponieważ zostały zidentyfikowane tylko w genomach pochodzenia mlecznego szczepu IL1403 (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2018; Bolotin et al., 2001; Szatraj et al., 2016), nie-mlecznego NCDO2054 (Vaughan et al., 1998) i izolowanego z kiełków fasoli KF147 (Siezen et al., 2010). Co godne uwagi, oprócz genów transportu i metabolizmu galaktozy (szlak Leloir a), szczepy te zawierają geny potrzebne do asymilacji laktozy, takie jak lacz (β-galaktozydaza) i laca (acetylotransferaza tiogalaktozydu), tworząc tzw. operon gal-lac. Bezpośrednio powyżej wspomnianych genów wymaganych do hydrolizy laktozy i późniejszej konwersji galaktozy, ale w ramach wspólnego operonu, znajduje się gen kodujący permeazę LacS. Wszystkie te geny tworzą tzw. system permeazy-β-galaktozydazy (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2018). Fakt odnalezienia w ramach moich badań pełnego systemu metabolizmu laktozy (permeazy-β-galaktozydazy) w genomie L. lactis IL1403 (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2018; Szatraj et al., 2016) był zaskakujący i wydał mi się niezmiernie interesującą obserwacją. Ten modelowy szczep, powszechnie wykorzystywany w badaniach nad LAB, został otrzymany po usunięciu wszystkich plazmidów ze szczepu L. lactis IL594. Ze względu na fakt, że pozbawiono go plazmidu niosącego geny kodujące białka systemu lac-pts oraz szlaku tagatozowego, powszechnie uważa się go za szczep laktozo-negatywny. Z moich wcześniejszych badań, które realizowałam jeszcze w czasie pracy doktorskiej, i które opisuję tutaj w celu przedstawienia tematu moich badań w szerszym kontekście, wynikło jednak, że L. lactis IL1403 zaczyna powoli rosnąć w pożywce zawierającej laktozę, jako jedyne źródło węgla, ale dopiero po około 40 godzinach inkubacji (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2005). Postawiłam dwie hipotezy na temat przyczyn tej niewydajnej asymilacji laktozy: (i) mało wydajny transport laktozy z powodu niskiego powinowactwa LacS do laktozy i / lub (ii) nieefektywna hydroliza laktozy z powodu 8

niskiej funkcjonalności β-galaktozydazy. Przeprowadzone analizy wskazały, iż gen lacs z L. lactis IL1403 wykazuje bardzo wysokie podobieństwo do galp z laktozo-ujemnego szczepu L. lactis MG1363. Obydwie permeazy, kodowane przez w/w geny, należą do tej samej podrodziny (TC # 2.A.2.2.3), która obejmuje transportery specyficzne dla transportu galaktozy, w przeciwieństwie do permeaz LacS, które należą innej podrodziny (TC # 2.A.2.2.1) i mają udowodnioną rolę w wydajnym pobieraniu laktozy. Brak zaangażowania LacS w transport laktozy potwierdza fakt, że mutacja w lacs miała niewielki wpływ na asymilację laktozy przez L. lactis IL1403 (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2005). Kolejną przyczyną niewydajnego wzrostu na laktozie, pomimo posiadania pełnego układu permeaza-β-galaktozydaza i aktywnego szlaku Leloir a, mogła być niska aktywność enzymu β-galaktozydazy. Przeprowadzona przeze mnie analiza porównawcza białek LacZ z L. lactis IL1403 i ze szczepu NCDO2054, w którym ten enzym posiada znaczną aktywność, wykazała wysokie podobieństwo obu sekwencji aminokwasowych (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2005). Jednakże badania wskazują, że pomimo tak wysokiego podobieństwa na poziomie sekwencji aminokwasowych, gen lacz z L. lactis IL1403 może ulegać niewydajnej ekspresji lub jego produkt białkowy, enzym, może być bardzo słabo aktywny / nieaktywny, ponieważ ten szczep nie wykazuje aktywności β-galaktozydazy (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2005). Idąc tym tropem, w kolejnych pracach wykazaliśmy, że komplementacja w L. lactis IL1403 w układzie in trans chromosomalnego lacz przez gen kodujący aktywną β-galaktozydazę nie poprawiła wydajności asymilacji laktozy. Taki wynik wskazuje, iż brak aktywności β-galaktozydazy nie jest jedyną przeszkodą w zdolności szczepu do wydajnego fermentowania laktozy i dodatkowo wspiera hipotezę, iż pierwotną przyczyną braku wydajnego wykorzystania laktozy jest galaktozo-specyficzna permeaza LacS, która wykazuje nikłe powinowactwo do laktozy i funkcjonuje głównie jako transporter galaktozy (Aleksandrzak-Piekarczyk, 2013; Aleksandrzak- Piekarczyk et al., 2018). Poza środowiskiem mleka, powierzchnie roślin i fermentujący materiał roślinny są również ważnymi ekosystemami zajmowanymi przez LAB. Postuluje się nawet, że rośliny stanowią pierwotne środowisko bytowania tej grupy bakterii, z którego zasiedliły wtórnie inne biotopy takie jak mleko i przewody pokarmowe różnych organizmów. W porównaniu do środowiska mleka, materiał roślinny różni się bardzo pod względem składu chemicznego, wykazując na przykład znacznie niższe stężenie białka i szerszą dostępność węglowodanów innych niż laktoza. Wśród nich wyróżnia się m. in. cukry należące 9

