Biotechnologia współczesna

Transkrypt

1 Biotechnologia współczesna Co to jest biotechnologia? Jest to interdyscyplinarna dziedzina nauki, integrująca nauki przyrodnicze i inżynieryjne w celu osiągnięcia zastosowao organizmów, komórek lub ich części oraz molekularnych analogów do pozyskiwania produktów lub usług Podstawowe terminy biotechnologiczne: Ex vivo: wyodrębnienie określonych komórek z organizmu, ich modyfikacja genetyczna In vitro i powtórne wprowadzenie do organizmu In vivo: wprowadzenie genu (np. z wektorem) do organizmu In vitro: modyfikacja genetyczna poza organizmem (w laboratorium) Transformacja: proces przeniesienia DNA wyizolowanego z hodowli bakteryjnej do bakterii biorcy Transfekcja: proces przeniesienia DNA wyizolowanego z bakteriofaga do bakterii biorcy lub proces przeniesienia DNA do komórek eukariotycznych Transgenizacja: proces transformowania całych organizmów, w wyniku którego organizm ulega modyfikacji genetycznej Transgen: gen przeniesiony do organizmu, w wyniku czego powstaje organizm transgeniczny Sonda genetyczna: jednoniciowy kwas nukleinowy (DNA/RNA) znakowany radioaktywnie, używany do identyfikacji komplementarnej sekwencji dzięki parowaniu zasad Wektor: czynnik (np. plazmid lub wirus) przenoszący informacje genetyczną Cząsteczki adaptorowe: krótkie fragmenty DNA z jednej strony tępe, a z drugiej posiadające specjalnie przygotowane lepkie kooce, właściwe dla danej restryktazy Linkery: tępo zakooczone sekwencje łącznikowe zawierające miejsca cięcia dla określonych restryktaz Inżynieria genetyczna DNA jako podstawowy materiał dla inżynierii genetycznej Metody pracy z DNA: 1. Wydzielanie czystego DNA z komórek i tkanek na drodze homogenizacji polega na rozdrobnieniu mechanicznym fragmentu badanej tkanki w celu zniszczenia ich struktur komórkowych. Następnie to tak otrzymanej zawiesiny dodaje się detergentu powodującego rozpad błony komórkowej oraz uwolnienie DNA do roztworu. Kolejną czynnością jest dodanie proteazy (enzym trawiący białko), w celu oddzielenia od DNA towarzyszących mu białek, które są następnie

2 denaturowane przy użyciu ciekłego fenolu. Ostatnim etapem jest dodanie do niemieszającej się fazy wodnej DNA i fenolu, który wytrąca DNA w postaci białych włókienek, które po rozpuszczeniu są gotowe do dalszej obróbki. 1 Wykorzystanie działania enzymów restrykcyjnych w praktyce 2. Fragmentacja DNA wydzielonego z komórek jest niezbędna dla dalszej nad nim pracy, gdyż otrzymane w ten sposób czyste fragmenty DNA zawierają olbrzymie ilości par zasad, a do dalszej obróbki najkorzystniejsze jest otrzymanie fragmentów o długości jednego genu. W tym celu wykorzystuje się nukleazy restrykcyjne wyizolowane z bakterii i charakteryzujące się zdolnością do przecinania DNA jedynie w miejscach występowania określonych, rozpoznawanych jedynie przez dany enzym, krótkich sekwencji zasad. W konsekwencji ich działania otrzymywane są fragmenty: Lepkie kooce: efekt przecięcia DNA, w taki sposób, że miejsca cięcia w niciach komplementarnych są przesunięte w stosunku do siebie o kilka par zasad, co powoduje powstawanie krótkich odcinków jednoniciowego DNA komplementarnych do siebie. Sekwencje lepkich kooców powstałych w wyniku działania tego samego enzymu są komplementarne i mogą łatwo hybrydyzowad ze sobą. W obecności enzymu (ligazy DNA) można takie cząsteczki połączyd kowalencyjnie, co jest wykorzystywane przy rekombinowaniu DNA

