(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. A01N 37/36 (06.01) A01N 9/06 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy /38 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Kompozycje do zastosowania przeciwko jednemu lub więcej czynnikom chorobotwórczym () Pierwszeństwo: EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 07/27 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 11/07 (73) Uprawniony z patentu: Bionext, Rosieres, BE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 PHILIPPE PUJOS, Lille, FR MOHAMED HAISSAM JIJAKLI, Bruxelles, BE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Gdula WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. Rudolfa Weigla Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji zawierających antagonistyczne mikroorganizmy i sole. Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto wspomnianej kompozycji do zastosowania jako biologiczny środek ochrony roślin. Tło wynalazku [0002] Infekcje chorobotwórcze, takie jak infekcje grzybicze zwierząt, w tym ludzi oraz roślin, powodują duże straty w zdolności produkcyjnej na całym świecie. Ogromna liczba czynników chorobotwórczych jest odpowiedzialna za znaczące straty ekonomiczne w płodach rolnych i zebranych płodach rolnych. Na przykład, gatunki Penicillium i Botrytis są odpowiedzialne za znaczące straty ekonomiczne. Powszechne występowanie tych gatunków w żywności stanowi szczególny problem. Niektóre gatunki wytwarzają toksyny i mogą powodować, że żywność staje się niejadalna lub nawet niebezpieczna. Gatunki Penicillium mogą powodować poważne gnicie owoców, na przykład jabłek (Malus), gruszek (Pyrus) i cytryn (Citrus spp). [0003] Pestycydy zwalczające czynniki chorobotwórcze są dobrze znane w dziedzinie i są intensywnie stosowane od wielu lat. Metody profilaktycznego i/lub terapeutycznego leczenia infekcji grzybiczych i bakteryjnych u zwierząt i roślin na ogół obejmują stosowanie przeciwgrzybiczych i przeciwbakteryjnych produktów agrochemicznych lub stosowanie bardziej przyjaznych dla środowiska naturalnego biologicznych środków ochrony roślin bazujących na biologicznych środkach do zwalczania infekcji. Zainteresowanie zwalczaniem środkami biologicznymi wobec zwalczania środkami chemicznymi szybko wzrasta z kilku powodów, takich jak redukcja pozostałości,

3 troska o środowisko naturalne, pojawienie się oporności szczepów czynników chorobotwórczych na pestycydy chemiczne lub ograniczenie użycia pestycydów chemicznych. [0004] Jako biologiczne środki do zwalczania, znane są mikroorganizmy, które są antagonistyczne względem czynników chorobotwórczych. Opublikowano wiele dokumentów dotyczących stosowania kompozycji zawierających drożdże lub inne mikroorganizmy zwalczające czynniki chorobotwórcze działające na rośliny, wśród nich europejski opis patentowy EP , w którym ujawniono w zamieszczonych w nim przykładach kompozycję zawierającą antagonistyczny mikroorganizm, o wysokim stężeniu CaCl 2 2% ( g/l). Jako inne przykłady można zacytować międzynarodowe zgłoszenia patentowe WO 99/62340, WO 99/62341, opisy patentowe St. Zjedn. Ameryki nr US,2,132, US,741,699, US 6,060,429, międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 00/442 i opisy patentowe St. Zjedn. Ameryki nr US,288,488 i US,780,023. [000] Rozmaite mikroorganizmy wybrane spośród bakterii, grzybów i drożdży są pomyślnie stosowane przeciwko chorobom roślin wywołanym przez czynniki chorobotwórcze. Dostępne na rynku produkty biologiczne do zwalczania czynników chorobotwórczych, takie jak Aspire (Candida oleophila Montrocher, 1-182) i Biosave (Pseudomonas syringae van Hall, Esc-11) były i są już dostępne odpowiednio od Ecogen Inc. (Longhorn, PA) i Ecoscience Corp. (Worcester, MA) i są stosowane między innymi na zebranych jabłkach przeciwko chorobom związanym z uszkodzeniem powierzchni. [0006] Jednakże, często okazywało się, że te biologiczne środki ochrony roślin nie były wystarczająco skuteczne. Ta pierwsza generacja produktów biologicznych do zwalczania czynników chorobotwórczych, polegająca na stosowaniu pojedynczych antagonistów, została skrytykowana za brak dostarczania trwałego i niezawodnego działania ochronnego, podczas stosowania w warunkach przemysłowych. W celu ulepszenia ich naturalnej zdolności do kontrolowania infekcji powodowanych przez grzyby i szczególnie Penicillium expansum,

4 4 1 zmniejszenia stosowanej objętości środka, i kosztów, poszukiwane są nowe środki stymulujące. [0007] Rzeczywiście, bardziej skuteczne kompozycje pozwalają na stosowanie mniejszych ilości antagonistycznych mikroorganizmów na zabieg, bez obniżania skuteczności kompozycji zwalczającej czynniki chorobotwórcze i bez ograniczania czasu trwania skutecznego działania kompozycji zwalczającej czynniki chorobotwórcze, a więc umożliwiają osiąganie ekonomicznego progu dochodowości. [0008] W związku z powyższym, głównym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowych kompozycji, które są odpowiednie do zastosowania przeciwko chorobom wywoływanym u roślin, w ich produktach oraz u zwierząt, przez czynniki chorobotwórcze, takim jak choroby wywoływane przez pleśnie. Kolejnym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie kompozycji, które są co najmniej tak skuteczne jak kompozycje znane ze stanu techniki. Kolejnym celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie kompozycji, które zawierają mniejsze stężenia antagonistycznych mikroorganizmów, posiadając jednocześnie podobną lub lepszą skuteczność przeciwko czynnikom chorobotwórczym. Istota wynalazku 2 3 [0009] W pierwszym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza nową kompozycję, jak zdefiniowana w załączonych zastrzeżeniach patentowych. [00] W szczególności, niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji do zastosowania przeciwko jednemu lub więcej czynnikom chorobotwórczym, zawierającej co najmniej jeden antagonistyczny mikroorganizm i co najmniej jedną sól wybraną spośród takich jak diwodoroortofosforan wapnia Ca(H 2 PO 4 ) 2, wodoroortofosforan wapnia (CaHPO 4 ), ortofosforan wapnia (Ca 3 (PO 4 ) 2 ), mleczan wapnia, glukonian wapnia, laktoglukonian wapnia, cytrynian wapnia lub askorbinian wapnia, w której wymieniony antagonistyczny mikroorganizm stanowi Candida

