Właściwości przeciwnowotworowe polisacharydów izolowanych z grzybów klasy Basidiomycetes

Transkrypt

1 Właściwości przeciwnowotworowe polisacharydów izolowanych z grzybów klasy Basidiomycetes Marta Kinga Lemieszek martalemieszek@gmail.com Zakład Biologii Medycznej, Instytut Medycyny Wsi w Lublinie Streszczenie Grzyby z klasy Basidiomycetes stanowią cenne źródło substancji biologicznie aktywnych, o właściwościach przeciwnowotworowych. Atrybut ten przypisuje się przede wszystkim polisacharydom oraz ich pochodnym. Potencjał przeciwnowotworowy wielocukrów związany jest z ich pochodzeniem, składem i strukturą chemiczną, rozpuszczalnością oraz sposobem izolacji. Ich aktywność moŝe być znacząco zwiększona na drodze modyfikacji chemicznych. Efekt przeciwnowotworowy polisacharydów moŝe wynikać z działania pośredniego (immunostymulacja) lub bezpośredniego (hamowanie proliferacji komórek i/lub indukcja apoptozy). Z pośród szerokiej gamy polisacharydów o udokumentowanych właściwościach przeciwnowotworowych, na szczególną uwagę zasługują lentinan, PSK i schizophyllan. Polisacharydy te są od wielu lat z powodzeniem wykorzystywane w terapii róŝnego rodzaju nowotworów. Stosunkowo niewiele wiadomo natomiast o prozdrowotnych właściwościach bardzo popularnych na półkuli północnej Boletus edulis (borowik szlachetny; prawdziwek) oraz Cantharellus cibarius (pieprznik jadalny; kurka). Prezentowana praca przedstawia chemoprewencyjne właściwości ekstraktów pozyskiwanych z prawdziwka i kurki względem komórek raka okręŝnicy. Udowadniając olbrzymi potencjał terapeutyczny wspomnianych grzybów. Słowa kluczowe: Basidiomycetes, polisacharydy, lentinan, PSK, krestin, schizophyllan, Boletus edulis, Cantharellus cibarius

2 WSTĘP Korzyści zdrowotne wynikające ze spoŝycia grzybów znane są od tysięcy lat. W medycynie krajów Dalekiego Wschodu (Chiny, Japonia, Korea, część azjatycka Rosji) stosuje się produkty z grzybów jako suplementy diety lub jako leki od ponad 2000 lat [1]. Na Zachodzie, grzyby spoŝywano przede wszystkim ze względu na ich walory smakowe i zapachowe. Jednak w ostatnich latach grzyby znalazły się w centrum zainteresowania uczonych z całego świata jako źródło substancji biologicznie aktywnych o korzystnym wpływie na funkcjonowanie organizmu człowieka. Efektem tych badań było wprowadzenie na rynki światowe tzw. mykofarmaceutyków czy teŝ grzybowych suplementów diety. O skali i randze tego zjawiska świadczy fakt, Ŝe grzyby jadalne zostały zaliczone do grupy produktów określanej mianem Ŝywności funkcjonalnej tj. Ŝywności o udokumentowanym badaniami naukowymi korzystnym wpływie na zdrowie ponad ten, który wynika z obecności w nich składników odŝywczych tradycyjnie uznanych za niezbędne [2-5]. Od wieków wiadomo, Ŝe niektórzy przedstawiciele grzybów z klasy Basidiomycetes (Podstawczaki) posiadają właściwości przeciwnowotworowe. Po raz pierwszy zademonstrował je Lucas i wsp. [6] na ekstrakcie sporządzonym z owocników Boletus edulis (borowik szlachetny) w teście z uŝyciem komórek sarkoma 180 u myszy. Zespół Lucasa wyizolował równieŝ z Calvatia gigantea (purchawica olbrzymia) calvacin, który w 1960 był najpopularniejszym produktem naturalnym izolowanym z grzybów o właściwościach przeciwnowotworowych [7]. Działanie calvacinu potwierdzono w komórkach Sarcoma 180, gruczolaka sutkowego 755, białaczki L-1210 oraz HeLa [4]. Pod względem chemicznym, z pośród licznych substancji biologicznie aktywnych o właściwościach przeciwnowotworowych pozyskiwanych z grzybów, zdecydowaną większość stanowią polisacharydy [4, 8-12]. Głównym ich źródłem jest ściana komórkowa komórek grzybowych. Przy czym, jak wykazano w badaniach, chityna i chitosan nie posiadają aktywności antynowotworowej [13]. Pod względem chemicznym większość polisacharydów grzybowych o właściwościach przeciwnowotworowych moŝna zaliczyć do pochodnych (1 3), (1 6) β-glukanów oraz (1 3) α-glukanów [14]. Związki te zbudowane są z linearnego lub rozgałęzionego łańcucha, utworzonego przez cząsteczki glukozy oraz z łańcucha bocznego zawierającego róŝną kombinację innych cukrów prostych, głównie kwasu glikuronowego, ksylozy, galaktozy, mannozy, arabinozy lub rybozy. Powszechne są równieŝ kompleksy białkowe. Równie liczną grupę wielocukrów o właściwościach przeciwnowotworowych stanowią glukany, gdzie cząsteczka wielocukru utworzona jest z innych niŝ glukoza monosacharydów. U grzybów, najczęściej występują glukany zawierające w przewaŝającej mierze: arabinozę, mannozę, fukozę, galaktozę, ksylozę, kwas glikuronowy jak równieŝ glukozę [12]. Struktura chemiczna a właściwości przeciwnowotworowe

3 W zaleŝności od źródła pochodzenia (kaŝdy gatunek a nawet szczep ma nieco inny zestaw wielocukrów), polisacharydy róŝnią się strukturą chemiczną, masą cząsteczkową oraz sposobem i liczbą odgałęzień łańcuchów bocznych, co wpływa na ich aktywność biologiczną. [15-18]. Właściwości przeciwnowotworowe polisacharydów zaleŝą od: składu cukrów Właściwości przeciwnowotworowe zostały wykazane dla polisacharydów naleŝących do hetero β- glukanów [19], heteroglikanów [20], kompleksów β-glukan białko [21], α-manno-β-glukany, kompleksy α-glukan-białko [19] oraz kompleksy białko-heteroglikany [22, 23]. masy cząsteczkowej Glukany o wyŝszej masie cząsteczkowej wydają się być bardziej skuteczne niŝ te o małej masie cząsteczkowej [8-10, 13]. rozpuszczalności w wodzie Z reguły, większą aktywność wykazują polisacharydy rozpuszczalne w wodzie [24]. sposobu połączenia cząsteczek cukrów Wykazano, Ŝe właściwości przeciwnowotworowe posiadają glukany, w których łańcuch główny złoŝony jest z reszt glukozowych połączonych wiązaniami β-(1 3) glikozydowymi, a dodatkowo występują rozgałęzienia utworzone przez wiązania β-(1 6) glikozydowe. β-glukany posiadające głównie wiązania β-(1 6) glikozydowe charakteryzują się mniejszą aktywnością [8-10]. struktury trzeciorzędowej Wykazano, Ŝe zniszczenie struktury trzeciorzędowej polisacharydów poprzez denaturację, znacznie obniŝa lub całkowicie znosi ich aktywność biologiczną [25-27]. sposobu i liczby odgałęzień łańcuchów bocznych Wykazano, Ŝe najwyŝszą aktywnością charakteryzują się polisacharydy ze stopniem odgałęzienia w zakresie 0,20-0,33 w stosunku do masy cząsteczkowej [16, 17, 28, 29]. obecności innych podstawników Na właściwości przeciwnowotworowe korzystnie wpływa obecność innych cukrów np. galaktozy, mannozy, fruktozy, ksylozy czy arabinozy. Dodatkowo, aktywność przeciwnowotworową nasila obecność białka [13]. modyfikacji chemicznych Aktywność przeciwnowotworową polisacharydów moŝna zwiększyć poprzez chemiczne modyfikacje mające na celu zwiększenie ich rozpuszczalności w wodzie i zdolności do przenikania przez ściany jelita po ich doustnym podaniu. Najczęściej stosowane modyfikacje to degradacja Smitha (hydroliza utleniająco-redukująca), aktywacja metodą formolizy czy karboksymetylacji [8, 9, 23, 30-33]. Najpopularniejsze preparaty przeciwnowotworowe pozyskiwane z Podstawczaków