do β-glukozydów (cząsteczek składających się z dwóch jednostek połączonych wiązaniem β- 1,4-glukozydowym) np. arbutyna, celobioza, eskulina i salicyna. Zdolność roślinnych szczepów L. lactis do wykorzystania tak dużej różnorodności węglowodanów roślinnych znajduje odzwierciedlenie w ich genomach i zdolnościach fermentacji cukrów. Porównanie laktokoków związanych ze środowiskami mleka z roślinnymi wskazuje, że te ostatnie mają większą liczbę genów zaangażowanych w transport i hydrolizę węglowodanów, co powoduje ich zwiększoną zdolność do fermentacji cukrów (Siezen et al., 2008). We wcześniejszych badaniach, których wyniki stanowią w niektórych aspektach punkt wyjścia do badań prowadzonych w ramach tej rozprawy habilitacyjnej, wykazałam, iż L. lactis IL1403 może wykorzystywać szeroki zakres β- glukozydów (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2011). Przeprowadzona analiza funkcji genów chromosomalnych tego szczepu wskazała, że potencjał katabolizmu tych cukrów może być niesiony przez przynajmniej pięć genów lub operonów, które kodują permeazy EIIC β- glukozydo-specyficznych systemów PTS, zaangażowanych w transport β-glukozydów. Dwa z nich kodują trójskładnikowe EIIABC PTS (PtbA i YedF), kolejne trzy to pojedyncze permeazy EIIC (CelB, PtcC i YidB). Ponadto, spośród grupy białek uczestniczących w fosforylacji β- glukozydów zidentyfikowano jeden składnik EIIA (PtcA) i jeden składnik EIIB (PtcB). CelB, PtcA, PtcB, PtcC i YidB należą do rodziny Lac (TC nr 4.A.3), która obejmuje kilka transporterów laktozy z bakterii Gram-dodatnich, jak również E. coli. Udział permeaz CelB i PtcC w transporcie celobiozy został eksperymentalnie przez nas potwierdzony w L. lactis IL1403 (Rys. 1; Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2011). Chociaż L. lactis IL1403 ma tak dużą liczbę systemów PTS specyficznych dla β-glukozydów, CelB jest jedyną permeazą niezbędną w internalizacji celobiozy, podczas gdy PtcC, wydaje się nie uczestniczyć w transporcie tego, jak i innych cukrów (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2011). Przeprowadzone przez nas badania ekspresji ptcc wskazały na brak jego transkrypcji, co może stanowić powód braku zaangażowania tego genu w metabolizm cukrów. Z drugiej strony wykazaliśmy, że składniki EIIAB, mianowicie PtcA i PtcB, są bardziej uniwersalne, uczestnicząc w metabolizmie licznych cukrów (arbutyna, celobioza, glukoza, salicyna) w L. lactis IL1403 (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2011). Z kolei białko EIIABC PtbA bierze udział w transporcie arbutyny, eskuliny i salicyny, ale nie wykazuje powinowactwa do celobiozy u L. lactis IL1403 (Rys. 1). Wykazaliśmy, że w tym szczepie inaktywacja genu ptba doprowadziła do poważnych defektów wzrostu w podłożu wzbogacanym każdym z tych trzech cukrów (Aleksandrzak-Piekarczyk, 2013). 10

Istotne siedlisko zamieszkiwane przez LAB stanowią przewody pokarmowe zwierząt. Spośród grupy bakterii fermentacji mlekowej, w jelitach stałymi rezydentami są szczepy bakterii należących do rodzaju Lactobacillus. Pomimo specyficznych warunków tego środowiska odnośnie zawartości substancji odżywczych (w dużej części łatwo wchłanialne substancje proste) wydaje się, iż rezydenci nie utracili możliwości katabolizmu β-glukozydów. W ramach badań prowadzonych na trzech szczepach LAB pochodzenia jelitowego uzyskaliśmy pełne sekwencje genomowe szczepów należących do gatunków Lactobacillus casei i Lactobacillus rhamnosus, które są składnikiem probiotycznego preparatu Latopic (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2013; Koryszewska-Baginska et al., 2013; Koryszewska- Baginska et al., 2014). Sekwencje te zostały zdeponowane przez nas w bazie GenBank i są często wykorzystywane do badań porównawczych przez innych badaczy. Przeprowadzona analiza otrzymanych sekwencji genomowych ukierunkowana na identyfikację genów systemów PTS zaangażowanych w transport β-glukozydów wskazuje na obecność w tych szczepach aż od 8 do 10 specyficznych dla β-glukozydów permeaz EIIC. Analizy innych sekwencji szczepów jelitowych i innego pochodzenia szczepów Lactobacillus casei i Lactobacillus rhamnosus zdeponowanych w GenBanku wskazują na podobną reprezentację tych genów. Odmienną sytuację zaobserwowaliśmy analizując zsekwencjonowany przez nas genom (nieopublikowane dane) innego gatunku LAB Lactobacillus salivarius. W genomie tej bakterii, jak i genomach innych szczepów tego gatunku zdeponowanych w GenBanku, zidentyfikowaliśmy tylko jedną specyficzną dla β-glukozydów permeazę EIIC. Zatem, w przypadku Lactobacillus casei i Lactobacillus rhamnosus tak duża liczba β-glukozydospecyficznych permeaz