ODPORNOŚĆ WAŻNA CECHA METODY BADAWCZEJ

Transkrypt

1 ODPORNOŚĆ WAŻNA CECHA METODY BADAWCZEJ Ryszard Dobrowolski, Waldemar Korol 1 UMCS Lublin, Wydział Chemii 1 Instytut Zootechniki-PIB, KLP w Lublinie

2 Co to jest odporność metody? Odporność metody badawczej (ang. robustness, ruggedness) jest cechą metody, którą możemy określić badając wpływ niewielkich, niezamierzonych zmian warunków postępowania analitycznego (parametrów) na końcowy wynik oznaczania np. zmiany temp. mineralizacji lub spalania, czasu mineralizacji, zmiany ph, zmiany czasu tworzenia barwy itp.

3 Metody nieodporne i odporne Metoda nieodporna Metoda odporna niewielkie zmiany warunków postępowania analitycznego wpływają na końcowy wynik badania niewielkie zmiany warunków oznaczania nie wpływają na końcowy wynik

4 Graficzny obraz odporności metody badawczej rys. 1 metoda nieodporna metoda odporna

5 Schematy i przewodniki badania odporności metody - Schemat Youdena - postępowanie zalecane przez AOAC [1] - Przewodnik oceny odporności metod badawczych stosowanych w biochemii i farmacji podczas ich walidacji - Heyden i wsp.[4] - Algorytm Donga, stosowany m.in. podczas walidacji metody badania zanieczyszczeń nierozpuszczalnych w tłuszczach [11]. - Przegląd badania odporności metod chromatograficznych - Dejaegher i Heyden [2]. - Schemat walidacji metody uwzględniający badanie odporności w dziedzinie nauk medycznych zaproponowali Frey i Xiang Li [3].

6 Cel referatu Celem referatu jest wskazanie odporności jako cechy metody badawczej, którą należy uwzględnić podczas sprawdzania lub walidacji metody. Podano sposób oceny odporności metody i przykłady badania odporności przy oznaczaniu kadmu w glebie metodą GFAAS i chlorków w paszach metodą amperometrycznego miareczkowania.

7 Odtwarzalność miara odporności metody Kryteria prowadzenia badań międzylaboratoryjnych określił Horwitz. Liczba laboratoriów uczestniczących ( 8) i liczba badanych matryc ( 6). Kryterium oceny badań międzylaboratoryjnych jest wskaźnik Horrat H tj. stosunek względnego odchylenia standardowego odtwarzalności uzyskanego w badaniach międzylaboratoryjnych do względnego docelowego odchylenia standardowego odtwarzalności obliczonego z równania Horwitz a RSDR (%) = 2 C -0,15 w którym RSDR oznacza względne docelowe odchylenie standardowe odtwarzalności (%) a C jest niemianowanym ułamkiem masy, np. 1 ppm = 10-6 Akceptowane wartości wskaźnika H mieszczą się w przedziale 0,5 < H < 2.

8 Odtwarzalność miara odporności metody Wskaźnik Horwitz a Horrat H jest powszechnie stosowany w ocenie precyzji metod, np. w normach CEN i ISO Jednak uczestnictwo w badaniach międzylaboratoryjnych nie jest powszechne i tylko wybrane laboratoria, często po ocenie wyników fazy wstępnej, mogą uczestniczyć w takich badaniach.