5 1 2 3 oleophila, i charakteryzującej się tym, że ilość soli jest zawarta pomiędzy 0,00 i g/l, korzystnie pomiędzy 0,01 i 4 g/l, bardziej korzystnie pomiędzy 0,1 i 3 g/l, bardziej korzystnie pomiędzy 0,01 i 2, g/l, i jeszcze bardziej korzystnie pomiędzy 0,1 i 2,2 g/l. Korzystne realizacje są zdefiniowane w zastrzeżeniu patentowym 2. [0011] Niniejszy wynalazek dotyczy także stosowania kompozycji według wynalazku, jak zdefiniowano w dowolnym z zastrzeżeń patentowych od 3 do 8 i 11, i sposobów, jak zdefiniowano w którymkolwiek z zastrzeżeń patentowych 9 i. [0012] Zgodnie z wynalazkiem, wymienionym antagonistycznym mikroorganizmem jest Candida oleophila. [0013] Zgodnie z wynalazkiem, wymienioną solą jest glukonian wapnia, cytrynian wapnia, mleczan wapnia, diwodoroortofosforan wapnia Ca(H 2 PO 4 ) 2, wodoroortofosforan wapnia (CaHPO 4 ), ortofosforan wapnia (Ca 3 (PO 4 ) 2 ), laktoglukonian wapnia, askorbinian wapnia. [0014] Stwierdzono, że sól wykazuje niespodziewane właściwości wzmagające aktywność biologiczną antagonistycznych mikroorganizmów. Połączenie było szczególnie aktywne przy małych stężeniach soli, tj. poniżej g/l. Pokazano, że połączenie jest bardziej efektywne, niż podczas stosowania samego mikroorganizmu. Dla takich samych ilości soli, zgłaszający otrzymali podobną skuteczność jak podczas stosowania wysokich stężeń CaCl 2 2% ( g/l) razem z antagonistycznym mikroorganizmem. Pokazano, że kompozycja według wynalazku ma niespodziewanie bardzo dobrą skuteczność przy niskich dawkach soli, tj. poniżej g/l, i wykazuje podobną lub lepszą skuteczność niż kompozycja z antagonistycznym mikroorganizmem zawierająca wysokie stężenie CaCl 2 2% ( g/l). Kompozycja według wynalazku charakteryzuje się ulepszoną i/lub dłuższą skutecznością przeciwko chorobom wywoływanym przez czynniki chorobotwórcze u roślin i/lub zwierząt. Kompozycja według wynalazku jest szczególnie skuteczna na przykład przeciwko chorobom wywoływanym przez

6 pleśnie, które kolonizują części roślin, zarówno po zebraniu, jak i podczas cyklu życiowego rośliny. [001] Pokazano, że połączenie jest bardziej efektywne niż podczas stosowania samego mikroorganizmu. Kompozycja według wynalazku umożliwia stosowanie mniejszych ilości mikroorganizmu i/lub mniejszych ilości soli, posiadając jednocześnie podobną lub nawet lepszą skuteczność przeciwko czynnikom chorobotwórczym. [0016] Kompozycja według wynalazku jest użyteczna przeciwko jednemu lub więcej czynnikom chorobotwórczym, które są zdolne do wywoływania chorób u roślin lub u zwierząt, w tym u ludzi. Wymienionym czynnikiem chorobotwórczym mogą być grzyby, drożdże, bakterie i wirusy. [0017] Kompozycja według niniejszego wynalazku jest szczególnie użyteczna w zwalczaniu czynników chorobotwórczych zdolnych do wywoływania chorób w materiale roślinnym. Stosowany tu termin roślina obejmuje całą roślinę, części roślin, owoce i inne materiały dotyczące roślin. Nieograniczający przykład roślin obejmuje materiał roślinny, który może być wybrany z grupy obejmującej części roślin, owoce, takie jak gatunki Malus spp., Pyrus spp., Citrus spp. (na przykład, pomarańcze, cytryny, grejpfruty, mandarynki), oraz płody rolne, takie jak pomidory, papryka słodka, ogórki, winorośl i truskawki); rośliny okopowe (na przykład, ziemniaki, marchewki); owoce tropikalne (na przykład, mango, banany, gujawa, ananas, awokado); melony, i kwiaty oraz inne ozdobne płody rolne. Skuteczność kompozycji według wynalazku jest lepsza niż skuteczność kompozycji otrzymywanych przy użyciu samego antagonistycznego mikroorganizmu przy takim samym stężeniu i podobna do kompozycji otrzymywanych przy użyciu wysokich stężeń CaCl 2 (2% masa/objętość) z zastosowaniem mikroorganizmu. [0018] Niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu zwalczania środkami biologicznymi chorób spowodowanych przez czynniki chorobotwórcze w materiale roślinnym, obejmujący

7 7 etap stosowania kompozycji według wynalazku na wspomniany materiał roślinny. [0019] Niniejszy wynalazek dodatkowo dotyczy zastosowania kompozycji według wynalazku jako biologicznego środka ochrony roślin, korzystnie jako biologicznego środka grzybobójczego, biologicznego środka przeciwwirusowego i/lub jako biologicznego środka bakteriobójczego, oraz sposobu wytwarzania biologicznego środka ochrony roślin zawierającego kompozycję według wynalazku. [00] Niniejszy wynalazek zostanie następnie ujawniony bardziej szczegółowo poniżej. Przedstawiono także przykłady, które będą dodatkowo wspomagać opis. Szczegółowy opis [0021] Niniejszy wynalazek dotyczy kompozycji i sposobów zwalczania grzybiczych i bakteryjnych czynników chorobotwórczych działających na rośliny, jak zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach patentowych. [0022] Niespodziewanie stwierdzono, że kombinacja kompozycji daje lepszą kontrolę niż sam antagonistyczny mikroorganizm. [0023] Ilość co najmniej jednej soli jest zawarta pomiędzy 0,00 i g/l masa/objętość, korzystnie pomiędzy 0,01 i 4 g/l masa/objętość, bardziej korzystnie pomiędzy 0,1 i 3 g/l masa/objętość, bardziej korzystnie pomiędzy 0,01 i 2, g/l masa/objętość, i jeszcze bardziej korzystnie pomiędzy 0,1 i 2,2 g/l masa/objętość. W innej realizacji, wymieniony antagonistyczny mikroorganizm jest stosowany w stężeniu wynoszącym od 3 do 11 cfu/ml, korzystnie od 4 do cfu/ml. Kolejny przykład odpowiedniego stężenia obejmuje od do 8 cfu/ml i korzystnie stężenie mikroorganizmu wynosi od 6 do 8 cfu/ml, w przypadku gdy wymienionym antagonistycznym mikroorganizmem są grzyby i do 11, i korzystnie 9 do 11, w przypadku gdy wymienionym antagonistycznym mikroorganizmem są bakterie.

