Praca oryginalna Original Article

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 50(4): 317-324 Praca oryginalna Original Article Ocena prognostycznego i predykcyjnego znaczenia wybranych czynników molekularnych u chorych na raka szyjki macicy leczonych napromienianiem i cisplatyną Evaluation of the prognostic and predictive value of the selected molecular factors in patients with cervical cancer treated with radiotherapy and cisplatin Małgorzata Klimek 1, Anna Kruczak 2, Bożena Lackowska 2, Urszula Rychlik 3, Ewa Wójcik 3 1 Klinika Ginekologii Onkologicznej, 2 Zakład Patomorfologii Nowotworów, 3 Zakład Analityki i Biochemii Klinicznej Centrum Onkologii Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie Oddział w Krakowie Streszczenie Oceniono prognostyczne i predykcyjne znaczenie wybranych czynników molekularnych. Retrospektywną analizę przeprowadzono w oparciu o dane 131 chorych na płaskonabłonkowego raka szyjki macicy, w stopniach zaawansowania według klasyfikacji FIGO IB2-IIIB, leczonych napromienianiem i cisplatyną w latach 2003-2008. Oceniono następujące czynniki: populacyjne (wiek), kliniczne (stopień zaawansowania i czas leczenia), laboratoryjne (poziom Hb przed i w trakcie leczenia, poziom SCC-Ag po leczeniu), mikroskopowe (atypowe mitozy, indeks mitotyczny), immunohistochemiczne (P53, P16, Bcl-2, Bax, Cox-2, EGFR, gęstość kapilar, Ki-67), cytofluorometryczne (ploidia, odsetek komórek w fazie S i S+G2M i komórek aneuploidalnych). Analiza jednocechowa wykazała, że znacząco lepsze, 5-letnie przeżycia całkowite dotyczyły chorych w stopniu zaawansowania do IIA, z Hb>9 g/dl, u których poziom SCC-Ag po leczeniu nie był podwyższony i których guz pierwotny charakteryzował się następującymi parametrami: indeks mitotyczny 40/10HPF, ekspresja domeny BP białka P53<12 w skali Remmela, indeks Ki-67<52, odsetek komórek aneuploidalnych poniżej 47, komórek w fazie S 11 i S+G2M<20 a także diploidalnym charakterem. Czas leczenia jako zmienna ciągła był także istotnym czynnikiem. Większość z tych czynników, przy takich samych punktach odcięcia była istotna dla przeżycia bezobjawowego (FIGO, Hb, SCC Ag, Ki-67, MI, % komórek w fazach S i S+G2M, % komórek aneuploidalnych), a także atypowe mitozy. W oparciu o model regresji logistycznej wykazano, że największą szansę na uzyskanie całkowitej, klinicznej regresji nowotworu po radiochemioterapii miały chore, których naciek szyjki macicy charakteryzowała frakcja komórek w fazie S<11%, indeks Ki-67<52% oraz u których poziom SCC-Ag po leczeniu był niepodwyższony. Summary Prognostic and predictive significance of selected molecular factors has been analysed based on retrospective data of 131 patients with squamous cell carcinoma, FIGO stages IB2-IIIB and treated with radiotherapy and cisplatin between 2003 and 2008. The following factors were assessed: population-based (age), clinical (FIGO stage, treatment time), laboratory (Hb level before and during treatment, SCC-Ag after treatment), microscopic (atypical mitoses, mitotic index), immunohistochemical (P53, P16, Bcl2, EGFR, Bax, Cox-2, microvessel density, Ki-67), cytofluorometric (ploidy, S phase and S+G2M phase fraction, % of aneuploidy cells). Significantly better 5-year overall survival was observed in patients with FIGO stage up to IIA, not elevated after treatment SCC-Ag, and those primary tumor characterized by mitotic index 40/10HPF, expression of the BP epitope of P53 protein <12, index Ki-67<52, S phase cell fraction 11%, S+G2M phase cell <20%, % of aneuploid cells <47 and diploid type of tumor. Treatment time as a continuous variable was also important. Most of these factors, with the same cut-off levels were predictors of disease-free survival (FIGO, Hb, SCC-Ag, Ki-67, MI, % of cells in the S and S + G2M phases, % of aneuploid cells) and atypical mitosis. Using logistic regression method, a model was constructed that included the factors significant for achievement of complete clinical remission after treatment completion. The best change for complete clinical regression after treatment have the patients with S phase cell fraction 11% and Ki-67 index <52. Słowa kluczowe: Key words: rak szyjki macicy, czynniki prognostyczne, czynniki predykcyjne, radiochemioterapia cervical cancer, prognostic factors, predictive factors, radiochemotherapy 317

www.diagnostykalaboratoryjna.eu Wstęp Wolniejszy od oczekiwanego spadek zachorowalności i umieralności z powodu raka szyjki macicy w Polsce powoduje, że nasze dane nadal znacząco odbiegają od danych europejskich. Analiza uwarunkowań ekonomicznych, socjalnych i kulturowych przyczyniających się do niewydolności działającego programu badań profilaktycznych, a przede wszystkim proponowane modyfikacje mogą przyczynić się w najbliższych latach do obniżenia (według założeń o połowę) umieralności z powodu raka szyjki macicy. Wyższy poziom szczepień przeciwko wirusowi brodawczaka ludzkiego w połączeniu z kontynuacją efektywnej profilaktyki wtórnej daje realną szansę na spadek również zachorowalności na raka szyjki macicy. Na utrzymującą się, niekorzystną sytuację epidemiologiczną raka szyjki macicy wpływa fakt, że u ponad połowy chorych nowotwór rozpoznawany jest w stadium loko regionalnego zaawansowania (stopnie zaawansowania według FIGO IIB i wyższe). Od kilkunastu lat podstawową metodą leczenia chorych na miejscowo zaawansowanego raka szyjki macicy jest napromienianie od zewnątrz z równoczasowym podawaniem chemioterapii (najczęściej cisplatyna) i brachyterapia. Większość meta-analiz opublikowanych w pierwszej dekadzie XXI wieku wykazała poprawę kilkuletnich przeżyć całkowitych jak i bezobjawowych o kilka-kilkanaście procent u chorych napromienianych i poddanych chemioterapii w porównaniu z wyłącznym napromienianiem. Mimo niewątpliwej poprawy wyników leczenia nieoperacyjnego raka szyjki macicy, nadal u