4 Bogatym i wciąŝ niezbadanym do końca źródłem polisacharydów o właściwościach przeciwnowotworowych są grzyby z klasy Podstawczaków (Basidiomycetes). Potwierdzają to zakrojone na szeroką skalę badania uczonych z Chin i Japonii, którzy wykazali, Ŝe większość jeśli nie wszystkie Podstawczaki zawierają biologicznie aktywne polisacharydy. Badania zostały wykonane na zwierzętach z Sarkomą 180 oraz guzami Ehrlicha [11]. Do tej pory najlepiej scharakteryzowane zostały trzy polisacharydy, które od blisko 50 lat dostępne są na rynku tj. lentinan, PSK (krestin) i schizophyllan [8, 34]. Lentinan jest wysoce oczyszczoną frakcją polisacharydową izolowaną z Lentinus edodes (Shiitake). Pod względem struktury chemicznej jest to ß-glukan, w którym łańcuch główny utworzony jest z cząsteczek glukozy połączonych wiązaniami β-(1 3) glikozydowymi, zaś odgałęzienia boczne stanowią cząsteczki glukozy połączone z łańcuchem głównym wiązaniami β-(1 6) glikozydowymi [9]. Lentinan jest powszechnie stosowany w Japonii, gdzie został zalegalizowany jako lek przeciwnowotworowy. Podawany jest łącznie z innymi konwencjonalnymi farmaceutykami w terapii nowotworów m.in. wątroby, Ŝołądka, jelita, płuca i jajnika. Wykazano, Ŝe lentinan zwiększa skuteczność konwencjonalnej terapii a tym samym wydłuŝa przeŝycie pacjentów [35]. W badaniach eksperymentalnych wykazano, Ŝe podawanie lentinanu zapobiega onkogenezie indukowanej chemicznie lub przez wirusy, jak równieŝ zapobiega procesom przerzutowania [25, 36-38]. Krestin (PSK) jest polisacharydem izolowanym z Trametes versicolor. Poza częścią cukrową którą stanowi β-glukan, w skład cząsteczki PSK wchodzi równieŝ peptyd. Część cukrową stanowi łańcuch główny utworzony przez cząsteczki glukozy połączone wiązaniami β-(1 3) oraz β-(1 4) glikozydowymi, w odgałęzieniach bocznych występują wiązania β-(1 6) glikozydowe [9]. Podobnie jak lentinan, krestin jest bardzo popularnym lekiem stosowanym w Japonii. Liczne badania kliniczne wykazały, Ŝe jego podawanie zwiększa skuteczność chemioterapii u pacjentów cierpiących na nowotwory piersi, wątroby, prostaty, Ŝołądka, płuca i okręŝnicy. Samodzielnie, jako lek stosowany jest w weterynarii m.in. przeciwko nowotworom płuca, jelita grubego oraz sarkomie, mastocytomie i czerniakowi [35]. Schizophyllan pozyskiwany jest z Schizophyllum commune. Pod względem struktury chemicznej tj. składu cukrów oraz sposóbu ich połączenia, przypomina lentinan. Komercyjna nazwa tego ß-glukanu to Sonifilan [9]. Preparat ten stosowany jest w terapii raka Ŝołądka i szyi [2]. Dodatkowo, jest podawany w trakcie radioterapii ze względu na swoje radioprotekcyjne właściwości związanych z pobudzaniem proliferacji i regeneracji uszkodzonych promieniowaniem gamma komórek szpiku kostnego [39-41]. Polisacharydy pozyskiwane z innych grzybów w obrębie klasy Basidiomycetes równieŝ wykazują działanie prozdrowotne. Liczne doniesienia naukowe potwierdziły ich zdolności do zapobiegania karcynogenezie, przerzutowaniu oraz hamowaniu rozwoju juŝ istniejących zmian nowotworowych [25, 36-38]. Mechanizm działania

5 RóŜnorodność struktury polisacharydów i ich pochodnych ma swoje odzwierciedlenie w róŝnorodności mechanizmów ich działania. Ogólnie moŝna wyróŝnić dwa podstawowe mechanizmy działania polisacharydów na komórki nowotworowe: wpływ pośredni poprzez immunostymulację oraz bezpośredni poprzez hamowanie ich wzrostu oraz indukcję apoptozy. I Działanie pośrednie Oddziaływanie pośrednie polega na stymulacji mechanizmów obronnych gospodarza, przede wszystkim na aktywacji limfocytów T i B, makrofagów i komórek NK [15, 16, 18, 28]. Wiele grzybowych β- glukanów posiada zdolność pobudzania wytwarzania interferonu, interleukin i innych cytokin stanowiących pierwszą linię obrony układu odpornościowego gospodarza, pozwalając na skuteczną eliminację komórek transformowanych nowotworowo na długo przed wystąpieniem w pełni rozwiniętej odpowiedzi humoralnej i komórkowej [42]. Badania wykazały, Ŝe β-glukany indukują odpowiedź organizmu poprzez wiązanie się z receptorami błonowymi komórek immunologicznie kompetentnych [43]. Jednym z najwaŝniejszych receptorów dla β- glukanów jest receptor CR3 (syn. Mac-1, CD11b/CD18) [44, 45]. Receptor ten, występuje powszechnie na powierzchni komórek układu odpornościowego, przede wszystkim makrofagów, neutrofilów, komórek NK i K. CR3 ma zdolność rozpoznawania opsoniny ic3b, która bardzo często występuje na powierzchni komórek nowotworowych. Do pobudzenia aktywności Ŝernej fagocytów dochodzi w wyniku jednoczesnego przyłączenia do receptora CR3 składnika dopełniacza ic3b (opsonina) oraz β-glukanu a brak któregoś z tych komponentów uniemoŝliwia indukcję cytotoksyczności [44, 46, 47]. Polisacharydy zwiększają więc zdolność komórek układu odpornościowego do rozpoznawania jako obce komórek nowotworowych, a tym samym zwiększają skuteczność mechanizmów obronnych gospodarza [48]. Polisacharydy, których immunostymulacyjne właściwości zostały najlepiej udokumentowane, to wspomniane juŝ wcześniej lentinan, PSK i schizophyllan. Lentinan Badania wykazały, Ŝe lentinan stymuluje proliferację jednojądrzastych komórek krwi tj. limfocytów, monocytów i makrofagów [49, 50]. Ponad to, pobudza on równieŝ dojrzewanie i róŝnicowanie komórek zaangaŝowanych w mechanizmy obronne gospodarza. Lentinan jest równieŝ w stanie zwiększyć reaktywności komórek układu odpornościowego oraz pobudzić je do wydzielania cytokin, hormonów i/lub innych substancji biologicznie aktywnych. Dzięki opisanym właściwościom, lentinan zwiększa oporność organizmu na transformację nowotworową [51, 52]. Lentinan został opisany jako adiuwant ukierunkowany na limfocyty T [53]. Przesuwa on równowagę Th1/2 w kierunku Th1 poprzez znaczący wzrost produkcji IL-12 [54]. Wpływa równieŝ na monocyty/makrofagi nasilając fagocytozę, a poprzez aktywację czynnika transkrypcyjnego NF-κβ zwiększa wydzielanie niektórych cytokin, szczególnie TNFα [55, 56]. Zaobserwowano równieŝ jego stymulujący wpływ na populację komórek NK [57]. Liczne dowody wskazują, Ŝe lentinan stymuluje komórki dendrytyczne, co ma istotne znaczenie dla