3 Tępe kooce: efekt przecięcia obu nici DNA w miejscach położonych naprzeciwko siebie, co powoduje powstawanie krótkich fragmentów DNA nie będących komplementarnymi dla siebie. Tępe kooce można poddad odpowiednim modyfikacjom umożliwiając ich wykorzystanie w procesie rekombinacji DNA. Jedną z nich jest dołączenie cząsteczek adaptorowych bądź linkerów (przed dołączeniem linkerów niezbędna jest metyzacja genomowego DNA dla ochrony przed enzymem restrykcyjnym używanym do 2 Schemat klonowania DNA przy zastosowaniu wektora bakteryjnego wytwarzania lepkich kooców po przyłączeniu linkerów) 3. Metoda elektroforezy posiadających ładunek związków organicznych uwzględnia ich różną szybkośd w poruszaniu się w polu elektrycznym. Przeprowadza się ja umieszczając roztwór DNA w studzienkach wyciętych w agarozowym bloczku umieszczonym w płaskim naczyniu wypełnionym roztworem soli oraz posiadającym elektrody podłączone do źródła stałego prądu na przeciwległych brzegach. Fragmenty DNA wędrują do elektrod poruszając się w polu elektrycznym odpowiednio do swojej wielkości. Po zakooczeniu procesu umieszcza się bloczek w roztworze barwiącym DNA, który wybarwia prążki cząsteczek DNA o określonej długości. 4. Ligaza DNA jako metoda łączenia ze sobą rozdzielonych nukleazami restrykcyjnymi fragmentów DNA (zarówno tych o lepkich, jak i tępych koocach).

4 Klonowanie DNA jest metodą pracy z DNA pozwalającą na otrzymanie milinów identycznych kopii cząsteczek DNA o żądanej sekwencji. Na początku tego procesu wyizolowane z komórki człowieka DNA oraz plazmidy bakteryjne/ bakteriofagowe tnie się przy użyciu odpowiednich restryktaz pozostawiających lepkie kooce. Następnie miesza się przecięte fragmenty DNA i plazmidów, które odnajdują wzajemnie swoje wolne kooce i pod wpływem dodanej ligazy wytwarzają między sobą wiązania kowalencyjne (zrekombinowany plazmid). Tak powstały wektor (służy do przenoszenia fragmentów DNA do komórek, sztucznie zmodyfikowany) wprowadza się do komórek bakterii, który to proces musi poprzedzid umieszczenie bakterii w roztworze chlorku wapnia o temperaturze 273 K w celu osłabienia ich ścian komórkowych i umożliwienia wprowadzenia wektora (transformacja). Następnie na drodze hybrydyzacji (powstawanie dwunicieniowych struktur z połączenia komplementarnych nici DNA), za pomocą sondy (krótki fragment poszukiwanej sekwencji z dodatkiem radioaktywnego fosforu) identyfikuje się kolonię bakterii zawierającą poszukiwaną sekwencję. W metodzie z sondą należy uprzednio przyłożyd do powierzchni hodowli celulozowy/ nylonowy krążek do którego przyczepiają się komórki z każdej kolonii dając replikę wszystkich kolonii na szalce. Następnie krążki płucze się w roztworze wodorotlenku sodu powodując rozpad DNA na fragmenty jednonicieniowe i wiąże się je promieniami UV z podłożem. Tak przygotowany 3 Hybrydyzacja DNA przy użyciu sondy krążek umieszcza się w roztworze z sondą, która przyłącza się tylko do sekwencji komplementarnej do niej. Po wypłukaniu i wysuszeniu przykłada się go w ciemności do kliszy fotograficznej i wywołuje (jeżeli nastąpiło zespolenie DNA z sondą powstaje zaciemnienie na kliszy, jej porównanie z oryginalną szalką pozwala zidentyfikowad poszukiwaną kolonię). Z tak zidentyfikowanej kolonii pobiera się małą ilośd bakterii i umieszcza na kilkanaście godzin w świeżej pożywce, po czym z mikroorganizmów izoluje się plazmidy poddawane następnie działaniu nukleazy restrykcyjnej oraz procesowi elektroforezy, podczas której jeden z powstałych prążków będzie utworzony wyłącznie z