znaczącego odsetka chorych w ciągu 2-3 lat po leczeniu dochodzi do nawrotu nowotworu. Ponadto, jak pokazują dane literaturowe i obserwacje kliniczne u części chorych po zakończeniu radiochemioterapii obserwuje się przetrwały proces nowotworowy. Radiochemioterapia raka szyjki macicy na obecnym etapie osiągnęła stan plateau. Możliwości dalszej poprawy wyników leczenia chorych na miejscowo zaawansowanego raka szyjki macicy wiążą się z nowymi technikami napromieniania, wprowadzeniem leków bardziej skutecznych niż standardowe chemioterapeutyki, w tym leków ukierunkowanych molekularnie. Od ponad dwóch dekad, postęp w zakresie immunohistochemii i biologii molekularnej umożliwia badanie coraz większej liczby czynników molekularnych pod kątem ich przydatności jako czynników o znaczeniu prognostycznym lub predykcyjnym. Wyniki prowadzonych od szeregu lat prac klinicznych oceniających znaczenie prognostyczne czynników molekularnych są rozbieżne. Jak do tej pory, żaden z badanych markerów molekularnych nie wszedł do panelu standardowych badań diagnostycznych u chorych na nieoperacyjnego raka szyjki macicy. Celem przeprowadzonych badań była ocena wybranych biomarkerów pod kątem ich wartości prognostycznej i predykcyjnej u chorych na nieoperacyjnego raka szyjki macicy leczonych napromienianiem i cisplatyną. Wyboru ocenianych biomarkerów dokonano w oparciu o dane literaturowe, możliwość wykonania badań w ośrodku i warunki finansowe związane z przyznanym grantem. Oceniono wpływ następujących grup czynników: populacyjnych (wiek), klinicznych (stopień zaawansowania i całkowity czas leczenia), laboratoryjnych (poziom Hb przed i w trakcie leczenia, poziom SCC-Ag po leczeniu), mikroskopowych (obecność atypowych mitoz, indeks mitotyczny), immunohistochemicznych (ekspresja białka P53, P16, Bcl-2, Bax, Cox-2, EGFR, gęstości mikronaczyń (MVD), Ki-67), cytofluorometrycznych (ploidia, odsetek komórek w fazie S (SF) i S+G2M, odsetek komórek aneuploidalnych). Przedmiotem analizy była ocena wpływu ekspresji analizowanych markerów na przeżycie całkowite i bezobjawowe oraz na szansę uzyskania całkowitej klinicznej regresji nowotworu po leczeniu. Materiał i metody Do przeprowadzenia badań wykorzystano materiał tkankowy przechowywany w blokach parafinowych dostępnych w Zakładzie Patologii Nowotworów krakowskiego oddziału Centrum Onkologii a także wypożyczony z kilkunastu pracowni histopatologicznych z Krakowa i Małopolski. Zakwalifikowany do retrospektywnej analizy materiał dotyczył 131 chorych na płaskonabłonkowego raka szyjki macicy leczonych radykalnie napromienianiem i cisplatyną w krakowskim oddziale Centrum Onkologii Instytutu im. M. Skłodowskiej-Curie w latach 2003-2008. Ponowna ocena histologiczna uwzględniła obecność atypowych mitoz, indeks mitotyczny. Do barwień immunohistochemicznych wykorzystano przeciwciała wykrywające antygeny: COX-2, p16, bax, bcl 2, p53 (klon BP53-12 oraz klon 1801), CD34 komórek śródbłonka, EGFR i Ki- 67. Przy ocenie ekspresji bcl-2, bax, COX-2, EGFR, i P16 oceniano intensywność reakcji w skali od 0 do 3 (0 brak reakcji, 1-reakcja słaba, 2-umiarkowana i 3-silna), oraz odsetek zabarwionych komórek. Reakcję immunohistochemiczną z przeciwciałem przeciwko białku P53 oceniano w oparciu o skalę Remmela i Stegnera (iloczyn punktów przyznanych za intensywność reakcji barwnej i za odsetek pozytywnych komórek). Przy ocenie ekspresji antygenu proliferacyjnego Ki-67 liczono odsetek pozytywnie zabarwionych jąder komórkowych na 100 komórek. Średnia wartość całkowitej liczby mikronaczyń krwionośnych liczona była w 5 polach widzenia pod powiększeniem 100x. W badaniach cytofluorymertycznych określono poprzez indeks DNA (stosunek natężenia fluorescencji dla komórek w fazie G0/G1 populacji badanej do natężenia fluorescencji dla komórek w fazie G0/G1 populacji komórek prawidłowych) stopień aneuploidii. Dla populacji diploidalnej indeks DNA wynosi 1,00. Określono także odsetki komórek raka w fazach S i S+G2M. Analiza statystyczna oceniła przydatność wybranych biomarkerów jako czynników prognostycznych. Za kryterium oceny przyjęto czas przeżycia całkowitego i bezobjawowego. Czas przeżycia obliczano metodą Kaplana-Meiera. Dla oceny istotności stwierdzonych różnic posłużono się testem log-rank. Za poziom istotności statystycznej przyjęto p 0,05. W celu znalezienia punktów odcięcia dla przedziałów zmienności istotnie różnicujących przeżycia, zmienne o charakterze ciągłym przetestowano zarówno jako zmienne ciągłe i jako zmienne skokowe. Analiza krzywych przeżycia dla różnych wartości różnicujących poziomy badanych zmiennych umożliwiła eliminację zmiennych nieistotnych oraz określenie optymalnych wartości odcinających dla zmiennych ciągłych. Wpływ wybranych czynników na przeżycia całkowite i bezobjawowe oceniono przy pomocy modelu proporcjonalne- 318

Diagn Lab 2014; 50(4): 317-324 go ryzyka Coxa. Selekcji ostatecznych czynników rokowniczych dokonano metodą krokową, na drodze eliminacji czynników nieistotnych. Siłę wpływu badanych parametrów przedstawiono jako wartość relatywnego ryzyka hazardu (RRH). W oparciu o model regresji logistycznej podjęto próbę wskazania czynników predykcyjnych. Wyniki Wiek chorych wahał się od 29 do 80 lat, średnia i mediana wynosiły 53,5 i 52 lat odpowiednio. Chore na niezaawansowanego raka szyjki macicy (do stopnia IIA) stanowiły 32,1% (42 chore), wyższe stopnie zaawansowania dotyczyły 89 pacjentek (67,9%). Poziom SCC-Ag oznaczono u 70 chorych. W tej grupie chorych u 56 chorych (80,0%) poziom SCC-Ag po leczeniu był w normie, a u 14 chorych (20,0%) poziom markera pozostał podwyższony. Przyjęto powszechnie akceptowaną wartość odcinającą 2,0 ng/ml. U 89 chorych (67,9%) poziom Hb przed leczeniem był powyżej 12 g/dl, u 42 (32,1%) był poniżej. W trakcie leczenia prawidłowy poziom Hb utrzymywał się u 41 chorych (31,3%), u pozostałych 90 chorych (68,7%) wystąpił okresowy spadek poziomu Hb. Wyniki badań aktywności proliferacyjnej komórek raka wykonanych dla potrzeb przedstawianej pracy przedstawiały się następująco: wartość indeksu mitotycznego (MI) wahała się od 3 do 180/10HPF. Wartości średnia i medialna indeksu mitotycznego wynosiły 40,5 i 40,0 odpowiednio. U 95 chorych (73,1%) stwierdzono obecność atypowych mitoz. Wartości indeksu Ki-67 (MIB-1) wahały się od 14,8 do 93,4. Średnia i mediana wynosiły 52,7 i 52,0 odpowiednio. Gęstość mikrokapilar w guzie (MVD) wahała się od 14,3 do 146,6. Średnia wynosiła 48,7, a mediana 45,0. Wyniki badań cytofluorymetrycznych ocenione dla 120 chorych przedstawiały się następująco: u 85 chorych (70,8%) stwierdzono diploidalny, a u 35 (29,2%) aneuploidalny typ guza. Procent komórek aneuploidalnych wahał się od 6,1 do 91,1. Średnia i mediana wynosiły 32,8% i 27,6% odpowiednio. Procent komórek w fazie S wynosił od 0,1 do 56,3. Średnia i mediana wynosiły 11,9% i 8,2% odpowiednio. Procent komórek w fazie S+G2M wynosił od 0,8 do 56,4. Średnia i mediana wynosiły 15,3% i 11,8% odpowiednio. Wyniki pozostałych badań immunohistochemicznych przedstawiały sie nastepująco: ekspresję P16 stwierdzono u 119 chorych (96,7%), przy czym u 28 chorych (22,8%) wystąpiła reakcja głównie cytoplazmatyczna a u 91 (73,9%) jądrowo/cytoplazmatyczna. U 4 pacjentek (3,3%) nie stwierdzono ekspresji P16. Ekspresję epitopów białka P53 oceniono u 127 chorych. Ekspresję domeny BP53-12 stwierdzono u 115 chorych (90,5%), ekspresję domeny 1801 białka P53 stwierdzono u 78 chorych (61,4%). Ekspresję Bcl 2 wykazano u 28 chorych (22,1%). Ekspresję Bax stwierdzono u 34 chorych (27,0%). Ekspresję białka receptorowego EGFR stwierdzono u 115 chorych (90,5%). Ekspresję Cox-2 stwierdzono u 95 chorych (74,8%). W tabeli I i II zestawiono parametry wpływające znamiennie na wyniki przeżyć całkowitych i bezobjawowych. Analiza jednocechowa wykazała, że znacząco lepsze, 5-letnie przeżycia całkowite dotyczyły chorych w stopniu zaawansowania do IIA, z poziomem Hb>9 g/dl, u których poziom SCC Ag po leczeniu nie był podwyższony i których guz pierwotny charakteryzował się następującymi parametrami: indeks mitotyczny 40/10HPF, ekspresja domeny BP białka P53 <12 w skali Remmela, indeks Ki-67 <52, odsetek komórek aneuploidalnych poniżej 47, odsetek komórek w fazie S 11 i w fazie S+G2M <20 a także diploidalnym charakterem. Czas leczenia jako zmienna ciągła był także istotnym czynnikiem. Większość z tych czynników, przy takich samych punktach odcięcia była istotna dla przeżycia bezobjawowego (FIGO, Hb, SCC-Ag, Ki-67, MI, % komórek w fazach S i S+G2M, % komórek aneuploidalnych), a także atypowe mitozy. Analiza wielocechowa czynników wpływających na przeżycie całkowite i bezobjawowe wykazała, że jedynie podwyższony po leczeniu poziom SCC-Ag miał istotne znaczenie. Dla obu rodzajów przeżyć nie udało się zbudować wielocechowego modelu Coxa zawierającego więcej niż ta jedna zmienna. Przy użyciu metody regresji logistycznej zbudowano model zawierający cechy istotne dla uzyskania całkowitej, klinicznej regresji po radiochemioterapii. Przedstawiono go w tabeli III. Mniejszą szansę (o ponad 60%) na Tabela I Parametry wpływające na wyniki przeżyć całkowitych w badanej grupie 131 chorych na raka szyjki macicy (analiza jednocechowa) Badany parametr Wartość p (log-rank test) FIGO > IIA 0,0226 Hb > 9g/dl 0,0175 Czas leczenia (zm. ciągła) 0,0369 SCC-Ag po lecz. 0,0001 Ki-67 52 0,0062 MI > 40/10HPF 0,0384 P53 BP skala Remmela 12 0,0311 SF > 11 0,0269 S+G2M 20 0,0124 % kom. aneupl. > 47 0,0064 Ploidia 0,0479 Tabela II. Parametry wpływające na wyniki przeżyć bezobjawowych w badanej grupie 131 chorych na raka szyjki macicy (analiza jednocechowa) Badany parametr Wartość p (long-rank test) FIGO>IIA 0,0123 Hb>9g/dl 0,0213 Atypowe mitozy 0,0377 Czas leczenia (zm.ciągła) 0,0121 SCC-Ag po lecz. 0,0012 Ki-67 52 0,0044 MI > 40/10HPF 0,0367 SF > 11 0,0329 S+G2M 20 0,0329 % kom. aneupl.> 47 0,0404 Tabela III. Model regresji logistycznej dla 131 chorych % komórek vs. w normie Ki-67 w fazie S SCC-Ag po <52 vs. 52 11 vs. >11 leczeniu Wartość p 0,0308 0,0411 0,0039 Iloraz szans 0,363 0,385 0,160 95% przedział ufności 0,145-0,909 0,154-0,961 0,047-0,549 319

www.diagnostykalaboratoryjna.eu uzyskanie całkowitej klinicznej regresji mają chore, których guz nowotworowy charakteryzuje się odsetkiem komórek w fazie S przekraczającym 11% i wartością Ki-67 większą niż 52. Ponadto regresja logistyczna wykazała silne, niekorzystne znaczenie utrzymującego się po zakończeniu leczenia onkologicznego podwyższonego poziomu SCC, szansa na uzyskanie całkowitej regresji u tych chorych spada o 84%. Dyskusja Wiedza o czynnikach prognostycznych u chorych na nieoperacyjnego raka szyjki macicy, leczonych napromienianiem i systemowo, głównie cisplatyną pozwala na wyłonienie chorych o złym rokowaniu: dokładna kontrola tej grupy po radiochemioterapii może przyczynić się do wcześniejszego wykrycia niepowodzeń i zastosowania leczenia chirurgicznego, ewentualnie chemioterapii. Być może kontynuacja chemioterapii po zakończeniu radiochemioterapii u chorych z niekorzystnymi czynnikami prognostycznymi wpłynęłaby na dalszą poprawę wyników. Znajomość czynników predykcyjnych przydatnych w codziennej praktyce klinicznej może pomóc wyłonić chore, które mają szansę odnieść największe korzyści z radiochemioterapii. Typowanie przydatnego w praktyce klinicznej zestawu biomarkerów, jest trudnym zadaniem między innymi dlatego, że niektóre z analizowanych parametrów guza to niezależne czynniki i nie zawsze procesy z nimi wiązane przebiegają z podobna tendencją. Na przykład, nie zawsze w parze idzie wysoka aktywność proliferacyjna guza i wczesne ujawnianie się niepowodzeń leczenia. Klasyczne czynniki prognostyczne: Udokumentowane czynniki prognostyczne u chorych na nieoperacyjnego raka szyjki macicy