może sugerować, że gatunki te są raczej stabilnymi rezydentami obfitujących w te cukry materiału roślinnego, natomiast przewody pokarmowe zasiedlają tylko czasowo. Z drugiej strony redukcja liczby transporterów β-glukozydów u Lactobacillus salivarius może sugerować, że u tego gatunku w wyniku przystosowania się do zamieszkiwanej przez niego niszy, nastąpiła redukcja zdolności do katabolizmu tych cukrów. Po translokacji przez błonę komórkową przy udziale PTS, P-β-glukozyd jest hydrolizowany przez P-β-glukozydazę do glukozy i glukozo-6-p lub odpowiedniego aglikonu (Tobisch el al., 1997). Istnieje wiele genów kodujących P-β-glukozydazy, obecnych w chromosomach szczepów bakterii fermentacji mlekowej, zwłaszcza tych bytujących na roślinach. Ich duża liczba jest prawdopodobnie wynikiem adaptacji tych bakterii do życia na roślinach obfitujących w β-glukozydy, z których wtórnie zasiedliły przewody pokarmowe 11

zwierząt i mleko. W genomie L. lactis IL1403 zidentyfikowano sześć genów kodujących β- glukozydazy, z czego dwa kodują P-β-glukozydazy specyficzne wobec ufosforylowanych β- glukozydów, czyli takich, które do komórki zostały przetransportowane za pomocą systemu PTS, lub ufosforylowane wewnątrz komórki za pomocą odpowiednich enzymów. Wykazaliśmy, że jedna z nich, P-β-glukozydaza BglS, jest odpowiedzialna za hydrolizę celobiozy, ale nie salicyny, w L. lactis IL1403 (Rys. 1; Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2005). Z drugiej strony, żadnej funkcji nie przypisaliśmy innej P-β-glukozydazie kodowanej przez gen bgla tworzący jeden operon z ptcc. Mutacja bgla nie wpływała na wzrost niosącego tę mutację szczepu L. lactis IL1403 w pożywce uzupełnionej szeroką gamą cukrów (Aleksandrzak- Piekarczyk, 2013). Białka zaangażowane w transport i hydrolizę rożnych cukrów zwykle wykazują dużą specyficzność w stosunku do metabolizowanego substratu. Odrębne systemy dedykowane wyłącznie laktozie, i inne dla różnych β-glukozydów, zostały opisane w literaturze naukowej (Aleksandrzak-Piekarczyk, 2013). W trakcie prowadzonych przez nas badań zidentyfikowaliśmy w L. lactis IL1403 unikatowy system PTS, który wykazuje powinowactwo zarówno do celobiozy, jak i laktozy. Wykazaliśmy, że ten alternatywny, do opisanych dotychczas, system metabolizmu laktozy stanowią produkty genów celb, ptcba oraz bgls wykazujące homologię odpowiednio do permeazy, przenośników grup fosforanowych i P-βglukozydazy. Szczegółowe badania dotyczące analiz funkcjonalnych tego systemu zostały opisane w przeze mnie w publikacji z 2011 (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2011). Ze względu na fakt, że część tych doświadczeń prowadziłam jeszcze w czasie realizacji pracy doktorskiej, a drugą część po jej zakończeniu, a rozdzielenie tych badań byłoby trudne do opisu, zdecydowałam nie włączać tej pracy do listy publikacji wchodzących w skład osiągnięcia naukowego, jednak opisuję tutaj część wyników, bo stanowią punkt wyjścia do niektórych badań prowadzonych w ramach rozprawy habilitacyjnej. Badania te ujawniły, że zidentyfikowany przeze mnie alternatywny system katabolizmu laktozy jest powiązany z katabolizmem celobiozy i uwarunkowany podwójną specyficznością CelB i BglS, które mają powinowactwo zarówno do celobiozy, jak i laktozy (Rys. 1; Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2011). Poprzez badania funkcjonalne mutantów delecyjnych, analizy ekspresji genów i testy enzymatyczne wskazaliśmy, że mechanizm transportu laktozy przez CelB zależy od indukcji permeazy przez celobiozę (celobiozo-indukowalny system metabolizmu laktozy), a z kolei hydroliza obu cukrów jest możliwa dzięki podwójnej aktywności BglS jako P-β-glukozydazy i 12

P-β-galaktozydazy (Rys. 1; Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2005; 2011). Co więcej, wykazano, że u L. lactis IL1403 ten alternatywny system katabolizmu laktozy podlega ścisłej kontroli przez nadrzędny regulator represji katabolicznej białko CcpA (Rys. 1). Jest to kontrola negatywna, ponieważ inaktywacja genu ccpa prowadzi do derepresji transkrypcji genów bgls, celb, ptca i ptcb, znosząc represję glukozową i umożliwiając wykorzystanie laktozy przez szczep mutanta (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2011). W ten sposób wykazaliśmy, że laktozo-negatywny szczep L. lactis IL1403 można jednak zaindukować do wydajnego metabolizmu laktozy poprzez mutację genu ccpa lub dodatek niewielkiego (indukującego) stężenia celobiozy. W prowadzonych przeze mnie badaniach genów / operonów L. lactis IL1403 zaangażowanych w metabolizm szerokiej gamy cukrów uwzględniłam również badania mechanizmów regulujących procesy transkrypcji genów zaangażowanych w metabolizm cukrów. W celu przeprowadzenia tych badań wnioskowałam o