Opracowanie metod analitycznych przeznaczonych do charakterystyki dodatków żywnościowych i pasz przygotowanych na bazie drożdży wzbogaconych w selen 2006 dr inż. Aleksandra Polatajko 1 15.05.06
Selen, Se Toksyczność Konieczność Niedobór µg/dzień 1000 800 600 400 200 0 34 Se 78.96 2
Znaczenie biologiczne selenu 3 dla zdrowia człowieka zmniejsza ryzyko chorób nowotworowych, serca i układu krążenia wzmacnia sprawność układu odpornościowego zwiększa płodność oraz zapobiega poronieniom chroni przed przedwczesnym starzeniem zmniejsza ryzyko depresji poprawia wygląd skóry, włosów i paznokci...i zwierząt stymuluje właściwy wzrost wzmacnia sprawność układu odpornościowego zwiększa płodność u samic pomaga utrzymać świeżość produktów mięsnych dodaje mięsu soczystości i smaku polepsza kolor i teksturę mięsa zwiększa sprawność koni wyścigowych
Źródła selenu Człowiek Żywność bogata w selen Parafarmaceutyki na bazie drożdży wzbogaconych w selen Zwierzęta Dodatki paszowe na bazie drożdży wzbogaconych w selen 4 30-85 µg /dzień 0.15-0.3 mg /kg paszy
5 Dzienne zapotrzebowanie i aktualne spożycie selenu w wybranych państwach Kraj Australia Belgia Francja Japonia Kanada Niemcy Nowa Zelandia Polska Szwecja Szwajcaria Wielka Brytania USA Zalecane dzienne dawki spożycia Se µg/dzień Mężczyźni 85 70 60 55-60 55 30-70 65 60-70 50 30-70 75 55 Kobiety 70 70 50 45 55 30-70 55 60-75 40 30-70 60 55 Aktualne spożycie Se 57-87 28-61 29-43 104-199 98-224 35 55-80 30-40 (teoretyczne) 38 70 29-39 106
Zawartości selenu w wybranych produktach żywnościowych 6 Produkt Orzechy brazylijskie Pszenica Tuńczyk w konserwie Prażone nasiona słonecznika Watroba drobiowa Maka pszenna Chude mieso i drób Czosnek Zawartośc selenu µg w 100g do 3000 ok. 100 60-80 78 70 70 20 14
Zalecana forma selenu-l-selenomethionina CH 3 S CH 2 Se CH 3 Se CH 2 CH 2 + H 3 N C COO H CH 2 + H 3 N C COO H Methionina (Met) M Selenomethionina (SeMet) 7
Opracowanie metod analitycznych do charakterystyki drożdży selenowych i produktów pochodnych Frakcjonowanie i analiza specjacyjna selenu w drożdżach i paszach wzbogaconych w selen Analiza ilościowa selenometioniny, badanie jej stabilności i procesów utleniania Walidacja opracowanych metod analitycznych Systematyczna charakterystyka związków selenu obecnych w drożdżach wzbogaconych w selen Porównanie profili chromatograficznych (ang. fingerprinting) jako metoda określania źródeł pochodzenia produktów handlowych 8 Zaproponowanie metody ilościowego oznaczania białek zawierających selen
Stosowane techniki analityczne Przygotowanie próbki do analizy specjacyjnej 1. metody ekstrakcji nienaruszające struktury chemicznej związków 2. kontrolowana degradacja np. enzymatyczna Techniki sprzężone (SEC, AE, RP) 9 ICP MS Wysokosprawna chromatografia cieczowa ES MS/MS MALDI TOFMS
Frakcjonowanie związków selenu w drożdżach wzbogaconych w selen Wydajność ekstrakcji 100% 80% 60% 40% 20% 0% A B C D E F G H Próbki różnego pochodzenia Pozostałość Białka nierozpuszczalne w wodzie Związki selenu pozostające w strukturze ścian komórkowych Związki selenu rozpuszczalne w wodzie: selen nieorganiczny, selenoaminokwasy, niektóre proteiny zawierające selen 10 Ekstrakcja wodna Rozkład mieszaniną enzymów pektynolitycznych Ekstrakcja za pomocą SDS Rozkład kwasem azotowym