to stan ogólny, anemia, zaawansowanie nowotworu, przerzuty do węzłów chłonnych i średnica nacieku nowotworowego. W odniesieniu do anemii, najistotniejszy, w opinii autorów jest minimalny poziom Hb w trakcie leczenia napromienieniem, mający związek z niedotlenieniem guza i jego mniejszą promieniowrażliwością. Całkowity czas leczenia napromienianiem przekraczający 7-9 tygodni ma istotne, niekorzystne znaczenie prognostyczne a także stopień klinicznej regresji nowotworu po zakończeniu radiochemioterapii. Kliniczną ocenę efektu leczenia przeprowadza się najczęściej między 6 a 12 tygodniem po zakończeniu leczenia, a następnie w toku kolejnych badan kontrolnych. Analiza materiału własnego potwierdziła prognostyczne znaczenie zaawansowania, anemii i czasu leczenia. Atypowe Mitozy: Przeprowadzona analiza wykazała także, że obecność atypowych mitoz wpływa niekorzystnie na przeżycie bezobjawowe. W dostępnej literaturze znaleziono jedno doniesienie dotyczące atypowych mitoz w dysplazji szyjki macicy [1]. Brak możliwości porównania własnych wyników z piśmiennictwem utrudnia ocenę przydatności atypowych mitoz jako rutynowego elementu raportu histopatologicznego. Antygen SCC: Oznaczanie w surowicy stężenia antygenu SCC (SCC-Ag) znajduje zastosowanie na etapie diagnostyki [2-9], monitorowania leczenia [8, 10] i po jego zakończeniu [11-14]. Brak normalizacji SCC-Ag po radiochemioterapii jest niezależnym czynnikiem predykcyjnym dla rozsiewu raka szyjki macicy [13]. Nieliczni autorzy nie widzą potrzeby monitorowania SCC-Ag po leczeniu [15]. W cytowanych pracach zwraca uwagę przyjmowanie różnych punktów odcięcia dla poziomu SCC-Ag: w niektórych pracach jest to górna granica normy przyjmowanej w laboratorium, w innych średnia wartość lub poziom dwu, trzykrotnie powyżej normy. W analizowanej grupie 131 chorych na nieoperacyjnego raka szyjki macicy SCC-Ag powyżej normy, po zakończeniu radiochemioterapii był silnym, niekorzystnym czynnikiem prognostycznym dla przeżycia całkowitego i bezobjawowego jak również czynnikiem predykcyjnym dla całkowitej klinicznej regresji nowotworu. Brak jest danych na temat celowości kontynuowania chemioterapii w tej grupie chorych. Ploidia DNA: Badania nad związkiem między zawartością DNA w komórkach guza, frakcją komórek w fazach S i S+G2M a wynikami leczenia raka szyjki macicy dotyczyły chorych leczonych wyłącznie napromienianiem jak i metodami skojarzonymi. Najczęściej badane parametry to: charakter ploidii (podział guzów na diploidalne i aneuploidalne), odsetek komórek w fazie S, rzadziej odsetek komórek w fazie S+G2M. W opinii części autorów, aneuploidia guzów pierwotnych chorych leczonych napromienianiem z lub bez chemioterapii jest negatywnym czynnikiem prognostycznym [16, 17]. Znaczenie wielkości frakcji komórek w fazach S i S+G2M świadczących o stopniu proliferacji nowotworu jest różnie oceniane, przeważają opinie o niekorzystnym, prognostycznym znaczeniu wysokiej frakcji S [18-21]. W analizowanej grupie 131 chorych na nieoperacyjnego raka szyjki macicy frakcje komórek w fazach S i S+G2M i odsetek komórek aneuploidalnych powyżej przyjętych punktów odcięcia wpływały niekorzystnie na oba analizowane przeżycia. Ponadto, frakcja komórek w fazie S była obok Ki-67 i SCC-Ag czynnikiem predykcyjnym dla całkowitej regresji klinicznej po radiochemioterapii. Ustalenie, w oparciu o badania przeprowadzone niezależnie w różnych ośrodkach, powszechnie akceptowanych wartości granicznych tych parametrów pozwoliłoby na wdrożenie ich do praktyki klinicznych w charakterze badań standardowych. Ki-67, MI: Poza pomiarem frakcji komórek w fazie syntezy, tempo proliferacji guza można oceniać poprzez indeks mitotyczny (MI odsetek komórek w fazie mitozy) i poprzez wykorzystanie przeciwciała monoklonalnego MiB1, które identyfikuje antygen jądrowy Ki-67 wykrywalny w fazach S, G2 i M. Prognostyczne znaczenie ekspresji Ki-67 u chorych na raka szyjki macicy jest różnie oceniane. Część autorów nie wykazała związku między ekspresją Ki-67 a rokowaniem [22-25]. Według innych autorów, wysoka ekspresja Ki-67 jest niekorzystnym czynnikiem prognostycznym [26, 27]. Wysoki MI uważany jest na ogół również za niekorzystny czynnik prognostyczny [28-30]. Brak zgodnej opinii przyczynia się do tego, że w przypadku raka szyjki macicy określenie frakcji wzrostowej komórek nowotworowych nie jest stałym elementem badania histopatologicznego. Interpretację nielicznych raportów histopatologicznych uwzględniających wspomniane informacje utrudnia brak powszechnie przyjętych punktów odcięcia. Analiza 320

Diagn Lab 2014; 50(4): 317-324 jednocechowa materiału własnego wykazała, że przekroczenie ustalonych punktów odcięcia dla indeksu Ki-67 i MI wiązało się z istotnym, niekorzystnym wpływem na przeżycie bezobjawowe i całkowite. Białka regulujące cykl komórkowy i apoptozę: Białka P53, Bcl-2 i Bax kodowane przez odpowiednie geny czuwają nad prawidłowym przebiegiem cyklu komórkowego i apoptozy. Białko P53 nazywane jest powszechnie strażnikiem genomu, co wynika z roli, jaką odgrywa w zachowaniu stabilności materiału genetycznego, jest także czynnikiem transkrypcyjnym dla szeregu genów, w tym biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA i w procesie apoptozy. Część autorów nie wykazała prognostycznego znaczenia ekspresji białka P53 [31, 32]. Inni autorzy wykazali niekorzystne, prognostyczne znaczenie wysokiej ekspresji białka P53 [33-36]. Korzystny wpływ na przeżycie niskiej ekspresji białka P53 ocenianej przed napromienianiem wykazał Oka i wsp. [37]. Analiza materiału własnego wykazała, że poziom ekspresji epitopu BP białka P53 wpływa na przeżycie całkowite chorych napromienianych i leczonych cisplatyną. Prawidłowe białko P53 regulując geny Bax i Bcl-2 wpływa indukująco lub hamująco na przebieg apoptozy. Z dostępnej literatury wynika, że ekspresja białka Bcl-2 występuje nawet