9 Jak w praktyce określić odporność metody? Schemat Youdena

10 Plan badań odporności metody wg Youdena (AOAC). Przykład 8 kombinacji i 7 czynników zastosowanych do badania odporności metody analitycznej Czynnik Nr kombinacji lub oznaczenia A lub a A A A A a a a a B lub b B B b b B B b b C lub c C c C c C c C c D lub d D D d d d d D D E lub e E e E e e E e E F lub f F f f F F f f F G lub g G g g G g G G g Wynik s t u v w x y z

11 Plan badań odporności metody wg Youdena (AOAC). (przykład 8 kombinacji i 7 czynników zastosowanych do badania odporności metody analitycznej) Dużymi literami A, B, C i G oznakowano zalecane w procedurze wartości czynników (np. temp. mineralizacji, czas mineralizacji, objętość kwasu do mineralizacji), które mogą wpływać na wynik badania i które nieznacznie zmieniano. Alternatywne wartości zmienionych czynników oznakowano małymi literami a, b, c i g. Całkowita liczba kombinacji wynosi 2 7 tj. 128 i w praktyce jest trudna do sprawdzenia.

12 Plan badań odporności metody wg Youdena (AOAC). (przykład 8 kombinacji i 7 czynników zastosowanych do badania odporności metody analitycznej) Możliwe jest jednak wybranie kilku (8) kombinacji, które odpowiednio równoważą wysokie i niskie wartości badanych czynników. Wyniki tych kombinacji oznakowano w tabeli literami od s do z. Aby sprawdzić czy zmiana czynnika A na a wywiera wpływ na wynik należy porównać średnią (s + t + u + v)/4 ze średnią (w + x + y + z)/4. Odpowiednio, badając wpływ zmiany czynnika G na g należy porównać średnie (s + v + x + y)/4 i (t + u + w + z)/4 (tab. 1).

13 PRZYKŁAD 1: BADANIE ODPORNOŚCI METODY GFAAS OZNACZANIA KADMU W GLEBIE Czynnik* Nr kombinacji lub oznaczenia A: temperatura A A A A a a a A B:czas mineral. B B B b B B b B C: obj. HNO 3 C c C c C c C C D: obj. HF D D D d d d D D E: symulacja E e E e e E e E F: symulacja F f F F F f f F G: symulacja G g G G g G G G Wynik s t u v w x y z Absorbancja 0,475 0,480 0,485 0,481 0,479 0,470 0,477 0,478 * temperatura: A 180 C, a C; czas mineralizacji B 30 min, b 60 min; objętość HNO 3 C- 5 ml, c 5,5 ml; objętość HF D 5 ml, d 5,5 ml

14 PRZYKŁAD 1: BADANIE ODPORNOŚCI METODY GFAAS OZNACZANIA KADMU W GLEBIE Równanie Czynnik Odporność V = A ¼ (s +t+u+v) ¼ (w +x +y +z) V A= 0,00425 temp Tak V B = ¼ (s+t+w+x) ¼ (u+v+y+z) V B =-0,0043 Czas Tak V C = ¼ (s+u+w+y) ¼ (t +v+x+ z) V c =0,00175 Obj. Tak V D = ¼ (s+t+y+z) ¼ (u + v + w + x) V D =-0,0012 Obj. Tak V E = ¼ (s +u+x z) ¼ (t + v + w + y) V E =-0,0022 Symulacja Tak V F = ¼ (s+ v+ w+ z) ¼ (t+ u+ x + y) V F =0,00025 Symulacja Tak V G = ¼ (s +v +x + y) ¼ (t +u+ w+z) V G =-0,0047 Symulacja Tak

15 PRZYKŁAD 2: BADANIA ODPORNOŚCI OZNACZANIA CHLORKÓW W PASZACH METODĄ AMPEROMETRYCZNEGO MIARECZKOWANIA (Chem. Anal. 27, 1982, ) AZOTAN SREBRA 2 ml HNO 3 2 ml r-r ŻELATYNY PRÓBKA 100 ml H 2 O MIESZANIE 2 min. MIARECZKOWANIE AMPEROMETRYCZNE ELEKTRODY SREBROWE mv AMPEROMIERZ (PAM-AA 2)