6 immunomodulacji i aktywności przeciwnowotworowej tego preparatu. Komórki dendrytyczne we współpracy z komórkami K odgrywają kluczowa rolę w eliminacji komórek nowotworowych [52]. Dodatkowo zaobserwowano, Ŝe u pacjentów cierpiących na raka Ŝołądka, podawanie lentinanu powodowało inhibicję syntezy prostaglandyn prowadzącą w wielu przypadkach do spowolnienia róŝnicowania limfocytów T, jak równieŝ hamowania aktywności limfocytów Treg [49]. Jednocześnie w śledzionie obserwowano zwiększenie poziomu zaktywowanych i cytotoksycznych limfocytów T [50] oraz stymulację jednojądrzastych komórek krwi obwodowej do wytwarzania IL-1α, IL-1β i TNF-a [52]. Zdolność lentinanu do stymulacji wytwarzania IL-1 została udowodniona równieŝ w innych typach nowotworów [51]. Poza tym opisano wiele innych interesujących biologicznych aktywności lentinau m.in. nasilenie niespecyficznej odpowiedzi zapalnej przejawiające się stymulacją produkcji białek ostrej fazy [58] i hamowaniem układu dopełniacza [54]. Krestin (PSK) Wykazano, Ŝe PSK pobudza zarówno składniki odporności komórkowej jak i humoralnej [59]. Po podaniu w obręb guza, obserwuje się bezpośrednie interakcje PSK z komórkami nowotworowymi i indukcję mechanizmów odpowiedzi zapalnej prowadzącej ich eliminacji [60]. U pacjentów, którym podawano PSK, zaobserwowano wzrost ilości komórek immunologicznie kompetentnych oraz zwiększenie zdolności komórek dendrytycznych oraz limfocytów Tc do infiltracji guza. Ponad to, krestin wpływa na dojrzewanie fenotypowe i funkcjonalne ludzkich komórek dendrytycznych z komórek CD14+ [61], a takŝe stymuluje aktywność fagocytarną makrofagów [41]. Wykazano, Ŝe PSK indukuje ekspresję genów dla TNF-α, IL-1, IL-8, IL-6 [62-65]. Cytokiny te wywołują reakcje prowadzące do stymulacji cytotoksyczności limfocytów T względem komórek nowotworowych, nasilania wytwarzania przeciwciał przez limfocyty B, czy teŝ indukcji ekspresji receptorów dla IL-2 na limfocytach T [63]. Badania wskazały, Ŝe antynowotworowe działanie PSK opiera się na jego zdolności do stymulacji limfocytów T oraz komórek prezentujących antygen, co pozwala na skuteczne rozpoznanie komórek nowotworowych i ich niszczenie [59, 66]. Schizophyllan Shizophyllan, budową a takŝe mechanizmem działania bardzo przypomina lentinan. Antynowotworowe działanie tej substancji opiera się na modulacji odpowiedzi immunologicznej [66]. Podobnie jak lentinan, shizophyllan wykazuje aktywność antynowotworową jedynie w obecnosci limfocytów T, co zostało udowodnione w badaniach in vivo przeprowadzonych na myszach z sarcomą 180. Zwierzętom podano cyklosporynę A będącą supresorem limfocytów T, co spowodowało zniesienie antynowotworych właściwości obu preparatów [67, 68]. Schizophyllan stymuluje wytwarzanie białek ostrej fazy oraz CSF, w efekcie czego dochodzi do pobudzenia proliferacji makrofagów, jednojądrzastych komórek krwi obwodowej i limfocytów a takŝe do stymulacji układu dopełniacza [69]. Poza tym, preparat ten zwiększa

7 produkcję limfocytów Th i makrofagów [69]. Charakteryzuje się równieŝ silną aktywacją komórek Ŝernych, powodujac wzrost produkcji reaktywnych form tlenu, cytokin prozapalnych jak IL-6, IL-8 i TNF-α. Zwiększa równieŝ ekspresję cząsteczek CD11b i CD69L na powierzchni leukocytów [70, 71]. II Działanie bezpośrednie Poza wpływem pośrednim, wiele polisacharydów wykazuje bezpośrednie działanie na komórki nowotworowe. Liczne badania in vitro i in vivo wskazują, Ŝe polisacharydy hamują proliferację komórek nowotworowych i/lub indukują ich śmierć na drodze apoptozy [16, 17, 28, 29, 72]. Jednym z najlepiej opisanych mechanizmów bezpośredniego, przeciwnowotworowego działania polisacharydów pozyskiwanych z Podstawczaków jest modulacja aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-ĸβ. Nadmierna aktywacja NF-κB jest obserwowana w wielu typach nowotworów. Aktywny NF-κB promuje wzrost guza przez zwiększenie transkrypcji genów, które indukują proliferację, wykazują działanie antyapoptotyczne, czy teŝ promują angiogenezę i przerzutowanie [73]. Wykazano, Ŝe polisacharydy hamują fosforylację i/lub degradację inhibitora NF-κB (IĸBα) [4, 19, 28, 74-77], co uniemoŝliwia aktywację czynnika transkrypcyjnego a w konsekwencji ekspresję podległych mu genów [78, 79]. Poza modulacją szlaku NF-ĸβ, polisacharydy mogą równieŝ w inny sposób oddziaływać na komórki nowotworowe. Znakomitym przykładem jest tutaj kompleks polisacharydowo-białkowy tzw. PSP pozyskiwany z Trametes versicolor. Wykazano, Ŝe w komórkach białaczki U-937 oraz komórkach raka piersi MDA-MB-231, PSP powodował zatrzymanie cyklu komórkowego w punktach restrykcyjnych G1/S oraz G2/M, jak równieŝ hamował aktywność białek antyapoptotycznych powodując zahamowanie podziałów komórkowych i nasilenie apoptozy [80, 81]. Natomiast w komórkach białaczki HL-60 PSP wywoływał podobny efekt poprzez indukcje spadku poziomu czynnika NF-κB i ekspresji kinaz ERK [81]. BADANIA WŁASNE Ciekawym i obiecującym obiektem do poszukiwania polisacharydów o właściwościach przeciwnowotworowych wydają się być grzyby jadalne Boletus edulis (prawdziwek) i Cantharelus cibarius (kurka). Jedno z pierwszych badań nad leczniczymi właściwościami grzybów dotyczyło właśnie borowika szlachetnego. Inicjatorem badań był Lucas i wsp., którzy z pozytywnym skutkiem wykorzystali ekstrakt z owocników borowika w leczeniu raka u myszy [4]. Po blisko 20 latach Ohtsuka i wsp., przebadali pod katem właściwości przeciwnowotworowych polisacharydy izolowane z róŝnych grzybów w obrębie kasy Podstawczaków, w tym równieŝ pochodzących z kurki i prawdziwka. Wykazali właściwości przeciwnowotworowe frakcji polisacharydowych pozyskiwanych z tych grzybów w stosunku do guza Erlicha i Sarkomy 180 u myszy [8]. Od tamtych czasów nikt nie podjął się próby izolacji polisacharydów z tych grzybów oraz charakterystyki ich aktywności biologicznej. Dziwi to w