u ponad 77% chorych na raka szyjki macicy [38-40]. Cytowani autorzy przyjmowali punkty odcięcia w szerokim zakresie od 5 do 50%. Ekspresję białka Bax przy stosowaniu również bardzo różnych punktów odcięcia stwierdzano w podobnym przedziale częstotliwości [38, 39, 41]. W dostępnym piśmiennictwie nie ma zgodnej opinii o znaczeniu prognostycznym białek regulujących apoptozę. Część autorów wykazała korzystny wpływ ekspresji białka Bcl-2 na przeżycie chorych na raka szyjki macicy, przy braku wpływu białka Bax [40, 41], inni odwrotnie, wskazują na pozytywny wpływ ekspresji Bax i niekorzystny Bcl-2 [39]. W materiale własnym, zarówno dla ekspresji białka Bax jak i Bcl-2 nie udało się znaleźć punktu odcięcia, przekroczenie którego miałoby wpływ na przeżycia chorych. Brak standaryzacji interpretacji wyników badań immunohistochemicznych przyczynia się do niespójnych wniosków z prac. Białko P16: Przeprowadzona analiza materiału własnego wykazała, że ekspresja białka P16, którą stwierdzono u 96,7% chorych nie wpływa na przeżycie bezobjawowe i całkowite badanej grupy chorych. W dostępnej literaturze ekspresja białka P16 stwierdzana u 80-100% chorych na raka szyjki macicy jest uznawana za czynnik wpływający pozytywnie na przeżycie chorych na raka szyjki macicy zarówno operowanych jak i poddawanych radiochemioterapii [42-47]. Zwiększona ekspresja P16 ma związek z białkami E6 i E7 onkogennych wirusów HPV, które mogą wiązać i inaktywować białka supresorowe P53 i Rb. Brak ekspresji białka P16 w nielicznych przypadkach raka szyjki macicy może wynikać z jej utraty w toku progresji zmian przedinwazyjnych i w efekcie prowadzić do formy raka o bardziej agresywnym przebiegu [44]. W przeciwieństwie do danych literaturowych, analiza własnego materiału nie wykazała prognostycznego znaczenia ekspresji P16. Cyklooksygenaza-2: Cyklooksygenaza (COX) jest kluczowym enzymem katalizującym przemianę kwasu arachidonowego do prostaglandyn, prostacyklin i tromboksanów. Indukcja izomeru COX-2 następuje w stanach fizjologicznych i patologicznych jak ostre i przewlekłe reakcje zapalne i nowotwory (121, 122). W nowotworach nadekspresja COX-2 hamuje apoptozę, pobudza neoangiogenezę, powoduje wzrost aktywności metaloproteinaz i wzrost produkcji białek adhezyjnych, wpływa także na zmniejszenie wrażliwości komórek nowotworowych na napromienianie i chemioterapię. W dostępnej literaturze odsetek chorych na raka szyjki macicy wykazujących ekspresję Cox-2 waha się od 24 do ponad 75% [48-51]. W materiale własnym, ekspresja Cox-2 stwierdzona u ponad 74% chorych nie miała prognostycznego znaczenia. Większość autorów badających znaczenie ekspresji tego biomarkera, mimo stosowania różnej klasyfikacji reakcji barwnych, uważa, że wykazanie ekspresji Cox-2 ma negatywny wpływ na przeżycia chorych na raka szyjki macicy leczonych zarówno operacyjnie jak i napromienianiem z udziałem bądź bez chemioterapii [48, 49, 52-56]. Prace, w których nie wykazano prognostycznego znaczenia ekspresji Cox-2 są nieliczne [57-59]. Wyniki analizy materiału własnego są zgodne z nielicznymi doniesieniami o braku prognostycznego znaczenia ekspresji Cox-2 u chorych na raka szyjki macicy. Gęstość mikrokapilar: Wzrost nowotworu, progresja, formowanie ognisk przerzutowych zależą od powstania nowych naczyń krwionośnych (neoangiogeneza). Przebieg angiogenezy zależy od czynników metabolicznych, czynników proangiogennych i antyangiogennych. W szeregu pracach badano nasilenie angiogenezy poprzez ocenę gęstości mikronaczyń (MVD). Autorzy wykorzystywali ocenę ekspresji szeregu antygenów komórek śródbłonka naczyniowego: CD 31, CD 34 i CD 105. Spośród nich najczęściej był wykorzystywany antygen CD 34 [60, 61]. Analiza materiału własnego wykazała, że liczba mikronaczyń w guzie pierwotnym nie miała wpływu na przeżycia chorych. Według części autorów, MVD powyżej przyjętego przez nich punktu odcięcia wiąże się z większym ryzykiem nawrotu u chorych na raka szyjki macicy leczonych napromienianiem z lub bez chemioterapii [62-64]. Według innych autorów duża gęstość mikrokapilar odpowiada dobrze unaczynionemu, dobrze utlenowanemu guzowi i wiąże się z lepszą odpowiedzią na napromienianie i chemioterapię [65, 66]. Szeroki zakres przyjmowanych punktów odcięcia dla MVD (od 10 do 190) oraz stosowanie przeciwciał przeciwko różnym antygenom może wpływać na tak rozbieżne wyniki. EGFR: Receptor czynnika wzrostu naskórka (EGFR), jeden z czterech należących do rodziny receptorów kinazy tyrozynowej (ErbB) znajduje się w błonach komórek nabłonkowych, szeregu komórek mezenchymalnych. Prawidłowy przepływ sygnałów ze środowiska zewnętrznego do wnętrza komórki możliwy jest po związaniu się liganda (czynnika wzrostu) z receptorami rodziny kinazy tyrozynowej. Nadmierną ekspresję receptora stwierdzono w nowotworach o różnej lokalizacji. Aktywacja receptora naskórkowego czynnika wzrostu w tkance nowotworu reguluje wszystkie najistotniejsze dla guza procesy: proliferację, angiogenezę, ochronę przed apoptozą, zapewnia utratę różnicowania, migrację, inwazję [67-70]. W piśmiennictwie, odsetek chorych na raka szyjki macicy ze 321

