W XIX wieku... WITAMY NA KURSIE HISTOLOGII Histologia to nauka o mikroskopowej budowie komórek, tkanek i narządów Podobnie jak anatomia, histologia należy do nauk morfologicznych. w XXI wieku: Histologia to nauka o powiązaniach struktury mikroskopowej, submikroskopowej i molekularnej komórek, tkanek i narządów z ich funkcją Poprzez badanie funkcji komórek i tkanek, histologia jest częściowo zintegrowana z: fizjologią immunologią biochemią biologią molekularną Podstawowe narzędzie: mikroskop Nasz kurs: Dział: techniki mikroskopowe Dział: podstawy histologii tkanek i narządów Źródła wiedzy... METODY PRZYGOTOWANIA MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO DO BADAŃ W MIKROSKOPIE ŚWIETLNYM cz. I www.histologia.cm-uj.krakow.pl regulamin kursu prezentacje wykładowe materiały uzupełniające ogłoszenia wyniki egzaminu repetytorium praktyczne (obrazy preparatów) wydanie z 2011 r. 1
. TYPY PREPARATÓW: PREPARAT MIKROSKOPOWY: przejrzysty (cienki) zabarwiony (skontrastowany) dobrze zachowana struktura skrawki szlify (z tkanek zmineralizowanych) rozmazy (z płynów ustrojowych i zawiesin komórkowych) wymazy (z wydzielin) rozgnioty odciski preparaty całościowe hodowle komórkowe Przygotowanie materiału biologicznego do badań mikroskopowych obejmuje wiele etapów, z których każdy służy osiągnięciu pewnego celu PIERWSZY CEL: UTRWALENIE (dobre zachowanie struktury) Co osiągamy przez utrwalenie materiału: technika parafinowa zapobieżenie autolizie poprzez inaktywację enzymów wytrącenie i zachowanie niektórych substancji rozpuszczalnych wstępne utwardzenie materiału UTRWALANIE: Chemiczne aldehydy (formalina, ald. glutarowy) alkohole (metanol, etanol) ketony (aceton) kwasy (octowy, pikrynowy) związki metali ciężkich (sublimat, czterotlenek osmu) Utrwalacze proste i złożone Fizyczne: mikrofale (często w kombinacji z utrwalaczem chemicznym) immersyjne perfuzyjne DRUGI CEL: UTWARDZENIE I KROJENIE (tylko dla skrawków) Przepojenie substancją utwardzającą (zatapianie) parafina celoidyna żywice akrylowe Zamrożenie 2
Parafina, celoidyna i część żywic to substancje niepolarne (nie rozpuszczają się w wodzie). Przygotowywany materiał trzeba zatem stopniowo przeprowadzić ze środowiska polarnego (wodny roztwór utrwalacza) do niepolarnego (1) Odwadnianie (alkohol etylowy lub aceton szereg roztworów o wzrastającym stężeniu) (2) Płyny pośrednie rozpuszczalne zarówno w środowisku odwadniającym jak i w substancji używanej do zatapiania - dla parafiny: rozpuszczalniki organiczne (ksylen, benzen, chloroform) - dla celoidyny: roztwór alkoholu i eteru, octan amylu (3) Zatapianie podwyższona temperatura (54-60ºC) Utrwalone próbki tkanek umieszcza się w specjalnych kasetkach i przeprowadza przez kolejne płyny albo ręcznie, albo automatycznie w tzw. procesorach tkankowych Zestalenie zatopionego materiału: parafina ochłodzenie celoidyna odparowanie rozpuszczalnika żywice polimeryzacja Formowanie bloczków parafinowych wykonuje się przez przeniesienie materiału do foremek, wypełnienie parafiną, a następnie schłodzenie Tworzy się bloczek z zatopionym materiałem, który można kroić na skrawki na mikrotomie celoidyna parafina Stacja do zatapiania w parafinie ZAMRAŻANIE (technika mrożeniowa) Podczas zamrażania woda w materiale biologicznym ulega krystalizacji. Najmniejsze kryształki, nie uszkadzające struktury komórek i tkanek tworzą się przy bardzo szybkim zamrożeniu do bardzo niskiej temperatury. Dlatego do zamrażania stosujemy: ciekłe gazy (azot, hel) zestalony CO2 (tzw. suchy lód) zamrożoną listwę metalową w kriostacie Można zamrażać i kroić materiał nieutrwalony technika mrożeniowa umożliwia najszybsze uzyskanie preparatów DO KROJENIA SKRAWKÓW SŁUŻĄ MIKROTOMY Mikrotom rotacyjny do skrawków parafinowych stolik przedmiotowy nóż mechanizm przesuwu stolika względem noża skrawki parafinowe: 2-10 μm skrawki z żywic: 0.5-2.0 μm 3
