(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/050738

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO04/ (13) B1 (51) Int.Cl. G01N 33/574 ( ) C12Q 1/68 ( ) (54) Sposób i zestaw do rozróżniania komórek dysplastycznych (30) Pierwszeństwo: , EP, , EP, (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 23/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/13 (73) Uprawniony z patentu: Roche mtm laboratories AG, Heidelberg, DE (72) Twórca(y) wynalazku: RUEDIGER RIDDER, Schriesheim, DE ANJA REICHERT, Nussloch, DE MARCUS TRUNK-GEHMACHER, Heidelberg, DE RICHARD BATRLA, Heidelberg, CH (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek

2 2 PL B1 Opis wynalazku Niniejszy opis dotyczy metody służącej do lepszej diagnostyki dysplazji, polegającej na jednoczesnym wykrywaniu produktów genu INK4a i co najmniej jednego markera proliferacji komórkowej. Jest to metoda pozwalająca na rozróżnianie komórek dysplastycznych, w których występuje nadekspresja produktów genu INK4a od komórek, w których występuje nadekspresja produktów genu INK4a, a które nie są dysplastyczne, poprzez wykrywanie markera odpowiedniego do oceny właściwości proliferacyjnych danej komórki. Charakterystyka właściwości proliferacyjnych może obejmować wykrywanie markera lub grupy markerów charakterystycznych dla aktywnej proliferacji komórkowej i/lub markera lub grupy markerów charakterystycznych dla opóźnionej lub zakończonej proliferacji komórkowej. Przedstawiana tutaj metoda pozwala więc, na specyficzną diagnostykę dysplazji w próbkach histologicznych i cytologicznych. Wykazano, że wykrycie nadekspresji p16 INK4a w próbkach biologicznych jest użytecznym markerem w diagnostyce zmian okolicy odbytowo-płciowej, takich jak rak szyjki macicy (zobacz WO00/01845; Klaes i wsp., Int. J. Cancer:92, (2001)). Metoda oparta na barwieniu immunochemicznym specyficznym dla p16 INK4a pozwala na czułą i specyficzną identyfikację komórek w wycinku tkanki oraz w próbkach cytologicznych. W badaniach immuno-histochemicznych tkanek, komórki dysplastyczne i nowotworowe można barwić stosując barwienie z wykorzystaniem specyficznych przeciwciał przeciwko p16 INK4a. Rozpoznanie histologiczne zmian nowotworowych można w ten sposób potwierdzić za pomocą barwienia opartego na markerze molekularnym, charakterystycznym dla transformacji komórek w zmianach w okolicy odbytowo-płciowej. W tej procedurze, rozpoznanie, czy komórki są, czy nie są komórkami nowotworowymi, nie opiera się wyłącznie na barwieniu specyficznym wobec p16 INK4a, ale również uwzględnia informacje histologiczne. Wynika to z faktu, że w około 20-30% próbek, komórki metaplastyczne wykazują w pewnym stopniu immunoreaktywność z przeciwciałami przeciwko p16 INK4a i ulegają barwieniu podczas procedury. Obraz barwienia komórek metaplastycznych różni się jednak od obrazu, uzyskiwanego ze zmian nowotworowych. Komórki metaplastyczne dają barwienie niejednolite lub ogniskowe, podczas gdy zmiany nowotworowe dają rozproszony wzór barwienia. Ponadto, intensywność barwienia w komórkach metaplastycznych jest zwykle mniejsza niż w komórkach nowotworowych. Powszechne metody stosowane w testach przesiewowych służących do wczesnego wykrywania dysplazji i/lub zmian nowotworowych nie wykorzystują testów opartych na badaniach histologicznych i ograniczają się zwykle do procedur cytologicznych. Jednakże, zwłaszcza w przypadkach, kiedy nie jest dostępna informacja histologiczna dotycząca budowy tkanki, jak na przykład w badaniach cytologicznych, samo badanie w kierunku nadekspresji p16 INK4a może dawać wyniki fałszywie dodatnie. Wynika to z faktu, że ta część komórek metaplastycznych, w której występuje nadekspresja p16 INK4a na wykrywalnym podwyższonym poziomie, może nie być zróżnicowana według kryteriów histologicznych. Odsetek komórek wykazujących nadekspresję p16 INK4a zwiększa się w miarę rozwoju dysplazji. Dlatego w stadiach nowotworowych lub przednowotworowych, kiedy w próbkach występuje tylko ograniczona populacja komórek nowotworowych i przednowotworowych, immunoreaktywność p16 INK4a może być słaba. Ta słaba immunoreaktywność może być na mniej więcej takim samym poziomie jak w przypadku komórek metaplastycznych. W pomniejszych stadiach dysplazji, całkowita immunoreaktywność p16 INK4a jest silniejsza i wówczas zmiany nowotworowe można łatwo odróżnić od metaplazji nawet w badaniu cytologicznym. Może to prowadzić do przypadków, gdzie obecność komórek metaplastycznych, w których występuje ekspresja p16 INK4a może być uznana za obecność komórek nowotworowych, co prowadzi do wyników fałszywie dodatnich. Sytuacja ta jest bardzo niekorzystna zwłaszcza w badaniach przesiewowych, gdzie istotne jest wykrycie wczesnych stadiów zmian nowotworowych. Jest to szczególnie istotne, ze względu na fakt, iż wykazano, że diagnostyka oparta na p16 INK4a stanowi użyteczne narzędzie w badaniach histologicznych i że zastosowanie jej w procedurach przesiewowych opartych na badaniu cytologicznym mogłoby ulepszyć ustalone procedury. Aby zmniejszyć liczbę wyników fałszywie dodatnich w badaniach cytologicznych oraz, aby dodatkowo zwiększyć prawidłowość diagnostyki zmian okolicy odbytowo- -płciowej w oparciu o p16 INK4a, konieczna byłaby metoda rozróżniania pozwalająca na rozróżnienie metaplazji od zmian nowotworowych i dysplastycznych. Temu celowi służy przedstawiona tutaj metoda.

3 PL B1 3 Dla potwierdzenia rozróżnienia metaplazji od zmian nowotworowych w procedurach opartych na nadekspresji p16 INK4a, konieczna byłaby cząsteczka markerowa, obecna w komórkach i tkankach nowotworowych i przednowotworowych, która nie występuje obok produktów genu INK4a w pojedynczej komórce metaplastycznej. Rozwiązanie przedstawionego problemu zapewniają opisane tutaj metody. W przebiegu eksperymentów prowadzących do niniejszego odkrycia, badacze wykazali, że jednoczesna detekcja obecności lub nieobecności i/lub poziomu p16 INK4a oraz co najmniej jednego markera proliferacji komórkowej, takiego jak, np. Ki67, Ki-S2, mcm5 lub mcm2 może rozwiązać ten problem. W artykule przedstawiono klika dokumentów dotyczących łącznego zastosowania markerów molekularnych dla lepszej diagnostyki dysplazji. W WO przedstawiono metodę ulepszonej diagnostyki złośliwych zmian szyjki macicy, przy łącznym zastosowaniu markera HPV oraz markera proliferacji komórkowej lub aktywności wirusa. p16!nk4a wspomniany jest w kontekście tego wynalazku jako marker, który może być stosowany jednocześnie z markerami HPV. W EP przedstawiono metodę zautomatyzowanego wykrywania zmian złośliwych szyjki macicy poprzez detekcję więcej niż jednej cząsteczki markerowej. Niektóre zdefiniowane kombinacje markerów określono w dalszej części dokumentu. Dokument nie odnosi się jednak do wyboru odpowiednich markerów do łącznego stosowania. Celem łącznego stosowania markerów w tym zastosowaniu jest poprawa prawidłowości zautomatyzowanej analizy obrazów barwienia w biologicznych próbkach cytologicznych. W dokumencie wspomniano połączenie p16 INK4a z innymi markerami nowotworów. W WO przedstawiono metodę wykrywania zaburzeń cyklu komórkowego w celu poprawy diagnostyki złośliwych zmian w szyjce macicy. W dokumencie opisano, że komórki dysplastyczne wykazują zaburzenia kontroli cyklu komórkowego i dlatego można je zidentyfikować poprzez detekcję białka typu cykliny E łącznie z substancjami post G1. Jeffrey Keating w artykule Ki67, Cyklin E, and p16ink4a Are Complimentary Surrogate Biomarkers for human papilloma Wirus-Related Cervical Neoplasia (American Journal of Surgical Pathology 25(7): , 2001) przedstawia komplementarność zastosowania p16 INK4a oraz cykliny w przebiegu diagnostyki dysplazji szyjkowych. Dokument odnosi się do problemów każdego pojedynczego markera stosowanego w wykrywaniu dysplazji i stwierdza, że zastosowanie p16 INK4a wraz z cykliną E może być pomocne w pokonaniu niedogodności związanych ze stosowaniem pojedynczych cząstek markerowych, zwłaszcza przy ocenie próbek cytologicznych. Nie podano natomiast żadnej informacji dotyczącej zastosowania p16 INK4a wraz z markerem charakterystycznym dla komórek proliferujących takim jak Ki67. Dokument nie wskazuje na jednoczesne zastosowanie p16 INK4a w metodach diagnostycznych; co więcej odnosi się do ograniczonego zastosowania Ki67 w diagnostyce różnicowej zmian w szyjce macicy i proponuje zaniechanie stosowania tego markera w diagnostyce zmian złośliwych szyjki macicy. W artykule nie ma informacji dotyczących łącznego zastosowania p16 INK4a oraz markera charakterystycznego dla proliferacji komórkowej jako metody diagnostycznej służącej dla lepszego rozróżniania komórek nie-dysplastycznych produkujących p16 INK4a od dysplazji produkujących p16 INK4a. WO nie daje wskazówek odnośnie zastosowania p16 INK4a w wykrywaniu proliferacji komórek dysplastycznych. EP nie przedstawia innego celu łącznego stosowania markerów nowotworowych do wykrywania niż automatyzacja procesu analizy. Nie ma stwierdzenia odnoszącego się do korzyści z łącznego stosowania markerów do celów rozróżniania pomiędzy komórkami dysplastycznymi a np. komórkami metaplastycznymi w próbkach pochodzących z szyjki macicy. Twórcy niniejszej metody próbowali pokonać niedoskonałości, polegające na tym, że p16 INK4a, który jest nadmiernie produkowany w różnych dysplazjach, może być również wykrywany w niektórych innych nie-dysplastycznych komórkach. Rozróżnienie pomiędzy komórkami nie-dysplastycznymi produkującymi p16 INK4a i komórkami dysplastycznymi nadmiernie produkującymi p16 INK4a może opierać się na cechach dotyczących proliferacji odpowiednich komórek. W prawidłowo kontrolowanych komórkach p16 INK4a hamuje cdk4 i w ten sposób hamuje proliferację. Przeciwnie, w komórkach dysplastycznych, regulacja ta jest uszkodzona. Stąd p16 INK4a pomimo jego niezwykle wysokiej ekspresji nie prowadzi do zahamowania proliferacji komórki. Twórcy niniejszej metody wykryli, że komórki dysplastyczne można odróżnić od komórek wykazujących kontrolowaną proliferację komórkową poprzez jednoczesne wykrycie p16 INK4a oraz markera charakterystycznego dla proliferacji komórkowej. Wobec tego, że w prawidłowych komórkach podwyż-