www.diagnostykalaboratoryjna.eu stwierdzoną ekspresją EGFR waha się od kilku do 100, co związane jest ze stosowaniem różnych technik badania i brakiem jednolitej, powszechnie przyjętej skali oceny ekspresji EGFR. Przyjmowane punkty odcięcia dla oceny ekspresji EGFR wahają się na poziomie od 0 do 50% [71-74]. W materiale własnym ekspresja EGFR obecna u 115 chorych (90.5%) nie miała wpływu na przeżycie chorych: nie udało się znaleźć punktu odcięcia, którego przekroczenie miałoby wpływ na przeżycie całkowite lub bezobjawowe. W literaturze nie ma zgodnej opinii co do prognostycznego znaczenia ekspresji EGFR. W części prac, podobnie jak w materiale własnym nie wykazano wpływu ekspresji EGFR na przeżycie chorych na raka szyjki macicy [74-76]. W innych, autorzy wykazali, że ekspresji EGFR powyżej punktu odcięcia towarzyszą niższe przeżycia chorych na raka szyjki macicy leczonych napromienianiem z lub bez chemioterapii [72, 77, 78]. Wnioski 1. Przeprowadzona analiza potwierdziła znaczenie klasycznych czynników prognostycznych: zaawansowania raka szyjki macicy, poziomu Hb i czasu leczenia. 2. Znamienny wpływ na przeżycie całkowite miały markery proliferacji guza: indeks mitotyczny, ekspresja Ki-67, odsetek komórek w fazach S i S+G2M, aneuploidalna ilość DNA w komórkach guza, wielkość frakcji komórek aneuploidalnych, oraz ekspresja białka P53 i poziom SCC Ag po leczeniu. 3. Istotny wpływ na przeżycie bezobjawowe miały następujące markery proliferacji guza: indeks mitotyczny, ekspresja Ki-67, odsetek komórek w fazach S i S+G2M a także wielkość frakcji komórek aneuploidalnych, poziom SCC-Ag po leczeniu i obecność atypowych mitoz. 4. Dwa markery proliferacji guza: indeks Ki-67 i frakcja komórek w fazie S a także poziom SCC-Ag po leczeniu wpływają istotnie na szansę uzyskania całkowitej regresji klinicznej po zakończeniu radiochemioterapii. Praca powstała dzięki pomocy finansowej Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego: Projekt badawczy nr N N401 077137 Piśmiennictwo 1. Van Leeuwen AM, Pieters WJ, Hollema H et al. Atypical mitotic figures and mitotic index in cervical intraepithelial neoplasia. Virchows Arch 1995; 427: 139-144. 2. Takeda M, Sakuragi N, Okamato K et al. Preoperative serum SCC, CA 125 and CA 19-9 levels and lymph node status in squamous cell carcinoma of uterine cervix. Acta Obstet Gynecol Scand 2002, 81: 451-457. 3. Gadducci A, Cosio S, Capri A et al. Serum tumor markers in the management of ovarian, endometrial and cervical cancer. Biomed Pharmacother 2004; 58: 24-38. 4. Kulpa J, Wojcik E, Reinfuss M i wsp. Carcinoembryonic antygen, squamous cell carcinoma antygen, CYFRA 21-1, and neuron-specific enolase in sguamous cell lung cancer patients. Clin Chem 2002; 48: 1931-1937. 5. Gaarenstroom K, Kenter G, Bonfrer J et al. Can initial serum cyfra 21-1, SCC antigen and TPA levels in sqamous cell cervical cancer predict lymph node metastases or prognosis? Gynecol Oncol 2000; 77: 164-170. 6. Strauss HG, Laban C, Lautenschläger C et al. SCC antigen in the serum as an independent prognostic factor in operable squamous cell carcinoma of the cervix. Eur J Cancer 2002; 38(15): 1987-1991. 7. Takeshima N, Hirai Y, Katase K et al. The value of squamous cell carcinoma antigen as a predictor of nodal metastasis in cervical cancer. Gynecol Oncol 1998; 68(3): 263-266. 8. Ferrandina G, Macchia G, Legge F et al. Squamous cell carcinoma antigen in patients with locally advanced cervical carcinoma undergoing preoperative radiochemotherapy: association with pathological response to treatment and clinical outcome. Oncology 2008; 74(1-2): 42-49. 9. Ogino I, Nakayama H, Okamoto N et al. The role of pretreatment squamous cell carcinoma antigen level in locally advanced squamous cell carcinoma of the uterine cervix treated by radiotherapy. Int J Gynecol Cancer. 2006; 16(3): 1094-1100. 10. Hashimoto K, Yonemori K, Katsumata N et al. Use of squamous cell carcinoma antigen as a biomarker of chemotherapy response in patients with metastatic cervical carcinoma. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2011; 159(2): 394-8. 11. Yoon SM, Shin KH, Kim JY et al. Use of serum squamous cell carcinoma antigen for follow-up monitoring of cervical cancer patients who were treated by concurrent chemoradiotherapy. Radiat Oncol. 2010; 15(5): 78 12. Micke O, Bruns F, Schäfer U et al. The impact of squamous cell carcinoma (SCC) antigen in patients with advanced cancer of uterine cervix treated with chemo- -radiotherapy. Anticancer Res. 2005; 25(3A): 1663-66. 13. Hirakawa M, Nagai Y, Inamine M et al. Predictive factor of distant recurrence in locally advanced squamous cell carcinoma of the cervix treated with concurrent chemoradiotherapy. Gynecol Oncol. 2008; 108(1): 126-29. 14. Hong JH, Tsai CS, Chang JT et al. The prognostic significance of pre and posttreatment SCC levels in patients with squamous cell carcinoma of the cervix treated by radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1998; 41(4): 823-30. 15. Chan YM, Ng TY, Ngan HY et al. Monitoring of serum squamous cell carcinoma antigen levels in invasive cervical cancer: is it cost-effective? Gynecol Oncol. 2002; 84(1): 7-11 16. Susini T, Olivieri S, Molino C et al. DNA Ploidy is Stronger Than Lymph Node Metastasis as Prognostic Factor in Cervical Carcinoma. Int J Gynecol Oncol 2011; 21(4): 678-684. 17. Jakobsen A. Ploidy level and short-time prognosos of early cervix cancer. Radiot Oncol 1984; 1: 271-275 18. Wimberger P, Hillemanns P, Kapsner T et al. Evaluation of prognostic factors following flow-cytometric DNA analysis after cytokeratin labelling: II. Cervical and endometrial cancer. Anal Cell Pathol. 2002; 24(4-5): 147-158. 19. Reich O, Pürstner P, Klaritsch P et al. Prognostic significance of preoperative DNA flow cytometry in surgically-treated cervical cancer. Eur J Gynaecol Oncol. 2003; 24(1): 13-17. 20. Wilailak S, Rochanawutanon M, Srisupundit S et al. Flow cytometric analysis of DNA ploidy and S-phase fraction of Stage IIIB cervical carcinoma. Eur J Gynaecol Oncol. 2004; 25(4): 428-430. 21. Zanetta GM, Katzmann JA, Keeney GL et al. Flow-cytometric DNA analysis of stages IB and IIA cervical carcinoma. Gynecol Oncol. 1992; 46(1): 13-19. 22. Cole DJ, Brown DC, Crossley E et al. Carcinoma of the cervix uteri: an assessment of the relationship of tumour proliferation to prognosis. Br J Cancer. 1992; 65(5): 783-785. 23. Levine EL, Renehan A, Gossiel R et al. Apoptosis, intrinsic radiosensitivity and prediction of radiotherapy response in cervical carcinoma. Radiother Oncol. 1995; 37(1): 1-9. 