ich finansowanie z agencji NCN w ramach programu OPUS, które uzyskałam w 2011 roku, a w poniższym opisie przedstawię najistotniejsze osiągnięcia uzyskane w wyniku realizacji projektu. W bakteriach transkrypcja może być aktywowana lub reprymowana przez różne czynniki transkrypcyjne (TF), które rozpoznają specyficzne elementy DNA (operatory) w regionach promotora regulowanych genów. Zbiór genów lub operonów znajdujących się pod bezpośrednią kontrolą tego samego TF jest zdefiniowany jako regulon. Zestaw wszystkich regulonów w pewnym organizmie tworzy transkrypcyjną sieć regulacyjną. W ostatnich latach liczba poznanych sekwencji genomowych LAB znacznie zwiększa się. W każdej sekwencji część genów koduje białka dedykowane regulacji transkrypcji. Analiza zsekwencjonowanych przedstawicieli LAB wskazuje, iż zawartość TF mieści się w zakresie od około 3,5% (np. Streptococcus thermophillus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus helveticus) do 7,5% (Lactobacillus plantarum) całego proteomu. Ponadto, w obrębie genomu LAB, całkowita liczba TF zmienia się znacząco w zależności od gatunku i waha się od około 60 (S. thermophilus i L. helveticus) do aż 240 (L. plantarum). W 30 genomach rzędu Lactobacillales, potencjalne TF należą do 49 rodzin białek regulacyjnych, a około 90% z nich należy do 24 głównych rodzin z co najmniej dwoma przedstawicielami kodowanymi w genomie. Największa liczba reprezentantów rodzin TF jest przypisana rodzinie Xre (łącznie 298 TF). Liczba przedstawicieli rodziny Xre osiąga kilkanaście, a nawet kilkadziesiąt na genom. Inne rodziny są znacznie słabiej reprezentowane, a te, które mają co najmniej czterech przedstawicieli na genom, obejmują rodziny TetR, GntR, MarR, OmpR, LacI, LysR, MerR i AraC (Kowalczyk et al., 2015; Ravcheev et al., 2013). Na 13

podstawie ich specyfiki wyodrębniono dwie grupy regulatorów, nadrzędne (globalne) i drugorzędne (lokalne, wtórne). W większości bakterii Gram-dodatnich o niskiej zawartości GC głównym regulatorem nadrzędnym jest białko CcpA (Control Catabolite Protein), które działa poprzez wiązanie z 14-nukleotydowymi sekwencjami DNA określanymi jako cre (catabolite responsive element), przeprowadzając aktywację (CCA) lub represję (CCR) transkrypcji około 15% genów gospodarza. Miejsca cre znajdują się w regionach promotorowych genów podlegających CCR i CCA, a wiązanie przez nie CcpA jest silnie stymulowane przez białko HPr ufosforylowane w miejscu Ser46. W szczepach L. lactis wykazano, że CcpA hamuje transkrypcję różnych genów związanych z metabolizmem β-glukozydów, fruktozy, galaktozy i laktozy oraz aktywuje operon glikolityczny (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2005; Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2011, Barrière el al., 2005, Luesink el al., 1998, Monedero el al., 2001). Katabolizm cukrów może być również kontrolowany przez działające lokalnie regulatory, powszechne w LAB i należące do różnych rodziny białek takich jak LacI, LysR, AraC, GntR, DeoR, RpiR lub BglG. W laktokokach regulatory należące do niektórych z tych rodzin przeprowadzały pozytywną lub negatywną kontrolę genów zaangażowanych w wykorzystanie cukrów, takich jak α-galaktozydy, β-glukozydy, fruktoza, laktoza, maltoza, sacharoza i ksyloza. Opisanego powyżej przeglądu prac dotyczących dotychczasowego stanu wiedzy na temat mechanizmów regulacji transkrypcji ze szczególnym uwzględnieniem metabolizmu cukrów w bakteriach fermentacji mlekowej dokonałam w dwóch monografiach stanowiących rozdziały w książkach cytowanej już powyżej Updates on metabolism in lactic acid bacteria in light of omic technologies (Kowalczyk et al., 2015) oraz Updates in the metabolism of lactic acid bacteria (Mayo et al., 2010). Kolejne dwie prace, które opisuję poniżej powstały w wyniku badań eksperymentalnych prowadzonych w ramach realizacji otrzymanego przeze mnie w 2011 finansowania projektu badawczego OPUS. O ile regulacja operonu bglah została już wcześniej opisana i udowodniono wpływ należącego do rodziny BglG antyterminatora transkrypcji BglR (Bardowski et al., 1994), to regulacja ekspresji genów celb, ptcb, ptca, bgls oraz operonu gallac nie była dotychczas poznana. Wyniki badań hipotetycznego regulatora transkrypcji, białka YebF, wskazały na jego nadrzędną rolę w celobiozo-zależnej aktywacji genów regulonu celb i bgls (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2015). Białku temu, ze względu na pełnioną przez niego funkcję, nadaliśmy nową nazwę, mianowicie ClaR (Celobiose-lactose metabolism Regulator) (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2015). Regulator ten należy do rodziny regulatorów RpiR, która 14

