Ćwiczenie 7 Klonowanie DNA w wektorach plazmidowych Celem ćwiczenia jest sklonowanie fragmentu DNA (powielonego techniką PCR i wyizolowanego z żelu agarozowego na poprzednich zajęciach) do wektora plazmidowego puc19. Etapy klonowanie molekularnego DNA są następujące: przygotowanie DNA wektora (równoczesne trawienie DNA puc19 dwoma enzymami restrykcyjnymi), przygotowanie końców klonowanego fragmentu PCR (równoczesne trawienie dwoma enzymami restrykcyjnymi), defosforylacja 5 końców plazmidowego DNA, ligacja linowych cząsteczek plazmidowego DNA i produktów reakcji PCR po trawieniu enzymami restrykcyjnymi, transformacja komórek kompetentnych E. coli DH5α mieszaniną ligacyjną, selekcja zrekombinowanych klonów (PCR kolonijny, izolacja i analiza restrykcyjna plazmidowego DNA). I. Przygotowanie do klonowania plazmidowego DNA puc19 i produktu PCR Trawienie plazmidowego DNA ma na celu linearyzację wektora i utworzenie lepkich końców charakterystycznych dla zastosowanych enzymów restrykcyjnych. Trawienie liniowego fragmentu PCR ma na celu utworzenie takich samych lepkich końców, jakie powstaną w wektorze. 1. Całkowicie rozmrozić i wymieszać bufory reakcyjne oraz roztwory DNA, które będą poddawane trawieniu. Wszystkie składniki do nastawienia reakcji trawienia krótko zwirować i wstawić do lodu. 2. W probówkach eppendorfa o poj. 1,5 ml połączyć składniki mieszaniny reakcyjnej we wskazanej kolejności: A) Trawienie plazmidowego DNA puc19: woda jałowa (wolna od nukleaz) uzupełnić do 30 μl bufor R (10 stężony) 3 μl plazmidowy DNA 0,5 1 µg enzym EcoRI (10 U/μl) enzym HindIII (10 U/μl) B) Trawienie produktu PCR: woda jałowa (wolna od nukleaz) uzupełnić do 30 μl bufor R (10 stężony) 3 μl produkt PCR 0,1 0,5 µg enzym EcoRI (10 U/μl) enzym HindIII (10 U/μl) 3. Przygotowane mieszaniny reakcyjne delikatnie wymieszać i krótko zwirować. 4. Probówki umieścić w termobloku i inkubować w 37 C przez min. 1 h. 5. W międzyczasie przygotować 0,7% żel agarozowy, rozpuścić, wylać do rynienki z ustawionym grzebieniem. Po zastygnięciu grzebień usunąć, a żel umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać 1 stężonym buforem TBE.
II. Defosforylacja 5 końców plazmidowego DNA Defosforylacja, tj. usunięcie reszt fosforanowych z 5ʹ końców wektorów trawionych enzymami restrykcyjnymi, ma na celu uniemożliwienie ponownej cyrkularyzacji (autoligacji) cząsteczek wektora bez DNA wstawki. 1. Po zakończeniu reakcji trawienia DNA puc19 krótko zwirować próbkę w celu odzyskania resztek roztworu z wieczka i ścianek probówki. 2. Bezpośrednio do mieszaniny reakcyjnej, w której trawiono DNA puc19, dodać (1U) termowrażliwej fosfatazy alkalicznej FastAP. 3. Próbkę delikatnie wymieszać i krótko zwirować. 4. Probówkę umieścić w termobloku i inkubować w 37 C przez 10 min. III. Elektroforeza produktów reakcji trawienia i inaktywacja termiczna enzymów W rozdziale elektroforetycznym sprawdzamy efektywność i poprawność trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi. Reakcje trawienia i defosforylacji zatrzymujemy poprzez termiczną inaktywację enzymów. 1. Po zakończeniu reakcji trawienia DNA i defosforylacji wektora mieszaniny reakcyjne wyjąć z termobloku i krótko zwirować. 2. Przestawić termoblok na 80ºC. 3. W nowych probówkach eppendorfa o poj. 1,5 ml przygotować próbki do elektroforezy: pobrać 3 μl reakcji trawienia DNA, dodać 7 µl wody i 2 µl buforu próbkowego, wymieszać, krótko zwirować i w całości nanieść do studzienki w żelu (UWAGA! Do pierwszej studzienki w żelu nanieść marker wielkości DNA!). 4. Prowadzić elektroforezę do momentu kiedy błękit bromofenolowy osiągnie ⅔ długości żelu. Następnie żel barwić przez 10 min w 0,05% wodnym roztworze bromku etydyny i poddać analizie w celu ustalenia efektywności i poprawności trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi. 5. Przeprowadzić termiczną inaktywację enzymów restrykcyjnych i alkalicznej fosfatazy poprzez inkubację próbek przez 20 min w temp. 80 C. 6. Uzyskane strawione DNA wektora puc19 i produktu PCR przechowywać w temp. 20 C do czasu dalszych analiz.