Podczas krojenia skrawków parafinowych tworzy się wstęga Kriostat służy do krojenia skrawków z zamrożonego materiału Mikrotom umieszczony w komorze o regulowanej temperaturze ujemnej Temperatura krojenia: od -15 C do -25 C skrawki mrożeniowe: 4-10 μm HISTOLOGIA OGÓLNA (TKANKI) Elementy składowe tkanki: komórki (o podobnym pochodzeniu, zbliżonej strukturze i funkcji) substancja międzykomórkowa (produkowana przez komórki) Główne rodzaje tkanek zwierzęcych: tkanka nabłonkowa tkanka łączna tkanka mięśniowa tkanka nerwowa Tkanka nabłonkowa FORMY: wyściółki (pokrywające zewnętrzne i wewnętrzne powierzchnie organizmu) gruczoły (zespoły komórek nabłonkowych pełniących funkcje wydzielnicze) Nabłonki nie zawierają naczyń krwionośnych! FUNKCJE: ochronna (np. naskórek) resorbcyjna (np. nabłonek jelitowy) wydzielnicza (np. gruczoły) regulacja transportu przez nabłonek (np. śródbłonek wyścielający naczynia krwionośne) zmysłowa (np. kubki smakowe) W obrębie jednego nabłonka mogą występować różne typy komórek pełniące różne funkcje KLASYFIKACJA NABŁONKÓW liczba warstw: - jednowarstwowe - wielowarstwowe kształt komórek: - płaskie - sześcienne - walcowate W klasyfikacji należy zawsze uwzględniać oba kryteria W nabłonkach wielowarstwowych kształt komórek dotyczy warstwy powierzchniowej 4
Nabłonek jednowarstwowy płaski Nabłonek jednowarstwowy sześcienny wchłanianie, wydzielanie Przykładowa lokalizacja: kanaliki nerkowe, owodnia, gruczoły i ich przewody kontrola transportu Przykładowa lokalizacja: naczynia (śródbłonek), pęcherzyki płucne (pneumocyty), opłucna i otrzewna (międzybłonek) Nabłonek jednowarstwowy walcowaty Nabłonek wieloszeregowy (wielorzędowy) wchłanianie, wydzielanie, kontrola transportu, ochrona Przykładowa lokalizacja: przewód pokarmowy, drogi żółciowe, żeńskie drogi rozrodcze, duże przewody wyprowadzające gruczołów Odmiana nabłonka jednowarstwowego walcowatego - komórki różnej wysokości (niekiedy różne typy komórek) i/lub jądra na różnych poziomach, ale wszystkie komórki mają podstawy na tym samym poziomie (przylegają do blaszki podstawnej) ochrona, wydzielanie, funkcja zmysłowa Przykładowa lokalizacja: drogi oddechowe, najądrze, kubki smakowe Nabłonek wielowarstwowy płaski Odmiany: nierogowaciejący rogowaciejący (komórki warstw powierzchniowych obumierają) Nabłonek przejściowy (urotelium) wielowarstwowy na powierzchni komórki baldaszkowate: niekiedy dwujądrzaste połączenia ścisłe i mechaniczne specyficzna szczytowa błona komórkowa zawierająca sztywne białkowe płytki (uroplakina) powiązane z filamentami aktynowymi ochrona Przykładowa lokalizacja: nierogowaciejący: jama ustna, przełyk, rogówka oka, pochwa rogowaciejący: naskórek ochrona (szczelny - bariera osmotyczna, bardzo rozciągliwy) Lokalizacja: drogi moczowe 5
Inne nabłonki wielowarstwowe (rzadkie) Odnowa i regeneracja nabłonków TYP FUNKCJA PRZYKŁADY LOKALIZACJI dwuwarstwowy kontrola przewody wyprowadzające gruczołów sześcienny transportu potowych, ciałko rzęskowe oka wielowarstwowy ochronna, rejony przejściowe pomiędzy nabłonkiem sześcienny lub wydzielnicza wielowarstwowym płaskim a jednowarstwowym, walcowaty walcowatym (jama gardłowa, odbyt), spojówka, męska cewka moczowa, przewody wyprowadzające ślinianek Wszystkie nabłonki mają zdolność do szybkiej odnowy i zawierają niezróżnicowane komórki macierzyste w nabłonkach jednowarstwowych stare komórki obumierają na drodze apoptozy i są zastępowane przez komórki różnicujące się z komórek macierzystych w nabłonkach wielowarstwowych komórki stale migrują z warstw podstawnych do powierzchniowych, gdzie ulegają złuszczeniu Komórki macierzyste nabłonków rak skóry w nabłonkach jednowarstwowych zazwyczaj są to małe komórki zlokalizowane przy blaszce podstawnej (komórki podstawne) w nabłonkach wielowarstwowych są to niektóre (nie wszystkie) komórki