Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP
Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane czy nie]? Do innych celów, np. do dalszego klonowania? Do produkcji białka rekombinowanego? Do transfekcji hodowli komórkowych? Czy białko fuzyjne?). 2. Przygotowanie wektora Miejsce klonowania, restrykcja, żel, oczyszczenie. 3. Przygotowanie wstawki Co chcę sklonować? Jak duże? Jakie musi mieć końce (przygotowanie starterów)? PCR lub reverse transcription-pcr, żel, oczyszczenie, restrykcja, oczyszczenie. 4. Ligacja. 5. Transformacja (selekcja biało-niebieska, jeśli możliwe). 6. Hodowla bakterii. 7. Oczyszczanie DNA z bakterii (mini-, midi-, maxi-prep) LUB białka z bakterii albo hodowli komórkowej. 8. Analiza restrykcyjna (dotyczy DNA).
Wybór wektora T A T A Do klonowania produktów PCR do wektorów typu A-T koniecznie użyć polimerazy Taq lub innej polimerazy, która na końcach produktu dodaje bez matrycy jeden deoksyrybonukleotyd, zwykle A!!!!. Lub dodać takie końce po zakończeniu PCR Wykonanego z polimerazą dającą tępe końce poprzez dodatkową inkubację z polimerazą Taq.
Wybór wektora Ekspresja białek rekombinowanych Zawiera silny promotor, pod który klonujemy sekwencję kodującą białko. Wybór promotora zależy od rodzaju komórek, w których będziemy robić ekspresję (promotor prokariotyczny bakterie lub wirusowy/eukariotyczny komórki eukariontów).
Wybór wektora Ekspresja białek rekombinowanych fuzyjnych (nowe białko składa się z dwóch wyjściowych białek lub ich części) Należy tak wklonować własny gen, by nie zmieniła się ramka odczytu, czyli by po kodonach kodujących białko fluorescencyjne (lub jakiekolwiek inne białko) szły kodony naszego białka.
Wybór wektora Ekspresja białek rekombinowanych fuzyjnych (nowe białko składa się z dwóch wyjściowych białek lub ich części) Należy tak wklonować własny gen, by nie zmieniła się ramka odczytu, czyli by po kodonach kodujących nasze białko, szły kodony białka fluorescencyjnego (lub jakiekolwiek innego białka).
Wybór wektora Badanie aktywności promotorów Wektor zawiera gen reporterowy, ale trzeba wklonować badany promotor lub jego fragment.
Przygotowanie wektora Multiple cloning site (miejsce klonowania wstawki) W zależności od celu klonowania, wybieramy enzymy, którymi przetniemy wektor. Końce wektora i wstawki muszą być kompatybilne (odwrotnie komplementarne). Są to najczęściej takie enzymy, którymi przecięte będą również końce wstawki!!! Trzeba pamiętać o orientacji wstawki: czasami nie ma znaczenia, w którą stronę będzie wklonowana, ale jeśli mamy produkować białko, to tylko jedna orientacja jest prawidłowa. BamHI BamHI BamHI EcoRI EcoRI EcoRI
Restrykcja (trawienie) DNA!
Restrykcja (trawienie) DNA Powszechnie używane enzymy restrykcyjne rozpoznają w DNA konkretne sekwencje o określonej długości. Niektóre rozpoznają sekwencje krótkie (4 pary zasad, np. GTAC), niektóre (najczęściej używane) 6 (np. GAATTC), inne 8 lub więcej. Miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne najczęściej tworzą palindromy (identyczne sekwencje na obydwu niciach czytane od 5 do 3, mają oś symetrii z lustrzanym odbiciem). lepkie końce tępe końce
Restrykcja (trawienie) DNA Czasami trzeba stępić końce, czyli po restrykcji która zostawia lepkie końce produkt poddaje się działaniu enzymu Klenowa, który dodaje do tego, co wystaje.
Elektroforeza i wycięcie odpowiedniego prążka z żelu Żel i oczyszczanie DNA z żelu
Przygotowanie wstawki 1. Wycięcie z innego wektora/dna. 2. Namnożenie w reakcji PCR z matrycy DNA lub z cdna (matrycą jest RNA poddane procesowi odwrotnej transkrypcji). odwrotna transkrypcja
PCR
PCR Amplifikacja ekspotencjalna może nastąpić tylko w początkowych etapach PCR, kiedy występuje nadmiar starterów, dntp, itd. W następnych fazach namnażania proporcje DNA odczynniki zmieniają się, a reakcja nie jest już tak wydajna. Detekcja DNA na żelu możliwa jest najczęściej wtedy, gdy reakcja wejdzie w fazę plateau.
PCR PCR może być dwufazowy (denaturacja + hybrydyzacja i wydłużanie razem)
Projektowanie starterów 1. Można użyć darmowego programu komputerowego. 2. Można zaprojektować samemu: Minimalna długość startera 17 (raczej więcej), Para starterów musi mieć zbliżone temperatury topnienia Tm; gruba metoda liczenia Tm: na każdą A lub T po 2 o C, na każdą C lub G po 4 o C, Na końcu 3 powinny być (ale nie muszą) G lub C, Zawartość G i C powinna wynosić 40-50% (ale nie zawsze jest to możliwe nie jest kluczowe), Startery mogą być zaprojektowane tak, by wprowadzić do DNA miejsce restrykcyjne!!! (tak zwykle przygotowuje się startery przed późniejszym klonowaniem do wektora!!!) albo mutację.
Przygotowanie wstawki: restrykcja produktu PCR Należy pamiętać, że enzymy restrykcyjne niewydajnie tną sekwencje na końcach DNA!!! Konieczne jest dodawanie ogonków na końcach 5 starterów. x x GCGCGCnnn.nnnCTCGAG TAGCTGCGCGCnnn.nnnCTCGAGCAATG Następnie elektroforeza i oczyszczanie z żelu!!!
Ligacja DNA
Ligacja DNA Zwykle wektor i wstawkę tniemy tymi samymi enzymami. Można to też ciąć używając enzymów pozostawiających komplementarne końce, ale po ligacji miejsce restrykcyjne jest stracone (bo powstaje sekwencja inna od wyjściowych). Można też stępiać końce również utrata miejsca restrykcji, ale zwykle nie jest to już ważne.
Transformacja bakterii biało-niebieska selekcja pozytywnych transformantów
Oczyszczanie DNA z bakterii
Analiza restrykcyjna X Enzym i enzym dadzą dwa prążki. Enzym da trzy prążki. O ściśle określonej wielkości!!! Konieczne jest puszczenie również markera wielkości by bez wątpliwości określić wielkość prążków po restrykcji. Jeśli ma być produkowane białko rekombinowane, albo wprowadzono celowo mutację, to konieczne jest sekwencjonowanie!!!