8 świetle ogromnej popularności tych grzybów zarówno w kontekście ich występowania (gatunki kosmopolityczne, powszechnie występujące na całej półkuli północnej), jak równieŝ spoŝycia - oba gatunki są cenione za walory smakowe i zapachowe. Celem naszych badań była ocena chemoprewencyjnego potencjału frakcji polisacharydowych izolowanych z prawdziwka i kurki względem komórek raka okręŝnicy. Nowotworu, który stanowi jedną z najczęstszych przyczyn zgonów na nowotwory złośliwe i zapadalność na którego niestety ciągle się zwiększa [82, 83]. Wybór przedmiotu badań był podyktowany równieŝ naturą schorzenia, gdzie szczególną rolę w przeciwdziałaniu rozwojowi choroby pełni profilaktyka a przede wszystkim odpowiednia dieta. W tym kontekście grzyby jadalne wydają się być idealnym kandydatem do badań. Stanowią one nie tylko smaczny i poŝywny składnik diety, ale równieŝ dzięki bogactwie substancji aktywnych w nich zawartych, wywierają korzystny wpływ na wiele procesów zachodzących w organizmach Ŝywych. Materiały i metody Linie komórkowe HT-29 linia wyizolowana z gruczolakoraka jelita grubego 44-letniej kobiety rasy Kaukaskiej (stadium I według skalali Dukesa) LS180 linia wyizolowana z gruczolakoraka jelita grubego 58-letniej kobiety rasy Kaukaskiej (stadium II według skalali Dukesa) CCD 841 CoTr linia ludzkich, nabłonkowych komórek jelita, unieśmiertelniona fenotypowo wraŝliwym na temperaturę mutantem wirusa SV40. Komórki zostały pobrane z ludzkiego płodu w 21 tygodniu ciąŝy. Linie HT-29 oraz LS180 pochodzą z ECACC (European Collection of Cell Cultures, Center for Applied Microbiology and Research, Salisbury, UK). Z uwagi na cechy morfologiczne i funkcjonalne są uznawane jako reprezentatywne dla stransformowanego nowotworowo nabłonka jelita grubego. Linia CCD 841 CoTr pochodzi z kolekcji ATCC (American Type Culture Collection, Menassas, VA, USA) Do hodowli komórek poszczególnych linii uŝyto następujących podłóŝ hodowlanych: linia HT29 i LS180 - podłoŝe DMEM + F12 HAM (Dulbecco Modified Essential Medium + Nutrient Mixture F12 MAM) (1:1) (Sigma) linia CCD 841 CoTr - podłoŝe DMEM (Dulbecco Modified Essential Medium) (Sigma) PodłoŜa hodowlane uzupełniono o antybiotyki: penicylinę (100 j/ml) (Sigma) i streptomycynę (100 µg/ml) (Sigma), dodatkowo wzbogacono w płodową surowicę bydlęcą (FBS) (Sigma) w ilości 10%. Komórki hodowano w wilgotnej atmosferze powietrza + 5% CO 2, w temperaturze 37ºC (HT29 i LS180) oraz w 33ºC (CCD 841 CoTr).

9 Otrzymywanie frakcji polisacharydowych Grzyby wykorzystane do przygotowania próbek zostały zebrane w sadzie kasztanowym (w Macedo de Cavaleiros oraz w lesie mieszanym sosnowo-dębowym w Vila Real (41 o 19 N i 7 o 44 W, 479 m npm) w Portugalii. Identyfikacja grzybów i potwierdzenie ich przynaleŝności do gatunków Boletus edulis i Cantharellus cibarius zostało wykonane przez specjalistę z dziedziny mikologii. Reprezentacyjne próbki zebranych gatunków grzybów zostały złoŝone w zielniku mykologicznym University of Trás-os-Montes e Alto Douro. Frakcje polisacharydowe BE1-4 i CC1-6 zostały otrzymane i przygotowane do analiz biologicznych w Chemistry Department, University of Trás-os-Montes e Alto Douro, Vila Real (Portugalia). Liofilizowane grzyby Boletus edulis i Cantharellus cibarius ekstrahowano wrzącym 80% etanolu, w celu eliminacji związków niskocząsteczkowych nierozpuszczalnych w alkoholu. Następnie mieszaniny ekstrahowano gorącą wodą i dializowano (punkt odcięcia kda), co pozwoliło na uzyskanie rozpuszczalnych w wodzie frakcji bogatych w związki wysokocząsteczkowe w tym w polisacharydy. W celu oddzielenia polisacharydów obojętnych od glikoprotein, uzyskane frakcje poddano oczyszczaniu za pomocą chromatografii jonowymiennej na kolumnach XK16/20 (szerokość 1,6 cm, długość 20 cm) (Pharmacia) wypełnionych Q-Sepharose FF, jako eluentu uŝyto buforowanego roztworu octanu sodu 5 mm, ph 4,5 zawierającego 0,02% azydek sodu. W pierwszym etapie frakcje WSM (1 mg/ml) zostały naniesione na kolumnę, po czym kolumna został przemyta buforem startowym w ilości odpowiadającej 4 krotnej objętości kolumny lub w ilości przy której mierzona przy długości fali 280 nm absorbancja osiągnęła poziom startowy. Zatrzymane na kolumnie substancje były wymywane w warunkach elucji gradientowej z zastosowaniem coraz to bardziej stęŝonych roztworów NaCl: mm NaCl przez 5 h, mm NaCl 3 h, mm NaCl 2 h. W trakcie elucji zbierano frakcje (po 2 ml), w których oznaczano całkowitą zawartość cukrów metodą fenol-kwas siarkowy oraz odczytano absorbancję przy długości fali 280 nm (białko). Następnie odpowiednie frakcje zostały połączone i poddane dializie (punkt odcięcia kda), po czym zostały on zliofilizowane. Otrzymano 5 frakcji polisacharydowych z Cantharellus cibarius (oznaczone jako CC1-6) oraz cztery frakcje z Boletus edulis (oznaczone jako BE1-4). Celem określenia struktury pierwszorzędowej polisacharydów obecnych w badanej frakcji, poddano je kwaśnej hydrolizie. W tym celu 2-5 mg zliofilizowanej próbki zawieszono w 1 M kwasie siarkowym i utrzymywano w stanie wrzenia przez 2.5 h. Po hydrolizie do roztworu dodane 0.5 ml 2-deoksyglukozy (1mg/ml) jako standard wewnętrzny. Następnie roztwór rozcieńczono 10 krotnie i poddano właściwemu oznaczeniu z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii jonowej z pulsacyjną detekcją amperometryczną HPLC-PAD. Oznaczenie wykonano na aparacie ICS-300 (Dionex), z wykorzystaniem kolumn CarboPac PA-20 zaopatrzonych w prekolumny CarboPac PA20. Jako eluent wykorzystano 5 mm roztwór NaOH zawierający 2 mm Ba(OH) 2