zlokalizowane w warstwie podstawnej niekiedy mają ściśle określoną lokalizację (nisza w konkretnym miejscu wyściółki nabłonkowej bądź gruczołu) Z powodu wysokiej aktywności proliferacyjnej komórek nabłonkowych, najczęściej występujące nowotwory (piersi, płuc, jelita grubego, szyjki macicy i inne) wywodzą się właśnie z tkanki nabłonkowej. Noszą nazwę raków (carcinoma). Komórki nabłonkowe są spolaryzowane (biegunowe): mają powierzchnię szczytową, boczną i przypodstawną Powierzchnia boczna: - połączenia międzykomórkowe - kanaliki międzykomórkowe Powierzchnia szczytowa: - mikrokosmki, - rzęski (migawki), - białka transportowe Struktury występujące na szczytowej powierzchni komórek nabłonkowych: mikrokosmki rzęski (migawki) stereocylia Powierzchnia przypodstawna: - połączenia komórka substancja międzykomórkowa - białka transportowe - prążkowanie przypodstawne to wypustki cytoplazmy pokryte błoną komórkową i zawierające elementy cytoszkieletu 6
Mikrokosmki nieregularne zawierają wiązki filamentów aktynowych bardzo liczne, regularne = brzeżek szczoteczkowy Stereocylia to długie i grube mikrokosmki występujące na powierzchni niektórych komórek nabłonkowych (w najądrzu, nasieniowodzie i uchu wewnętrznym) Funkcja: zwiększają powierzchnię błony, ułatwiając wchłanianie (brzeżek szczoteczkowy jest typowy dla nabłonków resorbcyjnych) sieć krańcowa Rzęski (migawki) Układ mikrotubul w aksonemie: 9 obwodowych dubletów 2 mikrotubule centralne ciałko podstawne korzonek łodyga - część wystająca ponad powierzchnię, zawiera aksonemę (układ mikrotubul) ciałko podstawne (= centriola) korzonek - wiązka włókienek białkowych Ruch rzęsek generuje mechanoenzym dyneina, która przesuwa względem siebie pary mikrotubul, powodując czynne zgięcie rzęski. Elastyczna neksyna odpowiada za fazę bierną ruchu (powrót). Skoordynowany ruch (metachronia) licznych rzęsek tworzących tzw. brzeżek migawkowy transportuje po powierzchni nabłonka różne obiekty: śluz z przylepionymi cząstkami pyłów w drogach oddechowych oocyty w jajowodzie plemniki w męskich drogach rozrodczych Rzęska pierwotna Ruch płynu pojedyncza, nieruchoma aksonema 9 x 2 + 0 występuje w różnych komórkach zawiera receptory i białka uczestniczące w regulacji cyklu komórkowego i różnicowania w niektórych komórkach pełni rolę mechanosensora: jej zgięcie otwiera kanały wapniowe i powoduje reakcję komórki 7
Połączenia międzykomórkowe Strefa zamykająca (połączenie ścisłe) - połączenia ścisłe: strefa zamykająca (zonula occludens) - połączenia mechaniczne: strefa przylegania (zonula adherens) desmosom - połączenia komunikacyjne: połączenie szczelinowe (neksus) Błony sąsiadujących komórek są połączone za pośrednictwem stykających się ze sobą białek transbłonowych (białka łączące) Połączenia mogą występować między komórkami wszystkich tkanek Białka łączące: klaudyny i okludyny Strefa (zonula): połączenie w formie ciągłego pasa otaczającego komórkę; połączenia typu stref łączą w sposób ciągły (bez przerw) zespoły komórek Strefa zamykająca jest wzmocniona poprzez połączenie z filamentami aktynowymi W mechanicznych połączeniach międzykomórkowych połączone są nie tylko błony komórkowe, ale również elementy cytoszkieletu (poprzez białka pośredniczące) filament białko ZO klaudyna aktynowy lub okludyna Funkcje: uszczelnienie przestrzeni międzykomórkowych (kontrola transportu) bariera dla ruchu białek błonowych (polaryzacja komórki) KADHERYNY Strefa przylegania Desmosom strefa przylegania białka łączące białka pośredniczące białka łączące: kadheryny filamenty aktynowe Forma lokalna: punkt przylegania 8