8 [0024] Sól może być w postaci uwodnionej lub bezwodnej. Kompozycja według wynalazku może, oczywiście, zawierać także mieszaniny soli i/lub ich polimery. [002] Sól jest wybrana z grupy obejmującej diwodoroortofosforan wapnia Ca(H 2 PO 4 ) 2, wodoroortofosforan wapnia (CaHPO 4 ), ortofosforan wapnia (Ca 3 (PO 4 ) 2 ), cytrynian wapnia, mleczan wapnia, laktoglukonian wapnia, askorbinian wapnia, oraz ich mieszaniny. Niespodziewanie stwierdzono, że kompozycja była szczególnie skutecznym inhibitorem pozbiorczych chorób owoców i warzyw. Niespodziewanie i nieoczekiwanie stwierdzono, że zastosowanie co najmniej jednej soli, jak zdefiniowano powyżej, z co najmniej jednym antagonistycznym mikroorganizmem według niniejszego wynalazku ułatwia lepsze kontrolowanie czynników chorobotwórczych działających na rośliny. Kombinacja soli, jak tu opisano, i antagonistycznego mikroorganizmu zapewnia skuteczne zwalczanie poważnego pozbiorczego gnicia owoców i daje lepszą kontrolę niż stosowanie samego antagonisty przy takim samym stężeniu lub daje podobną kontrolę niż stosowanie dużych ilości CaCl 2 (2%) z mikroorganizmem. Kompozycja wykazuje szczególną aktywność przeciwgrzybiczą i przeciwbakteryjną. [0026] Wymieniony antagonistyczny mikroorganizm stanowi Candida oleophila. [0027] Szczep Candida oleophila może być w postaci szczepu obejmującego szczep O Candida oleophila Montrocher złożony w depozycie pod oznaczeniem MUCL-4064, który został zdeponowany 17 czerwca 1997 roku w BBCM /MUCL Culture Collection, Mycothčque de l Université Catholique de Louvain, i komercyjny szczep Candida oleophila Montrocher. [0028] W jednej z realizacji, kompozycja według wynalazku obejmuje kombinację jednej soli z jednym antagonistycznym mikroorganizmem, przy czym wymieniona kombinacja jest wybrana spośród takich jak CaHPO 4 + Candida oleophila, Ca 3 (PO 4 ) 2 + Candida oleophila. [0029] W innej realizacji, wymieniona kombinacja jest wybrana spośród takich jak glukonian wapnia + Candida

9 oleophila, winian wapnia + Candida oleophila, cytrynian wapnia + Candida oleophila. [00] W innej realizacji, wymieniona kombinacja jest wybrana spośród takich jak laktoglukonian wapnia + Candida oleophila, askorbinian wapnia + Candida oleophila. [0031] Niniejszy wynalazek obejmuje także kompozycje zawierające co najmniej jeden antagonistyczny mikroorganizm i co najmniej dwie sole, jak tu opisano powyżej. Niniejszy wynalazek obejmuje także kompozycje zawierające co najmniej dwa antagonistyczne mikroorganizmy i co najmniej jedną sól, jak tu opisane powyżej. [0032] Stosowane w niniejszym opisie i w załączonych zastrzeżeniach patentowych formy pojedyncze obejmują także liczby mnogie terminów, których dotyczą, o ile z kontekstu nie wynika wyraźnie, że jest inaczej. Na zasadzie przykładu, związek dotyczy jednego związku lub więcej niż jednego związku. [0033] Wyliczenie zakresów liczbowych przez podanie ich punktów końcowych obejmuje wszystkie liczby całkowite i, gdy jest to odpowiednie, ułamki zaliczane do tego zakresu (np. zakres od 1 do może obejmować 1, 1,1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,, 2, 2,7, 3, 3,80, 4, i ). [0034] Stosowany tu termin pochodne obejmuje pochodne chemiczne, takie jak na przykład solwaty, hydraty, postacie stereoizomeryczne, mieszaniny racemiczne, i estry. O ile nie określono tego inaczej, stosowany tu termin solwat obejmuje dowolną kombinację, która może być tworzona przez sól z odpowiednim rozpuszczalnikiem nieorganicznym (np. hydraty) lub z rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak, między innymi, alkohole, ketony, estry i tym podobne. [003] Wszystkie stereoizomery soli, jak tu opisano, są objęte zakresem wynalazku, jako czyste związki, jak również jako ich mieszaniny. Wszystkie poszczególne enancjomery, diastereoizomery, izomery geometryczne, i kombinacje oraz ich mieszaniny są objęte zakresem niniejszego wynalazku. Czyste postacie stereoizomeryczne soli i związków pośrednich, jak tu

10 1 2 3 wymienione, są zdefiniowane jako izomery zasadniczo pozbawione innych enancjomerycznych lub diastereoizomerycznych form tej samej podstawowej struktury cząsteczkowej wymienionych związków lub związków pośrednich. [0036] Stosowany tu termin związek wzmagający działanie dotyczy związku, który jest zdolny do wzmagania właściwości biologicznych mikroorganizmu. Na przykład, może on wzmagać właściwości biologiczne antagonistycznych mikroorganizmów zwalczających czynniki chorobotwórcze zdolne do wywoływania chorób w materiale roślinnym. [0037] Stosowany tu termin antagonistyczny mikroorganizm dotyczy mikroorganizmu, który jest antagonistą dla czynnika chorobotwórczego, takiego jak na przykład czynnik chorobotwórczy, który jest zdolny do wywoływania chorób u roślin lub u zwierząt, w tym u ludzi. W korzystnej realizacji, wymienionym mikroorganizmem jest antagonista czynnika chorobotwórczego, takiego jak na przykład czynnik chorobotwórczy, który jest zdolny do wywoływania chorób w materiale roślinnym. Taki antagonistyczny mikroorganizm może być wybrany z grupy obejmującej bakterie, grzyby i drożdże. [0038] Stosowany tu termin biologiczny środek ochrony roślin obejmuje biologiczny środek grzybobójczy, biologiczny środek bakteriobójczy i biologiczny środek przeciwwirusowy. [0039] Kompozycje według niniejszego wynalazku mogą następnie obejmować, oprócz soli i mikroorganizmu, co najmniej jedne mannany i/lub ich pochodne. Ilość wymienionych mannanów może być zakresie od 0,001% do 2% masa/objętość, korzystnie w zakresie od 0,001 do 0,2% masa/objętość. [0040] A zatem, niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję, która może być stosowana jako kompozycja fitofarmaceutyczna i farmaceutyczna w leczeniu roślin i zwierząt przeciwko infekcjom mikrobiologicznym obejmującym infekcje bakteryjne, drożdżowe, grzybicze, wirusowe i pierwotniakowe. [0041] W szczególności, kompozycje według niniejszego wynalazku wykazują ulepszoną skuteczność przeciwko chorobom