4 4 PL B1 szone poziomy p16 INK4a hamują proliferację, komórki wykazujące nadmierną ekspresję p16 INK4a można sklasyfikować jako dysplastyczne, jeżeli wykazują cechy aktywnej proliferacji komórkowej. Przedmiotem wynalazku jest sposób służący do rozróżniania komórek dysplastycznych wykazujących nadekspresję produktów genu INK4a od innych komórek wykazujących ekspresję produktów genu INK4a na poziomie wykrywalnym w próbkach biologicznych, obejmujący określanie za pomocą procedury cytologicznej lub histologicznej ekspresji cząstek markerowych, charakteryzujący się tym, że określa się jednoczesną ekspresję co najmniej dwóch cząstek markerowych, w co najmniej jednej pojedynczej komórce, gdzie co najmniej jedna cząsteczka markerowa jest produktem ekspresji genu INK4a wybranego z grupy obejmującej p16 INK4a i p14arf i co najmniej jedna inna cząsteczka markerowa jest markerem proliferacji komórkowej, a marker proliferacji komórkowej wybrany jest z grupy obejmującej marker proliferacji konieczny do utrzymania proliferacji komórkowej, marker proliferacji biorący udział w replikacji DNA, marker proliferacji wchodzący w skład widełek replikacyjnych lub kodujący białko wchodzące w skład widełek replikacyjnych, marker starzenia komórkowego, marker zatrzymania cyklu komórkowego i marker apopotozy, przy czym nadekspresja co najmniej jednego produktu genu INK4a wybranego z grupy obejmującej p16 INK4a i p14arf i ekspresja na poziomie wykrywalnym co najmniej jednego markera aktywnej proliferacji komórkowej, w obrębie rzeczonej pojedynczej komórki wskazuje na stan dysplastyczny komórki, a nadekspresja co najmniej jednego produktu genu INK4a wybranego z grupy obejmującej p16 INK4a i p14arf i ekspresja na poziomie wykrywalnym co najmniej jednego markera starzenia, krańcowego różnicowania komórkowego, apopotozy lub zahamowania cyklu komórkowego, w obrębie rzeczonej pojedynczej komórki wskazuje na niedysplastyczny stan komórki. Korzystnie, wykrywany jest zestaw dwóch lub więcej markerów proliferacji komórkowej. Korzystnie, co najmniej jeden produkt genu INK4a ma masę cząsteczkową pomiędzy 13 i 19 kda. Korzystnie, produkt genu koniecznego do utrzymania proliferacji komórkowej jest cząsteczką wybraną z grupy obejmującej cząsteczki Ki67, Ki-S5 oraz Ki-S2. Korzystnie, produkt genu biorący udział w replikacji DNA jest wybrany z grupy obejmującej helikazy lub ich podjednostki, cząsteczki cyklu podziałowego komórki (cell division cycle, cdc), cząsteczki fosfataz i cząsteczki kinaz. Bardziej korzystnie, helikazy lub ich podjednostki wybrane są z grupy obejmującej MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7 oraz HELAD1. Bardziej korzystnie, cząsteczki cdc, kinazy i fosfatazy wybrane są z grupy obejmującej CDC6, kinezę białkową CDC7, Dbf4, fosfatazę białkową CDC14, CDC45 oraz MCM10. Korzystnie, cząsteczki wchodzące w skład widełek replikacyjnych wybrane są z grupy obejmującej PCNA i POLD. Korzystnie, produkt genu jest polipeptydem lub cząsteczką kwasu nukleinowego. Korzystnie, dodatkowo wykrywana jest co najmniej jedna cząsteczka markerowa w celu poprawy oceny diagnozy lub prognozy. Bardziej korzystnie, dodatkowa cząsteczka markerowa jest co najmniej jedną dodatkową cząsteczką markerową proliferacji. Bardziej korzystnie, dodatkowa cząsteczka markerowa wybrana jest z grupy obejmującej marker starzenia, marker apopotozy, marker zahamowania cyklu komórkowego, marker końcowego różnicowania się komórek, marker zakażenia wirusowego, marker aktywności wirusowej, białko regulatorowe cyklu komórkowego, produkt genu konieczny do utrzymania proliferacji komórkowej, produkt genu biorący udział w replikacji DNA, produkt genu wchodzący w skład widełek replikacyjnych. Korzystnie, dodatkowo stosowana jest procedura barwienia cytologicznego wykorzystująca co najmniej jeden barwnik z grupy obejmującej DAPI, Quinacrin, chromomycynę, Alan, oranż akrydyny, hematoksylinę, eozynę, czerwień Sudan, błękit toluidyny oraz tioninę lub metodę barwienia wybraną z grupy obejmującej barwienie Pap, barwienie Giemza, barwienie metodą hematoksylina-eozyna, barwienie van-gieson, barwienie Schiff, barwienie za pomocą precypitatów metali, barwienie błękitem Tumbulls oraz barwienie za pomocą cyjanków metali. Korzystnie, komórki dysplastyczne są komórkami zmian rakowych lub przedrakowych. Bardziej korzystnie, komórki dysplastyczne pochodzą z dysplazji związanej z zakażeniem wirusem brodawczaka.

5 PL B1 5 Bardziej korzystnie, wirus brodawczaka jest wirusem brodawczaka o wysokim stopniu ryzyka wybranym z grupy obejmującej HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 66 oraz HPV 68. Korzystnie, zmiana wybrana jest z grupy obejmującej zmiany okolicy odbytowo-płciowej, zmiany dróg oddechowych oraz zmiany skóry i jej przydatków. Korzystnie, zmiana wybrana jest z grupy obejmującej zmiany pochodzące z szyjki macicy, pochwy, sromu, prącia, odbytu, odbytnicy, drzewa oskrzelowego, płuc, przestrzeni otrzewnowej, jamy nosowo-gardłowej, jamy ustnej lub skóry. Korzystnie, próbka biologiczna jest próbką obejmującą komórki pochodzące z okolicy odbytowo-płciowej, z układu oddechowego lub ze skóry i jej przydatków. Bardziej korzystnie, komórki są komórkami pochodzącymi z szyjki macicy, pochwy, sromu, prącia, odbytu, odbytnicy, drzewa oskrzelowego, płuc, jamy nosowo-gardłowej, jamy ustnej lub ze skóry. Korzystnie, próbka biologiczna jest preparatem cytologicznym lub histologicznym. Korzystnie, detekcja produktów genu INK4a i/lub cząstek markera proliferacji komórkowej wykonywana jest za pomocą co najmniej jednej sondy specyficznie rozpoznającej co najmniej jedną z cząstek, które mają być wykryte. Bardziej korzystnie, co najmniej jedna sonda jest znakowana w sposób możliwy do wykrycia. Bardziej korzystnie, co najmniej jeden znacznik jest radioizotopem, związkiem bioluminescencyjnym, związkiem chemiluminescencyjnym, związkiem fluorescencyjnym, związkiem chelatowym metalu lub enzymem. Korzystnie, co najmniej jedna sonda jest białkiem i/lub kwasem nukleinowym. Bardziej korzystnie, co najmniej jedna sonda jest przeciwciałem skierowanym przeciwko produktowi genu kodowanego przez INK4a lub produktem genu markera proliferacji komórkowej. Korzystnie, sposób obejmuje procedurę barwienia immunocytochemicznego. Korzystnie, co najmniej jedna sonda jest kwasem nukleinowym hybrydyzującym specyficznie z produktem genu INK4a lub produktem genu markera proliferacji komórkowej. Korzystnie, sposób obejmuje reakcje hybrydyzacji in situ. Korzystnie, sposób obejmuje reakcje amplifikacji kwasu nukleinowego. Korzystnie, reakcją amplifikacji kwasu nukleinowego jest PCR, NASBA lub LCR. Korzystnie, reakcje detekcji wykorzystujące sondy kwasu nukleinowego oraz sondy polipeptydowe przeprowadzane są jednocześnie. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw do przeprowadzania przedmiotowego sposobu charakteryzujący się tym, że jest zestawem diagnostycznym lub badawczym, zawierającym co najmniej jedną sondę, służącą do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu nadekspresji co najmniej jednego produktu genu INK4a wybranego z grupy obejmującej p16 INK4a i p14arf, i co najmniej jednego produktu genu markera proliferacji komórkowej w próbkach biologicznych, przy czym marker proliferacji komórkowej wybrany jest z grupy obejmującej marker proliferacji konieczny do utrzymania proliferacji komórkowej, marker proliferacji biorący udział w replikacji DNA, marker proliferacji wchodzący w skład widełek replikacyjnych lub kodujący białko wchodzące w skład widełek replikacyjnych, marker starzenia komórkowego, marker zatrzymania cyklu komórkowego i marker apoptozy. Korzystnie, produkty genu markera proliferacji komórkowej są wybierane z grupy obejmującej CDC6, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, kinazę białkową CDC7, Dbf4, fosfatazę białkową CDC14, CDC45 oraz MCM10, Ki67, Ki-S2, PCNA lub POLD. Korzystnie, zestaw zawiera dodatkowo co najmniej jeden z poniższych elementów: a. próbkę p16 INK4a do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej, b. próbkę p14arf do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej c. próbkę Ki67 do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej d. próbkę Ki-S2 do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej e. próbkę MCM5 do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej f. próbkę MCM2 do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej g. próbkę PCNA do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej h. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu p16 INK4a i. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu p14arf j. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu Ki67 k. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu Ki-S2 I. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu MCM5

6 6 PL B1 m. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu MCM2 n. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu PCNA o. jedną lub więcej próbek produktów genu INK4a do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej p. jedną lub więcej próbek produktów genu markera proliferacji komórkowej do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej q. jeden lub więcej odczynników do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu produktów genu INK4a r. i jeden lub więcej odczynników do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu innych produktów genu markera proliferacji komórkowej. Niniejsza metoda służy do rozróżniania zmian nowotworowych, przednowotworowych i/lub dysplastycznych od komórek nie-dysplastycznych wykazujących wysoki poziom p16 INK4a w próbkach biologicznych za pomocą procedur histologicznych lub cytologicznych, polegających na wykrywaniu obecności lub braku komórek wykazujących ekspresję genu p16 INK4a jednocześnie z markerami proliferacji komórkowej. Odpowiednie markery proliferacji komórkowej to np. Ki67, Ki-S2, KiS5, mcm5 lub mcm2. W jednej z odmian metody, białko lub mrna markerów proliferacji komórkowej może służyć jako marker do odróżniania metaplazji od wczesnych zmian dysplastycznych lub przednowotworowych w próbkach. Jednym z aspektów niniejszej metody jest odróżnianie komórek dysplastycznych wykazujących nadekspresję produktów genu INK4a od innych komórek wykazujących ekspresję produktów genu INK4a na wykrywalnym poziomie, w próbkach biologicznych, poprzez określenie w procedurach cytologicznych lub histologicznych jednoczesnej ekspresji co najmniej dwóch cząstek markerowych w co najmniej jednej odrębnej komórce. Co najmniej jedna oznaczana cząsteczka markerowa powinna być produktem kodowanym przez gen INK4a i co najmniej jedna inna cząsteczka markerowa powinna być markerem proliferacji komórkowej. Nadekspresja co najmniej jednego produktu genu INK4a i ekspresja co najmniej jednego markera aktywnej proliferacji komórkowej na poziomie wykrywalnym metodą immunochemiczną w obrębie danej pojedynczej komórki, wskazuje na stan dysplastyczny komórki, natomiast nadekspresja co najmniej jednego produktu genu INK4a i ekspresja co najmniej jednego markera starzenia się, końcowego różnicowania komórek, apoptozy lub zahamowania cyklu komórkowego na wykrywalnym poziomie w obrębie pojedynczej komórki wskazuje, iż nie jest to komórka dysplastyczna. Drugi aspekt niniejszej metody odnosi się do zestawu testowego służącego do określania dysplazji w próbkach zgodnie z przedstawioną metodą. W trakcie eksperymentów prowadzących do ustanowienia niniejszej metody stwierdzono, że w określonych sytuacjach komórki nie-dysplastyczne mogą wykazywać immunoreaktywność wobec p16 INK4a. Twórcy metody stwierdzili, że te komórki, wykazujące uporządkowaną kontrolę proliferacji komórkowej, w odpowiedzi na podwyższone poziomy produktów genu INK4a ulegają zahamowaniu wzrostu. Z tego względu te komórki nie wykazują immunoreaktywności markerów proliferacji komórkowej. Przeciwnie, komórki nieprawidłowe, wykazujące nadekspresję p16 INK4a charakteryzują się nieprawidłową regulacją kontroli proliferacji komórkowej i nie odpowiadają na podwyższony poziom p16 INK4a zaprzestaniem proliferacji. Wobec tego komórki dysplastyczne wykazują jednoczesną ekspresję p16 INK4a oraz markerów proliferacji komórkowej. Badacze stwierdzili, że jednoczesne wykrycie p16 INK4a oraz markerów proliferacji komórkowej może służyć do rozróżnienia komórek dysplastycznych od komórek z zahamowanym wzrostem wykazujących nadekspresję p16 INK4a, takich jak np. komórki metaplastyczne. Odkrycie, że p16 INK4a ulegający nadmiernej ekspresji w różnych dysplazjach może być również wykrywany w niektórych innych nie-dysplastycznych komórkach, doprowadziło twórców prezentowanej metody do ustalenia techniki służącej do odróżniania komórek nie-dysplastycznych, produkujących p16 INK4a od komórek dysplastycznych, wykazujących nadekspresję p16 INK4a, w oparciu o charakterystykę proliferacji danych komórek. Podczas gdy w normalnie kontrolowanych komórkach p16 INK4a hamuje cdk4 i tym samym hamuje proliferację komórki, nie obserwuje się tego w komórkach dysplastycznych. Zatem, w komórkach dysplastycznych p16 INK4a pomimo niezwykle wysokiego poziomu ekspresji, nie prowadzi do zahamowania proliferacji komórki. Metodę tutaj przedstawioną oparto na fakcie, że komórki dysplastyczne można odróżnić od komórek wykazujących normalnie kontrolowaną proliferację komórkową poprzez jednoczesne wykrycie produktu genu INK4a, takiego jak p16 INK4a oraz markera charakterystycznego dla proliferacji komórkowej.