11 Analiza specjacyjna selenu w drożdżach i paszach wzbogaconych w selen Warunki 8 0.2g drożdży + roztwór chromatograficzne- AE proteazy Eluenty: A: 20 mm kwas octowy, 10 mm trietyloamina B: 200 mm kwas octowy, 100 mm trietyloamina Gradient: 0 5 min: 0 100% A wirowanie 5 30 min: 0 100% B10 min, 2500 rpm 30 40 min: 100% B Przeplyw fazy ruchomej: 1.5 ml/min przesącz Granice wykrywalności: SeMet: 1-2 ng/g Se(IV)/Se(VI): Analiza 50 ng/gae HPLC-ICP MS 82 Se Intensywność x 10 4, cps mieszanie, 17h w 37 C 82 Se Intensywność x 10 3, cps 4 osad Czas, min 0 8 5 10 15 20 25 30 35 40 4 SeMetO SeMet Wydajność ekstrakcji 93±4% Se SeMet 75±4 % Se(IV) x 2 Se(VI) 0 5 10 15 20 25 30 35 40
12 82 Se Intensywność x 10 4, cps Zastosowanie chromatografii dwuwymiarowej AE - SEC - ICP MS 8 6 4 2 Chromatografia anionowymienna SeMetO SeMet I II III 0 5 10 15 20 25 30 35 Czas, min 40 82 Se Intensywność x 10 3, cps 1.6 1.2 0.8 0.4 8.0 4.0 0.8 0.4 0 Frakcja I Frakcja II Frakcja III Czas elucji, min Chromatografia wykluczania SeMet+SeMetO 54 % 98 % 39 % SeMet SeMetO Se 7.1 ± 0.2 % 67 ± 1 % 26 ± 1 % 5 10 15 20 25 30 35 40
Walidacja opracowanych metod analitycznych metodą rozcieńczeń izotopowych (ang. Isotopic Dilution Analysis) Oznaczanie całkowitej zawartości Se niespecyficzny dodatek wzorca znakowanego izotopowo - Se 76 Oznaczanie SeMet specyficzny dodatek wzorca znakowanego izotopowo - SeMet 77 próbka Metoda dodatku wzorca wewn IDA ( 80 Se/ 76 Se) próbka Metoda dodatku wzorca wewn IDA ( 80 Se/ 77 Se) mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg 1 0.51 ± 0.04-1 0.07 ± 0.01 0.09 2 3.3 ± 0.3 3.5 2 1.4 ± 0.2 1.6 3 5.0 ± 0.3 5.3 ± 0.02 3 2.1 ± 0.1 2.4 ± 0.1 4 4.5 ± 0.2 4.5 4 2.1 ± 0.3 2.2 13 5 3.8 ± 0.3 4.1 5 1.9 ± 0.1 1.7
Walidacja opracowanych metod analitycznych - udział w badaniach międzylaboratoryjnych Analizowana próbka: Drożdże wzbogacone w selen Oznaczanie całkowitej zawartości Se Oznaczanie SeMet 14 Całkowita zawartość Se x 10 3, mg/kg 2.0 1.5 1.0 0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 x numer laboratorium x x Stężenie selenometiony x 10 3, mg/kg 4 3 2 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 numer laboratorium
15 Systematyczna charakterystyka związków selenu w drożdżach osad Próbka drożdży Próbka drożdży osad osad Ekstrakcja SDS przesącz Ekstrakcja wodna przesącz Frakcjonowanie przy użyciu SEC Ekstrakcja Driselasą przesącz Oczyszczanie frakcji charakterystyka charakterystyka przy przy użyciu użyciu SEC-ICP SEC-ICP MS, MS, RP RP HPLC-ICP HPLC-ICP MS, MS, ESI ESI MS/MS MS/MS rozkład trypsyną charakterystyka charakterystyka przy przy użyciu użyciu SEC-ICP SEC-ICP MS, MS, RP RP HPLC-ICP HPLC-ICP MS MS Frakcjonowanie przy użyciu RP HPLC rozkład proteazą charakterystyka charakterystyka przy przy użyciu użyciu MALDI MALDI TOF TOF MS, MS, ESI ESI MS/MS MS/MS charakterystyka charakterystyka przy przy użyciu użyciu SEC-ICP SEC-ICP MS, MS, RP RP HPLC-ICP HPLC-ICP MS MS charakterystyka charakterystyka przy przy użyciu użyciu SEC-ICP SEC-ICP MS MS
16 82 82 Se 3 Se Intensywność x 10 6 10 5,, cps cps Charakterystyka wodnego ekstraktu drożdzy selenowych 3.0 8 6 RP- ICP MS SEC-ICP MS 82 Se Intensywność x 10 4, cps 30 20 10 0 Wielkocząsteczkowe frakcje Małocząsteczkowe frakcje 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Objętość elucji, ml 6 4 1.5 4 ES TOF ES MS/MS ES TOF TOF MS/MS Baza danych MS/MS Baza danych 2 & & & 2 MALDI TOF MALDI MALDI MSTOF TOF MS MS HSP12 SIP18 Heat Salt Induced Shock Protein18 12 0 0 10 10 20 20 20 4030 30 60 40 50 40 80 60 Czas, min
