Ilościowe oznaczenie glikogenu oraz badanie niektórych jego właściwości Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z podstawową wiedzą dotyczącą budowy, funkcji i właściwości glikogenu jak również poznanie zasad najczęściej stosowanych metod ilościowego oznaczania zawartości tego polisacharydu. Wprowadzenie Budowa glikogenu. Jest to silnie rozgałęziony polisacharyd zwierzęcy, homopolimer zbudowany z reszt α-d-glukozy połączonych ze sobą wiązaniami α-1,4- glikozydowymi, a w miejscach rozgałęzień α-1,6-glikozydowymi. Glikogen ma budowę zbliżoną do składnika skrobi amylopektyny, ale rozgałęzienia w jego cząsteczce są liczniejsze i krótsze. Jedno rozgałęzienie przypada zwykle na 10-12 reszt glukozy. Taka budowa cząsteczki glikogenu sprawia, że rozpuszcza się on lepiej w wodzie niż amylopektyna. Wielkość cząsteczek glikogenu, jak też liczba i stopień rozgałęzień tego wielocukru zależą od źródła, z którego został wyizolowany. Masa cząsteczkowa glikogenu jest różna i waha się w granicach od kilkuset tysięcy do kilku milionów Da (masa cząsteczkowa glikogenu w mięśniach ok. 1 000 000, a w wątrobie ok. 5 000 000 Da). Występowanie i funkcje glikogenu. Jest to zapasowy polisacharyd odkładany w wątrobie i w mniejszych ilościach w mięśniach. Zawartość glikogenu jest zależna od stanu fizjologicznego organizmu, w wątrobie wynosi od 2 do 10%, a w mięśniach od 0,5 do 1,5% tkanki. Ze względu na dużą masę mięśni w porównaniu z masą wątroby w organizmie przeważa jednak forma mięśniowa tego polisacharydu. Organizm ludzki może zmagazynować nawet do 450 g glikogenu, z czego jedynie ok. 30 % znajduje się w wątrobie. W komórce glikogen wraz z większością enzymów niezbędnych do jego syntezy i degradacji jest zlokalizowany w postaci ziarnistości w cytoplazmie. Glikogen w wątrobie służy przede wszystkim do utrzymania odpowiedniego poziomu glukozy we krwi w przerwach pomiędzy posiłkami. Glikogen w mięśniach stanowi natomiast rezerwę glukozy wykorzystywanej do syntezy ATP podczas intensywnych skurczów mięśni i nie bierze udziału w regulacji stężenia cukru we krwi. Aktywność enzymów uczestniczących w syntezie i rozkładzie glikogenu podlega złożonej regulacji przez hormony i inne czynniki. Właściwości fizykochemiczne glikogenu. Podobnie jak pozostałe polisacharydy glikogen należy do grupy niezjonizowanych związków polarnych. Jako koloid hydrofilowy rozpuszcza się w wodzie na zimno, efektem czego jest opalizujący roztwór. Możliwe jest to dzięki występowaniu w jego cząsteczce licznych grup hydroksylowych, mogących łatwo tworzyć wiązania wodorowe z cząsteczkami wody. W obecności soli nieorganicznych o znacznych stężeniach oraz pod wpływem cieczy organicznych mieszających się z wodą glikogen łatwo ulega wytrąceniu z roztworu. Dodanie do roztworu glikogenu soli obojętnej dobrze zdysocjowanej, np. siarczanu amonowego lub chlorku sodowego, powoduje rozerwanie wiązań wodorowych między grupami OH polisacharydu a cząsteczkami wody (dehydratacja), a samorzutnie tworzące się wewnątrzi międzycząsteczkowe wiązania doprowadzają do agregacji cząsteczek glikogenu i wytrącenia asocjatów z roztworu. Pod wpływem rozpuszczalników organicznych, takich jak aceton czy alkohol, następuje znaczne zmniejszenie stałej dielektrycznej roztworu (woda 80, etanol 24), co w konsekwencji również prowadzi do zmniejszenia stopnia 1