7 PL B1 7 Termin marker, jak również cząsteczka markerowa, będzie tutaj zasadniczo stosowany odnośnie produktów ekspresji genu markera proliferacji, jak również produktów ekspresji genu INK4a. Nazewnictwo dotyczące genów stosowane w niniejszym tekście może po części odnosić się do genów lub białek odkrytych w różnych organizmach. W kontekście niniejszej metody nazewnictwo to odnosi się do odpowiedniego homologu określonych markerów w organizmie, którego dotyczy opisana metoda. W pewnych realizacjach niniejszej metody organizm ten jest ssakiem, w jednej z realizacji może być to człowiek. Tak więc, w jednej z realizacji niniejszej metody, określone markery będą to ludzkie homologi odpowiednio określonych markerów. Zasadniczo w tekście, termin marker proliferacji (komórkowej) lub marker dotyczący proliferacji komórkowej w różnych formach gramatycznych stosowany jest do określenia białek oraz markerów kwasu nukleinowego. W przypadku białka używana jest nazwa markera, taka jak np. białko replikacji, i to użycie będzie rozumiane jako metonimiczne i będzie odnosić się zarówno do białka, jak i do cząstek markerowych kwasu nukleinowego kodującego dane białko. Markerem użytecznym w niniejszej metodzie może być jakakolwiek cząsteczka pochodząca z transkrypcji genu lub jakakolwiek cząsteczka pochodząca z translacji po takiej transkrypcji. Wobec tego, termin produkt genu stosowany w kontekście niniejszej metody może obejmować polinukleotydy, takie jak np. DNA lub RNA oraz polipeptydy takie jak białka, proteoglikany, peptydy itd. Termin produkt(y) ekspresji stosowany w kontekście niniejszej metody będzie obejmować jakikolwiek produkt transkrypcji locus genu w obu kierunkach, obejmując jakiekolwiek ramki odczytu, warianty splicingowe. Stosowany tutaj termin produkty ekspresji będzie obejmować jakiekolwiek alternatywne produkty kodowane przez kwasy nukleinowe w locus danego genu. Termin produkty genu INK4a, stosowany w kontekście niniejszej metody, będzie to jakikolwiek mrna po transkrypcji z locus genu INK4a lub jakikolwiek polipeptyd po translacji z takiego mrna. W jednej realizacji metody produkty ekspresji genu INK4a mogą wykazywać masę cząsteczkową rzędu 5 do 40 kda lub jakąkolwiek wartość pomiędzy, a lepiej rzędu 10 do 20 kda lub jakąkolwiek wartość pomiędzy i najlepiej rzędu 14 do 19 kda lub jakąkolwiek wartość pomiędzy. Produkty genu INK4a odpowiednie dla niniejszej metody mogą obejmować, np. takie produkty genu jak np. p16 INK4a oraz p14arf. Termin marker proliferacji (komórkowej) lub marker dotyczący proliferacji komórkowej stosowany w kontekście niniejszej metody obejmować będzie jakąkolwiek cząsteczkę markerową znaną jako charakterystyczna dla stanu proliferacji komórek. Stan proliferacji może to być, np. stan aktywnej proliferacji komórek, opóźnionej proliferacji komórek, zahamowanej proliferacji komórek, starzenia się komórek, krańcowego zróżnicowania komórek, apoptozy itd. W jednej z realizacji wynalazku, markerem proliferacji komórkowej jest cząsteczka markerowa charakterystyczna dla aktywnej proliferacji komórek. W innej realizacji metody cząsteczka markerowa proliferacji może być cząsteczką charakterystyczną dla komórek w stanie zahamowanej proliferacji, krańcowo zróżnicowanych, starzejących się lub apoptotycznych. W niektórych realizacjach, markery proliferacji stosowane w kontekście niniejszej metody mogą obejmować geny biorące udział w replikacji DNA, takie jak, np. białka kompleksu pre-inicjacyjnego lub widełek replikacyjnych. Takie cząsteczki mogą na przykład obejmować helikazy, takie jak helikaza eukariotyczna lub białka MCM (MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7), białko TP, jak przedstawiono w WO oraz WO (określane również jako HELAD1, Pomfil2, Unc-53), kinazy lub fosfatazy biorące udział w procesie replikacji takie jak np. CDC6, kinaza białkowa CDC7, Dbf4, fosfataza białkowa CDC14, CDC45 oraz MCM10. Ponadto markery proliferacji mogą obejmować białka wchodzące w skład widełek replikacji, takie jak np. PCNA lub polimeraza DNA delta, białko replikacji A (replication protein A, RPA), czynnik replikacji C (replication factor C), FEN1. W innych realizacjach markery proliferacji mogą obejmować cząsteczki konieczne dla utrzymania proliferacji komórkowej, takie jak Ki67 lub KiS2. W tej realizacji białka mogą być np. obecne przez cały cykl komórkowy. Są one użyteczne dla przeprowadzenia badania zgodnie z niniejszą metodą zakładając, że są charakterystyczne dla aktywnej proliferacji komórkowej i nie są w znaczących ilościach produkowane w stanie zatrzymanej proliferacji, w komórkach ostatecznie zróżnicowanych, w stanie apoptozy lub starzenia się komórek. Ki67, Ki-S2 oraz Ki-S5 stosowane tutaj określać będą białkowe cząsteczki markerowe wykrywane przez odpowiednie przeciwciała jak również kwasy nukleinowe kodujące te antygeny. W innej realizacji markerem proliferacji komórkowej do stosowania w badaniu zgodnie z niniejszą metodą może być cząsteczka markerowa charakterystyczna dla opóźnionej lub zakończonej proli-

8 8 PL B1 feracji, taka jak np. marker starzenia, marker zatrzymania cyklu komórkowego, marker charakterystyczny dla komórek ostatecznie zróżnicowanych lub marker apoptozy. Takie cząsteczki obejmują np. p21, p27, kaspazy, BAD, CD95, ligand fas, białka parp itd. Rozróżnienie stosowane w kontekście niniejszej metody obejmować będzie ocenę czy próbka powinna być klasyfikowana w taki, czy w inny sposób. W jednej z odmian metody, rozróżnienie dotyczy oceny czy tkanka lub jej składniki są dysplastyczne czy nie-dysplastyczne. Wobec tego stosowane tutaj rozróżnienie dotyczy właściwości wzrostu komórek w próbce biologicznej. W jednej z realizacji niniejszej metody, rozróżnienie obejmuje wykrycie ekspresji produktu genu INK4a jednocześnie z wykryciem ekspresji markera charakterystycznego dla aktywnej proliferacji komórkowej. W tym przypadku, komórki wykazujące jednocześnie ekspresję obu cząstek markerowych powinny być klasyfikowane jako dysplastyczne. W innej realizacji niniejszej metody rozróżnienie obejmuje wykrycie produktu genu INK4a oraz jednoczesne wykrycie ekspresji markera charakterystycznego dla zatrzymania, zakończenia lub opóźnienia proliferacji komórkowej. W tym przypadku komórki wykazujące jednoczesną ekspresję obu cząstek markerowych powinny być klasyfikowane jako nie-dysplastyczne. W pewnych realizacjach niniejszej metody, użyteczne będzie wykrycie obecności lub nieobecności oraz/lub poziomu więcej niż dwóch cząstek markerowych. W jednej z odmian jeden produkt ekspresji genu INK4a wykrywany będzie wspólnie z dwoma lub większą liczbą markerów proliferacji komórkowej. Może to być użyteczne dla lepszej identyfikacji właściwości proliferacyjnych komórek wykazujących ekspresję produktu genu INK4a w próbkach. Niektóre markery proliferacji ograniczone są do specyficznych faz cyklu komórkowego lub są obecne w komórkach w małej ilości. Z tego względu, w niektórych przypadkach wykrycie komórek proliferujących wykazujących ekspresję produktów genu INK4a można ulepszyć poprzez wykrywanie dwóch lub większej liczby markerów proliferacji. W takich przypadkach, np., kiedy jeden z markerów proliferacji obecny jest podczas całego cyklu proliferacyjnego komórki, może być on wykrywany jednocześnie z markerami charakterystycznymi dla specyficznych faz cyklu komórkowego. Np., Ki67, Ki-S5 lub Ki-S2 mogą być wykrywane jednocześnie z mcm5, mcm2, PCNA, RPA, rfc itd. W innych przypadkach, np. białka zaangażowane w proces replikacji DNA mogą być wykrywane jednocześnie z Ki67, Ki- S5 lub Ki-S2. W jeszcze innym przypadku, Ki67 może być wykrywany razem z Ki-S2. Należy zrozumieć, że te przykłady mają na celu zilustrowanie możliwości kombinacji i nie są wyczerpujące, tak więc zastosowanie różnych innych kombinacji markerów proliferacji jest jednakowo użyteczne i odpowiednie w procedurze testowej według wynalazku. Może się zdarzyć, że w opisanej tutaj metodzie może być zastosowana kombinacja dwóch lub więcej markerów proliferacji komórkowej. W innej realizacji dwie lub więcej cząsteczki markerowe wykrywalne w długiej części cyklu komórkowego lub nawet w całym cyklu komórkowym lub w aktywnie proliferujących komórkach mogą być wykrywane jednocześnie tak, jak tutaj opisano. Połączenie detekcji więcej niż jednej cząsteczki markerowej proliferacji komórkowej może być zasadniczo użyteczne dla zwiększenia czułości wykrywania cech proliferacji komórek. W pewnych realizacjach niniejszej metody, połączenie może również obejmować inne cząsteczki markerowe, takie jak cząsteczki markerowe starzenia się komórki, markery zatrzymania proliferacji komórkowej, markery komórek krańcowo zróżnicowanych, markery komórek apoptotycznych, markery infekcji wirusowych lub aktywności wirusowej w komórkach albo markery w postaci białek regulujących cykl komórkowy. W pewnych realizacjach, w związku z powiązaniem dysplazji z zakażeniami HPV, wykrycie cząstek markerowych związanych z HPV lub wykrycie markerów aktywności wirusowej może być stosowane do detekcji dysplazji. Metody użyteczne do wykrywania zakażenia HPV w próbkach znane są osobom zajmującym się tym zagadnieniem. Te metody obejmują testy wykorzystujące sondy specyficzne dla czynników HPV oraz mogą obejmować reakcje amplifikacji kwasów nukleinowych. Wykrywanie zakażenia wirusowego można przeprowadzać jednocześnie z wykrywaniem INK4a oraz cząstek markerowych proliferacji lub w późniejszym czasie. Określenie dysplastyczny stosowane w kontekście niniejszej metody odnosi się do postaci dysplazji od łagodnych do ciężkich oraz ich stadiów prekursorawych, jak również do nowotworów takich jak nowotwory in situ lub nowotwory inwazyjne oraz rozsiane komórki nowotworowe. Dlatego też, stosowane tutaj określenie dysplastyczny będzie obejmowało również wczesne i prekursorowe stadia dysplazji i nowotworów. Komórki wykazujące nadekspresję produktów genu INK4a, które nie są dysplastyczne (stosowane tutaj określenie nie-dysplastyczne) mogą obejmować komórki metaplastyczne, komórki starzejące się, komórki krańcowo zróżnicowane lub komórki, które w pewnych stadiach cyklu komórkowego wykazują