5 poszukiwanego fragmentu DNA. W ten sposób proces klonowania zostaje zakooczony. Biblioteka DNA to zbiór bakterii transformowanych plazmidami zawierającymi fragmenty reprezentujące poszczególne sekwencje całego DNA danego organizmu: Genomowa: zawiera fragmenty DNA występujące w jadrze komórkowym (eksony, introny, sekwencje promotorowe) cdna : zawiera tylko sekwencje DNA kodujące białka (brak intronów) otrzymane z preparatu m RNA wszystkich komórek organizmu przepisanego z powrotem na DNA (odwrotna transkryptaza) Korzyści płynące z zastosowania bakterii transformowanych ludzkimi genami: Możliwośd otrzymywania na dużą skalę białka występującego w organizmie człowieka w znikomych ilościach, W przeciwieostwie do preparatów, które mogłyby byd pozyskiwane z tkanek człowieka czy zwierząt, są one pozbawione ludzkich czynników zakaźnych: wirusów i prionów Białka terapeutyczne: insulina, czynnik VIII (uczestniczy w krzepnięciu krwi), erytropoetyna, aktywator plazminogenu (rozpuszcza zakrzepy), hormon GH, Otrzymywanie antygenów stosowanych jako szczepionki. Sekwencjonowanie DNA 4 Schematy wyników sekwencjonowania DNA

6 Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych (RELP) jako metoda ustalania tożsamości wykorzystująca analizę przecinania DNA nukleazami restrykcyjnymi (wykorzystanie wzoru utworzonego w genomie przez mutacje punktowe charakterystyczne dla konkretnej osoby, uniemożliwiające działanie nukleaz restrykcyjnych w miejscu ich występowania). W jej przebiegu rozcina się DNA określoną kombinacją nukleaz i powstałe fragmenty poddaje elektroforezie. Następnie przeprowadza się hybrydyzację z użyciem określonej sondy, ujawniając wzór odcinków, które zawierają te sekwencje (zależny o mutacji punktowych). Metoda ta jest stosowana do ustalania pokrewieostwa, ojcostwa, oraz przynależności danych próbek DNA do konkretnej osoby. Łaocuchowa reakcja polimerazy (PCR) jako metoda otrzymywania dowolnej liczby kopii fragmentu DNA o określonej sekwencji wykorzystująca zdolnośd polimerazy DNA do kopiowania jednoniciowych odcinków DNA. Na początku procesu dwuniciowy DNA umieszcza się w roztworze ze starterami (krótkie odcinki DNA komplementarne do początku i kooca fragmentu DNA, który ma byd sklonowany), czterema rodzajami trifosfonukleozydów oraz polimerazą Taq DNA (termoodporną), który jest ogrzewany do temperatury 363 K powodując denaturację DNA do dwóch komplementarnych nici. Następnie roztwór jest schładzany do K wywołując przyłączanie się starterów do kooców pojedynczych nici oraz rozpoczęcie działania polimerazy Taq i wydłużanie nici. Cały cykl powtarza się kilkadziesiąt razy. Różnica między PCR a klonowaniem polega 5 Schemat przebiegu PCR