11 wywoływanym przez czynniki chorobotwórcze w materiale roślinnym, na przykład choroby wywołane przez pleśnie, które kolonizują części roślin, zarówno po zebraniu, jak i podczas cyklu życiowego rośliny. Przykładowe gatunki czynników chorobotwórczych działających na rośliny, które mogą być hamowane z wykorzystaniem kompozycji według wynalazku obejmują, miedzy innymi, takie jak Alternaria spp., Ascochyta spp., Aspergillus spp., Botrytis spp., Cercospora spp., Cladosporium spp., Claviceps spp., Colletotrichum spp., Erysiphe spp., Fusarium spp., Geotrichum spp., Gilbertella spp., Gloeosporium spp., Helminthosporium spp., Monilia spp., Monilinia spp., Mucov spp., Nectria spp., Penicillium spp., Peronospora spp., Pezicula spp., Phomopsis spp., Phytophthora spp., Plasmopara spp., Podosphaera spp., Pseudocercosporium spp., Puccinia spp., Rhizoctonia spp., Rhizopus spp., Rynchosporium spp., Sclerotinia spp., Septoria spp., Sphaerotheca spp., Uncinula spp., Ustilago spp., Venturia spp., Verticillium spp., oraz bakteryjne lub wirusowe czynniki chorobotwórcze. W szczególnej realizacji, czynniki chorobotwórcze działające na rośliny mogą być wybrane z grupy obejmującej Alternaria alternata, Ascochyta sp., Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Botrytis alii, Botrytis cinerea, Botrytis fabae, Cercospora sp., Cladosporium sp., Claviceps purpurea, Colletotrichum sp., Erysiphe betae, Erysiphe graminis, Fusarium oxysporum, Geotrichum candidum, Gilbertella persicovia, Gloeosporium perennans, Gloeosporium fructigenum, Helminthosporium sp., Monilia sp., Monilinia fructicola, Monilinia laxa, Mucov sp., Nectria cinnabarina, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium italicum, Peronospora sp., Pezicula malicorticas, Phomopsis viticola, Phytophthora infestans, Plasmopara viticola, Podosphaera leucotricha, Pseudocercosporium sp., Puccinia graminis, Rhizoctonia sp., Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Rynchosporium sp., Sclerotinia Cepivorum, Sclerotinia sclerotiorum, Septoria apicola, Sphaerotheca sp., Uncinula necator, Ustilago sp., Venturia inaequalis;

12 Verticillium alboatrum, i Verticillium dahliae. W szczególnej realizacji, czynniki chorobotwórcze działające na rośliny mogą być wybrane z grupy obejmującej Botrytis spp., Penicillium spp., Pezicula spp., i Rhizopus spp. Na przykład czynnikami chorobotwórczymi mogą być Botrytis cinerea, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium italicum, Pezicula spp., i Rhizopus spp.. [0042] W korzystnej realizacji, kompozycja według niniejszego wynalazku jest szczególnie użyteczna jako biologiczny środek ochrony roślin. [0043] Według niniejszego wynalazku, antagonistyczny mikroorganizm i sól, jak tu opisane, i/lub jej pochodne, mogą być dostarczane w postaci mieszaniny mikroorganizmu i soli, jak tu opisane. Stosownie do kolejnej realizacji według niniejszego wynalazku, antagonistyczny mikroorganizm i sól, jak tu opisane, mogą być dostarczane w postaci rozdzielonej, jako preparaty niezmieszane, które są przeznaczone do zmieszania w celu uzyskania kompozycji według wynalazku. Na przykład, antagonistyczny mikroorganizm i sól, jak tu opisane, mogą występować się w postaci zestawu, zapakowane oddzielnie lub zapakowane razem w gotowej zmieszanej postaci. Antagonistyczny mikroorganizm i sól, jak tu opisane, mogą występować się w postaci zestawu w postaci oddzielnej, jako preparaty niezmieszane lub razem w jednym preparacie. [0044] Niniejszy wynalazek następnie dotyczy sposobu wytwarzania kompozycji według niniejszego wynalazku, zawierającego etap mieszania co najmniej jednego antagonistycznego mikroorganizmu z co najmniej jedną solą, jak tu opisane. [004] Kolejnym aspektem niniejszego wynalazku jest kompozycja zawierająca co najmniej jeden antagonistyczny mikroorganizm i co najmniej jedną sól, jak tu opisane, i/lub ich pochodne, do jednoczesnego, oddzielnego lub kolejnego podawania obiektowi, który ma być leczony. [0046] Stosowany tu termin obiekt obejmuje rośliny lub zwierzęta, w tym ludzi, które mają być leczone. W realizacji

13 według niniejszego wynalazku obiektem są rośliny, takie jak materiał roślinny. [0047] W jeszcze innym aspekcie, przedmiotem wynalazku jest sposób leczenia materiału roślinnego obejmujący podawanie do tego materiału skutecznej ilości co najmniej jednego antagonistycznego mikroorganizmu według wynalazku i co najmniej jednej soli, jak tu opisane, i/lub jej pochodnej, jednocześnie, oddzielnie lub kolejno. [0048] Podawanie jednoczesne oznacza, że antagonistyczny mikroorganizm i sól, jak tu opisane, są podawane roślinie w tym samym czasie. Na przykład, w postaci mieszaniny antagonistycznego mikroorganizmu i soli, jak tu opisane, lub w postaci kompozycji zawierającej wymieniony antagonistyczny mikroorganizm i sól, jak tu opisane. [0049] Podawanie oddzielne oznacza, że antagonistyczny mikroorganizm i sól są podawane na materiał roślinny w tym samym czasie lub zasadniczo w tym samym czasie. Antagonistyczny mikroorganizm i sól są podawane w postaci oddzielnych, niezmieszanych preparatów. Na przykład, antagonistyczny mikroorganizm i sól mogą występować w postaci zestawu, jako oddzielnie zapakowane. [000] Zwiększona zdolność antagonistycznego mikroorganizmu do kontrolowania czynników chorobotwórczych działających na rośliny w obecności co najmniej jednej soli, jak tu opisano powyżej, jest szczególnie nieoczekiwana. Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycję biologicznego środka ochrony roślin, która zawiera mniejsze stężenia antagonistycznych mikroorganizmów, przy jednoczesnym wydłużeniu czasu trwania skutecznego działania kompozycji przeciwko czynnikom chorobotwórczym. [001] W niniejszym opisie patentowym opisano także stosowanie soli, jak tu opisane, jako związku do wzmagania skuteczności kompozycji zawierającej co najmniej jeden antagonistyczny mikroorganizm, w porównaniu do skuteczności samego mikroorganizmu. Pokazano, że sole, takie jak glukonian wapnia, cytrynian wapnia, fosforan wapnia, mleczan wapnia,

