Badanie procesów zwijania i agregacji GFP i jego mutantów. Monika Olasek, Zakład Biofizyki IFD UW
Plan O Green Fluorescent Protein i jego mutantach Absorpcyjne badanie agregacji EGFP Emisyjne badanie agregacji i zwijania EGFP i GFP Co wyszło na żelu? Podsumowanie
GFP co to jest? Green Fluorescent Protein to białko wyizolowane z meduzy Aqueorea victoria. Charakteryzuje się naturalną fluorescencją w obszarze widzialnym maksimum emisji chromoforu przypada na 58 51nm; Jest to małe białko 238 aminokwasów, Charakterystyczna struktura 11-kartkowa β-beczka z umieszczoną wewnątrz helisą; 3 aminokwasy wchodzące w skład helisy tworzą chromofor.
Dlaczego świeci? ma 1 tryptofan (Trp57) i 13 tyrozyn to są aminokwasy aromatyczne, fluoryzujące w obszarze ultrafioletowym jest to fluorescencja charakterystyczna dla białek. trzy aminokwasy: S65, Y66 i G67 cyklizują ulegają dehydrogenacji i dehydratacji tworząc chromofor, czyli strukturę zdolną do absorpcji promieniowania i do fluorescencji Oczywiście za zainteresowanie GFP odpowiada ten drugi rodzaj świecenia w obszarze widzialnym.
http://www.biochemtech.uni-halle.de/pps2/projects/jonda/ Jak wygląda GFP?
GFP - odkrycie Meduza ma fluoryzujące białko akweorynę (światło niebieskie). Meduza świeci na zielono. Zaczęto szukać i znaleziono GFP. http://www.biochemtech.uni-halle.de/pps2/projects/jonda/
Mutanty Mutanty dzielimy na : świecące: S65T (laboratoryjny dziki typ z uproszczonym widmem absorpcji), S65T/F64L (tzw. EGFP enhanced GFP wzmocnione GFP fluoryzuje ok. 1 razy silniej od typu dzikiego) nieświecące: S65T/G67A (mutacja na glicynie wchodzącej w skład chromoforu, takie mutanty zawsze są nieświecące) Oczywiście jest o wiele więcej mutantów, świecących różnymi kolorami
Oddziaływanie prom. e-m z materią Jeżeli energia fali jest równa energii przejścia, to promieniowanie może zostać pochłonięte (zaabsorbowane) przez cząsteczkę. Diagram Jabłońskiego
Co absorbuje/świeci w białkach? ogólnie układ - elektronowy (elektrony zdelokalizowane) w białkach: aminokwasy aromatyczne: tryptofan i tyrozyna absorpcja ok 28nm, emisja ok 34nm chromofory niebiałkowe (np hem) i białkowe (GFP)* wiązania peptydowe - absorpcja ok 22nm mostki disiarczkowe (np w utlenionym DTT) maksimum absorpcji 283nm (prawie pokrywa się z białkowym pikiem od Trp/Tyr) *chromofor jest generalnie strukturą zdolną do absorpcji promieniowania. Chromofory świecące to fluorofory
Jak wygląda widmo EGFP? Widmo absorpcji EGFP,16 absorpcja (kuw 1cm),14,12,1,8,6,4,2, 25 3 35 4 45 5 55 λ [nm]
Agregacja EGFP Widma absorpcji wykonywane co kilka godzin, odjęte tło buforu (5mM Pi 3mM NaCl, bez DTT) absorbancja [a.u.],3,25,2,15,1,5 h h3.1 h9 h18.9 h28 h37 h49 h55 h72 h72.5 iloraz absorbancji względem h 4, 3,5 3, 2,5 2, 1,5 1,,5, d d3.1 d9 d18.9 d28 d37 d49 d55 d72 d72.5, 25 3 35 4 45 5 55 dł fali [nm] -,5 25 3 35 4 45 5 55 dł fali [nm]