7 na tym, że do rozpoczęcia PCR niezbędna jest znajomośd początkowego i koocowego fragmentu DNA, który ma byd powielany, a niewymagana jest obecnośd wektorów ani bakterii. W przypadku klonowania sytuacja jest dokładnie odwrotna Wykorzystanie PCR: badanie śladów zbrodni, diagnostyka chorób oraz zakażeo wirusowych u roślin i zwierząt, kontrolowanie pochodzenia żywności (rozróżnianie żywności transgenicznej i nietransgenicznej) Organizmy transgeniczne Organizm transgeniczny to taki, którego wszystkie komórki zawierają w swoich chromosomach transgen (obcy fragment DNA) wprowadzony za pomocą metod inżynierii genetycznej (transformacja) = GMO Warunek: transgen musi byd w komórce transkrybowany, a jego transkrypt wykorzystywany w komórce do syntezy białka (obecnośd w transgenie genu kodującego białko oraz promotora pozwalającego na jego transkrypcję) Cel: zmiana właściwości organizmu, do którego wprowadzany jest transgen poprzez ekspresję zawartej w nim informacji Otrzymywanie roślin transgenicznych Z wykorzystaniem plazmidu Ti z bakterii Agrobacterium tumefaciens, po usunięciu z niego fragmentu DNA odpowiedzialnego za wywoływaną przez te bakterie chorobę roślin, Przy użyciu strzelby genowej z kuleczkami złota, do których przylepione są fragmenty DNA, które po wniknięciu do komórki dostają się do jądra i są włączane do genomu Wprowadzanie obcego DNA do komórek zwierzęcych (nie są to organizmy transgeniczne!) Zakażanie komórek wirusem pozbawionym sekwencji DNA 6 Otrzymywanie roślin transgenicznych z zastosowaniem plazmidu Ti

8 umożliwiającej namnażanie się go w organizmie, a posiadającym w genomie wstawiony transgen, Umieszczanie komórek zwierzęcych w roztworze zawierającym obce DNA, Wstrzykiwanie DNA do komórek Otrzymad zwierzę transgeniczne można jedynie poprzez wprowadzenie DNA do zapłodnionej komórki jajowej ssaka, która jest następnie wprowadzana do macicy samicy (implantacja), rozwija się zarodek i nowy organizm przychodzi na świat (nie zawsze aktywna transkrypcja zachodzi w całym organizmie) Zastosowanie GMO: Otrzymywanie rzadkich ludzkich białek z komórek zwierząt transgenicznych (nie wszystkie białka wytwarzane przez bakterie są pełnowartościowe ze względu na brak enzymów je modyfikujących), Otrzymywanie roślin transgenicznych odpornych na szkodniki, choroby, herbicydy o lepszej jakości i wyższej wartości użytkowej, Regulacja tempa dojrzewania roślin t. oraz ich składu chemicznego Współczesna biotechnologia w medycynie Komórki macierzyste: częściowo zróżnicowane komórki, które w razie zapotrzebowania ponownie się dzielą (liczba tych podziałów jest jednak ograniczona), występują m. In. w szpiku kostnym, mózgu, krwi, tkance tłuszczowej, skórze, mięśniach szkieletowych, trzustce, wątrobie Zarodkowe komórki macierzyste: całkowicie niezróżnicowane (nie tracą możliwości podziału), w stadium blastuli tworzą warstwę komórek otaczającą wypełnioną płynem przestrzeo, które można pobrad za pomocą mikropipety i hodowad na pożywkach aż do konieczności ich zróżnicowania w odpowiednią tkankę (za pomocą podania czynnika wzrostowego) Klonowanie organizmów Mechanizm: umieszczenie jądra pobranego z komórki somatycznej dorosłego osobnika i umieszczenie go w oocycie pozbawionym własnego materiału genetycznego; białka cytoplazmy oocytu odróżnicowują materiał genetyczny komórki somatycznej i jest zdolny do dalszego rozwoju po umieszczeniu w macicy matki zastępczej