Komórki tworzą również połączenia mechaniczne z substancją międzykomórkową (kontakty lokalne, półdesmosomy) Połączenie szczelinowe (neksus) filamenty aktynowe białka pośredniczące jednostka: konekson białka łączące: koneksyny białka łączące: integryny Kontakt lokalny Półdesmosomy Funkcja: umożliwia bezpośrednie przechodzenie substancji niskocząsteczkowych (jonów, cząsteczek sygnałowych, ATP) pomiędzy połączonymi komórkami Połączenia szczelinowe umożliwiają: bezpośrednie przewodzenie bodźców elektrycznych między komórkami szybką wymianę sygnałów chemicznych między komórkami synchronizację procesów metabolicznych i różnicowania (sprzężenie metaboliczne) Kompleksy połączeń międzykomórkowych Listewki graniczne (w niektórych nabłonkach jednowarstwowych np. nabłonku jelitowym): strefa zamykająca strefa przylegania desmosom Zamknięcie koneksonów i przerwanie komunikacji między komórkami następuje w warunkach zagrażających komórce (spadek ph, nadmierny wzrost wewnątrzkomórkowego stężenia jonów Ca 2+ ). Wstawki (pomiędzy komórkami mięśnia sercowego): strefy przylegania desmosomy neksusy Prążkowanie przypodstawne Blaszka podstawna - jedyna forma substancji międzykomórkowej w tkance nabłonkowej komórka nabłonkowa blaszka jasna blaszka ciemna głębokie fałdy przypodstawnej błony komórkowej, zwiększające jej powierzchnię w fałdach pionowo ułożone mitochondria Funkcja: aktywny transport jonów przez błonę komórkową Białka: laminina kolagen IV entaktyna Proteoglikany: perlekan błona komórkowa Składniki blaszki podstawnej tworzą molekularną sieć kolagen IV laminina entaktyna perlekan integryny 9
Funkcje blaszki podstawnej: przytwierdza nabłonek do podłoża (poprzez integryny komórek nabłonkowych) uczestniczy w regulacji przechodzenia substancji wysokocząsteczkowych do rejonu podnabłonkowego (filtr) ukierunkowuje migrację komórek w procesach rozwoju i regeneracji Blaszki podstawne są też wytwarzane przez komórki innych tkanek Błona podstawna (w niektórych nabłonkach): blaszka podstawna + dodatkowa warstwa włóknisto-siatkowata wytworzona przez tkankę łączna (fibryle z kolagenu III, VII, fibryliny) blaszka podstawna błona podstawna Gruczoły - zespoły komórek nabłonkowych o specjalizacji wydzielniczej Klasyfikacja: zewnątrzwydzielnicze: kierują wydzielinę do określonego miejsca przez przewody wyprowadzające (np. ślinianki, trzustka, małe gruczoły w ścianie przewodu pokarmowego, dróg oddechowych, w skórze). Posiadają jednostki (odcinki) wydzielnicze i przewody wyprowadzające. Od każdego odcinka wydzielniczego odchodzi przewód wyprowadzający. wewnątrzwydzielnicze: wydzielają do przestrzeni międzykomórkowej, skąd wydzielina (hormon) dostaje się do naczyń krwionośnych, a z krwią do odległych narządów (np. przysadka, tarczyca, nadnercza) Nie posiadają przewodów wyprowadzających, nie są podzielone na jednostki wydzielnicze (wyjątek: tarczyca) Morfologiczna klasyfikacja gruczołów zewnątrzwydzielniczych 1. Ze względu na kształt jednostek (odcinków) wydzielniczych: cewkowe pęcherzykowe cewkowy pęcherzykowy 2. Ze względu na układ odcinków wydzielniczych i przewodów wyprowadzających: proste (nierozgałęziony odcinek wydzielniczy, pojedynczy przewód wyprowadzający) rozgałęzione (rozgałęziony odcinek wydzielniczy) złożone (rozgałęziony układ przewodów proste rozgałęziony złożony wyprowadzających) Klasyfikacja gruczołów zewnątrzwydzielniczych ze względu na sposób wydzielania Małe gruczoły zewnątrzwydzielnicze: w ścianach przewodu pokarmowego i dróg oddechowych 1. Wydzielanie merokrynowe (ekrynowe) = egzocytoza Tak wydziela większość gruczołów 2. Wydzielanie apokrynowe Wydzielina lipidowa, nieotoczona błoną. Od szczytowych części komórek odrywają się pęcherzyki zawierające wydzielinę. Gruczoły apokrynowe (zapachowe) skóry, gruczoł mlekowy cewkowe proste cewkowe rozgałęzione 3. Wydzielanie holokrynowe Komórki gromadzą wydzielinę, obumierają i rozpadają się na fragmenty. Gruczoły łojowe cewkowe złożone pęcherzykowe złożone 10
Duże gruczoły zewnątrzwydzielnicze - zawsze złożone, tworzą odrębne narządy (ślinianki, trzustka, wątroba, gruczoł mlekowy) 11