10 Liofilizowane frakcje zawierające rozpuszczono w soli fizjologicznej do końcowego stęŝenia 10 mg/ml. Tak przygotowane roztwory wyjściowe przechowywano w temp. 4 C. Roztwory właściwe, bezpośrednio uŝywane w doświadczeniach otrzymano przez rozcieńczenie roztworów wyjściowych w płynach hodowlanych z dodatkiem FBS. Określanie aktywności antyproliferacyjnej frakcji polisacharydowych test MTT Test opracowano do określenia proliferacji i Ŝywotności komórek w obecności substancji o właściwościach cytostatycznych i cytotoksycznych. W komórkach aktywnych metabolicznie dehydrogenaza mitochondrialna redukuje Ŝółty, rozpuszczalny w wodzie MTT (bromek dimetylotetrazoliowy) do niebieskiego formazanu, który w postaci nierozpuszczalnych w wodzie kryształów gromadzi się w komórkach. Do rozpuszczenia formazanu wymagane jest uŝycie detergentu rozbijającego błonę komórkową i jednocześnie rozpuszczającego barwnik, w tym celu stosuje się bufor SDS HCl o ph 7.4. StęŜenie uwolnionego barwnika mierzy się spektrometrycznie. Intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do ilości Ŝywych komórek. Na płytki 96-dołkowe wylano komórki linii LS180 i HT-29 o gęstości kom/ml w płynie hodowlanym z 10% FBS. Po 24 godzinach inkubacji z płytek delikatnie usunięto płyn hodowlany i dodano roztwory badanych substancji w płynie hodowlanym z dodatkiem 10% FBS (po 100 µl na dołek). W oznaczeniu uŝyto frakcji o stęŝeniach: 1; 10; 50; 100; 250 µg/ml. Komórki hodowano 96 godzin w 37ºC w inkubatorze z 5% przepływem CO 2. Po tym czasie określono efekt działania badanych substancji za pomocą testu MTT. W tym celu do kaŝdego z dołków na płytkach 96-dołkowych dano po 15 µl roztworu MTT (o stęŝeniu 5 mg/ml w PBS z jonami Ca 2+ i Mg 2+ ). Po 3 godzinach inkubacji w temp. 37 C, do kaŝdego dołka dodano 100 µl buforu SDS-HCl o ph 7.4. Płytki umieszczono na 24 godziny w inkubatorze (37ºC, 5% CO 2 ). Następnie odczytano gęstość optyczną przy długości fali 570 nm przy uŝyciu czytnika do mikropłytek ELx800 Absorbance Microplate Reader (BioTek). Oznaczanie cytotoksyczności frakcji polisacharydowych test LDH Oznaczenie zawartości dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w płynie hodowlanym pobranym znad hodowli potraktowanej badaną substancją pozwala ocenić cytotoksyczny wpływ preparatów na komórki. Substancje toksyczne uszkadzają ich błony komórkowe i w konsekwencji powodują uwalnianie do płynu hodowlanego składników cytoplazmy, m.in. dehydrogenazy mleczanowej (enzym szlaku oddychania beztlenowego). Ilość LDH uwolnionego do podłoŝa hodowlanego jest proporcjonalna do ilości komórek z uszkodzoną błoną komórkową. Metoda opiera się na redukcji NAD do NADH przez komórkową LDH. Powstały NADH reaguje z barwnikiem tetrazoliowym, który przekształca się w formazan, czemu towarzyszy zmiana barwy. NatęŜenie barwy jest proporcjonalne do ilości LDH

11 uwolnionego z komórek, a tym samym do ilości uszkodzonych komórek. Intensywność zabarwienia mierzy się spektrofotometrycznie. Na płytki 96-dołkowe wylano komórki linii CCD 841 CoTr o gęstości kom/ml w płynie hodowlanym z 10% FBS. Po 24 godzinnej inkubacji, ostroŝnie usunięto płyn znad hodowli a w jego miejsce wprowadzono po 100 µl/dołek roztworów substancji badanych w płynie z 2% FBS. W oznaczeniu uŝyto frakcji o stęŝeniach: 1, 10; 50; 100; 250 µg/ml. Po 24 godzinnej inkubacji, znad hodowli poddanych działaniu ekstraktów pobrano po 50 µl płynu hodowlanego i przeniesiono na nowe płytki 96-dołkowe, które wykorzystano do przeprowadzenia testu. Test przeprowadzono przy uŝyciu komercyjnego zestawy In Vitro Toxicology Assay Kit Lactate Dehydrogenase Based, zgodnie z instrukcją producenta. Analiza wyników Wyniki opracowywano przy uŝyciu programów Graph Pad Prism 5.0, Microsoft Office Excel 2003 oraz KCJunior. Wyniki przedstawiono jako wartość średnią ± SD (odchylenie standardowe). Istotność statystyczną między próbami badanymi a kontrolą określono przy pomocy jednoczynnikowego testu ANOVA z testem post-hoc. Tukey a. Za próg istotności statystycznej przyjęto p < Wartość IC50 (stęŝenie powodujące zahamowanie proliferacji o 50% w stosunku do kontroli) wyliczono metodą Litchfielda i Wilcoxona [84]. Wyniki i dyskusja W pierwszej kolejności sprawdzono cytotoksyczność ekstraktów na komórkach prawidłowych linii CCD841 (ludzkie, komórki nabłonka jelita grubego) za pomocą komercyjnego zestawu: In vitro Toxicology Assay Kit Lactate Dehydrogenase Based (Sigma, St. Louis, USA). śaden z ekstraktów w analizowanym zakresie stęŝeń (od 1 do 250 µg/ml) nie był toksyczny w stosunku do komórek prawidłowych nabłonka jelita grubego (Wykres 1.).