9 Etapy 7 Schemat przebiegu klonowania klonowania organizmów: 1. Pobranie komórek somatycznych dawcy i poddanie ich hodowli In vitro 2. Wyizolowanie z pobranych Komorek somatycznych dawcy jądra 3. Pobranie komórki jajowej biorcy i usunięcie z niej jądra 4. Wprowadzenie wyizolowanego jądra komórek somatycznych dawcy do pozbawionej jądra komórki jajowej biorcy 5. Pobudzenie zmodyfikowanej komórki jajowej do podziałów 6. Implantacja powstałego zarodka do macicy biorcy 7. Uzyskanie organizmu identycznego genetycznie w stosunku do organizmu dawcy Diagnostyka genetyczna przy zastosowaniu metody PCR do ustalania mutacji w danych odcinkach DNA, określaniu odmian choroby i wykrywania obecności patogenów oraz pasożytów Terapia genowa (np. w przypadku wrodzonego zespołu niedoboru immunologicznego) Międzynarodowe banki sekwencji Współczesna biotechnologia a etyka Czy rośliny transgeniczne mogą wytwarzad szkodliwe dla człowieka produkty uboczne, chociażby alergeny?

10 Czy transgeny mogą rozprzestrzenid się w środowisku przez krzyżowanie z pokrewnymi organizmami dzikimi? Czy wiedza o genetycznej podatności osób na niektóre choroby może stad się przyczyną ich dyskryminacji? Czy technologia In vitro oraz klonowanie człowieka mogą zostad społecznie zaakceptowane? Praktyczne zastosowania osiągnięd inżynierii genetycznej Testy genetyczne w celu ustalenia, czy dana osoba ma określoną mutację genową, związaną z występowaniem np. mukowiscydozy, hemofilii, anemii sierpowatej, określenie ryzyka zachorowania m. In na nowotwory, co umożliwia odpowiednią profilaktykę, szybkie wykrycie choroby i odpowiednie działania lecznicze Terapia genowa (użycie specyficznego DNA do leczenia choroby poprzez naprawę defektu genetycznego) Produkcja środków farmaceutycznych np. insuliny (podawana insulino zależnym diabetykom), hormonu GH (podawany dzieciom wykazującym niedobory wzrosty, szczególnie przy karłowatości przysadkowej), ludzkiego czynnika krzepliwości krwi VIII (leczenie hemofilii typu A), tkankowego aktywatora plazminogenu (terapia chorób naczyo krwionośnych i serca gdyż jest białkiem zapobiegającym powstawaniu zakrzepów i rozpuszczającym je), tkankowego czynnika wzrostowego beta (leczenie ran oraz oparzeo, aktywuje wzrost naczyo krwionośnych i skóry) Produkcja szczepionek Typowanie DNA wykorzystywane w identyfikacji ofiar katastrof, określaniu linii komórkowych nowotworów ludzkich, wykrywaniu skażonej żywności, w badaniach genetycznych przodków populacji ludzkich, przy ustalaniu ojcostwa dziecka Organizmy genetycznie modyfikowane i ich wykorzystanie w medycynie oraz rolnictwie (czyt. wyżej) RELP i PCR wykorzystywane w kryminologii do ustalania/ potwierdzania tożsamości przestępców oraz ofiar nie mogących byd rozpoznanych na podstawie cech fenotypowych Umożliwianie bezpłodnym rodzicom posiadanie własnego potomstwa (zapłodnienie In vitro metoda polegająca na połączeniu komórki jajowej i plemnikowej w warunkach laboratoryjnych oraz późniejszym umieszczeniu zarodka w macicy matki; In vivo mechaniczne wtryśnięcie plemników pobranych wcześniej od dawcydo dróg rodnych kobiety) Hodowla organów zastępczych dla zwiększenia liczby i skuteczności przeszczepów

11 Bibliografia: 1. Solomon, Berg, Martin; Biologia ; Warszawa, Multico, 2007r. 2. Grykiel, Mazurek i inni; Tablice biologiczne, Gdaosk. Podkowa, 2007r. 3. Falkowski, Foremniak i inni; Matura 2010 Vadenecum biologia, Gdynia, Operon, 2006r. 4. Spalik; Biologia częśd 3, Podręcznik dla liceum ogólnokształcącego, liceum profilowanego i technikum - kształcenie w zakresie rozszerzonym, Warszawa, WSiP, 2004r. 5. Zakład Genetyki Uniwersytetu Warszawskiego Genetyka molekularna (