uwodnienia grup hydroksylowych glikogenu i powoduje jego wytrącenie z roztworu. Glikogen z jodem tworzy kompleks o barwie czerwonobrunatnej. Pozwala to na odróżnienie niektórych polisacharydów (glikogen, skrobia) od innych, gdyż kompleksy takie mogą być wytwarzane tylko przez cząsteczki o odpowiednio dużych wymiarach i uporządkowanej strukturze. Boczne łańcuchy rozgałęzionej cząsteczki glikogenu tworzą układy spiralne, w których środku występują wolne przestrzenie umożliwiające pomieszczenie cząsteczek jodu. Charakterystyczna absorpcja jodu występuje jedynie w przypadku łańcuchów zawierających, co najmniej 6 reszt polisacharydowych (jeden skręt spirali). Barwny efekt jest tym silniejszy, im większe są cząsteczki polisacharydu, a więc im większa jest liczba cząsteczek jodu związanego w kompleksie. Glikogen, jako polisacharyd nie wykazuje właściwości redukujących. Stosunkowo łatwo ulega on hydrolizie kwasowej oraz enzymatycznej z udziałem amylaz. Podczas zajęć laboratoryjnych hydroliza wiązań glikozydowych będzie przeprowadzona w wysokiej temperaturze w obecności kwasu solnego. Obecność uwolnionych w wyniku hydrolizy cukrów redukujących stanowi podstawę najczęściej stosowanych metod oznaczeń ilościowych tego polisacharydu. Rys. 1. Hydroliza kwasowa glikogenu Odczynniki 1. Roztwór glikogenu o stężeniu 0,2 % w/o 2. Roztwór glikogenu o stężeniu 0,5% w/o 3. Płyn Lugola 4. 2 M HCl 5. 1 M NaOH 6. 2 M NaOH 7. Odczynnik Benedicta 8. Roztwór glukoamylazy (firmy F-R M Nowozymes AMG) o stężeniu dobranym do warunków ćwiczenia 9. Odczynnik Somogyi 10. Odczynnik Nelsona 2
Wykonanie Na zajęciach 3-godzinnych obowiązuje punkt a. Na zajęciach 4-godzinnych obowiązuje punkt a i b. Zasada metody Somogyi i Nelsona Glukoza redukuje w środowisku alkalicznym obecne w odczynniku miedziowym (Somogyi) jony Cu 2+ do Cu +. Ilość powstałego w reakcji tlenku miedzi (I) oznacza się przy użyciu odczynnika arsenomolibdenowego (Nelsona), który ulega redukcji do błękitu molibdenowego. Natężenie powstałej niebieskiej barwy produktu jest proporcjonalne do ilości wytworzonego Cu 2 O a tym samym do ilości powstałej podczas hydrolizy glikogenu glukozy. a) Oznaczanie stężenia glikogenu metodą Somogyi i Nelsona Otrzymany w kolbie miarowej na 10 ml roztwór glikogenu (1) dopełnić wodą destylowaną do kreski i wymieszać. Pobrać z kolby 2 ml roztworu do probówki, dodać 5 ml 2 M kwasu solnego (4), wymieszać i prowadzić hydrolizę glikogenu we wrzącej łaźni wodnej przez 30 minut. Następnie próbę ochłodzić zimną wodą, zobojętnić hydrolizat przez dodanie 5 ml 2 M wodorotlenku sodowego (6) i wymieszać. Do 2 probówek pobrać po 1 ml uzyskanego hydrolizatu. Przygotować także próbę kontrolną, w której należy zmieszać 0,5 ml 2 M kwasu solnego (4) i 0,5 ml 2 M wodorotlenku sodowego (6). Do wszystkich trzech probówek odmierzyć po 1 ml odczynnika Somogyi (9), zamieszać i wstawić do wrzącej łaźni wodnej dokładnie na 10 minut. Próby ochłodzić zimną wodą i odmierzyć do nich po 1 ml odczynnika Nelsona (10), dokładnie wymieszać aż do rozpuszczenia osadu tlenku miedzi (I) i ustania wydzielania pęcherzyków gazu (CO 2 ). Próby rozcieńczyć dodając po 7 ml wody destylowanej, wymieszać i po 10 minutach zmierzyć w fotometrze absorbancję przy długości fali 520 nm wobec próby kontrolnej. Odczyty z aparatu uśrednić a następnie odczytać z wcześniej przygotowanej krzywej wzorcowej odpowiadające im stężenie glukozy. b) Badanie niektórych właściwości glikogenu Zasada metody Benedicta W środowisku alkalicznym jony Cu (II) ulegają pod wpływem glukozy redukcji do Cu(I), z roztworu wypada żółty, pomarańczowy lub ceglastoczerwony osad Cu 2 O (I). Z barwy i ilości osadu można w przybliżeniu ocenić stężenie sacharydu w badanym roztworze. 1. Stopniowa hydroliza kwasowa glikogenu. Przygotować 8 probówek i do 4 z nich odmierzyć po 1 ml 1 M wodorotlenku sodowego (5), a do 4 pozostałych po 1 ml wody. Równolegle przygotować próbę do hydrolizy glikogenu: do probówki odmierzyć 10 ml roztworu glikogenu (2) i 5 ml 2 M kwasu solnego, wymieszać i pobrać natychmiast po 1 ml tej mieszaniny do pierwszych probówek serii z 1 M wodorotlenkiem sodu oraz z wodą (próby pobrane w czasie zerowym). Pozostałą część próby do hydrolizy umieścić we wrzącej łaźni wodnej i po 5, 10 i 15 minutach pobierać po 1 ml mieszaniny do kolejnych probówek serii z wodorotlenkiem sodowym i z wodą. Roztwory w probówkach z wodą po pobraniu próby natychmiast schłodzić i potraktować 2 kroplami płynu Lugola (3). Następnie do probówek zawierających wodorotlenek sodowy i hydrolizat glikogenu dodać po 1 ml odczynnika Benedicta (7), po wymieszaniu wstawić na dwie minuty do wrzącej łaźni wodnej. 3