12 Wykres 1. Cytotoksyczność ekstraktów izolowanych z Boletus edulis (BE1-BE5) oraz z Cantharellus cibarius (CC1-CC6) względem komórek linii CCD841 po 24 h inkubacji z podłoŝem hodowlanym (kontrola) lub badanymi ekstraktami w stęŝeniach od 1 do 250 µg/ml. RóŜnice istotne statystycznie w porównaniu z kontrolą przy p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p < 0,0001 (***) test: one-way ANOVA, post test: Tukey. Zdolność frakcji polisacharydowych do hamowania proliferacji komórek nowotworowych sprawdzono za pomocą testu MTT na dwóch liniach ciągłych pochodzących z raka jelita grubego HT29 oraz LS180. Wyniki testu MTT wskazują, Ŝe wszystkie badane frakcje w całym zakresie analizowanych stęŝeń hamowały proliferację komórek raka okręŝnicy linii LS180 oraz HT-29 a efekt ich działania był zaleŝny od dawki. Z pośród ekstraktów izolowanych z Cantharellus cibarius najsilniejsze działanie antyproliferacyjne zaobserwowano w przypadku ekstraktu CC5. IC50 (stęŝenie powodujące zahamowanie proliferacji o 50% w stosunku do kontroli) dla HT29 wyniosło 11,1 µg/ml, natomiast dla LS180 2,6 µg/ml. W przypadku ekstraktów izolowanych z Boletus edulis najsilniejsze działanie antyproliferacyjne zaobserwowano po zastosowaniu ekstraktu BE3, IC50 dla HT-29 wyniosło 26,8 µg/ml, a dla LS180 1 µg/ml (Wykres 2. i 3.).

13 Wykres 2. Wpływ ekstraktów izolowanych z Boletus edulis (BE1-BE5) oraz z Cantharellus cibarius (CC1-CC6) na proliferację komórek linii LS180 po 96 h inkubacji z podłoŝem hodowlanym (kontrola) lub badanymi ekstraktami w stęŝeniach od 1 do 250 µg/ml. RóŜnice istotne statystycznie w porównaniu z kontrolą przy p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p < 0,0001 (***) test: one-way ANOVA, post test: Tukey. Wykres 3. Wpływ ekstraktów izolowanych z Boletus edulis (BE1-BE5) oraz z Cantharellus cibarius (CC1-CC6) na proliferację komórek linii HT-29 po 96 h inkubacji z podłoŝem hodowlanym (kontrola)

14 lub badanymi ekstraktami w stęŝeniach od 1 do 250 µg/ml. RóŜnice istotne statystycznie w porównaniu z kontrolą przy p < 0,05 (*), p<0,01 (**), p < 0,0001 (***) test: one-way ANOVA, post test: Tukey. Analiza struktury pierwszorzędowej polisacharydów obecnych w badanych frakcja wykazała, Ŝe frakcje o największym potencjale terapeutycznym tj. BE3 oraz CC5 zawierały najmniejszą ilość monosacharydów spośród wszystkich analizowanych ekstraktów (Tabela 1). Jednocześnie zawierały one największą ilość niezidentyfikowanych komponentów cukrowych. Najprawdopodobniej to właśnie te związki są odpowiedzialne za ich antynowotworowe właściwości. Identyfikacja ich moŝe przybliŝyć nas do stworzenia skutecznego i bezpiecznego leku zapobiegającego i/lub hamującego rozwój raka jelita grubego. Tabela 1. zawartość monosacharydów (%) frakcja Fuc GluN Gal Glc Man nieznane ŁĄCZNIE BE1 5,1 0,0 8,4 72 1,4 0,0 87 BE2 2,3 0,1 3,6 9,9 4,7 0,1 21 BE3 1,0 0,0 0,2 2,0 0,6 2,1 6,0 BE4 2,8 0,0 0,0 2,3 1,9 1,1 8,1 BE5 5,6 0,0 6,3 9,0 0,1 0,0 21 CC1 4,4 0,0 4,0 9,6 19 0,0 37 CC2 0,8 5,0 4, ,0 64 CC3 5,0 0,0 4,3 39 4,9 0,0 53 CC4 5,0 0,0 4,3 39 4,9 0,0 53 CC5 0,0 0,0 0,0 1,8 0,7 8,3 2,4 CC6 0,0 0,0 0,0 2,4 4,3 0,0 6,7 PODSUMOWANIE Przez wieki w świecie zachodnim grzyby były traktowane jedynie jako smaczne uzupełnienie diety. Medycyna krajów Dalekiego Wschodu stworzyła podwaliny dla ich terapeutycznego wykorzystania. Ostatnie półwiecze to okres rozkwitu nowej dziedziny medycyny - mykofarmakologi. Naukowe podejście do substancji zawartych w grzybach pozwoliło na wyizolowanie z nich wielu cennych substancji aktywnych, które znalazły zastosowanie w profilaktyce oraz terapii chorób cywilizacyjnych, w tym nowotworów. Nasz zespół jako pierwszy wykazały przeciwnowotworowy potencjał frakcji polisacharydowych izolowanych z prawdziwka i kurki względem komórek raka jelita grubego. Ze względu na właściwości antyproliferacyjne oraz niską toksyczność w stosunku do komórek prawidłowych jelita grubego analizowane substancje wydają się być atrakcyjnym kandydatami na suplementy diety/leki przeciw nowotworom jelita grubego. Osiągnięcie tego celu wymaga jednak identyfikacji i charakterystyki chemicznej składników odpowiedzialnych za antyproliferacyjnej właściwości ekstraktów oraz potwierdzenia ich aktywności w badaniach in vivo oraz w badaniach klinicznych. Niemniej jednak zanim zostaną zakończone kosztowne i długotrwałe procedury wdroŝenia nowych substancji terapeutycznych nie pozostaje nam nic innego jak włączyć do naszej codziennej diety prawdziwki i kurki.