24. Oka K, Arai T. MIB1 growth fraction is not related to prognosis in cervical squamous cell carcinoma treated with radiotherapy. Int J Gynecol Pathol. 1996; 15(1): 23-27. 25. Avall-Lundqvist EH, Silfverswärd C, Aspenblad U et al. The impact of tumour angiogenesis, p53 overexpression and proliferative activity (MIB-1) on survival in squamous cervical carcinoma. Eur J Cancer. 1997; 33(11): 1799-1804. 26. Kimura M, Matsumoto T, Morizane T et al. Histopathological study of the spreading neoplastic cells in cervical glands and surface epithelia in cervical intra-epithelial neoplasia and microinvasive squamous cell carcinoma: Ki-67 immunostaining is a useful marker for pathological diagnosis from the gland involvement site. Pathol Int 2006; 56: 428-433. 27. Garzetti GG, Ciavattini A, Lucarini G et al. MIB-1 immunostaining in stage I squamous cervical carcinoma: relationship with natural killer cell activity. Gynecol Oncol 1995; 58: 28-33. 28. Suzuki Y, Oka K, Ohno T et al. Prognostic impact of mitotic index of proliferating cell populations in cervical cancer patients treated with carbon ion beam. Cancer 2009; 115(9): 1875-1882. 29. Tjalma WA, Weyler JJ, Bogers JJ et al. The importance of biological factors (bcl- 2, bax, p53, PCNA, MI, HPV and angiogenesis) in invasive cervical cancer. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2001; 97(2): 223-230. 322

Diagn Lab 2014; 50(4): 317-324 30. Nakano, T., Oka, K., Ishikawa et al. Correlation of cervical carcinoma c-erb B-2 oncogene with cell proliferation parameters in patients treated with radiation therapy for cervical carcinoma. Cancer 1997; 79(3): 513 520 31. Dimitrakakis C, Kymionis G, Diakomanolis E et al. The possible role of p53 and bcl-2 expression in cervical carcinomas and their premalignant lesions. Gynecol Oncol 2000; 77(1): 129-136 32. Brenna SM, Zefferino LC, Pinto GA, Souza RA et al. P53 expression as a predictor of recurrence in cervical squamous cell carcinoma. Int J Gynecol Cancer 2002; 12: 299-303. 33. Jain D, Srinivasan R, Patel FD et al. Evaluation of p53 and Bcl-2 expression as prognostic markers in invasive cervical carcinoma stage IIb/III patients treated by radiotherapy. Gynecol Oncol 2003; 88(1): 22-28 34. Moon A, Won KY, Lee JY et al. Expression of BDNF, TrkB, and p53 in early-stage squamous cell carcinoma of the uterine cervix. Pathology 2011; 43(5): 453-458. 35. Lee-Wen Huang, Yuh-Yu Chou, Shiouh-Lirng Chao et al. P53 and p21 expression in precancerous lesions and carcinoma of the uterine cervix: overexpression of p53 predicts poor disease outcome. Gynecol Oncol 2001; 83(2): 348-354. 36. Oh M.J., Choi J.H., Lee Y.H et al. Mutant p53 protein in the serum of patients with cervical carcinoma: correlation with the level of serum epidermal growth factor receptor and prognostic significance. Cancer Lett 2004; 203: 107 112. 37. Oka K, Suzuki Y, Nakano T. Expression of p27 and p53 in cervical squamous cell carcinoma patients treated with radiotherapy alone: radiotherapeutic effect and prognosis. Cancer 2000; 88(12): 2766-73. 38. Tanaka Y, Harima Y. Oncoprotein expression predicts response to radiotherapy or thermoradiotherapy in human cervical cancer. Experimental Oncology 2000; 22: 52-58 39. Wootipoom V, Lekhyananda N, Phungrassami T et al. Prognostic significance of Bax, Bcl-2 and p53 exspression in cervical squamous cell carcinoma treated by radiotherapy. Gynecol Oncol 2004; 94 (3): 636-642. 40. Craford RAF, Caldwell C, Lowe D et al. Prognostic significance of the bcl-2 apoptotic family of proteins in primary and recurrent cervical cancer. Br J Cancer 1998; 78: 210-214. 41. Tjalma WA, Weyler JJ, Bogers JJ et al. The importance of biological factors (bcl- 2, bax, p53, PCNA, MI, HPV and angiogenesis) in invasive cervical cancer. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2001; 97(2): 223-230 42. Van de Putte G, Holm R Lie AK et al. Expression of p27, p21, and p16 protein in early squamous cervical cancer and its relation to prognosis. Gynecol Oncol 2003; 89: 140-147. 43. Schwarz JK, Lewis JS Jr, Pfeifer J et al. Prognostic Significance of p16 Expression in Advanced Cervical Cancer Treated with Definitive Radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2012; 84(1): 153-157. 44. Masoudi H, Van Niekerk DJ, Gilks CB et al. Loss of p16 INK4 expression in invasive squamous cell carcinoma of the uterine cervix is an adverse prognostic markers. Histopathology 2006; 49: 542-545. 45. Gupta R, Srinivasan R, Nijhawan R et al. Protein p16 INK4 expression in cervical intraepithelial neoplasia and invasive squamous cell carcinoma of uterine cervix. Indian Journal of Pathology and Microbiology 2010; 53(1): 7-11. 46. Queiroz C, Silva TC, Alves VAF et al. P16 INK4 expression as a potential prognostic marker in cervical pre-neoplastic and neoplastic lesions. Pathology-Research and Practice 2006; 202: 77-83. 47. Keating JT, Cviko A, Riethdorf S et al. Ki-67, cyclin E and p16 INK4 are complementary surrogate biomarkers for human papillomavirus-related cervical neoplasia. Am J Surg Pathol 2001; 25: 884-891. 48. Kim YB, Kim GE, Cho NH et al. Overexpression of cyclooxygenase-2 is associated with a poor prognosis in patients with squamous cell carcinoma of the uterine cervix treated with radiation and concurrent chemotherapy. Cancer. 2002; 95(3): 531-539. 49. Gaffney DK, Holden JA, Davis M et al. Elevated cyclooxygenase-2 expression correlate with diminished survival in carcinoma of the cervix treated with radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2001; 49: 1213-1217. 50. Jae Myoung Noh, Won Park, Seung Jae Huh et al. Correlation between tumor volume response to radiotherapy and expression of biological markers in patients with cervical cell carcinoma. J G O 2009; 20(4): 215-220. 51. Min Kyu Kang, Won Park, Yoon-La Choi et al. The effect of cyclooksygenase-2 expression on tumor volume response in patients with radiotherapy for uterine cervical cancer. J Korean Med Sci 2009; 24: 1170-1176. 