Opracowanie metody określania źródła pochodzenia produktów handlowych Przygotowanie próbki Stosowana aparatura drożdże mikroprzeplywowa HPLC pompa 106 µl min -1 102 µl min -1 ekstrakcja wodna podzielnik przepływu fazy ruchomej rozkład enzymatyczny trypsyną dozownik kolumna kapilarna Kalibrator 4 µl min-1 przedkolumna komora mgielna 17 Analiza kapilara RP HPLC ICP MS ICP palnik mikronebulizer
18 80 Se Intensywność x 10 3, cps 80 Se Intensywność x 10 3, cps Porównanie profili chromatograficznych próbek produktów handlowych (ang. fingerprinting) Podobne profile chromatograficzne 6.0 4.0 2.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Czas, min 3 80 Se Intensywność x 10 3, cps 80 Se Intensywność x 10 4, cps Różne profile chromatograficzne 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Czas, min
Zastosowanie HPLC ICP MS do analizy ilościowej białek zawierających selen HSP12 (Heat-Shock Protein) SEKWENCJA AMINOKWASÓW MSDAGRKGFGEKASEALKPDSQKSYAEQGKEYIT- DKADKVAGKVQPEDNKGVFQGVHDSAEKGKDNAE- GQGESLADQAR- D Y M G A A K -SKLND AVEYVSGRVHGEEDPTKK 19 peptyd DYMGAAK (Asp-Tyr-Met-Gly-Ala-Ala-Lys) powstający po rozkładzie trypsyną białka HSP12 i jest dla niego charakterystyczny hydroliza enzymatyczna trypsyną białka HSP12 jest ilościowa izotopowo znakowany peptyd może być otrzymany przez: syntezę oczyszczenie z ekstraktu enzymatycznego izotopowo znakowanych drożdży
Przygotowanie izotopowo znakowanego ( 77 Se) wzorca Izotopowo ( 77 Se) znakowane drożdże ekstrakcja wodna wirowanie Frakcjonowanie przy użyciu SEC-ICP MS rozkład przy użyciu trypsyny wirowanie Frakcjonowanie przy użyciu RP-ICP MS 77 Se Intensywność x10 3, cps 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 77 Se Intensywność x 10 3, cps 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Asp-Tyr-SeMet-Gly-Ala-Ala-Lys 20 0 1 40 60 80 100 120 140 Numer frakcji 0 15 30 45 60 75 90 Numer frakcji
Sprawdzenie czystości wyizolowanego peptydu Kapilarna RP HPLC ICP MS z komora zderzeniową 21 Intensywność x10 4, cps 20 15 10 5 C Se =2.04 ± 0.02 µg Se g -1 C peptydu =24.5 ± 0.2 nmol g -1 95 % 0 5 10 15 20 25 30 35 Czas, min 82 Se 80 Se 77 Se 40
Analiza ilościowa metodą rozcieńczeń izotopowych-kapilarna RP HPLC-ICP MS Intensywność x10 3, cps 6.0 3.0 77 Se 80 Se Próbka z dodatkiem znakowanego peptydu 77 Se/ 80 Se 1.2 0.8 0.4 Stosunek izotopowy C Se = 66 ± 3 µg Se g -1 C peptydu = 0.84 ± 0.04 nmol g -1 C proteiny = 21.7 ± 1.1 nmol g-1 22 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Czas, min
Wnioski Opracowano i zwalidowano metody oznaczania całkowitej zawartości selenu i selenometioniny w drożdżach i paszach wzbogaconych w selen- niezbędne do kontroli jakości tych produktów Wykazano, iż 80% selenu w próbkach drożdży występuje w postaci selenometioniny, a cześć z niej jest niespecyficznie związana ze składnikami matrycy Przedstawiono pełną charakterystykę ilościową i jakościową związków selenu obecnych w drożdżach wzbogaconych w selen Opracowano metodę określania źródeł pochodzenia produktów handlowych (ang. fingerprinting) 23 Zaproponowano metodę ilościowej analizy białek zawierających selen metodą rozcieńczeń izotopowych z zastosowaniem kapilarnej RP HPLC ICP MS z komorą zderzeniową
Dziękuje za uwagę! 2006 dr inż. Aleksandra Polatajko 24 15.05.06