15 Piśmiennictwo 1. Chang ST, Buswell JA. Mushroom nutriceuticals. World J Microb Biotech 1996; 12: Hobbs ChL: Medicinal Mushrooms: An Exploration of Tradition, Healing and Culture, Botanica Press, Williams, OR, USA Rajewska J, Bałasińska B. Związki biologicznie aktywne zawarte w grzybach jadalnych i ich korzystny wpływ na zdrowie. Postępy Hig Med Dosw 2004; 58: Wasser SP, Weis AL. Medicinal properties of substances occurring in higher Basidiomycetes. Int J Med Mushr 1999; 1: Wasser SP, Weis AL. Therapeutic effects of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: a modern perspective. Critical Rev Immunol 1999; 19: Lucas EH, Montesano R, Pepper MS, Hafner M, Sablon E. Tumor inhibitors in Boletus edulis and other holobasidiomycetes. Antibiot Chemother 1957; 7: Lucas EH, Byerrum M, Clarke DA, Reilly HC, Stevens JA, Stock CC. Production of oncostatic principles in vivo and in vitro by species of the genus Calvatia. Antibiot Annu 1958; 6: Mizuno T. Development of antitumor polysaccharides from mushroom fungi. Foods Food Ingred J Jpn 1996; 167: Mizuno T. The extraction and development of antitumoractive polysaccharides from medicinal mushrooms in Japan. Int J Med Mushrooms 1999; 1: Mizuno T. Bioactive substances in Hericium erinaceus (Bull.: Fr.) Pers. (Yamabushitake), and its medicinal utilization. Int J Med Mushrooms 1999; 1: Reshetnikov SV, Wasser SP, Tan KK. Higher Basidiomycota as a source of antitumor and immunostimulating polysaccharides. Int J Med Mushrooms 2001; 3: Wasser SP. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides. Appl Microbiol Biotechnol 2002; 60: Mizuno T. Yamabushitake, Hericium erinaceum: bioactive substances and medicinal utilization. Food Rev Intern 1995; Gorin PAJ, Barreto-Berger E. The chemistry of polysaccharides of fungi and lichens. W: The polysaccharides. Aspinall GO (red.). Academic Press, Orlando 1983; Augustin J. Glucans as modulating polysaccharides:thei characteristics and isolation from microbiological sources. Biologia 1998; 53(3): Bao X, Duan J, Fang X, Fang J. Chemical modifications of the (1 3)-α -D-glucan from spores of Ganoderma lucidum and investigation of their physicochemical properties and immunological activity. Carbohydrate Res 2001; 336: Tao Y, Zhang L, Cheung PCK. Physicochemical properties and antitumor activities of watersoluble native and sulfated hyperbranched mushroom polysaccharides. Carbohydrate Res 2006; 341: Zhang P, Cheung PCK. Evaluation of sulfated Lentinus edodes α (1,3)-D-glukan as a potential antitumor agent. Biosci Biotechnol. Biochem 2002; 66(5): Mizuno T, Saito H, Nishitoba T, Kawagishi H. Anti-tumoractive substances from mushrooms. Food Rev Int 1995; 11: Gao QP, Seljelid R, Chen HQ, Jiang R. Characterization of acidic heteroglycans from Tremella fuciformis Berk. with cytokine stimulating activity. Carbohydr Res 1996; 288: Kawagishi H, Kanao T, Inagaki R, Mizuno T, Shimura K, Ito H, Hagiwara T, Hakamura T. Formulation of a potent antitumor (1 6)-beta-D-glucan-protein complex from Agaricus blazei fruiting bodies and antitumor activity of the resulting products. Carbohydr Polym 1990; 12: Zhuang C, Mizuno T, Shimada A et al. Antitumor protein-containing polysaccharides from a Chinese mushroom Fengweigu or Houbitake, Pleurotus sajor-caju (Fr.) Sing. Biosci Biotechnol Biochem 1993; 57:

16 23. Mizuno T, Yeohlui P, Kinoshita T, Zhuang C, Ito H, Mayuzumi Y. Antitumor activity and chemical modification of polysaccharides from Niohshimeji mushroom, Tricholoma giganteum. Biosci Biotechnol Biochem 1996; 60: Manzi P, Pizzoferrato L. Beta-glucans in edible mushrooms. Food Chem 2000; 68(3): Maeda YY, Watanabe ST, Chihara C, Rokutanda M. Denaturation and renaturation of a β-1,6; 1,3-glucan, lentinan, associated with expression of T-cell-mediated responses. CancerRes 1988; 48: Yanaki T, Ito W, Tabata K, Kojima T, Norizuye T, Takano N, Fujita H. Correlation between the antitumor activity of a polysaccharide schizophyllan and its triple-helical conformation in dilute aqueous solution. Biophys Chem 1983; 17: Yanaki T, Ito W, Tabata K. Correlation between antitumor activity of schizophyllan and its triple helix. Agric Biol Chem 1986; 509: Ooi VEC, Liu F. Immunomodulation and anti-cancer activity of polysaccharide-protein complexes. Curr Med Chem 2000; 7: Zhang M, Cui SW, Cheung PCK, Wang Q. Antitumor polysaccharides from mushrooms: a review on their isolation process, structural characteristics and antitumor activity. Trends in Food Sci Technol 2007; 18: Karácsonyi S, Kuniak L. Polysaccharides of Pleurotus ostreatus: isolation and structure of pleuran, an alkali-insoluble β-dglucan. Carbohydr Polym 1994; 24: Kuniak L, Karácsonyi S, Augusti J, Ginterová A, Széchényl S, Kravarik D, Dubaj J, Varjú J. A new fungal glucan and its preparation. World Patent , Date of Patent Paulik S, Svrcec, Mojisová J, Durove A, Benisek Z, Húska M. The immunomodulatory effect of the soluble fungal glucan (Pleurotus ostreatus) on delayed hypersensitivity and phagocytic ability of blood leucocytes in mice. J Vet Med B 1996; 43: Zhuang C, Mizuno T, Ito H, Shimura K, Sumiya T. Chemical modification and antitumor activity of polysaccharides from the mycelium of liquid-cultured Grifola frondosa. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi 1994; 41: Miles PG, Chang ST. Mushroom biology. Concise basics and current developments. World Scientific, Singapore, New Jersey, London, Hong Kong 1997; Mahajna JA, Yassin M, Wasser SP. Mushrooms extracts having anticancer activity. USA Patent US 7,258,862 B2, Date of Patent Chihara G, Maeda Y, Hamuro J, Sasaki T, Fumiko F. Inhibition of mouse Sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes (Berk.)Sing. Nature 1969; 222: Chihara G, Hamuro J, Maeda YY, Arai Y, Fukuoka F. Fractionation and purification of the polysaccharides with marked antitumor activity, especially lentinan, from Lentinus edodes. Cancer Res 1970; 30: Ikekawa T, Uehara N, Maeda Y, Nakanishi M, Fukuoka F. Antitumor activity of aqueous extracts of edible mushrooms. Cancer Res 1969; 29: Brown G, Siamon G. Immune recognition: A new receptor for β-glucans. Nature 2001; 413: Herre J, Gordon S, Brown GD. Dectin-1 and its role in the recognition of β-glucans by macrophages. Mol Immunol 2004; 40: Zhu D. Recent advances on the active components in Chinese medicines. Abstr Chin Med 1987; 1: Borchers AT, Stern JS, Hackman RM, Keen CL, Gershwin ME. Mushrooms, tumors, and immunity. Proc Soc Exp Biol Med 1999; 221: Czop JK, Austen KF. Properties of glycans that activate the human alternative complement pathway and interact with the human monocyte beta-glucan receptor. J Immunol 1985; 135: Ross GD, Vetvicka V, Yan J, Xia Y, Vetvickova J. Therapeutic intervention with complement and beta-glucan in cancer. Immunopharmacology 1999; 42: 61-74