Ćwiczenie 8 Przygotowanie komórek kompetentnych Escherichia coli DH5α Ligacja fragmentów DNA po trawieniu enzymami restrykcyjnymi Celem ćwiczenia jest wprowadzenie komórek E. coli DH5α w stan kompetencji metodą indukcji chemicznej (traktowanie komórek bakteryjnych jonami magnezu). W tym stanie do komórek kompetentnych możemy wprowadzić cząsteczki kolistego DNA na drodze transformacji. Zrekombinowane koliste cząsteczki DNA zostaną utworzone w wyniku połączenia ze sobą linowych cząsteczek plazmidowego DNA i produktów reakcji PCR po trawieniu enzymami restrykcyjnymi w reakcji ligacji. I. Przygotowanie komórek kompetentnych E. coli DH5α Uwaga: wszystkie etapy przygotowania komórek kompetentnych przeprowadzać w warunkach sterylnych! 1. Nocną hodowlę E. coli DH5α rozcieńczyć 50-krotnie w świeżym płynnym podłożu LB (10 ml pożywki LB zaszczepić 200 μl hodowli bakteryjnej) i hodować w temperaturze 37 C z intensywnym wytrząsaniem do uzyskania OD 600 w zakresie 0,3 0,5 (OD 600 ang. Optical Density, gęstość optyczna mierzona przy długości fali 600 nm). 2. Pomiary OD600 przeprowadzia na spektrofotometrze. Do plastikowej kuwety jałowo odpipetować 1 ml hodowli. Jako próbę kontrolną zastosować pożywkę hodowlaną LB. Zmierzyć absorbancję próbek przy długości fali 600 nm, wartość absorbancji zapisać 3. W momencie osiągnięcia przez hodowle bakteryjne OD600 0,3 0,5, przelać je w całości do probówki typu Falcon o poj. 15 ml i umieścić je w lodzie na 10 min (UWAGA! Od tego etapu nie dopuszczać do wzrostu temperatury hodowli bakteryjnej powyżej 4 C). 4. Po inkubacji w lodzie bakterie zwirować w wirówce z chłodzeniem (4000 g, 10 min, 4 C). 5. W międzyczasie w probówce eppendorfa o poj. 1,5 ml przygotować 600 µl 1 stężonego roztworu TSS (270 µl płynnego podłoża LB + 300 µl 2 stężonego roztworu TSS + 30 µl DMSO), zworteksować, krótko zwirować i umieścić go w lodzie. 6. Podpisać pięć jałowych probówek eppendorfa o poj. 1,5 ml i również umieścić je w lodzie. 7. Po wirowaniu usunąć supernatant, a odwirowane komórki bardzo dokładnie zawiesić przez pipetowanie w 600 µl schłodzonego 1 stężonego roztworu TSS komórki stają się kompetentne (UWAGA! Komórki kompetentne są bardzo wrażliwe i od tego etapu należy się z nimi obchodzić bardzo delikatnie). 8. Zawiesinę komórek kompetentnych rozpipetować po 100 µl do odpowiednio podpisanych schłodzonych probówek. 