14 laktoglukonian wapnia, askorbinian wapnia, szczególnie zwiększają skuteczność kompozycji biologicznego środka zwalczającego czynniki chorobotwórcze, zawierającej co najmniej jeden mikroorganizm. [002] W niniejszym opisie patentowym opisano także stosowanie co najmniej jednej soli, jak tu opisano, jako związku wzmagającego działanie w celu zmniejszania stężenia antagonistycznego mikroorganizmu bez obniżania skuteczności kompozycji zwalczającej czynniki chorobotwórcze. W niniejszym opisie patentowym następnie opisano stosowanie co najmniej jednej soli, jak tu opisano, jako związku wzmagającego działanie w celu zmniejszania stężenia antagonistycznego mikroorganizmu, przy jednoczesnym wydłużeniu czasu trwania skutecznego działania kompozycji zwalczającej czynniki chorobotwórcze. [003] W wymieniony sposób, wzmaganie właściwości biologicznych mikroorganizmu lub kompozycji bazującej na mikroorganizmie, może obejmować zmniejszanie stężenia antagonistycznego mikroorganizmu bez obniżania skuteczności kompozycji zwalczającej czynniki chorobotwórcze. Wzmaganie i wzmacnianie właściwości biologicznych może także obejmować zmniejszanie stężenia antagonistycznego mikroorganizmu, przy jednoczesnym wydłużaniu czasu trwania skutecznego działania kompozycji zwalczającej czynniki chorobotwórcze. Z powodu niespodziewanego zwiększenia działania kompozycji według wynalazku, niniejszy wynalazek umożliwia stosowanie kompozycji w mniejszych stężeniach. [004] Niniejszy wynalazek dotyczy także sposobu leczenia materiału roślinnego, takiego jak owoce i warzywa, w celu zwalczania pozbiorczych chorób przez stosowanie nowej kompozycji skutecznych ilościach. [00] W niniejszym opisie patentowym opisano także sposób wzmagania właściwości biologicznego środka grzybobójczego, biologicznego środka bakteriobójczego i/lub biologicznego środka przeciwwirusowego w kompozycji,

15 1 obejmujący dodawanie co najmniej soli, jak tu opisano, jako związku wzmagającego działanie wymienionej kompozycji. [006] Niniejszy wynalazek dostarcza także kompozycję do zastosowania przeciwko jednemu lub więcej czynnikom chorobotwórczym, zawierającą kompozycję według wynalazku oraz co najmniej jeden związek agrochemiczny. W realizacji według niniejszego wynalazku, związek agrochemiczny może być wybrany z grupy obejmującej środek grzybobójczy, środek bakteriobójczy, środek nicieniobójczy, środek owadobójczy, środek chwastobójczy i tym podobne. [007] Wynalazek zostanie następnie zilustrowany poniżej poprzez opis pewnych sposobów jego realizacji. Przykład 1 1 [008] Sole i antagonistyczny mikroorganizm wchodzące w skład kompozycji według niniejszego wynalazku przedstawiono w tabelach 1 i 2. Tabela 1 Sole 2 Ca(H 2 PO 4 ) 2 3 CaHPO 4 4 Ca 3 (PO 4 ) 2 19 glukonian wapnia 36 cytrynian wapnia 39 laktoglukonian wapnia 40 askorbinian wapnia Tabela 2 Antagonistyczny mikroorganizm e Candida oleophila 2 [009] Niniejszy wynalazek obejmuje dowolną kombinację jednej lub kilku soli od 1 do 43 z jednym lub kilkoma

16 16 antagonistycznymi mikroorganizmami od a do ii. W realizacji, kompozycja według wynalazku obejmuje kombinację jednej soli z jednym antagonistycznym mikroorganizmem, przy czym wymieniona kombinacja jest wybrana z grupy obejmującej 2+e, 3+e, 4+e. [0060] W innej realizacji, kompozycja według wynalazku obejmuje kombinację jednej soli z jednym antagonistycznym mikroorganizmem, przy czym wymieniona kombinacja jest wybrana z grupy obejmującej 19+e. [0061] W innej realizacji, kompozycja według wynalazku obejmuje kombinację jednej soli z jednym antagonistycznym mikroorganizmem, przy czym wymieniona kombinacja jest wybrana z grupy obejmującej 39+e, 40+e. Przykład 2 1 [0062] Przykład 2 ilustruje fakt, iż można uzyskać dobre działanie ochronne poprzez zastosowanie kompozycji według wynalazku zawierających sól, jak tu zdefiniowana, taką jak glukonian wapnia (CG) oraz antagonistyczne drożdże aktywne przeciwko pozbiorczym chorobom wywołanym przez pleśnie, na owocach z gatunków Malus. Materiał roślinny 2 [0063] Jabłka (Malus domestica Borkh cv. Golden) zostały zebrane z komercyjnych sadów utrzymywanych zgodnie ze standardowymi praktykami hodowlanymi w Belgii i umieszczone w regularnych magazynach do długoterminowego przechowywania. Stosowano owoce klasy handlowej I. Zostały one zakupione od sprzedawców hurtowych i były przechowywane w zimnym pomieszczeniu w temperaturze 4 ± 1 C przez maksymalnie 1 dni przed użyciem. Czynniki chorobotwórcze 3

17 17 [0064] Szczepy Penicillium expansum (pleśń niebieska) szczepy na początku wyizolowano z jabłek w Gembloux Belgium. Bezpłciowe zarodniki z czynnika chorobotwórczego umieszczono w postaci zawiesiny w roztworze gliceryny (2%) i przechowywano w temperaturze -70 C. Wychodząc z tego przechowywanego materiału, szczep grzybiczy przeniesiono do ośrodka PDA w temperaturze 2 C. Zawiesiny bezpłciowych zarodników przygotowano w sterylnym roztworze wodnym Tween (0,0%), i uregulowano do wymaganego stężenia ( 6 zarodników/ml), stosując komorę Bürker a. Antagonistyczne mikroorganizmy 1 2 [006] Jako szczep antagonistycznych drożdży stosowano szczep Candida oleophila Montrocher, który został złożony w depozycie pod numerem 4064 w BBCM / MUCL Culture Collection, Mycothčque de l Université Catholique de Louvain, i w dalszej części niniejszego opisu jest oznaczany jako szczep O. [0066] Ten szczep antagonistycznych drożdży wyizolowano z powierzchni jabłka i przechowywano w temperaturze -70 C w roztworze gliceryny (2%). Przed użyciem, szczep drożdży trzykrotnie poddawano podhodowli, kolejno w 24 godzinnych przedziałach czasowych na PDA (agar z dekstrozą ziemniaczaną, Potato Dextrose Agar). W trzecim pokoleniu, komórki drożdży usunięto z pożywki hodowlanej i zawieszono w izotonicznej wodzie (NaCl 0,8%). Stężenia zawiesiny uregulowano do wymaganych wartości, po ustaleniu linii regresji w związku z absorbancją zawiesiny mikroorganizmów (przy 9 nm) oraz liczbą jednostek tworzących kolonię (cfu) samej zawiesiny rozsianej w pożywce PDA. Zabieg 3 [0067] Owoce zdezynfekowano przez zanurzenie na okres 2 minut w podchlorynie sodu (% komercyjnego produktu). Następnie, wypłukano w sterylnej wodzie i osuszono w