2. Hydroliza enzymatyczna glikogenu. Do probówki odmierzyć 2 ml glikogenu (2) i 1 ml glukoamylazy (8), wymieszać i wstawić do łaźni wodnej o temp. 40 C na 10 minut. Reakcję przerwać dodając 0,2 ml 2 M HCl (4), wymieszać. Przygotować dwie probówki, do jednej z nich pobrać 1 ml tej mieszaniny, do drugiej 1 ml glikogenu (2), do obu dodać po 1 ml odczynnika Benedicta (7), wymieszać i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 2 minuty. Opracowanie wyników W celu obliczenia czystości otrzymanego roztworu glikogenu należy na podstawie średniej wartości absorbancji prób pełnych dokonać odczytu stężenia glukozy z krzywej wzorcowej i uwzględnić podany podczas zajęć sposób rozcieńczenia preparatu glikogenu. W obliczeniach należy także uwzględnić współczynnik 0,9 (162g/180g) pozwalający na przeliczenie stężenia glukozy na stężenie glikogenu. Przykładowe obliczenia na podstawie przedstawionego poniżej schematu rozcieńczenia zadania kontrolnego: 2 g glikogenu technicznego rozpuszczono w 1000 ml wody destylowanej; z tak przygotowanego roztworu studenci otrzymali w formie zadania kontrolnego różne jego objętości (objętość podaje prowadzący ćwiczenia po przyjęciu wyników absorbancji, w przedstawionym przykładzie 3ml) w kolbce miarowej na 10ml, uzupełnionej do kreski wodą destylowaną. Do hydrolizy pobrano 2 ml z kolby na 10 ml, po neutralizacji ph otrzymano mieszaninę o objętości 12 ml, z której pobrano 1 ml do oznaczenia zawartości glukozy. Średnia wartość absorbancji dla prób pełnych wyniosła 0,240 a odczytana wartość z krzywej wzorcowej 90 μg glukozy, co po uwzględnieniu współczynnika 0,9 daje nam 81 μg glikogenu. Ze schematu rozcieńczeń wynika, że w 1 ml roztworu pobranego do oznaczenia jest 81 μg glikogenu a w 12 ml 972 μg, tyle samo glikogenu jest w 2 ml pobranego roztworu z 10 ml kolby. W kolbie miarowej (10 ml) jest zatem 4,86 mg glikogenu i tyle samo w 3 ml wydanego zadania kontrolnego więc w 1000 ml: 3 ml 4,86 mg 1000 ml x mg, x = 1620 mg=1,62 g, co odpowiada zawartości glikogenu w 1000 ml przygotowanego roztworu glikogenu technicznego. Ze schematu rozcieńczeń wynika, że w 1000 ml rozpuszczono 2 g glikogenu technicznego, więc: 2,0 g 100% 1,62 g x% Czystość glikogenu (%) technicznego wynosi 81%. B. 1. Należy dokonać obserwacji powstałego tlenku miedzi (I) w próbach, w których przeprowadzono reakcję z odczynnikiem Benedicta. W próbach z wodą z kolei obserwować stopniowy zanik barwy kompleksu glikogenu z jodem. 4
2. Dokonać obserwacji prób po reakcji z odczynnikiem Benedicta. Wyjaśnić potencjalne różnice pomiędzy barwą tych prób. Pytania 1. Do jakiej grupy związków należy glikogen? Omów występowanie i funkcje glikogenu. 2. Napisz fragment cząsteczki glikogenu. Wskaż i nazwij występujące tam wiązania. 3. W jaki sposób można dokonać hydrolizy glikogenu? 4. W jaki sposób można ilościowo oznaczyć glikogen? Podaj zasadę stosowanej na ćwiczeniach metody. 5. Omów sposoby wytrącania glikogenu z roztworu. 6. Czy jod w kompleksie z glikogenem zmienia swoją wartościowość? Uzasadnij odpowiedź. 7. Uzasadnij stopniową zmianę barwy roztworu glikogenu z odczynnikiem Benedicta lub z jodem w miarę postępu reakcji: a) z kwasem solnym, b) z glukoamylazą. Literatura: M. Somogyi. Notes on sugar determination. The Journal of Biological Chemistry, Baltimore, 195: 19-23 (1952) N. Nelson. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. The Journal of Biological Chemistry, Baltimore, 153: 375-381 (1944) Krishnaveni, S., Theymoli Balasubramanian and Sadasivam, S. Sugar distribution in sweet stalk Sorghum. Food Chemistry 15: 229-232 (1984). 5
Warszawie. Inne wykorzystanie tych materiałów bez zgody pracowników Katedry Biochemii jest zabronione. 6