9 PL B1 9 podwyższone stężenia produktów genu INK4a. W pewnych komórkach podwyższone stężenia produktów genu INK4a mogą występować w odpowiedzi na sygnały zewnętrzne takie jak hormony, przekaźniki, itd. W jednej realizacji niniejszej metody, komórki nie-dysplastyczne wykazujące nadmierną ekspresję produktów genu INK4a obejmują komórki metaplastyczne, komórki endometrialne, itd. Metodą odpowiednią do wykrywania poziomu ekspresji produktów genu INK4a i/lub produktów genu markera proliferacji, jest jakakolwiek metoda, która może (ale nie musi) być odpowiednia do wykrycia nawet bardzo małych ilości specyficznych cząstek biologicznych w próbkach biologicznych. Reakcja detekcji według niniejszej metody jest to wykrywanie albo na poziomie kwasów nukleinowych albo na poziomie białek. W kontekście niniejszej metody mówi się, że cząsteczka markerowa jest wykrywalna, jeżeli może być wykryta w przebiegu odpowiednich procedur detekcji, takich jak np. hybrydyzacja in-situ, barwienie immunochemiczne, test wychwytywania hybryd (hybryd capture assay), itd. Można sprawić, iż poziom ekspresji cząsteczki markerowej będzie wykrywalny, stosując odpowiednią reakcję reportera, taką jak np. barwienie chromogeniczne lub fluorescencyjne immunochemiczne lub metoda hybrydyzacji in-situ dla analizy mikroskopowej lub automatycznej. Przy tej metodzie stosować można dowolne odpowiednie sposoby zwiększania sygnału reportera, znane specjalistom w dziedzinie. Z tego względu mówi się, że marker jest wykrywalny, w przypadku, gdy barwienie wypiera odpowiednie barwienie tła uzyskane w procedurze barwienia immunochemicznego dając istotne wyniki barwienia. Cząstki markerowe można wykryć stosując odczynniki specyficznie rozpoznające te cząsteczki. Reakcja detekcji produktów genu INK4a i/lub produktów genu markera proliferacji może obejmować jedną lub więcej reakcji z czynnikami wykrywającymi, rozpoznającymi początkowe cząsteczki markerowe lub cząsteczki uprzednio zastosowane do rozpoznania innych cząstek. W niektórych realizacjach niniejszej metody, dwie lub więcej sond można stosować do wykrycia pojedynczej cząsteczki markerowej. Na przykład, stosować można dwa lub więcej różne czynniki wiążące (np. przeciwciała) lub sondy oligonukleotydowe, skierowane przeciwko pojedynczej cząstce markerowej (zależnie od przypadku skierowane przeciwko różnym epitopom lub różnym sekwencjom). Wykrywanie różnych produktów genów można przeprowadzić w jednym naczyniu reakcyjnym lub pojemniku lub w różnych pojemnikach jednocześnie albo kolejno w czasie. W ten sposób, różne produkty genu mogą być wykrywane jednocześnie w jednej komórce wykazującej ekspresję obu produktów. Inne komórki wykazujące jednocześnie ekspresję produktów genu mogą być stosowane do oddzielnych reakcji wykrywania (oddzielonych w przestrzeni lub w czasie), w celu wykrycia każdego pojedynczego markera w komórkach. W innej realizacji, stosowane mogą być komórki wykazujące ekspresję jednego lub drugiego markera. Wykrycie cząsteczki markerowej w różnych komórkach może być również przeprowadzane jednocześnie lub oddzielnie w czasie i/lub w przestrzeni. Reakcja detekcji ponadto może obejmować reakcję reportera wskazującą na obecność lub brak i/lub poziom produktów genu cząsteczki markerowej. Reakcja reportera może to być na przykład reakcja dająca kolorowy związek, reakcja bioluminescencji, reakcja fluorescencji, lub ogólnie reakcja emitująca promieniowanie, itd. W pewnych realizacjach, różne cząsteczki markerowe mogą być rozpoznawane przez czynniki, które produkują różne sygnały reportera tak, aby sygnały odnoszące się do cząstek markerowych mogły być odróżnione. W jednej szczególnej realizacji metody, wykrywanie ekspresji dwóch lub więcej produktów genu INK4a i/lub produktów genu markera proliferacji przeprowadzane jest jednocześnie. W tym przypadku reakcja reportera może na przykład wykorzystywać różne znaczniki fluorescencyjne dla różnych cząstek wykrywanych. Jednak w kontekście niniejszej metody nie jest konieczne uzyskanie odpowiedzi czy jeden lub więcej marker proliferacji albo produkt genu markera INK4a jest produkowany w komórce. W niektórych realizacjach pytaniem jest czy produkowany jest jakikolwiek marker proliferacji i/lub produkt genu INK4a. W przebiegu eksperymentów można wybrać taką procedurę, która daje ten sam sygnał fluorescencyjny wskazując na obecność markera proliferacji. Ta procedura jest odpowiednia dla poprawienia czułości detekcji cech proliferacji komórkowej (różne markery charakterystyczne dla aktywnej proliferacji komórkowej). Zależnie od okoliczności można stosować procedurę dającą jeden wykrywalny sygnał na trzy, cztery lub nawet więcej cząstek markerowych charakterystycznych dla proliferacji komórkowej. Analogicznie, to samo może w pewnych okolicznościach dotyczyć produktów ekspresji genu INK4a. Należy zrozumieć, że w zależności od okoliczności, pożądane może być zastosowanie

10 10 PL B1 różnych sygnałów barwiących dla różnych cząstek markerowych proliferacji. Można zastosować procedury w zależności od potrzeb odpowiedniego eksperymentu. W niektórych realizacjach niniejszej metody połączenie jednego lub więcej (np. dwóch różnych) produktów genu INK4a może być wykrywane łącznie z jednym lub więcej, np. zestawem dwóch, zestawem trzech, zestawem czterech, zestawem pięciu lub nawet większym zestawem markerów proliferacji komórkowej. W zależności od okoliczności, wykrywanie cząstek markerowych proliferacji komórkowej może dawać tylko jeden sygnał reportera. W innych przypadkach każdy pojedynczy marker proliferacji komórkowej może dawać specyficzny sygnał reportera lub grupy cząstek markerowych mogą dawać specyficzne sygnały reportera. Sygnały wskazujące na immunoreaktywność mogą być powstającymi w różny sposób sygnałami chromogenicznymi. Alternatywnie lub nawet łącznie, stosować można sygnały fluorescencyjne. Odpowiednie sygnały reportera obejmują znaczniki fluorescencyjne, takie jak fluoresceina, rodamina, itd. Odpowiednimi rodzajami reakcji detekcji zgodnymi z niniejszą metodą mogą być, techniki blotingowe takie, jak Western-Blot, Southern-blot, Northem-blot, procedury immuno-cytochemiczne lub immuno-histochemiczne. Techniki blotingowe znane są specjalistom w dziedzinie i mogą być wykonywane na przykład jako elektroblotingi, blotingi półsuche, blotingi próżniowe lub metodą dot-blot. Procedury barwienia immuno-cyto/histochemicznego znane są osobom specjalistom w dziedzinie i mogą obejmować wykrywanie polipeptydów za pomocą czynnika wiążącego oraz techniki hybrydyzacji in situ. Obie te techniki mogą być nawet stosowane jednocześnie. W pewnych realizacjach do detekcji stosować można wychwytywanie hybryd kwasów nukleinowych. Reakcja amplifikacji może być również odpowiednia do wykrywania, np. cząstek kwasów nukleinowych. W jednej z realizacji wynalazku, wykrywanie poziomu INK4a i/lub wykrywanie produktów genu markera proliferacji przeprowadzane jest poprzez detekcję odpowiednich kwasów nukleinowych (np. mrna) lub ich fragmentów obecnych w próbce. Środki służące do detekcji cząstek kwasu nukleinowego znane są specjalistom w dziedzinie. Procedura detekcji kwasów nukleinowych może być również na przykład przeprowadzana poprzez reakcję wiązania cząsteczki, która ma być wykryta, do komplementarnych sond kwasów nukleinowych, białek wiążących się specyficznie z kwasami nukleinowymi lub jakichkolwiek innych jednostek specyficznie rozpoznających i wiążących kwasy nukleinowe. W jednej z odmian, w celu wykrywania produktów ekspresji lub markerów może być stosowana hybrydyzacja in situ sond oligonukleotydowych do kwasów nukleinowych. Sondy stosowane w kontekście niniejszej metody mogą być czynnikami wiążącymi się specyficznie do cząsteczki. W przypadku kwasów nukleinowych, sondą może być oligonukleotyd ulegający hybrydyzacji do odpowiedniej sekwencji. W jednej realizacji, sondą może być np. primer. W przypadku wykrywania polipeptydów lub białek stosowaną sondą może być np. czynnik wiążący taki, jak przeciwciało. W pewnych realizacjach niniejszej metody sondy mogą być znakowane w taki sposób, aby można je było wykryć. Znacznik można wybrać z grupy obejmującej radioizotop, związek bioluminescencyjny, związek chemiluminescencyjny, związek fluorescencyjny, metal chelatujący lub enzym. Sondy można stosować w każdej znanej procedurze detekcji, np. w przebiegu hybrydyzacji in situ, w metodzie wychwytu hybryd, w reakcji barwienia immunochemicznego, w technikach blotingowych, itd. Metoda ta może być wykonywana zarówno in vitro jak i in situ, na przykład przy wykrywaniu reakcji barwienia. Innym sposobem wykrywania mrna markera w próbce wykonanej zgodnie z niniejszą metodą jest reakcja amplifikacji kwasów nukleinowych, którą można przeprowadzić w sposób ilościowy, taka, jak na przykład reakcja łańcuchowa polimerazy (polymerase chain reaction, PCR). W preferowanej realizacji niniejszej metody do ilościowego oznaczenia stężenia mrna markera w próbkach dysplazji lub zmian nowotworowych (komórkach lub próbkach tkanki) można zastosować PCR czasu rzeczywistego (Real Time PCR). W innej preferowanej realizacji metody, wykrywanie poziomu INK4a i/lub produktów genu markera proliferacji przeprowadzane jest poprzez określenie poziomu ekspresji białka lub jego fragmentów. Określenie produktu genu markera na poziomie białka może być, na przykład, przeprowadzane w reakcji obejmującej czynnik wiążący specyficzny dla detekcji danego polipeptydu markera. Czynniki wiążące można stosować w wielu różnych technikach takich, jak na przykład Western- -blot, ELISA lub immuno-precypitacja. Zazwyczaj detekcję opartą na wykrywaniu czynnika wiążącego polipeptyd można przeprowadzić zarówno in vitro jak i bezpośrednio in situ, na przykład w reakcji barwienia immuno-chemicznego. W niniejszej metodzie stosować można również jakiekolwiek inne badanie służące do określenia ilości określonych polipeptydów w próbkach biologicznych.