16 PRZYKŁAD 2: BADANIA ODPORNOŚCI OZNACZANIA CHLORKÓW W PASZY METODĄ AMPEROMETRYCZNEGO MIARECZKOWANIA Czynnik* Nr kombinacji lub oznaczenia A: tłuszcz A(6,83) A(6,76) A(6,69) A(6,93) a(6,93) a(6,88) a(7,03) a(7,11) B: czas ekstr. B(6,61) B(6,85) b(6,60) b(6,81) B(7,14) B(6,94) b(6,73) b(6,81 C: obj. ekstr. C(6,88) c(6,94) C(6,80) c(6,82) C(6,89) c(6,72) C(6,88) c(6,86) D: obj. HNO 3 D(6,92) D(6,76) d(6,75) d(6,79) d(6,63) d(6,76) D(6,90) D(6,77 Wynik s t u v w x y z Zawartość, g/kg 6,81 6,83 6,71 6,84 6,89 6,82 6,88 6,89 *tłuszcz w paszy A bez dodatku tłuszczu, a z dodatkiem 4,9% tłuszczu; czas ekstrakcji chlorków B 2 min, b 2,5 min; objętość ekstraktu C- 100 ml, c 125 ml; objętość HNO3 D 2 ml, d 2,5 ml

17 PRZYKŁAD 2: BADANIA ODPORNOŚCI METODY OZNACZANIA CHLORKÓW W PASZY METODĄ AMPEROMETRYCZNEGO MIARECZKOWANIA Równanie Czynnik Odporność V A = ¼ (s+t+u+v) ¼ (w+x+y+z) V A =-0,1850 Tłuszcz Tak V B = ¼ (s+t+w+x) ¼ (u+v+y+z) V B =0,1475 Czas ekst. Tak V C = ¼ (s+u+w+y) ¼ (t+v+x+z) V C =0,0275 Obj. ekstr. Tak V D = ¼ (s+t+y+z) ¼ (u+v+w+x) V D =0,1100 Obj. kw. azot. Tak

18 Badanie odporności wykrywanie istotnych różnic pomiędzy wariancjami i wartościami średnimi serii pomiarowych Różnice wykrywamy na podstawie testów statystycznych, (np. test Studenta - wariant dwustronny)

19 WYNIK TESTU (F-pozytywny) Wartości średnie próbek nie różnią się istotnie. P = 94.87% t exp =2.550, tkryt(95%, 5)=2.571 WPROWADZONE DANE 1. M-ka bez dod. tłuszczu 6.83 M-ka + 4,9 % tłuszczu PARAMETRY STATYSTYCZNE liczność serii n 4 4 średnia rytm. /n odchylenie std. SD (CV) RSD 100% błąd std. SD/ n

20 PODSUMOWANIE Ocena odporności metody pozwala na lepsze poznanie i zrozumienie czynników, które mogą wpływać na końcowy wynik badania. Wiedza w tym zakresie pozwala na lepszą kontrolę metody ponieważ znamy granice tolerancji parametrów metody w obrębie których uzyskujemy poprawne wyniki. Badanie odporności metody może być szczególnie zalecane i przydatne przy wdrażaniu elastycznego zakresu metody zwłaszcza w przypadku gdy uwzględnimy zmienność matrycy. Wprawdzie zmienność matrycy nie jest czynnikiem wynikającym bezpośrednio z definicji odporności metody jednak, w przypadku wytwarzanych aktualnie produktów takich jak środki farmaceutyczne, żywność, pasze zmienność matrycy jest wręcz regułą i wynika z dążenia do zaspokojenia potrzeb Klienta a nawet kreuje te potrzeby.

21 PODSUMOWANIE Badanie odporności metody podczas walidacji nie powinno wpływać zasadniczo na czas walidacji i związane z tym koszty. Wykonane pomiary można wykorzystać do oceny precyzji metody. Dane nt. wpływu zmiennych czynników na wynik badania można wykorzystać do budowy budżetu niepewności metody.

22 Dziękuję za uwagę Pytania? Instytut Zootechniki-PIB, Krajowe Laboratorium Pasz, ul.chmielna 2, Lublin, tel/fax