obejmuje białka wiążące ufosforylowane cukry (Sorensen i Hove-Jensen, 1996), a poza domeną wiążącą cukier (Sugar ISomerase domain; SIS) niesie domenę wiążącą DNA (HTH; Helix-Turn-Helix). Wykazano, że delecja clar spowodowała całkowitą niezdolność mutanta do fermentacji celobiozy i laktozy. Dodatkowo, w odpowiedzi na obecność celobiozy i ClaR, odnotowano wysoki poziom ekspresji bgls, celb i, w mniejszym stopniu, ptca i ptcb. Taki efekt nie był obserwowany gdy w podłożu zastosowano inny niż celobioza cukier (np. glukoza, galaktoza) lub kiedy testowano ekspresję genów w nieobecności ClaR (w mutancie clar) (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2015). Na podstawie otrzymanych wyników zaproponowaliśmy model katabolizmu, w którym celobioza lub laktoza, ufosforylowane przez PtcAB, wiążą się z domeną SIS ClaR. Takie połączenie może powodować zmianę konformacji tego TF i umożliwić jego wiązanie z odpowiednimi regionami DNA, co efekcie skutkuje zależną od ClaR aktywacją ekspresji genów. Stawiamy hipotezę, że poprzez ten mechanizm w obecności celobiozy lub laktozy regulowana jest ekspresja bgls i celb (Rys. 1). Kontynuując badania nad genami regulatorowymi, zidentyfikowanymi przez nas w genomie IL1403, postawiłam hipotezę, że kolejnym białkiem o istotnej funkcji w odniesieniu do regulacji ekspresji genów zaangażowanych w metabolizm cukrów jest hipotetyczny regulator transkrypcji YugA. Podobnie jak ClaR, regulator ten należy do rodziny RpiR i ze wzgląd na pełnioną przez niego funkcję, nadałam mu nową nazwę GlaR (Galactose-lactose operon Regulator). W serii różnorodnych eksperymentów, obejmujących testy wzrostowe uzyskanego mutanta glar, analizy poziomu ekspresji genów potencjalnie regulowanych przez GlaR oraz testy EMSA, wykazaliśmy, że białko to, poprzez wiązanie do promotora lacs (Rys. 1), reguluje pozytywnie ekspresję genów położonego poniżej operonu gal-lac, kodującego komponenty szlaku Leloira (galmkte), a ponadto ekspresję genów thga i lacz potencjalnie zaangażowanych w asymilację laktozy (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2018; Szatraj et al., 2016). Postulujemy, że jest to bardzo ścisła regulacja, ponieważ przy nieobecności galaktozy (która jest induktorem tego systemu) lub / i braku funkcjonalnego GlaR (szczep glar) ekspresja lacs jest praktycznie niewykrywalna. Kolejne geny operonu gal-lac w pewnym stopniu uniezależniły się od tej ścisłej regulacji dzięki obecności potencjalnych promotorów transkrypcji, które poprzedzają galm, galt, thga i gale i nie wiążą białka regulatorowego GlaR (Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2018; Szatraj et al., 2016). W wielu bakteriach mannozo-specyficzny PTS jest także głównym systemem odpowiedzialnym za transport innych cukrów takich jak np. glukoza. W trakcie naszych badań 15

prowadzonych w L. lactis IL1403 udowodniliśmy, że w tym szczepie system Man-PTS jest jedynym transporterem mannozy (Rys. 1), natomiast w przypadku glukozy możliwe jest również jej pobieranie przez inne, niepoznane dotąd permeazy (Tymoszewska et al., 2017). Nieoczekiwanym odkryciem w badaniach nad Man-PTS była obserwacja, że system ten jest zaangażowany w oddziaływanie niskocząsteczkowych białek o przeciwbakteryjnych właściwościach (bakteriocyn; Aleksandrzak-Piekarczyk et al., 2013a) z komórkami wrażliwych bakterii. Te obserwacje były impulsem do zapoczątkowania nowego kierunku moich badań, jakim są bakteriocyny i molekularne mechanizmy ich przeciwbakteryjnego działania. Aby realizować te badania przygotowaliśmy we współpracy z ośrodkiem naukowym z Norwegii (Uniwersytet Przyrodniczy w Norwegii (NMBU)) i w 2013 roku otrzymaliśmy finasowanie z NCN pięcioletniego projektu zatytułowanego Molekularne podstawy rozwoju oporności na bakteriocyny u Lactococcus lactis. Ciekawym odkryciem w ramach tych badań wydaje się fakt, iż Man-PTS stanowi receptor dla wielu niehomologicznych i mających odmienne spektra aktywności bakteriocyn. We wcześniejszych pracach wskazano, że składniki tego systemu, białka EIIC i EIID, pełnią funkcję kotwic wiążących bakteriocyny z grupy pediocyn i dwóch innych bakteriocyn (podobnych do laktokokcyny A; LcnA) należących do klasy IId (Diep et al., 2007). Wiązanie bakteriocyny powoduje prawdopodobnie zmianę konformacji tych białek, prowadząc do otwarcia kanału i wycieku wewnątrzkomórkowych substancji drobnocząsteczkowych, co prowadzi do śmierci komórki. W pierwszej z prac dotyczących bakteriocyn (Tymoszewska et al., 2017) udało nam się poszerzyć zakres tych związków oddziałujących z Man-PTS o garwicynę Q, bakteriocynę produkowaną przez Lactococcus garvieae (Rys. 1). Wykazaliśmy, że spektrum przeciwbakteryjnej aktywności tej bakteriocyny oraz jej sekwencja są odmienne od wcześniej analizowanych bakteriocyn odziaływujących z Man-PTS, co sugeruje, że