52. Ryu HS, Chang KH, Yang HW et al. High cyclooxygenase-2 expression in stage IB cervical cancer with lymph node metastasis or parametrial invasion. Gynecol Oncol 2000; 76(3): 320-325. 53. Ferrandina G, Lauriola L, Zannoni GF et al. Expression of cyclooxygenase-2 (COX- 2) in tumour and stroma compartments in cervical cancer: clinical implications Br J Cancer 2002; 87(10): 1145 1152. 54. Chen HHW, Wu-Chou S, Cheng-Yang C et al. Increased expression of nitric oxide synthase and Cycloxygenase-2 is associated with poor survival in cervical cancer treated with radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2005; 63: 1093-1100. 55. Maiko Noriyuki, Toshiyuki Sumu, Xu Zhi et al. Vascular endothelial growth factor, matrix metalloproteinases and cyclooxygenase-2 influence prognosis of uterine cervical cancer in young women. Int J Oncology 2007; 31: 531-536. 56. Huang M, Chen Q, Xiao J et al. Prognostic significance of cyclooksygenase-2 in cervical cancer: A meta-analysis. Int J Cancer 2012 Jun 22. doi:10.1002/ijc.27686. 57. Giordano G, D Adda T, Dal Bello B et al. Clinicopathologic implications of the epidermal growth factor receptor, cyclooxygenase 2 expression, and human papillomavirus status in squamous cell carcinoma of the uterine cervix in the elderly. Int J Gynecol Cancer. 2011; 21(2): 337-348 58. Athawale R, Clooney K, Hagan JO et al. COX-1 and COX-2 exspression in stage I and II invasive cervical carcinoma: relationship to disease relapse and long- -term survival. Int J Gynecol Cancer 2006; 16(3): 1303-1308. 59. Manchana T, Triratanachat S, Sirisabya N et al. Prevalence and prognostic significance of COX-2 expression in stage IB cervical cancer. Gynecol Oncol 2006; 100(3): 556-60. 60. Vieira SC, Zeferino LC, Da Silva BB et al. Quantification of angiogenesis in cervical cancer: a comparison among three endothelial cell markers. Gynecol Oncol. 2004; 93(1): 121-124. 61. Nakayama K, Kanzaki A, Takebayashi Y et al. Different features of angiogenesis between ovarian and breast carcinoma. Cancer Lett. 2001; 170(2): 161-167. 62. Lenczewski A, Terlikowski SJ, Sulkowska M et al. Prognostic significance of CD34 expression in early cervical squamous cell carcinoma. Folia Histochem Cytobiol 2002; 40(2): 205 206. 63. Vieira SC, Silva BB, Pinto GA et al. CD34 as a marker for evaluating angiogenesis in cervical cancer. Pathol Res Pract 2005; 201(4): 313-318. 64. Cantu De León D, Lopez-Graniel C, Frias Mendivil M et al. Significance of microvascular density (MVD) in cervical cancer recurrence. Int J Gynecol Cancer 2003; 13(6): 856-62. 65. Gasinska A, Urbanski K, Adamczyk A et al. Prognostic significance of intratumour microvessel density and haemoglobin level in carcinoma of the uterine cervix. Acta Oncol 2002; 41(5): 437-443. 66. Liao SY, Darcy KM, Randall LM et al. Prognostic revelance of carbonic anhydrase-ix in high risk, early-stage cervical cancer: a Gynecologic Oncology Group Study. Gynecol Oncol 2010; 116(3): 452-458. 67. Lin SY, Makino K, Xia W et al. Nuclear localization of EGF receptor and its potential new role as a transcription factor. Nat Cell Biol. 2001; 3(9): 802-808. 68. Oksvold M, Huitfeldt H, Stang E et al. Localizing the EGF receptor. Nat Cell Biol 2002; 4(2): E22. 69. Waugh MG, Hsuan JJ. EGF receptors as transcription factors: ridiculous or sublime? Nat Cell Biol 200; 3(9): 209-211. 70. West CM, Joseph L, Bhana S. Epidermal growth factor receptor targeted therapy. The British Journal of Radiology 2008; 81: 36-44. 71. Pérez-Regadera J, Sánchez-Muñoz A, De-la-Cruz Jet al. Impact of epidermal growth factor receptor expression on disease-free survival and rate of pelvic relapse in patients with advanced cancer of the cervix treated with chemoradiotherapy. Am J Clin Oncol 2011; 34(4): 395-400. 72. Cho NH, Kim YB, Park TK et al. P63 and EGFR as prognostic predictors in stage IIB radiation-treated cervical squamous cell carcinoma. Gynecol Oncol 2003; 91(2): 346-353. 73. Kedzia W, Schmidt M, Frankowski A et al. Immunohistochemical assay of p53, cyklin D1, c-erbb2, EGFr and Ki-67 proteins in HPV-positive and HPV-negative cervical cancerc. Folia Histochem Cytobiol 2002; 40: 37-41. 74. Lindstrom AK, Tot T, Stendahl U et al. Discrepancies in expression and prognostic value of tumor markers in adenocarcinoma and squamous cell carcinoma in cervical cancer. Anticancer Res 2009; 29: 2577-2578. 75. Yamashita H, Murakami N, Asari T et al. Correlation among six biologic factors (p53, p21(waf1), MIB-1, EGFR, HER2, and Bcl-2) and clinical outcomes after curative chemoradiation therapy in squamous cell cervical cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2009; 74(4): 1165-1172. 323

www.diagnostykalaboratoryjna.eu 76. Baltazar F, Filho AL, Pinheiro C et al. Cyclooxygenase-2 and epidermal growth factor receptor expressions in different histological subtypes of cervical carcinomas. Int J Gynecol Pathol 2007; 26(3): 235-241. 77. Gaffney DK, Haslam D, Tsodikov A et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) and vascular endothelial growth factor (VEGF) negatively affect overall survival in carcinoma of the cervix treated with radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2003; 56(4): 922-928. 78. Noordhuis MG, Eijsink JJ, Ten Hoor KA et al. Expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) and activated EGFR predict poor response to (chemo) radiation and survival in cervical cancer. Clin Cancer Res 2009; 15(23): 7389-7397. Adres do korespondencji: dr hab. n. med Małgorzata Klimek Klinika Ginekologii Onkologicznej Centrum Onkologii Oddział w Krakowie Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie 30-115 Kraków, ul. Garncarska 11 tel. + 48 12 6348331 e-mail: klimekmag@poczta.onet.pl Zaakceptowano do publikacji: 2.01.2015 324