11 PL B1 11 Procedury obrazowania immuno-cytochemicznego stosowane w kontekście niniejszej metody mogą obejmować np. barwienie preparatów cytologicznych lub histologicznych za pomocą barwników chromogenicznych lub fluorescencyjnych. Barwienie może np. obejmować wiązanie cząstek, które mają być wykryte przez pierwszorzędowy czynnik wiążący, który sam jest rozpoznawany przez drugorzędowy czynnik wiążący, który może być znakowany. Pierwszorzędowy czynnik wiążący może to być w niektórych realizacjach czynnik wiążący kwas nukleinowy lub białko (np. przeciwciało), a drugorzędowy czynnik wiążący może to być np. przeciwciało drugorzędowe rozpoznające pierwszorzędowy czynnik wiążący. W ramach niniejszej procedury można stosować jakiekolwiek znane metody służące do barwienia cytochemicznego lub histochemicznego. Czynniki wiążące stosowane w kontekście niniejszej metody do detekcji poziomu polipeptydów INK4a takich jak p16!nk4a lub polipeptydów p14arf oraz polipeptydów markera proliferacji takich jak polipeptydy mcm5, mcm2, KI67,Ki-S5, PCNA lub Ki-S2 mogą obejmować przeciwciała oraz fragmenty wiążące antygen, dwufunkcyjne przeciwciała hybrydowe, peptydomimetyki zawierające minimalne epitopy wiążące antygen, anty-kuliny (anti-caline ), itd. Uważa się, że przeciwciało lub czynnik wiążący antygen reaguje specyficznie, jeżeli reaguje na poziomie wykrywalnym z określonym białkiem i nie reaguje w istotny sposób z innymi białkami. Przeciwciała, które mogą być wykorzystane w niniejszym wynalazku mogą być przeciwciałami monoklonalnymi lub poliklonalnymi. Stosowany termin przeciwciało lub przeciwciało monoklonalne oznacza nienaruszone cząsteczki oraz fragmenty przeciwciał. Ponadto, przeciwciała, które mogą znaleźć zastosowanie w niniejszym wynalazku obejmują przeciwciała chimeryczne, jednołańcuchowe i humanizowane. W niniejszej metodzie, czynniki wiążące mogą być stosowane osobno lub łącznie. Poprzez łączenie możliwe jest uzyskanie wyższego stopnia czułości. Termin przeciwciało, odnosi się do przeciwciał, które obejmują przede wszystkim zebrane przeciwciała monoklonalne o różnej specyficzności epitopowej, jak również odrębne preparaty przeciwciał monoklonalnych. Przeciwciała monoklonalne produkowane są w oparciu o antygen zawierający fragmenty polipeptydu opisanego w niniejszej metodzie, za pomocą jakiejkolwiek odmiany technik znanych osobom zajmującym się zagadnieniem; patrz, np. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, W jednej z takich technik, immunogen zawierający polipeptyd antygenowy lub jego syntetyczną część jest początkowo wstrzykiwany różnym ssakom (np. myszom, szczurom, królikom, owcom i kozom). Na tym etapie, polipeptyd, o którym mowa w metodzie, może służyć bez modyfikacji jako immunogen. Alternatywnie, szczególnie dla stosunkowo krótkich polipeptydów, wyższą odpowiedź immunologiczną można wywołać, jeżeli polipeptyd jest połączony z białkiem nośnikowym takim jak albumina wołowa lub keyhole limpet hemocyanin. Immunogen wstrzykiwany jest do organizmu gospodarza, zgodnie z wcześniej ustalonym schematem obejmującym jedną lub więcej immunizacji wspomagających (booster immunizations) i okresowo pobierana jest krew. Przeciwciała poliklonalne specyficzne dla polipeptydu można następnie oczyścić z takiej surowicy odpornościowej za pomocą na przykład chromatografii powinowactwa, stosując polipeptyd połączony z odpowiednią wspierającą cząsteczką stałą. W kontekście niniejszej metody nie jest konieczna odpowiedź na pytanie czy jeden lub więcej marker proliferacji jest produkowany w komórkach. W niektórych realizacjach głównym pytaniem może być zagadnienie, czy produkowany jest jakikolwiek marker proliferacji. W związku z powyższym, w przebiegu eksperymentów wybrano procedurę, która daje ten sam sygnał fluorescencyjny stanowiący wskaźnik obecności markera proliferacji. Ta procedura jest odpowiednia dla poprawienia czułości detekcji cech proliferacji komórkowej. Zależnie od okoliczności można stosować procedurę dającą jeden wykrywalny sygnał na trzy, cztery lub nawet więcej cząstek markerowych charakterystycznych dla proliferacji komórkowej. Analogicznie to samo może w pewnych okolicznościach dotyczyć produktów ekspresji genu INK4a. Należy zrozumieć, że w zależności od okoliczności, pożądane może być zastosowanie różnych sygnałów barwiących dla różnych cząstek markerowych proliferacji. W zależności od potrzeb danego eksperymentu można stosować różne procedury. Produkty genu INK4a i/lub produkty genu markera proliferacji można w niniejszej metodzie wykrywać jednocześnie. W tym kontekście, jednocześnie oznacza albo dosłownie w tej samej chwili albo w obrębie jednej procedury testowej, gdzie poszczególne etapy detekcji następują w czasie po sobie. Procedura detekcji zgodnie z niniejszą metodą może ponadto obejmować procedurę barwienia cytochemicznego, która daje barwienie chromogeniczne lub fluorescencyjne komórek lub działów komórkowych. Takie procedury barwienia znane są osobom zajmującym się tym zagadnieniem i mogą

12 12 PL B1 obejmować np. barwienie struktur kwasochłonnych lub zasadochłonnych, różnych regionów w obrębie komórki (np. jądra, mitochondriów, aparatu Golgiego, cytoplazmy, itd.), specyficznych cząstek (chromosomów, lipidów, glikoprotein, polisacharydów, itd.) w próbkach cytologicznych. Zastosować można barwniki fluorescencyjne, takie jak DAPI, Quinacrin, chromomycyna, itd. Ponadto mogą być stosowane barwniki fluorescencyjne takie jak Alan, oranż akrydyny, hematoksylina, eozyna, czerwień Sudan, barwniki tiazynowe (błękit toluidyny, tionina). W innych realizacjach niniejszej metody mogą być stosowane takie procedury barwienia, jak barwienie Pap, barwienie metodą Giemza, barwienie metodą hematoksylina-eozyna, barwienie van-gieson, barwienie Schiff (za pomocą odczynnika Schiff), procedury barwienia wykorzystujące precypitację metali (takie jak np. srebro w procedurach barwienia wykorzystujących azotan srebra) lub nierozpuszczalne barwniki takie jak np. błękit Tumbulls (lub inne nierozpuszczalne cyjanki metali), itd. Należy przyjąć, że wymienione barwniki i metody barwienia stanowią tylko przykłady i, że w niniejszej procedurze może być stosowana każda inna znana metoda. Procedury barwienia mogą wykorzystywać barwniki chromogeniczne do oceny w mikroskopie świetlnym lub barwniki fluorescencyjne do oceny w warunkach mikroskopii fluorescencyjnej. W innej realizacji niniejszej metody mogą być stosowane procedury dające promieniowanie, procedury wykorzystujące substancje upośledzające przekazywanie promieniowania lub inne środki kontrastowe służące do obrazowania warunków cytologicznych w próbce (np. powstawanie odbicia optycznego w procesie tworzenia obrazu (mikro-)autoradiograficznego lub (mikro-)radiograficznego). Wszystkie procedury barwienia i obrazowania można stosować do analizy nie tylko w procedurach mikroskopowych, ale również w procedurach analizy automatycznej takich jak cytometria przepływowa, automatyczna analiza mikroskopowa (skomputeryzowana lub wspomagana komputerowo) lub w jakiejkolwiek innej metodzie służącej do analizy barwionych próbek cytologicznych. Analiza wyników barwienia lub obrazowania różnych procedur może być przeprowadzana jednoetapowo lub w serii kolejnych etapów. Np. analiza próbki w mikroskopie świetlnym może być wykonywana przed lub po analizie próbki w mikroskopie fluorescencyjnym. W mikroskopii fluorescencyjnej, analiza różnych barwników, wzbudzających różną długość fali świetlnej może być przeprowadzana jednocześnie lub etapowo. Inne metody obrazowania można stosować jednocześnie lub po przeprowadzeniu wymienionych procedur. Mogą zaistnieć różne okoliczności, w których odpowiednie będzie łączenie różnych metod barwienia. Np. w przypadkach, gdzie nie można uzyskać odpowiedniego barwienia cytologicznego za pomocą barwienia immunochemicznego, właściwe może być dodatkowe zastosowanie ogólnych technik barwienia cytologicznego. Próbką w niniejszej metodzie może być jakakolwiek próbka zawierająca komórki. Próbkami mogą być np. wydzieliny, wymazy, płyny ustrojowe oraz próbki komórkowe i tkankowe. W jednej z odmian niniejszej metody próbki obejmują komórki okolicy odbytowo-płciowej, układu oddechowego lub skóry i jej przydatków. W pewnej realizacji komórki mogą pochodzić z szyjki macicy, pochwy, sromu, prącia, odbytu, odbytnicy, drzewa oskrzelowego, płuc, otrzewnej, przestrzeni otrzewnowej, jamy nosowo-gardłowej, jamy ustnej lub skóry. W pewnych realizacjach niniejszej metody, próbka może być próbką biologiczną, próbką pochodzącą z biopsji lub próbką cytologiczną taką jak, np. rozmaz, wymaz, popłuczyny, płyn ustrojowy zawierający komórki (plwocina, wydzieliny, ślina, itd.). W pewnych realizacjach niniejszej metody próbki mogą obejmować komórki zakażone wirusem brodawczaka. Próbki mogą w pewnych realizacjach obejmować rozmazy z szyjki macicy, popłuczyny z drzewa oskrzelowego, itd. W pewnych szczególnych realizacjach niniejszej metody próbka może zostać przygotowana jako preparat jednowarstwowy lub cienkowarstwowy próbki cytologicznej. Odpowiednie metody służące do przygotowania cytologicznego preparatu jednowarstwowego lub cienkowarstwowego znane są specjalistom w dziedzinie. W jednej realizacji preparat może, np. obejmować technologię ThinPrep. Inne metody obejmują typowe rozmazy lub metody wykorzystujące zawiesiny komórek do przygotowania próbek cytologicznych. Przygotowanie próbki może obejmować np. uzyskanie próbki z tkanki, płynu ustrojowego, komórek pacjenta. Zgodnie z niniejszą metodą przygotowanie próbki może również obejmować kilka kroków dalszej preparatyki próbki, takich jak przygotowanie preparatów, przygotowanie zawiesiny komórek, wykonanie rozmazu lub naniesienie komórek, które mają być badane na szkiełka mikroskopowe, przygotowanie sond tkankowych, izolacja polipeptydów lub kwasów nukleinowych, przygotowanie fazy stałej ustalonych peptydów lub kwasów nukleinowych lub przygotowanie kulek, błon lub szkiełek, z którymi łączą się w sposób kowalentny i niekowalentny cząsteczki, które mają być określone.