9. Tak przygotowane komórki kompetentne zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temp. 80 C do następnych zajęć. Komórki mogą być w tym stanie przechowywane nawet przez kilka lat bez utraty swoich właściwości. Należy jedynie przestrzegać zasady, że porcja komórek raz rozmrożona nie może być ponownie zamrażana. Materiały: 1 stężony roztwór TSS PEG 8000 MgCl2 DMSO płynne podłoże LB 10% (w/o) 50 mm 5% (o/o)
II. Przygotowanie reakcji ligacji Ligaza DNA faga T4 katalizuje reakcję tworzenia wiązania fosfodiestrowego pomiędzy resztą fosforanową końca 5ʹ i hydroksylową końca 3ʹ DNA. Substratem dla enzymu są dsdna oraz hybrydy DNA-RNA. Enzym umożliwia łączenie ze sobą fragmentów DNA o lepkich końcach, jak również o tępych końcach z tym, że wydajność tego procesu jest znacznie niższa. Ligaza faga T4 wymaga do swojego działania ATP jako kofaktora. Przy nastawianiu reakcji ligacji obowiązuje zasada molowego nadmiaru ilości klonowanego fragmentu DNA (wstawki) w stosunku do DNA wektora. Mieszanina reakcyjna powinna mieć jak najmniejszą objętość, co poprawia skuteczność ligacji. 1. Całkowicie rozmrozić i wymieszać bufor reakcyjny oraz roztwory DNA, które będą poddawane ligacji. Wszystkie składniki do nastawienia reakcji ligacji krótko zwirować i wstawić do lodu. 2. W probówkach eppendorfa o poj. 0,2 ml połączyć składniki mieszaniny reakcyjnej we wskazanej kolejności: A) Właściwa mieszanina ligacyjna: woda jałowa (wolna od nukleaz) zlinearyzowany wektor puc19 (strawiony dwoma enzymami restrykcyjnymi) DNA wstawki (fragment PCR strawiony dwoma enzymami restrykcyjnymi) bufor reakcyjny (10 stężony) ligaza DNA faga T4 (1 Weiss U/μl) uzupełnić do 20 μl 20 100 ng 1 5-krotny molowy nadmiar w stosunku do wektora 2 μl B) Ligacja kontrolna (w reakcji kontrolnej zamiast klonowanego fragmentu DNA dodaje się jałową wodę): woda jałowa (wolna od nukleaz) uzupełnić do 20 μl zlinearyzowany wektor puc19 (strawiony dwoma enzymami restrykcyjnymi) taka sama ilość, jakiej użyto do przygotowania właściwej ligacji bufor reakcyjny (10 stężony) 2 μl ligaza DNA faga T4 (1 Weiss U/μl) 3. Próbki delikatnie wymieszać i krótko zwirować. 4. Mieszaniny reakcyjne inkubowano w 22 C przez 1 h. 5. Zatrzymać reakcję ligacji poprzez termiczną inaktywację ligazy w 65 C przez 10 min. 6. Uzyskane mieszaniny ligacyjne przechowywać w temp. 20 C do czasu dalszych analiz.