sposób odziaływania bakteriocyna-receptor również jest odmienny. W ramach tej pracy wytypowaliśmy szereg aminokwasów w Man-PTS prawdopodobnie oddziałujących z garwicyną Q, których substytucja prowadziła do wzrostu lub całkowitej oporności na badaną bakteriocynę. Aminokwasy te wydają się nie brać udziału w wiązaniu pediocyn, ani LcnA-podobnych bakteriocyn (Tymoszewska et al., 2017). W kolejnej pracy opublikowaliśmy wyniki, które dostarczają dalsze dowody dla postawionej wyżej hipotezy. Wskazaliśmy, że laktokokowe, kolejne niehomologiczne bakteriocyny garwicyny A, B i C o odmiennych spektrach aktywności przeciwdrobnoustrojowej również wykorzystują Man-PTS jako receptor (Fig. 1; Tymoszewska et al., 2018). Wykazaliśmy, że w odniesieniu do siebie, 16

GarQ, jak i pediocyn, do wiązania na powierzchni komórki bakteriocyny te wykorzystują odmienne aminokwasy podjednostek Man-PTS. Ze względu na obecność licznych transmebranowych domen żadna z podjednostek Man-PTS nie została dotąd skrystalizowana, ani trójwymiarowa struktura tego systemu nie została poznana. Jako pierwsi, za pomocą narzędzi bioinformatycznych, opracowaliśmy trzeciorzędową strukturę tego kompleksu i zaproponowaliśmy sposób jego lokalizacji w błonie komórkowej. Skonstruowane modele 3D Man-PTS EIICD wskazały na transmembranową lokalizację podjednostki EIIC i powierzchniową lokalizację EIID, sugerując ich odmienne funkcje w odniesieniu do bakteriocyn - dokującą (EIID) oraz kanału (EIIC), przez który następuje wypływ zawartości komórki bakterii (Tymoszewska et al., 2018). Ponieważ, bazując na wstępnych analizach in silico, spodziewam się, iż bakteriocyny wiążące Man-PTS tworzą znacznie większą rodzinę niż te cztery badane przez nas dotychczas, moje przyszłe badania skupią się na poszukiwaniu innych peptydów ukierunkowanych na podjednostki błonowe Man-PTS. Ich szczegółowe badania pozwolą zbudować pełen obraz interakcji między bakteriocynę a Man-PTS i może ostatecznie uzasadnić zaproponowanie oddzielnej grupy bakteriocyn, w dodatku do obecnie rozpoznawanych IIa-IId. Ponadto, wyniki uzyskane przez nas w ramach badań nad bakteriocynami i Man-PTS obalają obowiązującą dotychczas tezę, że niehomologiczne bakteriocyny o różnych spektrach aktywności oddziałują z odmiennymi receptorami błonowymi komórek bakterii. Postulujemy, że odziaływanie to jest możliwe ze względu na różnice w sekwencji aminokwasowej / strukturze Man-PTS, które decydują o selektywności wiązania określonych grup bakteriocyn. 17

Rysunek 1. Systemy transportu wybranych cukrów i ich regulacja u L. lactis IL1403. 18

Bibliografia Aleksandrzak-Piekarczyk, T. (2013). Lactose and β-glucosides metabolism and its regulation in Lactococcus lactis: a review, in Lactic Acid Bacteria - R & D for Food, Health and Livestock Purposes, ed. J. M. Kongo (InTech). doi:10.5772/50889. Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Kok, J., Renault, P., and Bardowski, J. (2005). Alternative lactose catabolic pathway in Lactococcus lactis IL1403. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6060 6069. doi:10.1128/aem.71.10.6060-6069.2005. Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Koryszewska-Baginska, A., and Bardowski, J. (2013). Genome sequence of the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus (formerly Lactobacillus casei) LOCK900. Genome Announc. 1, e00640-13-e00640-13. doi:10.1128/genomea.00640-13. Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Kowalczyk, M., and Bardowski, J. (2013a). Bacteriocins - alternatives to antibiotics. Chapter in: Biotechnology and Animal Food Quality, Part III, Biotechnology and Quality of Animal Products, (p.160). Peter Chrenek et al., Slovak University of Agriculture in Nitra, Animal Production Research Centre Nitra, ISBN 978-80-552-0965-4. Pages:99-108. Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Polak, J., Jezierska, B., Renault, P., and Bardowski, J. (2011). Genetic characterization of the CcpA-dependent, cellobiose-specific PTS system comprising CelB, PtcB and PtcA that transports lactose in Lactococcus lactis IL1403. Int. J. Food Microbiol. 145, 186 194. doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2010.12.011. Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Stasiak-Różańska, L., Cieśla, J., and Bardowski, J. (2015). ClaR a novel key regulator of cellobiose and lactose metabolism in Lactococcus lactis IL1403. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 337 347. doi:10.1007/s00253-014-6067-y. Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Szatraj, K., Kosiorek K. (2018). GlaR (YugA) - a novel RpiR-family transcription activator of the Leloir pathway of galactose utilization in Lactococcus lactis IL1403. MicrobiologyOpen. Aug 11:e00714. doi:10.1002/mbo3.714. Bolotin, A., Wincker, P., Mauger, S., Jaillon, O., Malarme, K., Weissenbach, J., et al. (2001). The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403. Genome Res. 11, 731 753. doi:10.1101/gr.169701. Bouffard, G. G., Rudd, K. E., and Adhya, S. L. (1994). Dependence of lactose metabolism upon mutarotase encoded in the gal operon in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 244, 269 278. doi:10.1006/jmbi.1994.1728. David, S., Stevens, H., van Riel, M., Simons, G., and de Vos, W. M. (1992). Leuconostoc lactis beta-galactosidase is encoded by two overlapping genes. J. Bacteriol. 174, 4475 4481. de Vos, W. M. (1996). Metabolic engineering of sugar catabolism in lactic acid bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek 70, 223 242. Diep, D. B., Skaugen, M., Salehian, Z., Holo, H., and Nes, I. F. (2007). Common mechanisms of target cell recognition and immunity for class II bacteriocins. Proc. Natl. Acad. Sci. 104, 2384 2389. doi:10.1073/pnas.0608775104. Fox, P. F., and McSweeney, P. L. H. (1998). Dairy chemistry and biochemistry. 1st ed. London ; New York: Blackie Academic & Professional. Franz, C. M. A. P., Cho, G.-S., Holzapfel, W. H., and Glvez, A. (2010). Safety of Lactic Acid Bacteria, in Biotechnology of Lactic Acid Bacteria, eds. F. Mozzi, R. R. Raya, and G. M. Vignolo (Oxford, UK: Wiley-Blackwell), 341 359. doi:10.1002/9780813820866.ch19. Kelly, W. J., Ward, L. J. H., and Leahy, S. C. (2010). Chromosomal diversity in Lactococcus lactis and the origin of dairy starter cultures. Genome Biol. Evol. doi:10.1093/gbe/evq056. Koryszewska-Baginska, A., Aleksandrzak-Piekarczyk, T., and Bardowski, J. (2013). Complete genome sequence of the probiotic strain Lactobacillus casei (formerly Lactobacillus paracasei) LOCK919. Genome Announc. 1, e00758-13-e00758-13. doi:10.1128/genomea.00758-13. Koryszewska-Baginska, A., Bardowski, J., and Aleksandrzak-Piekarczyk, T. (2014). Genome sequence of the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus (formerly Lactobacillus casei) LOCK908. Genome Announc. 2, e00120-14-e00120-14. doi:10.1128/genomea.00120-14. 19

Kowalczyk, M., Mayo, B., Fernández, M., and Aleksandrzak-Piekarczyk, T. (2015). Updates on metabolism in lactic acid bacteria in light of omic technologies, in Biotechnology of Lactic Acid Bacteria, eds. F. Mozzi, R. R. Raya, and G. M. Vignolo (Chichester, UK: John Wiley & Sons, Ltd), 1 24. doi:10.1002/9781118868386.ch1. Lorca, G. L., Twiddy, T. A., and Saier, M. H. (2015). Lactic acid bacteria: comparative genomic analyses of transport systems, in Biotechnology of LAB, 55 79. doi:10.1002/9781118868386.ch4. Mayo, B., Aleksandrzak-Piekarczyk, T., Fernández, M., Kowalczyk, M., Álvarez-Martín, P., Bardowski, J. (2010). Updates in the metabolism of lactic acid bacteria. In: Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. Mozzi F, Raya RR and Vignolo GM (eds). Blackwell Publishing, San Miguel de Tucumán. Argentina. 10.1002/9780813820866.ch1. Poolman, B. (1993). Energy transduction in LAB. FEMS Microbiol. Rev. 12, 125 147. Poolman, B., and Konings, W. N. (1993). Secondary solute transport in bacteria. Biochim. Biophys. Acta BBA - Bioenerg. 1183, 5 39. doi:10.1016/0005-2728(93)90003-x. Postma, P. W., Lengeler, J. W., and Jacobson, G. R. (1993). Phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphotransferase systems of bacteria. Microbiol. Rev. 57, 543 594. Ravcheev, D. A., Best, A. A., Sernova, N. V., Kazanov, M. D., Novichkov, P. S., and Rodionov, D. A. (2013). Genomic reconstruction of transcriptional regulatory networks in lactic acid bacteria. BMC Genomics 14, 94. doi:10.1186/1471-2164-14-94. Siezen, R. J., Bayjanov, J., Renckens, B., Wels, M., van Hijum, S. A. F. T., Molenaar, D., et al. (2010). Complete genome sequence of Lactococcus lactis subsp. lactis KF147, a plant-associated lactic acid bacterium. J. Bacteriol. 192, 2649 2650. doi:10.1128/jb.00276-10. Siezen, R. J., Starrenburg, M. J. C., Boekhorst, J., Renckens, B., Molenaar, D., and van Hylckama Vlieg, J. E. T. (2008). Genome-scale genotype-phenotype matching of two Lactococcus lactis isolates from plants identifies mechanisms of adaptation to the plant niche. Appl. Environ. Microbiol. 74, 424 436. doi:10.1128/aem.01850-07. Stiles, M. E., and Holzapfel, W. H. (1997). Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. Int. J. Food Microbiol. 36, 1 29. Szatraj, K., Bardowski, J., Aleksandrzak-Piekarczyk, T. (2016) The hypothetical YugA protein is involved in the positive regulation of galactose and maltose assimilation in L. lactis IL1403. New Biotechnology. 