13 PL B1 13 W pewnych realizacjach niniejszej metody, może być ona przeprowadzona w sposób automatyczny. Automatyzację metody można osiągnąć poprzez automatyczne barwienie i analizę próbek histologicznych lub cytologicznych na podłożu stałym, za pomocą mikroskopu. W innej realizacji automatyzacja może obejmować analizę barwionych komórek za pomocą cytometrii przepływowej w roztworze. Zmiany dysplastyczne, do których może być stosowana niniejsza metoda są to wszelkie zmiany dysplastyczne, które charakteryzują się nadekspresją produktów genu INK4a takich jak np., p16 INK4a lub p14arf. W pewnych realizacjach zmiany te jest to dysplazja powiązana z zakażeniami wywołanymi przez wirusy brodawczaka takie, jak np. HPV. W jednej realizacji, może to dotyczyć odmiany HPV o wysokim stopniu ryzyka, takiej jak HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 66, HPV 68, itd. W innej realizacji, zmiany dysplastyczne, które mogą być wykrywane według niniejszej metody obejmują zmiany okolicy odbytowo- -płciowej, zmiany w obrębie układu oddechowego, zmiany w obrębie głowy i szyi lub zmiany skóry i jej przydatków. Takie zmiany mogą np. obejmować dysplazję odbytu lub odbytnicy, sromu, pochwy, szyjki macicy lub prącia, drzewa oskrzelowego, płuc, jamy ustnej, jamy nosowo-gardłowej. Innym aspektem niniejszej metody jest zestaw testujący służący do przeprowadzenia badania zgodnie z założeniami procedury. Zestaw ten może być zestawem diagnostycznym lub badawczym. Zestaw według niniejszego wynalazku obejmuje przynajmniej jeden czynnik odpowiedni do wykrycia produktów genu INK4a. Zatem, zestaw wykorzystywany w niniejszej metodzie może obejmować odczynniki do wykrywania jednego lub więcej produktów genu INK4a odczynniki do wykrywania jednego lub więcej produktów genu markerowego proliferacji odczynniki i bufory powszechnie stosowane do przeprowadzenia reakcji detekcji, takie jak bufory, odczynniki reporterowe (barwniki, itp.), substancje nośnikowe i inne próbki produktu genu INK4a służący do wykonania reakcji z kontrolą pozytywną próbki produktu genu markerowego proliferacji służące do wykonania reakcji z kontrolą pozytywną. Odczynniki służące do wykrywania produktów genu markera mogą obejmować jakikolwiek czynnik wiążący się z produktami genu markera. Takie odczynniki mogą obejmować białka, polipeptydy, kwasy nukleinowe, kwasy nukleinowe połączone z peptydami, glikoproteiny, proteoglikany, polisacharydy lub lipidy. Próbki produktu genu INK4a oraz produktu genu markera proliferacji służące do przeprowadzenia kontroli dodatniej mogą zawierać na przykład kwasy nukleinowe w odpowiedniej formie, takiej jak roztwór lub sól, peptydy w odpowiedniej formie, próbki preparatów tkanki lub komórki wykazujące ekspresję odpowiedniego genu. W preferowanej realizacji metody wykrycie produktów genu markera przeprowadzane jest na poziomie polipeptydów. W tej realizacji czynniki wiążące mogą być na przykład przeciwciałami specyficznymi dla produktów genu markera lub ich fragmentami. W innej realizacji zestawu testowego wykrywanie produktów genu markera przeprowadzane jest na poziomie kwasu nukleinowego. W tej realizacji metody, odczynnikiem służącym do wykrywania może być na przykład sonda kwasu nukleinowego lub primer komplementarny do kwasu nukleinowego danego markera. Niniejszy wynalazek związany jest z metodą rozpoznawania nowotworowych i/lub dysplastycznych i przednowotworowych zmian chorobowych, możliwych do zidentyfikowania poprzez ocenę poziomu nadekspresji p16 INK4a, w komórkach ekspresjonujących również p16 INK4a, na poziomie wykrywalnym za pomocą testów histologicznych i/lub cytologicznych. Sposób oparty jest na wykrywaniu ekspresjonowanych produktów genu dwóch lub więcej produktów genu INK4a. W związku z powyższym, głównym problemem, który należało by rozwiązać, było dostarczenie metody pozwalającej na rozróżnienie pomiędzy komórkami dysplastycznymi a innymi komórkami, w których nie występuje złośliwy potencjał wzrostowy. Metoda może być stosowana w każdym stopniu dysplazji i może być szczególnie użyteczna we wczesnych etapach, kiedy metody diagnostyki cytologicznej oparte na nadekspresji p16 INK4a wymagają dodatkowych informacji do identyfikacji komórek metaplastycznych. Ponadto niniejsza metoda dostarcza zestaw do przeprowadzenia badania zgodnie z założeniami procedury.

14 14 PL B1 Krótki opis rysunków Figura 1: Barwienie fluorescencyjne próbki histologicznej szyjki macicy; Na Figurze 1 przedstawiono barwienie ciężkiej postaci dysplazji za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko p16 INK4a. Szczegóły dotyczące procedury znaleźć można w Przykładzie 1. Immunoreaktywność wobec p16 INK4a daje zieloną fluorescencję. Prawie wszystkie komórki w obrębie zmiany są zabarwione w sposób rozproszony w obrębie cytoplazmy i w jądrach komórkowych. Figura 2: Barwienie fluorescencyjne próbki histologicznej szyjki macicy; Na Figurze 2 przedstawiono barwienie ciężkiej postaci dysplazji za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67. Szczegóły dotyczące procedury znaleźć można w Przykładzie 1. Immunoreaktywność wobec Ki67 daje czerwoną fluorescencję. Wiele komórek w obrębie dysplazji wykazuje barwienie jądra wobec Ki67. Figura 3: Podwójne barwienie fluorescencyjne próbki histologicznej szyjki macicy; Na Figurze 3 przedstawiono barwienie ciężkiej postaci dysplazji za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67 oraz przeciwko p16 INK4a. Szczegóły dotyczące procedury znaleźć można w Przykładzie 1. Immunoreaktywność wobec Ki67 daje czerwoną fluorescencję; immunoreaktywność wobec p16 INK4a daje zieloną fluorescencję; nałożenie fluorescencji czerwonej i zielonej daje fluorescencję żółtą. Wiele komórek w obrębie dysplazji wykazuje barwienie jądra wobec Ki67 jak również barwienie wobec p16 INK4a i dlatego daje żółtą fluorescencję. Figura 4: Barwienie fluorescencyjne próbki histologicznej szyjki macicy; Na Figurze 4 przedstawiono barwienie metaplazji łuskowatej za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko p16 INK4a. Szczegóły dotyczące procedury znaleźć można w Przykładzie 1. Immunoreaktywność wobec p16 INK4a daje zieloną fluorescencję. Niektóre komórki zmiany są zabarwione w sposób rozproszony w obrębie cytoplazmy i w jądrach komórkowych. Figura 5: Barwienie fluorescencyjne próbki histologicznej szyjki macicy; Na Figurze 5 przedstawiono barwienie metaplazji łuskowatej za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67. Szczegóły dotyczące procedury znaleźć można w Przykładzie 1. Immunoreaktywność wobec Ki67 daje czerwoną fluorescencję. Wiele komórek w obrębie metaplazji łuskowatej wykazuje barwienie jądra wobec Ki67. Obszary, w których wykazano ekspresję p16 INK4a nie wykazują barwienia wobec Ki67, co wskazuje na brak ekspresji antygenu w tych obszarach. Figura 6: Podwójne barwienie fluorescencyjne próbki histologicznej szyjki macicy; Na Figurze 6 przedstawiono barwienie metaplazji łuskowatej za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67 oraz skierowanych przeciwko p16 INK4a ; szczegóły dotyczące doświadczenia znaleźć można w Przykładzie 1. Immunoreaktywność wobec Ki67 daje czerwoną fluorescencję, immunoreaktywność wobec p16 INK4a daje zieloną fluorescencję; nałożenie fluorescencji czerwonej i zielonej daje fluorescencję żółtą. Obszary, które wykazują ekspresję p16 INK4a nie wykazują barwienia wobec Ki67, co wskazuje na brak ekspresji antygenu w tych obszarach. Żadna z komórek próbki nie daje żółtej fluorescencji. Figura 7: Podwójne barwienie chromogeniczne próbki histologicznej szyjki macicy; Na Figurze 7 przedstawiono barwienie ciężkiej postaci dysplazji za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67 oraz skierowanych przeciwko p16 INK4a ; szczegóły dotyczące doświadczenia znaleźć można w Przykładzie 6. Immunoreaktywność wobec Ki67 daje czerwono zabarwione jądra, immunoreaktywność wobec p16 INK4a daje brązowawe zabarwienie całych komórek; podwójne barwienie daje w wyniku brązowe komórki z czerwonymi jądrami komórkowymi. Wiele komórek w obrębie dysplazji wykazuje barwienie jądra wobec Ki67, jak również pozytywny wynik barwienia wobec p16 INK4a i dlatego dają obraz brązowych komórek z czerwonymi jądrami. Figura 8: Podwójne barwienie chromogeniczne próbki cytologicznej szyjki macicy; Na Figurze 8 przedstawiono barwienie ciężkiej postaci dysplazji za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67 oraz skierowanych przeciwko p16 INK4a ; szczegóły dotyczące doświadczenia znaleźć można w Przykładzie 7. Immunoreaktywność wobec Ki67 powoduje czerwone zabarwienie jąder, immunoreaktywność wobec p16 INK4a daje brązowawe zabarwienie całych komórek; podwójne barwienie daje w wyniku brązowe komórki z czerwonymi jądrami. Wiele komórek w obrębie dysplazji wykazuje barwienie jądra wobec Ki67, jak również pozytywny wynik barwienia wobec p16 INK4a i dlatego dają obraz brązowych komórek z czerwonymi jądrami. Poniższe przykłady podane są tylko w celu zobrazowania metody i nie mają służyć ograniczeniu celu metody przedstawianego w niniejszym dokumencie. W celu zobrazowania metody, przedstawione zostały przy użyciu preparatów histologicznych. Przykłady histologiczne pomagają ocenić, czy

15 PL B1 15 komórki barwione w taki czy inny sposób powinny być sklasyfikowane jako dysplastyczne czy metaplastyczne. Metody te można łatwo przenieść na próbki cytologiczne zmieniając w odpowiedni sposób protokół. Zmiany te są znane specjalistom w dziedzinie. P r z y k ł a d 1: Wykrywanie nadekspresji p16 INK4a oraz Ki-67 w próbkach z szyjki macicy za pomocą immunofluorescencji (podwójne barwienie) Skrawki próbek tkankowych z szyjki macicy utrwalone w formalinie oraz zatopione w parafinie zostały poddane barwieniu immunofluorescencyjnemu za pomocą przeciwciał typowych dla p16 INK4a oraz Ki67. Skrawki tkanki uwodniono poprzez inkubację w ksylenie oraz w alkoholu etylowym o wzrastającym stężeniu i przeniesiono do Aqua bidest. Wyszukiwanie antygenów przeprowadzano w 10 mm buforze cytrynianowym (ph 6,0) dla p16 INK4a oraz Ki67. W tym celu skrawki ogrzano w łaźni wodnej przez 40 min w temperaturze 95 C - 98 C, a następnie schłodzono do temperatury pokojowej przez 20 minut, przeniesiono do buforu płuczącego (50 mm Tris-HCl, 150 mm NaCl, 0,05% Tweed 20 / DakoCytomation: kod nr: S3006). Aby uniknąć niespecyficznego wiązania przeciwciał drugorzędowych (gatunek: koza) próbki inkubowano z 10% surowicą kozią przez 30 min w temperaturze pokojowej. Skrawki inkubowano z przeciwciałami pierwszorzędowymi, przeciwciała mysie skierowane przeciwko ludzkiemu p16 INK4a (3,48 µg/ml) oraz przeciwciała królicze przeciwko Ki67 (1:25), przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie wypłukano buforem płuczącym i umieszczono w świeżym roztworze na 5 min. Nadmiar buforu odlano i każdą próbkę zalano 200 µl odczynnika drugorzędowego, zawierającego przeciwciała kozie skierowane przeciwko przeciwciałom mysim (goat antimouse antibody) skoniugowane z AlexaFluor 488 oraz przeciwciała kozie skierowane przeciwko przeciwciałom króliczym (goat anti rabbit antibody) skoniugowane z AlexaFluor 546 i inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej. Następnie, skrawki wypłukano dwa razy jak uprzednio i osadzono na szkiełku podstawowym za pomocą specjalnego mounting medium do fluorescencji. Ocena mikroskopowa szkiełek wykazuje, że komórki immunoreaktywne wobec p16 INK4a oraz wobec Ki67 można znaleźć wyłącznie w próbkach, które można zidentyfikować mikroskopowo jako próbki zmian dysplastycznych. Komórki barwione za pomocą reakcji specyficznej wobec p16 INK4a, pochodzące ze zmian metaplastycznych nie barwią się w reakcji specyficznej wobec Ki67. Ocena mikroskopowa barwienia markera proliferacji komórkowej wykazuje, że komórki metaplastyczne wykazują nadekspresję p16 INK4a i nie są immunoreaktywne dla przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67. Próbki zawierające obszary tkanki dysplastycznej zawierają natomiast komórki wykazujące immunoreaktywność wobec Ki67 oraz wobec przeciwciał skierowanych przeciwko p16 INK4a. Tak więc, w przeciwieństwie do dysplazji, w metaplazji żadne komórki nie wykazują podwójnego barwienia za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67 oraz p16 INK4a. Na figurach 1-6 przedstawiono wyniki barwienia tkanek szyjki macicy wykazujących ciężką dysplazję oraz metaplazję łuskowatą, za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67 oraz przeciwko p16 INK4a. Immunoreaktywność wobec Ki67 daje czerwoną fluorescencję, immunoreaktywność wobec p16 INK4a daje zieloną fluorescencję, a nałożenie czerwonej i zielonej fluorescencji daje fluorescencję żółtą. W próbce dysplastycznej (Fig. 1-3) wiele komórek dysplazji wykazuje barwienie jądra na Ki67 jak również na p16 INK4a i dlatego daje żółtą fluorescencję (patrz Figura 3). Przeciwnie, w próbce metaplastycznej (Fig. 4-6) obszary wykazujące ekspresję p16 INK4a nie wykazują barwienia na Ki67, co wskazuje na brak ekspresji antygenu w tych obszarach. W tej próbce można obserwować podwójne barwienie (Fig. 6) i dlatego żadne komórki w próbce nie dają żółtej fluorescencji. Wyniki wskazują, że podwójne barwienie komórek z wykorzystaniem odczynników specyficznych wobec Ki67 pozwala na rozróżnienie nadekspresji p16 INK4a w zmianach metaplastycznych i w zmianach dysplastycznych. P r z y k ł a d 2: Wykrywanie komórek wykazujących jednoczesną ekspresję p14arf oraz mcm2 w próbkach z szyjki macicy, za pomocą hybrydyzacji in-situ Rozmazy z szyjki macicy można przeanalizować w sposób półilościowy pod względem poziomu mrna p16 INK4a oraz mcm2 w reakcji barwienia in-situ. Reakcja barwienia wykonywana jest w następujący sposób: W celu uwodnienia, rozmazy utrwalone sprayem inkubowane są w świeżym 50% alkoholu etylowym na urządzeniu wahadłowym. Warstwa PEG powstała w trakcie procedury utrwalania usuwana jest poprzez intensywne płukanie. Następnie rozmazy płukane są w aqua bidest. Rozmazy inkubowano są z proteinazą K (10 µg/ml w PBS) przez 10 min w temperaturze 37 C. Następnie preparaty prze-