18 18 1 warunkach laminarnego przepływu powietrza przed uszkodzeniem poprzez usunięcie bloków tkanki o średnicy 4 mm i głębokości 2-3 mm w trzech miejscach, znajdujących się w odległości 4- cm od siebie, wzdłuż jednej strony powierzchni owoców. [0068] Uszkodzenia poddano zabiegowi przez zastosowanie 40 µl kompozycji znanych ze stanu techniki lub kompozycji według wynalazku. [0069] Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze C w skrzynkach z tworzywa sztucznego, uszkodzenia inokulowano, stosując 40 µl odpowiednich zawiesin bezpłciowych zarodników czynników chorobotwórczych. Owoce inkubowano w temperaturze 2 C. [0070] Średnice zmian patologicznych rozwijających się wokół uszkodzeń zmierzono 7 dni po inokulacji czynnika chorobotwórczego. Co najmniej pięć owoców (1 uszkodzeń) stosowano na zabieg. W większości przypadków ma jeden zabieg stosowano 1 owoców i 4 uszkodzeń. [0071] Procent zabezpieczenia zapewnianego z wykorzystaniem różnych zabiegów obliczano na podstawie średnicy zmiany patologicznej powodowanej przez środek wywołujący gnicie owoców po okresie inkubacji, stosując następujące równanie: 2 3 w którym Y oznacza procent zabezpieczenia; D T oznacza średnią średnicę zmian patologicznych w grupie kontrolnej nie poddanej zabiegom i D x oznacza średnią średnicę zmian patologicznych w owocach poddanych zabiegom. [0072] Działanie kompozycji według wynalazku przeciwko pozbiorczemu gniciu jabłek spowodowanemu przez P. expansum oszacowano w kontrolowanych warunkach. [0073] W pozostałej części opisu, GC oznacza glukonian wapnia w postaci monohydratu (numer CAS: ), klasa czystości do żywności, Jungbunzlauer, Germany. CN oznacza

19 19 azotan (V) wapnia (tetrahydrat), 98%, VWR. Produkty te są znane jako takie i są dostępne na rynku. [0074] W pierwszej serii doświadczeń, standardowe kompozycje szczepu O stosowano jako kontrolę. Standardowe stężenie dla stosowanego szczepu O wynosi 7 jednostek tworzących kolonię na mililitr (cfu/ml), podczas gdy stężenie wynoszące cfu/ml jest uważane za podoptymalne. Rzeczywiście, można zobaczyć w tabeli 3, że wyniki, (które są wyrażone w kategoriach procentu zabezpieczenia obliczonego sposobem zdefiniowanym powyżej), otrzymane z zastosowaniem tego stężenia podczas stosowania samego szczepu O nie są satysfakcjonujące. Tabela 3 Zabezpieczenie przeciwko Penicillium expansum 1 Kontrola Szczep O 0 7 Sól wapniowa CG 2g/l CN 1,2 g/l CN 2,4 g/l Średnia infekcja Skuteczność zabezpieczenia (%) 11, 0,8 2,00 1, 7,6,9-93,1 82,7 87,3 34,1,8 [007] Według niniejszego wynalazku, niespodziewanie stwierdzono, że kompozycja, która zawierała podoptymalne stężenie wynoszące cfu/ml szczepu O i 2 g/l CG dawała lepsze zabezpieczenie. [0076] Ponadto, stwierdzono, że kompozycja, która zawierała podoptymalne stężenie wynoszące cfu/ml szczepu O i azotan (V) wapnia w stężeniu wynoszącym 1,2 g/l albo 2,4 g/l była mniej skuteczna w zabezpieczaniu owoców 2 przeciwko P. expansum niż kompozycja zawierająca sam szczep O, lub niż kompozycja zgodna z realizacją według niniejszego wynalazku, tj. zawierająca szczep O z CG o stężeniu 2 g/l.

20 [0077] W drugiej serii doświadczeń prowadzonych na jabłkach, których wyniki przedstawiono w tabeli 4, jako kontrolę stosowano standardowe kompozycje szczepu O. Tabela 4 Kontrola Szczep O 0 7 CG g Średnia infekcja 12,9 6,1 8,4 1,2 Skuteczność zabezpieczenia % 2,6 3,1 90,7 [0078] W pierwszej kompozycji, stosowanym stężeniem szczepu O było standardowe stężenie wynoszące 7 cfu/ml, podczas gdy w drugiej kompozycji, stosowanym stężeniem było podoptymalne stężenie wynoszące cfu/ml. [0079] Ponownie, niespodziewanie stwierdzono, że kompozycja, która zawierała podoptymalne stężenie wynoszące cfu/ml szczepu O i 2 g/l CG, dawała lepsze zabezpieczenie 1 owoców przed czynnikiem chorobotwórczym. [0080] W trzeciej serii doświadczeń prowadzonych na jabłkach, których przedstawiono w tabeli, jako kontrolę stosowano standardowe kompozycje szczepu O. Tabela Kontrola Szczep O 0 7 CG g Średnia infekcja 13,2 3,7 7,1 2,7 Skuteczność zabezpieczenia % 71,7 46,0 79,3 [0081] Według wynalazku, dodanie CG umożliwia stukrotne zmniejszenie stężenia szczepu O do cfu/ml z jednoczesnym

21 21 uzyskaniem lepszej i wzmożonej skuteczności przeciwko P. Expansum niż z zastosowaniem standardowego stężenia wynoszącego 7 cfu/ml. Wynik ten ilustruje szczególne właściwości kompozycji według niniejszego wynalazku. Przykład 3 Materiał roślinny [0082] Stosowano jabłka (Malus domestica Borkh cv. Golden) jak opisane w przykładzie 2. Czynniki chorobotwórcze 1 2. [0083] Penicillium expansum, jak opisano w przykładzie Antagonistyczne mikroorganizmy [0084] Jako szczep antagonistycznych drożdży stosowano Candida oleophila opisany w przykładzie 2. Zabieg 2 3 [008] Jabłka uszkodzono sposobem opisanym w przykładzie 2 i poddano zabiegom przez zastosowanie kompozycji zawierających sól według wynalazku i cfu C. oleophila, lub kompozycji znanych ze stanu techniki. Stosowanymi solami były: glukonian wapnia (CG), cytrynian triwapnia: (TC) mleczan wapnia (CL), laktoglukonian wapnia (CLG), askorbinian wapnia (CA) [0086] Po inkubacji, uszkodzenia inokulowano z zastosowaniem Penicillum expansum. Owoce inkubowano dalej. Średnice zmian patologicznych rozwijających się wokół uszkodzeń zmierzono 7 dni po inokulacji czynnika chorobotwórczego. Procent zabezpieczenia zapewnianego z wykorzystaniem różnych zabiegów obliczono sposobem opisanym w przykładzie 2. Wyniki działania zabezpieczającego kombinacji