Ćwiczenie 9 Wprowadzanie cząsteczek DNA do komórek bakteryjnych transformacja Celem ćwiczenia jest wprowadzenie zrekombinowanego DNA (uzyskanego na poprzednich zajęciach w reakcji ligacji) do bakterii Escherichia coli DH5α i wyselekcjonowanie na płytkach ze stałym podłożem transformantów, które pobrały zrekombinowane cząsteczki plazmidów. Transformacja jest procesem, w którym informacja genetyczna w postaci DNA jest przekazywana do biorcy bez kontaktu komórek lub pośrednictwa faga. U wielu bakterii (Haemophilus, Streptococcus, Bacillus) pobieranie DNA z otoczenia jest rezultatem ich naturalnego stanu kompetencji. Natomiast w przypadku szczepów E. coli stan kompetencji bakterii uzyskuje się na drodze indukcji chemicznej (traktowanie komórek bakteryjnych jonami magnezu). W tym stanie bakterie E. coli są zdolne do przyjmowania z otoczenia cząsteczek kolistego DNA. Transformacja komórek kompetentnych z zastosowaniem szoku termicznego (UWAGA! Komórki kompetentne są bardzo wrażliwe i należy się z nimi obchodzić bardzo delikatnie, zwłaszcza podczas mieszania i pipetowania! Wszystkie etapy transformacji przeprowadzać w warunkach sterylnych!) 1. Rozmrozić 5 probówek z komórkami kompetentnymi E. coli DH5α w lodzie przez 10 min. 2. W międzyczasie rozmrozić probówki zawierające: właściwą mieszaninę ligacyjną (ćw. 9.), ligację kontrolną (ćw. 9.), wyizolowany DNA puc19 (ćw. 1.) oraz DNA puc19 strawiony enzymami restrykcyjnymi EcoRI i HindIII (ćw. 8.). Po rozmrożeniu próbki zworteksować, krótko zwirować i umieścić w lodzie. 3. Nastawić termoblok na 42 C. Płynne podłoże LB umieścić w termostacie w temp. 37 C. 4. Do pierwszej probówki dodać 20 μl właściwej mieszaniny ligacyjnej i delikatnie zamieszać. 5. Do drugiej probówki nie dodawać nic (kontrola komórek kontrola mutacji spontanicznych). 6. Do trzeciej probówki dodać 2 μl wyjściowego plazmidu puc19 (kontrola kompetencji) i delikatnie zamieszać. 7. Do czwartej probówki dodać 20 μl ligacji kontrolnej i delikatnie zamieszać. 8. Do piątej probówki dodać 2 μl strawionego wektora puc19 (kontrola wydajności reakcji trawienia enzymami restrykcyjnymi) i delikatnie zamieszać. 9. Wszystkie probówki inkubować w lodzie przez 30 min. 10. Próbki przenieść do termobloku i ogrzewać w temp. 42 C przez 45 s (szok termiczny). 11. Następnie szybko przełożyć probówki do lodu i inkubować przez 2 min. 12. Do każdej próbki dodać po 1 ml ogrzanego do 37 C podłoża LB (bez antybiotyku) i wymieszać przez odwracanie. 13. Wytrząsać hodowle przez 45 60 min. w temp. 37 C przy 200 RPM. 14. Wylać płytki selekcyjne z podłożem LB: 4 płytki z LB i ampicyliną (stężenie końcowe: 100 μg/ml), 2 płytki z LB, ampicyliną (100 μg/ml), X-gal (40 μg/ml) i IPTG (0,5 mm). 15. Po zastygnięciu płytki z podłożem selekcyjnym osuszyć i opisać w taki sposób, aby można je było łatwo zidentyfikować na kolejnych ćwiczeniach. 16. Po zakończonym wytrząsaniu hodowle zwirować przez 1 min. przy 14 000 g, a następnie odsączyć supernatant za pomocą pompki wodnej.
17. Osad bakteryjny bardzo dokładnie zawiesić w świeżej pożywce LB nie pozostawiając zbitych grudek osadu bakterii na dnie eppendorfa: komórki z właściwą ligacją zawiesić w 100 μl podłoża, pozostałe próbki zawiesić w 50 μl podłoża. 18. Nanieść pipetą na odpowiednio opisane płytki po 50 μl zawiesin, a następnie wetrzeć w podłoże za pomocą głaszczki rozprowadzając zawiesinę po całej powierzchni płytki: komórki z właściwą ligacją wysiać na LB z dodatkiem ampicyliny, X-gal i IPTG, pozostałe próbki wysiać na podłoże LB uzupełnione tylko antybiotykiem. Należy pamiętać o wyjałowieniu głaszczki pomiędzy kolejnymi próbkami poprzez zanurzenie w alkoholu i opalenie w płomieniu palnika. Przed opaleniem usunąć nadmiar alkoholu z głaszczki. Alkohol należy trzymać z daleka od płomienia palnika i NIE WOLNO zanurzać w nim palącej się głaszczki! 19. Płytki inkubować przez noc w termostacie w temp. 37 C, a następnie przenieść do 4 C (chłodnia lub lodówka) i pozostawić do czasu kolejnego ćwiczenia. 20. Na kolejnych ćwiczeniach przeanalizować wzrost bakterii na wszystkich płytkach. Policzyć kolonie i obliczyć wydajność transformacji. Wyselekcjonować na płytkach z właściwą ligacją zrekombinowane klony (komórki E. coli DH5α zawierające zrekombinowany wektor puc19 z wstawką).