17 45. Xia Y, Vetvicka V, Yan J, Hanikyrova M, Mayadas T, Ross GD. The beta-glucan-binding lectin site of mouse CR3 (CD11b/CD18) and its function in generating a primed state of the receptor that mediates cytotoxic activation in response to ic3b-opsonized target cells. J Immunol 1999; 162: Vetvicka V, Thornton BP, Wieman TJ, Ross GD. Targeting of NK cells to mammary carcinoma via naturally occurring tumor cellbound ic3b and beta-glucan-primed CR3 (CD11b/CD18). J Immunol 1997; 159: Yan J, Vetvicka V, Xia Y, Coxon A, Carroll MC, Mayadas TN, Ross GD. Beta-glucan, a specific biologic response modifier that uses antibodies to target tumors for cytotoxic recognition by leukocyte complement receptor type 3 (CD11b/CD18). J Immunol 1999; 163: Hamuro J, Chihara G. Lentinan, a T-cell oriented immunopotentiator: its experimental and clinical applications and possibile mechanism of immune modulation. W: Immunomodulation agents and their mechanisms. Fenichel RL, Chirigos MA (red.). Dekker, New York 1985; Aoki T. Lentinan. W: Immunology Studies: Immune modulation agents and their mechanisms. Femchel RL, Chirgis MA (red.). 1984; Hobbs C. Medicinal value of Lentinus edodes (Berk.) Sing. (Agaricomycetideae). A literature review. International Journal of Medicinal Mushrooms 2000; 2: Chihara G, Maeda YY, Taguchi T, Hamuro J. Lentinan as a host defence potentiator (HDP). International Journal of Immunotherapy 1989; 5: Chihara G. Immunopharmacology of Lentinan, a polysaccharide isolated from Lentinus edodes: its application as a host defense potentiator. International Journal Oriental Medicine 1992; 17: Wang GL, Lin ZB. The immunomodulatory effect of lentinan. Yao Xue Xue Bao 1996; 31: Lull C, Wichers HJ, Savelkoul HFJ. Antiinflamatory and immunomodulating properties of fungal metabolites. Mediators of inflammation 2005; 2: Hamuro J. Anticancer immunotherapy with perorally effective lentinan. Gan To Kagaku Ryoho 2005; 32: Kerekgyarto C, Virag L, Tanko L, Chihara G, Fachet J. Strain differences in the cytotoxic activity and TNF production of murine macrophages stimulated by lentinan. Int J Immunopharmacol 1996; 18: Takada K, Okumara K. CAM and NK cells. ecam 2004; 1: Suga T, Maeda YY, Uchida H, Rokutanda M, Chihara G. Macrophage-mediated acute-phase transport protein production induced by Lentinan. International Journal of Immunopharmacology 1986; 8: Tzianabos A. Polysaccharide immunomodulators as therapeutic agents: structural aspects and biologic function. Clinical Microbiology Reviews 2000; 13: Mizutani Y, Yoshida O. Activation by the protein-bound polysaccharide PSK (krestin) of cytotoxic lymphocytes that act on fresh autologous tumor cells and T24 human urinary bladder transitional carcinoma cell line in patients with urinary bladder cancer. J Urol 1991; 145(5): Nio Y, Shiraishi T, Tsubono M, Morimoto H, Tseng CC, Imai S, Tobe T. In vitro immunomodulating effect of proteinbound polysaccharide PSK on peripheral blood, regional nodes, and spleen lymphocytes in patients with gastric cancer. Cancer Imunol Immunother 1991; 32: Hsieh TC, Wu JM. Cell growth and gene modulatory activities of Yunzhi (Windsor Wunxi) from mushroom Trametes versicolor in androgen-dependent and androgen-insensitive human prostate cancer cells. Int J Oncol 2001; 18: Kato M, Hirose K, Hakozak M et al. Induction of gene expression for immunomodulating cytokines in peripheral blood mononuclear cells in response to orally administered PSK, an immunomodulating protein-bound polysaccharide. Cancer Immunology and Immunotherapy 1995; 40: Liu F, Fang MC, Ooi VEC, Chang ST. Induction in the mouse of gene expression of immunomodulating cytokines by mushroom polysaccharide-protein complexes. Life Science 1996; 58:

18 65. Sakagami H, Sugaya K, Utsumi A, Fujinaga S, Sato T, Takeda M. Stimulation by PSK of interleukin-1 production by human peripheral blood mononuclear cells. Anticancer Res 1993; 13: Okazaki M, Adach Y, Ohno N, Yadomae T. Structure-activity relationship of (1-3)-β-Dglucan in the induction of cytokine production from macrophages in vitro. Biological Pharmacological Bulletin 1995; 18: Kraus J, Franz G. β(1-3) Glucans: anti-tumour activity and immunostimulation. W: Fungal Wall and Immune Response. Latge JP, Boucias D (red.). NATO ASI Series H53, Springer, Berlin 1991; Kraus J, Franz G. Immunomodulating effects of polysaccharides from medicinal plants. W: Microbial Infections. Friedman H, Klein TW, Yamaguchi H (red.). Plenum Press, NewYork 1992; Bohn JA, BeMiller JN. (1-3)-β-D-Glucans as biological response modifiers: a review of structure-functional activity relationships. Carbohydrate Polymers 1995; 28: Falch BH, Espevik T, Ryan L, Stokke BT. The cytokine stimulating activity of (1 3)-beta-Dglucans is dependent on the triple helix formation. Carbohydr Res 2000; 329: Kubala J, Ruzickova J, Nickova K, Sandula J, Ciz M, Lojek A. The effect of (1 3)-beta-D-glucans, carboxymethyloglucan and schizophyllan on human leukocytes in vitro. Carbohydr Res 2003; 338: Smith JE, Rowan NJ, Sullivan R. Medicinal mushrooms: a rapidly developing area of biotechnology for cancer therapy and other bioactivities. Biotech Letters 2002; 24: Ravi R, Bedi A. NF-kappa B in cancer-a friend turned foe. Drug Resist Update 2004; 7: Ohno N, Miura NN, Nakajima M, Yadomae T. Anti-tumor 1,3-ß-glucan from cultured fruit body of Sparassis crispa. Biol Pharm Bull 2000; 23: Ohno N, Nameda S, Harada T et al. Immunomodulating activity of a ß-glucan preparation, SCG, extracted from a culinarymedicinal mushroom, Sparassis crispa Wulf. : Fr. (Aphyllophoromycetidae), and application to cancer patients. Int J Med Mushr 2003; 5: Yoshida I, Kiho T, Usui S, Sakushima M, Ukai S. Polysaccharides in fungi. XXXVII. Immunomodulating activities of carboxymethylated derivatives of linear (1-3)-alpha-d-glucans extracted from the fruiting bodies of Agrocybe cylindracea and Amanita muscaria. Biol Pharm Bull 1996; 19: Yoshioka Y, Ikekawa T, Noda M, Fukuoka F. Studies on anti-tumor activity of some fractions from Basidiomycetes. I. An anti-tumor acidic polysaccharide fraction of P. ostreatus (Fr.) Quél. Chem Pharm Bull 1972; 20: Escárcega RO, Fuentes-Alexandro S, García-Carrasco M, Gatica A, Zamora A. The transcription factor nuclear factor-κb and cancer. Clinical Oncology (Royal College of Radiologists (Great Britain)) 2007; 19(2): Sheikh MS, Huang Y. Death receptor activation complexes: it takes two to activate TNF receptor 1. Cell Cycle 2003; 2(6): Chow LW, Lo CS, Loo WT, Hu XC, Sham JS. Polysaccharide peptide mediates apoptosis by up-regulating p21 gene and downregulating cyclin D1 gene. Am J Chin Med 2003; 31: Hsieh T, Wu P, Park S, Wu JM. Induction of cell cycle changes and modulation of apoptogenic/anti-apoptotic and extracellular signaling regulatory protein expression by water extracts of I'm-YunityTM (PSP). BMC Compl Altern Med, 2006 Sep Bartnik Szczeklik A: Choroby wewnętrzne. T. 1. Medycyna praktyczna, Kraków Hauser SC, Pardi DS, Poterucha JJ: Mayo Clinic Gastroenterology and Hepatology Board Review. Mayo Clinic Scientific Press Taylor & Francis Group, Rochester Litchfield JT, Wilcoxon FA: A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J Pharmacol Exp Ther 1949, 96,