22 22 antagonisty i soli przeciwko gniciu jabłek z dwóch serii doświadczeń przedstawiono w tabelach 6a i 6b. Standardowe kompozycje szczepu O ( 7 ) stosowano jako kontrolę. Tabela 6a Szczep O Kontrola 7 brak szczepu Sól CG TC CL CLG CA Stężenie g/l 0,87 g/l 1,34 g/l 1,3 g/l 1,96 g/l Średnia infekcja 18,4,2 9,2 4,8 2,8 7,7,6,4 Skuteczność % 0 71,8 0,3 73,8 84,8 8,1 69,4 70,9 Tabela 6b Szczep O Kontrola 7 brak szczepu Sól CG TC CL CLG CA Stężenie g/l 0,87 g/l 1,34 g/l 1,3 g/l 1,96 g/l Średnia 4,07 6,,3 6,0 6,67 6,06 6,21,31 infekcja Skuteczność % 0 84,3 67,0 74,2 83,3 82, 86,3 86,7 1 [0087] Według wynalazku, dodanie różnych soli umożliwia stukrotne zmniejszenie stężenia szczepu O do cfu/ml i pozwala na uzyskanie lepszego zabezpieczenia przy takim stężeniu w porównaniu do samego szczepu O. [0088] W kolejnej serii doświadczeń prowadzonych na jabłkach, których wyniki przedstawiono w tabeli 7, jako

23 23 kontrolę stosowano standardowe kompozycje szczepu O, i stosowanymi solami były: glukonian wapnia (CG), cytrynian triwapnia (TC) i węglan wapnia (CCa). Tabela 7 Szczep O Kontrola 7 brak szczepu Sól CaCl 2 CG TC stężenie g/l 2 g/l 0,87 g/l Średnia 26, 6, 3,4 0,7 1,7 1,0 infekcja Skuteczność % 7, 87,1 97,4 93, 96,4 1 [0089] Kombinacja antagonistycznych mikroorganizmów z różnymi solami według wynalazku, umożliwia stukrotne zmniejszenie stężenia szczepu O do cfu/ml z jednoczesnym uzyskaniem lepszej i wzmożonej skuteczności przeciwko P. Expansum niż z zastosowaniem stężenia wynoszącego 7 cfu/ml. Dodatkowo, kompozycja według wynalazku umożliwia znaczące zmniejszenie wymaganej ilości soli w porównaniu ze stosowanymi w stanie techniki ilościami CaCl 2 w celu uzyskania równoważnego działania ochronnego. Przykład 4 Materiał roślinny: [0090] Stosowano jabłka (Malus domestica Borkh cv. Golden) jak opisane w przykładzie 2. 2 Czynniki chorobotwórcze:

24 24 2. [0091] Penicillium expansum, jak opisano w przykładzie Antagonistyczne mikroorganizmy: [0092] Jako szczep antagonistycznych drożdży stosowano Candida oleophila opisany w przykładzie 2. Zabieg: 1 [0093] Jabłka uszkodzono sposobem opisanym w przykładzie 2 i poddano zabiegom przez zastosowanie kompozycji zawierających sól według wynalazku i cfu C. oleophila, lub kompozycji znanych ze stanu techniki. [0094] Po inkubacji, uszkodzenia inokulowano z zastosowaniem Penicillum expansum. Owoce inkubowano dalej. Średnice zmian patologicznych rozwijających się wokół uszkodzeń zmierzono 7 dni po inokulacji czynnika chorobotwórczego. Procent zabezpieczenia zapewnianego z wykorzystaniem różnych zabiegów obliczono sposobem opisanym w przykładzie 2. Wyniki przedstawiono w tabeli 8. Standardowe kompozycje szczepu O stosowano jako kontrolę. Stosowanymi solami były: glukonian wapnia (CG), diwodoroortofosforan wapnia (CPM), i ortofosforan wapnia (CPT). 2 Tabela 8 Szczep O Kontrola 7 Sól CaCl 2 CG CPT CPM Stężenie g/l 2 g/l 0,486 g/l 1,48 g/l Średnia infekcja 2,3 1,0 1,2 0,3 0, 0,4 0,1 Skuteczność %,8 4,4 87,6 77,4 84,1 94,4 [009] W tym samym doświadczeniu, średnice zmian patologicznych rozwijających się wokół uszkodzeń zmierzono

25 2 11 dni po inokulacji czynnika chorobotwórczego. Procent zabezpieczenia zapewnianego z wykorzystaniem różnych zabiegów obliczono sposobem opisanym w przykładzie 2. Wyniki przedstawiono w tabeli 9. Standardowe kompozycje szczepu O stosowano jako kontrolę. Stosowanymi solami były: glukonian wapnia (CG), diwodoroortofosforan wapnia (CPM), i ortofosforan wapnia (CPT). Tabela 9 Szczep O Kontrola 7 Sól CaCl 2 CG CPT CPM Stężenie g/l 2 g/l 0,486 g/l 1,48 g/l Średnia infekcja,1 2,8 2,8 0,6 1, 0,9 0,7 Skuteczność % 4,2 44,1 87,7 70, 82,1 86,6 1 [0096] Jak można zobaczyć na podstawie wyników przedstawionych w tabelach 8 i 9, glukonian wapnia, węglan wapnia, wodorowęglan wapnia, diwodoroortofosforan wapnia i ortofosforan wapnia dostarczają dobre zabezpieczenie przeciwko Penicillium expansum, w porównaniu ze stosowaniem samego antagonistycznego mikroorganizmu, przy takim samym stężeniu. Przykład Materiał roślinny: 2 [0097] Stosowano jabłka (Malus domestica Borkh cv. Golden) jak opisane w przykładzie 2. Czynniki chorobotwórcze: [0098] Botrytis cinerea.

26 26 Antagonistyczne mikroorganizmy: [0099] Jako szczep antagonistycznych drożdży stosowano Candida oleophila opisany w przykładzie 2. Zabieg: 1 [00] Jabłka uszkodzono sposobem opisanym w przykładzie 2 i poddano zabiegom przez zastosowanie kompozycji zawierających sól według wynalazku i cfu C. oleophila, lub kompozycji znanych ze stanu techniki. [01] Po inkubacji, uszkodzenia inokulowano z zastosowaniem Penicillum expansum. Owoce inkubowano dalej. Średnice zmian patologicznych rozwijających się wokół uszkodzeń zmierzono dni po inokulacji czynnika chorobotwórczego. Procent zabezpieczenia zapewnianego z wykorzystaniem różnych zabiegów obliczono sposobem opisanym w przykładzie 2. Wyniki przedstawiono w tabeli. Standardowe kompozycje szczepu O stosowano jako kontrolę. Stosowanymi solami były: glukonian wapnia (CG), cytrynian triwapnia: (TC), glutaminian wapnia (CGt). Tabela 2 Szczep O Kontrola 7 Sól CaCl 2 CG CGt TC Stężenie g/l 2 g/l 1,80 g/l 0,848 g/l Średnia infekcja 1,6 0,3 0,9 0,3 0,6 0,8 0,3 Skuteczność % 84,2 43,3 82,4 60,7 1,3 78,9

27 27 Wnioski 1 [02] Wszystkie wyniki podane w tych przykładach pokazują, że kompozycje według niniejszego wynalazku wykazują większą skuteczność niż kompozycje znane ze stanu techniki zawierające szczepy mikroorganizmów stosowanych w takim samym stężeniu. Nieoczekiwane właściwości soli, jak tu opisano, wpływające na zabezpieczające właściwości antagonistycznego mikroorganizmu zostały wyraźnie pokazane w wykorzystaniem niniejszych przykładów. Bardzo dobre wyniki uzyskano, stosując kombinację glukonianu wapnia, cytrynianu wapnia, diwodoroortofosforanu wapnia, ortofosforanu wapnia, askorbinianu wapnia, mleczanu wapnia lub laktoglukonianu wapnia ze szczepem C. oleophila. [03] Sole stosowane w niniejszym wynalazku stanowią niespodziewanie dobre związki wzmagające działanie ochronne, które umożliwiają zmniejszanie stężenia antagonistycznego mikroorganizmu bez obniżania skuteczności kompozycji zwalczających czynniki chorobotwórcze. Pozwalają one także na zmniejszenie stężenia antagonistycznego mikroorganizmu, przy jednoczesnym wydłużeniu czasu trwania skutecznego działania kompozycji zwalczającej czynniki chorobotwórcze.