16 16 PL B1 noszone są do buforu płuczącego (PBS/0,1% Tweed 20) a w końcu obszar zawierający komórki otaczany jest za pomocą lipid-pencil. Mieszanina hybrydyzacyjna przygotowywana jest poprzez zmieszanie 50 µl gotowego do użycia buforu do hybrydyzacji (DAKO A/S, Glostrup, Dania) oraz około 5-10 pmol sond. Sondy są to oligonukleotydy znakowane biotyną i digoksygeniną o sekwencjach komplementarnych do odpowiednich mrna. Mieszanina hybrydyzacyjna ogrzewana jest do temperatury 95 C a następnie schładzana do temperatury 37 C. Po procedurze gotowania, rozmazy inkubowane są z 50 µl mieszaniny hybrydyzacyjnej przez 4 godziny w temperaturze 42 C. Próbki płukane są w nadmiarze objętości buforu płuczącego dwa razy w 2 x SSC w temperaturze 37 C przez 15 min i raz w 1 x SSC w temperaturze 37 C przez 15 min. Następnie rozmazy przepłukiwane są dwa razy w temperaturze pokojowej w 2 x SSC. Po tej procedurze płukania, preparaty inkubowane są przez 30 min z buforem blokującym (NEN, Blockingbuffer) w temperaturze pokojowej. Następnie inkubowane są przez 1 godzinę z rozcieńczonym 1:100 (w roztworze blokującym, patrz wyżej) kompleksem fosfataza alkaliczna - streptawidyna oraz z monoklonalnymi przeciwciałami mysimi znakowanymi HRP skierowanymi przeciwko digoksygeninie (Molecular Probes). Rozmazy są następnie płukane kolejno 2 razy w 1 x PBS/0,1% Tryton X-100 przez 10 min w temperaturze pokojowej oraz jeden raz w 1 x PBS, 50 mm MgCl 2 (ph 9,2) przez 10 min, w temperaturze pokojowej. Dalej przeprowadzana jest reakcja barwienia z fosforanem ELF 97 (Molecular Probes) przez 10 sekund do 7 minut, w temperaturze pokojowej. Nadmiar substratu jest wymywany 3 razy za pomocą 1 x PBS/0,1% Tryton X-100 przez 10 min w temperaturze pokojowej. W drugim etapie barwienia, preparaty inkubowane są w Tyramides-Alexa-Fluor 594 przez 10 sekund do 7 minut. Nadmiar substratu wymywany jest 3 razy za pomocą 1 x PBS/0,1% Tryton X-100 przez 10 min w temperaturze pokojowej. Wreszcie rozmazy zanurzane są w destylowanej H 2 O i zatapiane w mounting medium do fluorescencji (DakoCytomation). Następnie zabarwione preparaty można oceniać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ocena mikroskopowa preparatów pokazuje, że komórki wykazujące ekspresję p16 INK4a oraz mcm2 można znaleźć tylko w próbkach, które mikroskopowo można zidentyfikować jako próbki zmian dysplastycznych. Komórki barwione w reakcji specyficznej wobec p16!nk4a, które można zidentyfikować jako metaplazja, nie barwią się w reakcji specyficznej wobec mcm2. Ocena mikroskopowa hybrydyzacji mrna pokazuje, ze komórki metaplastyczne wykazujące nadekspresję p16 INK4a nie wykazują znacznej ekspresji mrna mcm2. Komórki dysplastyczne natomiast mogą być barwione w reakcji hybrydyzacji in-situ sondami specyficznymi dla mcm2 oraz sondami skierowanymi przeciwko p16 INK4a. Zatem, w przeciwieństwie do komórek dysplastycznych, w komórkach metaplastycznych nie stwierdza się podwójnego barwienia za pomocą sond specyficznych dla Ki67 oraz p16 INK4a. Wyniki wskazują, że podwójne barwienie komórek za pomocą odczynników specyficznych dla mcm2 pozwala na rozróżnienie zmian metaplastycznych, wykazujących nadekspresję p16 INK4a od zmian dysplastycznych. P r z y k ł a d 3: Wykrywanie nadekspresji p16 INK4a oraz Ki-S2 w próbkach z szyjki macicy, za pomocą immunofluorescencji (podwójne barwienie) Próbki cytologiczne pochodzące z szyjki macicy, utrwalone za pomocą Merckofix (typowe rozmazy oraz preparaty cytologiczne wykonane za pomocą metody ThinPreps ) wybarwiono immunofluorescencyjnie za pomocą przeciwciał specyficznych dla p16 INK4a oraz Ki-S2. Typowe rozmazy oraz próbki cytologiczne wykonane za pomocą metody ThinPreps uwodniono w etanolu (50%) przez 10 min i przeniesiono do Aqua bidest. Wyszukiwanie antygenów przeprowadzono w 10 mm buforze cytrynianowym (ph 6,0) dla p16 INK4a oraz Ki67. W tym celu preparaty ogrzano w łaźni wodnej przez 40 min w temperaturze 95 C - 98 C, a następnie schładzano do temperatury pokojowej prze 20 minut. Dalej preparaty przeniesiono do roztworu płuczącego (50 mm Tris- -HCl, 150 mm NaCl, 0,05% Tweed 20 / DakoCytomation: kod nr: S3006) i wreszcie próbki zakreślono za pomocą lipid-pencil. W celu uniknięcia niespecyficznego wiązania przeciwciał drugorzędowych (gatunek: koza), próbki inkubowano z 10% surowicą kozią przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Preparaty inkubowano następnie z przeciwciałami pierwszorzędowymi, przeciwciała mysie skierowane przeciwko ludzkiemu p16 INK4a (klon E6H4) (3,48 µg/ml) oraz przeciwciała królicze przeciwko Ki-S2 (1:25) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wypłukano preparaty buforem płuczącym i umieszczono w świeżym roztworze na 5 min. Nadmiar buforu odlano i każdą próbkę zalano 200 µl odczynnika drugorzędowego, zawierającego przeciwciała kozie skierowane przeciwko przeciwciałom mysim (goat anti-mouse antibody) skoniugowane z AlexaFluor 488 oraz przeciwciała kozie

17 PL B1 17 skierowane przeciwko przeciwciałom króliczym (goat anti rabbit antibody) skoniugowane z AlexaFluor 546 i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie preparaty wypłukano dwa razy tak jak uprzednio i osadzono na szkiełku podstawowym za pomocą specjalnego mounting medium do fluorescencji. Ocena mikroskopowa szkiełek pokazuje, że komórki wykazujące immunoreaktywność wobec p16 INK4a oraz wobec Ki-S2 można zidentyfikować mikroskopowo jako komórki dysplastyczne. Komórki barwione za pomocą reakcji specyficznej wobec p16 INK4a, które nie barwią się w reakcji specyficznej dla Ki-S2, mogą zostać sklasyfikowane przez doświadczonego patologa jako albo metaplastyczne albo pochodzenia endometrialnego. Ocena mikroskopowa barwienia markera proliferacji komórkowej wykazuje, że komórki metaplastyczne wykazujące nadekspresję p16 INK4a nie są immunoreaktywne wobec przeciwciał skierowanych przeciwko Ki-S2. Komórki dysplastyczne są immunoreaktywne wobec Ki-S2 oraz z przeciwciałami skierowanymi przeciwko p16 INK4a. Zatem, w przeciwieństwie do komórek dysplastycznych, w metaplazji żadne komórki nie wykazują podwójnego barwienia za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67 oraz p16 INK4a. Wyniki te pokazują, że podwójne barwienie komórek z wykorzystaniem odczynników specyficznych dla Ki-S2 pozwala na rozróżnienie komórek metaplastycznych wykazujących nadekspresję p16 INK4a od komórek dysplastycznych. P r z y k ł a d 4: Wykrywanie nadekspresji p16 INK4a, Ki67 oraz PCNA w próbkach pochodzących z popłuczyn z drzewa oskrzelowego od osób, u których rozpoznano raka drobnokomórkowego płuc, za pomocą immunofluorescencji (podwójne barwienie) Komórki zawarte w próbkach popłuczyn z drzewa oskrzelowego przygotowano zgodnie z technologią ThinPrep. Próbki cytologiczne popłuczyn od pacjentów, u których rozpoznano raka drobnokomórkowego płuc, utrwalone za pomocą Merckofix, poddane zostały barwieniu immunofluorescencyjnemu za pomocą przeciwciał specyficznych dla p16 INK4a, Ki67 oraz PCNA. W tym doświadczeniu zastosowano procedurę, która nie rozróżnia barwienia pochodzącego z immunoreaktywności dwóch markerów proliferacji PCNA i Ki67. W kontekście niniejszej metody, nie jest konieczna odpowiedź na pytanie czy komórki wykazują ekspresję, któregoś z markerów proliferacji. Głównym pytaniem jest, czy komórki wykazują ekspresję jakiegokolwiek markera. Wobec tego w trakcie eksperymentów wybrano procedurę, która daje taki sam sygnał fluorescencji jako świadectwo obecności markera proliferacji. Procedura ta służy do zwiększenia czułości wykrywania cech proliferacji komórkowej. Zależnie od okoliczności, można zastosować procedurę, która daje jeden wykrywalny sygnał dla trzech, czterech lub nawet większej liczby cząstek markerowych, charakterystycznych dla proliferacji komórkowej. Analogicznie, to samo może w pewnych okolicznościach odnosić się do produktów ekspresji genu INK4a. Należy zrozumieć, że w zależności od okoliczności, pożądane może być zastosowanie różnych sygnałów barwienia dla różnych cząstek markerowych proliferacji. Procedury można stosować zależnie od potrzeb odpowiedniego eksperymentu. Skrawki tkanki uwodniono poprzez inkubację w ksylenie oraz w alkoholu etylowym o wzrastającym stężeniu i przeniesiono do Aqua bidest. Typowe rozmazy oraz próbki cytologiczne wykonane za pomocą metody ThinPreps uwodniono w etanolu (50%) przez 10 minut a następnie przeniesiono do Aqua bidest. Wyszukiwanie antygenów przeprowadzano w 10 mm buforze cytrynianowym (ph 6,0) dla p16 INK4a, Ki67 oraz PCNA. W tym celu preparaty ogrzano w łaźni wodnej przez 40 min w temperaturze 95 C - 98 C, a następnie schładzano do temperatury pokojowej przez 20 minut; przeniesiono do buforu płuczącego (50 mm Tris-HCl, 150 mm NaCl, 0,05% Tween 20/DakoCytomation: kod nr: S3006) i wreszcie próbki zakreślono za pomocą lipid-pencil. Aby uniknąć niespecyficznego wiązania przeciwciał drugorzędowych (gatunek: koza) próbki inkubowano z 10% surowicą kozią przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Preparaty inkubowano następnie z przeciwciałami pierwszorzędowymi, przeciwciała mysie skierowane przeciwko ludzkiemu p16 INK4a (3,48 µg/ml), przeciwciała królicze przeciwko Ki67 oraz przeciwciała królicze przeciwko PCNA (każde 1:25), przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie wypłukano skrawki buforem płuczącym i umieszczono w świeżym roztworze na 5 min. Nadmiar buforu odlano i każdą próbkę zalano 200 µl odczynnika drugorzędowego, zawierającego przeciwciała kozie skierowane przeciwko przeciwciałom mysim (goat anti-mouse antibody) skoniugowane z AlexaFluor 488 oraz przeciwciała kozie skierowane przeciwko przeciwciałom króliczym (goat anti rabbit antibody) skoniugowane z AlexaFluor 546 i inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej. Następnie preparaty wypłukano dwa razy jak uprzednio i osadzono na szkiełku podstawowym za pomocą specjalnego mounting medium do fluorescencji.