3: S211-S211. DOI: 10.1016/j.nbt.2016.06.1449. Tymoszewska, A., Diep, D.B., Aleksandrzak-Piekarczyk, T. (2018). The extracellular loop of Man- PTS subunit IID is responsible for the sensitivity of Lactococcus garvieae to garvicins A, B and C. Sci. Rep. 8:15790. doi:10.1038/s41598-018-34087-2. Tymoszewska, A., Diep, D. B., Wirtek, P., and Aleksandrzak-Piekarczyk, T. (2017). The nonlantibiotic bacteriocin garvicin Q targets Man-PTS in a broad spectrum of sensitive bacterial genera. Sci. Rep. 7. doi:10.1038/s41598-017-09102-7. van Rooijen, R. J., van Schalkwijk, S., and de Vos, W. M. (1991). Molecular cloning, characterization, and nucleotide sequence of the tagatose 6-phosphate pathway gene cluster of the lactose operon of Lactococcus lactis. J. Biol. Chem. 266, 7176 7181. Vaughan, E. E., David, S., and de Vos, W. M. (1996). The lactose transporter in Leuconostoc lactis is a new member of the LacS subfamily of galactoside-pentose-hexuronide translocators. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1574 1582. Vaughan, E. E., Pridmore, R. D., and Mollet, B. (1998). Transcriptional regulation and evolution of lactose genes in the galactose-lactose operon of L. lactis NCDO2054. J. Bacteriol. 180, 4893 4902. Vaughan, E. E., van den Bogaard, P. T. C., Catzeddu, P., Kuipers, O. P., and de Vos, W. M. (2001). Activation of silent gal genes in the lac-gal regulon of Streptococcus thermophilus. J. Bacteriol. 183, 1184 1194. doi:10.1128/jb.183.4.1184-1194.2001. Williams, S. G., Greenwood, J. A., and Jones, C. W. (1992). Molecular analysis of the lac operon encoding the binding-protein-dependent lactose transport system and beta-galactosidase in Agrobacterium radiobacter. Mol. Microbiol. 6, 1755 1768. 20

5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych. 5.1. Prace opublikowane po uzyskaniu stopnia doktora (w spisie nie uwzględniono prac wchodzących w skład osiągnięcia naukowego): W skład prac, których nie uwzględniono w osiągnięciu naukowym wchodzi 15 publikacji eksperymentalnych oraz dwa recenzowane doniesienia konferencyjne. W czterech pracach byłam pierwszym autorem, i również w czterech autorem korespondencyjnym. Wyniki przedstawione w poniższych publikacjach najczęściej zostały otrzymane w ramach realizacji projektów badawczych, w których uczestniczyłam jako kierownik / wykonawca, są efektem moich szerokich zainteresowań naukowych, na których realizację nie uzyskałam dotąd finansowania lub powstały w efekcie mojej współpracy z grupami badawczymi IBB PAN i innych jednostek naukowych. Mój udział w przeprowadzeniu badań do części tych publikacji dotyczył przede wszystkim charakterystyki fizjologicznej i genetycznej nowo wyizolowanych środowiskowych szczepów bakterii fermentacji mlekowej, w tym testów zdolności do metabolizmu sacharydów, adherencji do powierzchni biotycznych i abiotycznych, oporności na zasolenie i zakwaszenie, produkcji bakteriocyn i aktywności przeciwdrobnoustrojowej, oporności na antybiotyki oraz identyfikacji genetycznej bakterii izolowanych z przewodów pokarmowych zwierząt. W wyniku tych prac zidentyfikowano bakterie z rodzaju Lactobacillus o aktywności anty-campylobacter (Kobierecka el al., 2017), o silnej adherencji i przeżywalności w jelicie kurzym po podaniu in ovo (Aleksandrzak-Piekarczyk el al., 2018) i bakterie Lactococcus lactis niosące plazmidy z genami oporności na tetracyklinę (Zycka-Krzesinska el al., 2015), które obecnie wykorzystujemy do konstrukcji unikatowego wektora ekspresyjnego. Z kolei analiza qrt-pcr pozwoliła nam na ilościowe oszacowanie obecności trzech pochodzących z polskiego preparatu probiotycznego szczepów z rodzaju Lactobacillus w jelicie mysim, co, w dodatku do szeregu innych badań, pozwoliło nam na przypisanie poszczególnym szczepom pozytywnego wpływu na integralność enerocytów i co z tym się łączy, wyciszania powstawania reakcji alergicznych (Kozakova el al., 2016). Osobny rozdział badań, który niedawno zapoczątkowałam w naszej grupie badawczej, stanowią publikacje dotyczące charakterystyki bakteriocyn. Bakteriocyny są substancjami, w których pokłada się duże nadzieje w walce z bakteriami patogennymi, w związku z ich wydajnym działaniem przeciwbakteryjnym. Gruntowne badania tych ciągle słabo poznanych związków mogą umożliwić ich szersze zastosowania jako naturalnych konserwantów żywności, i poza tym w farmacji lub nawet medycynie. W badaniach, w których uczestniczyłam m. in. zidentyfikowaliśmy metalo-zależną proteazę jako nowy błonowy receptor, z którym wiążą się niemodyfikowane potranslacyjnie bakteriocyny enterocyna K1 oraz LsbB, oddziałując na Enterococcus faecium oraz Lactococcus lactis (Ovchinnikov el al., 2017; Uzelac el al., 2013). Kolejne prace stanowią zbiór poświęcony globalnym badaniom fenotypowym szerokiej grupy mikroorganizmów. Badania były prowadzone w oparciu o technikę 21