28 Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja do zastosowania przeciwko jednemu lub więcej czynnikom chorobotwórczym, zawierająca co najmniej jeden antagonistyczny mikroorganizm i co najmniej jedną sól wybraną spośród takich jak diwodoroortofosforan wapnia Ca(H 2 PO 4 ) 2, wodoroortofosforan wapnia (CaHPO 4 ), ortofosforan wapnia (Ca 3 (PO 4 ) 2 ), mleczan wapnia, glukonian wapnia, laktoglukonian wapnia, cytrynian wapnia lub askorbinian wapnia, w której wymieniony antagonistyczny mikroorganizm stanowi Candida oleophila, znamienna tym, że ilość soli jest zawarta pomiędzy 0,00 i g/l, korzystnie pomiędzy 0,01 i 4 g/l, bardziej korzystnie pomiędzy 0,1 i 3 g/l, bardziej korzystnie pomiędzy 0,01 i 2, g/l, i jeszcze bardziej korzystnie pomiędzy 0,1 i 2,2 g/l. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że wymieniony antagonistyczny mikroorganizm jest stosowany w stężeniu wynoszącym od 3 do 11 cfu/ml, korzystnie od 4 do cfu/ml. 3. Zastosowanie kompozycji według dowolnego z zastrz. 1 albo 2, do zwalczania czynników chorobotwórczych zdolnych do wywoływania chorób w materiale roślinnym. 4. Zastosowanie kompozycji według zastrz. 3, w którym wymieniony materiał roślinny jest wybrany z grupy obejmującej owoce z takich gatunków, jak Malus spp., Pyrus spp., Citrus spp., w tym pomarańcze, cytryny, grejpfruty, mandarynki; płody rolne z takich gatunków, jak pomidory, papryka słodka, ogórki, winorośl i truskawki; rośliny okopowe obejmujące

29 29 ziemniaki, marchewki; owoce tropikalne, w tym mango, banany, gujawa, ananas, awokado; melony, oraz kwiaty i inne ozdobne płody rolne.. Zastosowanie kompozycji według zastrz. 3 albo 4, w którym czynniki chorobotwórcze są wybrane z grupy obejmującej Alternaria spp., Ascochyta spp., Aspergillus spp., Botrytis spp., Cercospora spp., Cladosporium spp., Claviceps spp., Colletotrichum spp., Erysiphe spp., Fusarium spp., Geotrichum spp., Gilbertella spp., Gloeosporium spp., Helminthosporium spp., Monilia spp., Monilinia spp., Mucov spp., Nectria spp., Penicillium spp., Peronospora spp., Pezicula spp., Phomopsis spp., Phytophthora spp., Plasmopara spp., Podosphaera spp., Pseudocercosporium spp., Puccinia spp., Rhizoctonia spp., Rhizopus spp.; Rynchosporium spp., Sclerotinia spp., Septoria spp., Sphaerotheca spp., Uncinula spp., Ustilago spp., Venturia spp., Verticillium spp., oraz bakteryjne lub wirusowe czynniki chorobotwórcze. 6. Zastosowanie kompozycji według zastrz., w którym czynniki chorobotwórcze są wybrane z grupy obejmującej Alternaria alternata, Ascochyta sp., Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Botrytis alii, Botrytis cinerea, Botrytis fabae, Cer-cospora sp., Cladosporium sp., Claviceps purpurea, Colletotrichum sp., Erysiphe betae, Erysiphe graminis, Fusarium oxysporum, Geotrichum candidum, Gilbertella persicovia, Gloeosporium perennans, Gloeosporium fructigenum, Helminthosporium sp., Monilia sp., Monilinia fructicola, Monilinia laxa, Mucov sp., Nectria cinnabarina, Penicillium digitatum, Penicillium expansum, Penicillium italicum, Peronospora sp., Pezicula malicorticas, Phomopsis viticola, Phytophthora infestans, Plasmopara viticola, Podosphaera leucotricha, Pseudocercosporium sp., Puccinia graminis, Rhizoctonia sp., Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Rynchosporium sp., Sclerotinia Cepivorum, Sclerotinia sclerotiorum, Septoria apicola, Sphaerotheca sp., Uncinula

30 necator, Ustilago sp., Venturia inaequalis; Verticillium albo-atrum i Verticillium dahliae. 7. Zastosowanie kompozycji według zastrz. albo 6, w którym czynniki chorobotwórcze są wybrane z grupy obejmującej Botrytis spp., Penicillium spp., Pezicula spp. i Rhizopus spp.. 8. Zastosowanie kompozycji według dowolnego z zastrz. 1 albo 2, do jednoczesnego, oddzielnego lub kolejnego podawania roślinie, która ma być poddana zabiegowi. 9. Sposób zwalczania środkami biologicznymi chorób spowodowanych przez czynniki chorobotwórcze w materiale roślinnym, znamienny tym, że zawiera etap, w którym stosuje się kompozycję według dowolnego z zastrz. 1 albo 2 do wspomnianego materiału roślinnego.. Sposób wytwarzania kompozycji według dowolnego z zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera etap, w którym miesza się co najmniej jeden antagonistyczny mikroorganizm z co najmniej jedną solą i/lub jej pochodnymi. 11. Zastosowanie kompozycji według dowolnego z zastrz. 1 albo 2, jako biologicznego środka ochrony roślin.

31 31 ODSYŁACZE CYTOWANE W OPISIE PATENTOWYM Poniższa lista odsyłaczy cytowanych przez zgłaszającego, załączona jest tylko dla wygody czytelnika. Lista ta nie stanowi części europejskiego dokumentu patentowego. Chociaż bardzo uważnie zestawiano odsyłacze, nie można wykluczyć błędów lub opuszczeń i pod tym względem EPO zrzeka się wszelkiej odpowiedzialności. Dokumenty patentowe cytowane w niniejszym opisie EP A [0004] US A [0004] WO A [0004] WO A [0004] WO A [0004] US A [0004] US 2132 A [0004] US A [0004] US A [0004]