Ćwiczenie 10 Analiza wyników klonowania selekcja rekombinantów techniką PCR Celem ćwiczenia jest potwierdzenie obecności w transformantach Escherichia coli DH5α, uzyskanych na poprzednich zajęciach, zrekombinowanego plazmidu zawierającego sklonowany fragment DNA z bakterii Rhizobium leguminosarum bv. Trifolii TA1. Jednym ze sposobów szybkiego przeszukiwania zrekombinowanych klonów jest tzw. PCR kolonijny, w którym jako źródło materiału genetycznego do amplifikacji DNA wykorzystujemy niewielką ilość bakterii pobranych bezpośrednio z płytki selekcyjnej. Taki materiał biologiczny poddajemy lizie w wysokiej temperaturze bezpośrednio w mieszaninie reakcyjnej zawierającej wszystkie składniki niezbędne do powielania fragmentu DNA zrekombinowanego w wektorze plazmidowym. Przygotowanie reakcji PCR (UWAGA! i mieszaniny reakcyjnej trzymamy w lodzie!): 1. Przed użyciem całkowicie rozmrozić i starannie wymieszać wszystkie komponenty niezbędne do nastawienia reakcji PCR. i krótko zwirować i wstawić do lodu. 2. W eppendorfie o poj. 1,5 ml przygotować mieszaninę na 3 5 reakcji PCR, tzw. premiks: Objętość (na 20 μl) Stężenie wyjściowe Stężenie końcowe woda jałowa 11,8 μl uzupełnić do 20 μl bufor reakcyjny 2 μl 10 stężony 1 stężony mieszanina dntp 2 μl 2 mm dntps 0,2 mm dntps starter forward 10 μm 0,5 μm starter reverse 10 μm 0,5 μm MgCl2 1,2 μl 25 mm 1,5 mm polimeraza DNA Taq 1 U/μl 1 U 3. Przygotowaną mieszaninę reakcyjną wymieszać przez worteksowanie, krótko zwirować i rozpipetować po 20 μl do probówek o poj. 0,2 ml. 4. Przy pomocy ezy lub tipa pobrać sterylnie z płytki niewielką ilość pojedynczej białej kolonii bakteryjnej, dodać do mieszaniny reakcyjnej i wymieszać. 5. Probówki umieścić w termocyklerze i uruchomić program o następującym profilu reakcji: Etap Temperatura Czas Liczba cykli wstępna denaturacja DNA 96 C 5 min 1 denaturacja DNA 94 C 30 s hybrydyzacja starterów Tm 5 C 30 s 25 synteza DNA 72 C 30 s na każde 500 pz 6. Przygotować 0,7% żel agarozowy, rozpuścić, wylać do rynienki z ustawionym grzebieniem. Po zastygnięciu żel umieścić w aparacie do elektroforezy i zalać 1 stężonym TBE. 7. Po zakończeniu reakcji PCR dodać do probówek po 2 µl buforu próbkowego, wymieszać, krótko zwirować i nanieść do studzienek w żelu po 15 μl próbek (UWAGA! Do pierwszej studzienki w żelu nanieść marker wielkości DNA!). Prowadzić elektroforezę do momentu kiedy błękit bromofenolowy osiągnie ⅔ długości żelu. Następnie żel barwić przez 10 min w 0,05% wodnym roztworze bromku etydyny i poddać analizie w celu selekcji kolonii zawierających zrekombinowany wektor (amplifikacja DNA odpowiedniej wielkości). 8. Wyselekcjonowane kolonie bakteryjne przepasażować na wcześniej przygotowaną i osuszoną płytkę LB z ampicyliną. Płytkę inkubować przez noc w temp. 37 C, a następnie przenieść do 4 C i pozostawić do czasu kolejnego ćwiczenia.