Agregacja EGFP,35,3 1,2 1, iloraz absorbancji,25 absorbancja [a.u.] 1,4 l55 l49 l39 l36 l28 l275 l26 l25,2,15,1,6,4,5,2,, 1 2 3 4 czas [h] 5 6 7 8 d5528 d4928 d3928 d3628 d27528 d2625 d2528,8 1 2 3 4 czas [h] 5 6 7 8
Zmiany emisji a agregacja Ex 29nm Ex 415nm emisja 55 5 45 4 35 3 25 h h24 h48 h67.5 h87 h19 h134.5 h156 h181 h25 emisja 45 4 35 3 25 2 h h24 h48 h67.5 h87 h19 h134.5 h156 h181 h25 2 15 15 1 5 1 5 32 34 36 38 4 42 44 dł. fali [nm] 48 5 52 54 56 58 6 dł fali [nm]
Zmiany emisji w czasie - agregacja Zanik eksponencjalny: y+aexp(-t/ τ) fluorescencja [a.u.] Chi^2 R^2 4 1 = 95.66165 =.9911 rozpraszanie 64nm 42 y = 315 ± 5 A = 122 ± 7 τ = 47 ± 6 38 36 34 8 6 4 2 rozp64 ch58 32 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 czas [h] czas [h] 75 tt32 tt34 2 55 65 flu o re sc e n c ja [a.u.] flu o re sc en cja [a.u.] 7 6 55 5 45 4 35 trp 32 5 trp 34 5 5 45 4 35 3 25 3 2 25 2 4 6 8 1 12 cza s [h ] 14 16 18 2 2 4 6 8 1 1 2 cza s [h ] 14 1 6 18 2
Denaturacja białek Denaturacją nazywamy każdą zmianę struktury natywnej białka powodującą utratę aktywności biologicznej. Denaturację mogą wywołać różne czynniki: środki chaotropowe (mocznik, hydrochlorek guanidyny H2NC(=NH) NH2 HCl), działają w wysokich stężeniach detergenty (SDS sodium dodecyl sulphate) ciepło odczynniki rozcinające mostki disiarczkowe (DTT dithiotreitol, DTE dithioerythritol) kwasy lub zasady ingerujące w mostki solne w białkach Chaotrope = chaos maker ; chaotropes break down the hydrogen-bonded network of water, so allowing macromolecules more structural freedom and encouraging protein extension and denaturation.
Zmiany emisji w czasie - zwijanie S65T - GFP S65T/F64L - GFP 35 2 18 3 16 25 14 emisja 58nm [a.u] 2 15 1 emisja 58nm [a.u] 12 1 8 6 4 5 2 2 4 6 8 1 12 14 czas [min] 3 6 9 12 15 18 21 czas [min] Ex 47nm em 58nm
Zwijanie EGFP emisja [a.u.] 28 26 24 22 2 18 16 14 12 1 8 6 4 2 32 34 36 38 4 42 44 dł fali [nm] M,5M 1M 1,5M 2M 2,5M 3M 4M 5M 6M
Zwijanie EGFP 25 356 24 355 emisja w 37nm [a.u.] 23 22 21 2 19 maksimum emisji Trp (ex 295nm) [nm] 354 353 352 351 35 349 18 1 2 3 4 5 6 stężenie GdnHCl [M] 348 1 2 3 4 5 6 stężenie GdnHCl [M]
Co wyszło na żelu? bez β merkaptoetanolu z β merkaptoetanolem 3 próbki: bez DTT, z DTT, ze świeżym DTT; stały 1 dni, zwirowane, oddzielnie supernatant, oddzielnie pellet
Wnioski Nie wiadomo do końca czemu, ale EGFP agreguje ze stanu natywnego po rozcieńczeniu stężona próbka jest stabilna. Agregację można zobrazować zarówno metodmi absorpcyjnymi jak i emisyjnymi Inny jest mechanizm zwijania GFP i EGFP przy tym samym stężeniu białka w próbce i w tych samych warunkach. Elektroforeza widać, że białko agreguje prążki odpowiadające dimerom i trimerom; nie wiadomo co z wyższymi polimerami trzeba zrobić żel z wiekszymi porami. Czeka mnie jeszcze dużo pracy!!!
My Agnieszka Bzowska Beata Kutrowska Monika Olasek Anna Buszko Patricia Clark (University of Notre Dame, USA)