18 18 PL B1 Ocena mikroskopowa szkiełek pokazuje, że komórki wykazujące immunoreaktywność wobec p16 INK4a oraz wobec Ki67 lub PCNA można zidentyfikować w sposób mikroskopowy jako komórki raka drobnokomórkowego płuc. Komórki wybarwione za pomocą reakcji specyficznej wobec p16 INK4a, pochodzące ze zmian metaplastycznych nie barwią się w reakcji specyficznej wobec Ki67 oraz PCNA. Ocena mikroskopowa barwienia markera proliferacji komórkowej wykazuje, że komórki metaplastyczne wykazujące nadekspresję p16 INK4a nie są immunoreaktywne dla przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67 i PCNA. Próbki zawierające komórki dysplastyczne zawierają natomiast komórki wykazujące immunoreaktywność wobec Ki67/PCNA oraz wobec przeciwciał skierowanych przeciwko p16 INK4a. Zatem, w przeciwieństwie do dysplazji, w metaplazji żadne komórki nie wykazują potrójnego barwienia za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67 i PCNA oraz p16 INK4a. Wyniki wskazują, że potrójne barwienie komórek za pomocą odczynników specyficznych dla Ki67/PCNA pozwala rozróżnić komórki nie-dysplastyczne wykazujące nadekspresję p16 INK4a od dysplazji. P r z y k ł a d 5: Wykrywanie komórek dysplastycznych metodą cytometrii przepływowej poprzez jednoczesne wykrywanie mcm5 mrna, białka p14arf oraz białka Ki67 w komórkach szyjki macicy Próbki cytologiczne (zawiesina komórek w PBS, ph 7,4) szyjki macicy zostały wybarwione fluorescencyjnie za pomocą przeciwciał specyficznych dla p14arf i Ki-67 oraz oligosond dla mcm5 i ocenione za pomocą trójkolorowej analizy fluorescencyjnej FACS. Komórki zostały odwirowane, supernatant zlano, a komórki utrwalono i dokonano ich permeabilizacji przy użyciu Permafix (Ortho Diagnostic, Raitan, NJ, USA), przez 1 godzinę, w temperaturze pokojowej. Komórki wypłukano w sterylnym PBS, ph 7,4, zwirowano i ponownie zawieszono w 100 ml Permeafix na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Komórki wypłukano w sterylnym PBS, ph 7,4, zwirowano i ponownie zawieszono w sterylnym PBS. Następnie poddano ją inkubacji z przeciwciałem skoniugowanym z PE, skierowanym przeciwko p14arf oraz przeciwciałem skoniugowanym z PE-Cy5 skierowanym przeciwko Ki67, przez 1 godzinę, w temperaturze +4 C. Komórki wypłukano w sterylnym PBS, ph 7,4, zwirowano i zawieszono w 100 ml Permeafix na 30 minut w temperaturze pokojowej. Komórki wypłukano w sterylnym PBS, odwirowano, a następnie wypłukano ponownie w 2x standardowym cytrynianie soli (standard saline citrate, SSC). Po odwirowaniu, osad komórkowy zawieszono w roztworze hybrydyzacyjnym (2x SSC, 30% formamid, sonicated salmon sperm, drożdże transferujące DNA) zawierającym 500 ng sond oligonukleotydowych specyficznych wobec mcm5 podwójnie znakowanych za pomocą 5-karboksy-fluoresceiny. Hybrydyzacja wewnątrzkomórkowa przeprowadzana była w temperaturze 42 C przez 1 godzinę, a następnie dokonano płukania w 2x SSC, 0,5% Tryton X- 100 oraz 1 x SSC, 0,5% Tryton X-100 w temperaturze 42 C. Komórki zawieszono do analizy w PBS, ph 8,3 i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej (FACScan, Becton Dickinson, IS). Dla każdej analizy zebrano zdarzeń bramkowanych. Analizę danych przeprowadzono za pomocą CellQuest (Becton Dickinson, IS). Analiza za pomocą cytometrii przepływowej wykazuje, że komórki immunoreaktywne z p14arf i jednocześnie immunoreaktywne wobec Ki-67 i/lub reaktywne wobec oligosond mcm5 mogą być zidentyfikowane tylko w próbkach pacjentów ze zmianami dysplastycznymi w szyjce macicy. Próbki od kobiet, u których nie występują zmiany dysplastyczne nie wykazywały żadnego jednoczesnego barwienia wobec p14arf oraz Ki67 lub mcm5. Wyniki te wskazują, że podwójne lub potrójne barwienie komórek za pomocą odczynników specyficznych wobec Ki67 i/lub mcm5 pozwala na rozróżnienie komórek nie-dysplastycznych wykazujących nadekspresję p14arf od komórek dysplastycznych wykazujących nadekspresję p14arf. P r z y k ł a d 6: Immunoenzymatyczne wykrywanie nadekspresji p16 INK4a i Ki67 w próbach histologicznych szyjki macicy (kolejne podwójne barwienie) Fragmenty utrwalone w formalinie, próby tkanek z szyjki macicy zanurzone w parafinie poddawano immunoenzymatycznemu podwójnemu barwieniu stosując przeciwciała swoiste wobec p16 INK4a i Ki67. Skrawki tkanki uwodniono poprzez inkubację w ksylenie oraz w alkoholu etylowym o wzrastającym stężeniu i przeniesiono do Aqua bidest. Wyszukiwanie antygenów przeprowadzano w 10 mm buforze cytrynianowym (ph 6,0) dla p16 INK4a i Ki67. W tym celu preparaty ogrzewano w łaźni wodnej przez 40 min w temperaturze 95 C - 98 C, a następnie schładzano do temperatury pokojowej przez 20 minut; przeniesiono do buforu płuczącego (DakoCytomation). Aktywność endogennej peroksydazy blokowano stosując 3% H 2 O 2 (DakoCytomation) przez 5 min w temperaturze pokojowej.

19 PL B1 19 Po przemyciu preparatów przez 5 min w temperaturze pokojowej, były one inkubowane przez 30 minut w temperaturze pokojowej z przeciwciałami pierwszorzędowymi, przeciwciałami mysimi skierowanymi przeciwko ludzkiemu p16 INK4a (MTM), a następnie przemywane buforem płuczącym i umieszczane w świeżym buforze na 5 minut. Nadmiar buforu odlewano i każdą próbkę zalewano 200 µl odczynnika drugorzędowego (EnVision przeciwciało kozie skierowane przeciwko mysiemu skoniugowane z perosydazą/ DakoCytomation) i inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej. Następnie, jak uprzednio, preparaty przepłukano trzy razy. Do uwidocznienia obrazu chromogenicznego zastosowano DAB (DakoCytomation), inkubując szkiełka wraz z kompleksem chromogenicznego substratu przez 10 min w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymywano w dejonizowanej wodzie i szkiełka umieszczano w buforze płuczącym. Po przemyciu preparatów, inkubowane były przez 30 minut w temperaturze pokojowej z przeciwciałami drugorzędowymi, przeciwciałami króliczymi skierowanymi przeciwko przeciwciału ludzkiemu pki67 (Dianova, klon Ab-3), a następnie przemywane buforem płuczącym i umieszczane w świeżym buforze na 5 minut. Nadmiar buforu odlewano i każdą próbkę zalewano 200 µl odczynnika drugorzędowego (przeciwciało kozie skierowane przeciwko króliczemu znakowane alkaliczną fosfatazą/dakocytomation) i inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej. Następnie, jak uprzednio, preparaty przepłukano trzy razy. Do uwidocznienia obrazu chromogenicznego zastosowano FastRed (BioGenex), inkubując szkiełka wraz z kompleksem chromogenicznego substratu przez 30 min w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymywano w dejonizowanej wodzie. Po 2 minutowym w temperaturze pokojowej barwieniu kontrastowym z użyciem hematoksyliny (DakoCytomation), preparaty inkubowano pod bieżącą wodą przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie osadzano na szkiełku za pomocą wodnego podłoża wiążącego (Aquatex/ MERCK). Ocena mikroskopowa szkiełek pokazuje, że komórki wykazujące immunoreaktywność wobec p16 INK4a oraz wobec Ki67 znajdują się jedynie w próbach, które zostały zidentyfikowane za pomocą badania mikroskopowego jako próby pochodzące z obszaru zmian dysplastycznych. Komórki wybarwione w reakcji specyficznej wobec p16 INK4a, pochodzące ze zmian metaplastycznych nie ulegały barwieniu w reakcji specyficznej dla Ki67. Ocena mikroskopowa barwienia markera proliferacji komórkowej wykazuje, że komórki metaplastyczne wykazujące nadekspresję p16 INK4a nie są immunoreaktywne wobec przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67. Próbki zawierające obszary tkanki dysplastycznej zawierają natomiast komórki wykazujące immunoreaktywność wobec Ki67 oraz wobec przeciwciał skierowanych przeciwko p16 INK4a. Zatem, w przeciwieństwie do dysplazji, w metaplazji żadne komórki nie wykazują podwójnego barwienia za pomocą przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67 oraz p16 INK4a. Wyniki przedstawione na Figurze 7 wskazują na to, że podwójne barwienie komórek z użyciem odczynników swoistych dla Ki67 oraz p16 INK4a pozwala na uzyskanie specyficznego obrazu podwójnego barwienia również w metodach barwienia chromogenicznego. P r z y k ł a d 7: Immunoenzymatyczne wykrywanie nadekspresji p16 INK4a i Ki67 w próbach cytologicznych szyjki macicy (kolejne podwójne barwienie) Próby cytologiczne utrwalone Merckofix (konwencjonalnie stosowane w cytologii rozmazy i płyny (ThinPreps )) pochodzące z szyjki macicy barwiono podwójnie metodą immunoenzymatyczną, stosując przeciwciała swoiste dla p16 INK4a i Ki67. Konwencjonalnie stosowane w cytologii próby rozmazów i płynów uwodniono w alkoholu etylowym (50%) przez 10 min w temperaturze pokojowej i przeniesiono do Aqua bidest. Wyszukiwanie antygenów dla p16 INK4a i Ki67 przeprowadzano w 10 mm buforze cytrynianowym (ph 6,0). W tym celu preparaty ogrzano w łaźni wodnej przez 40 min w temperaturze 95 C - 98 C, a następnie schładzano do temperatury pokojowej przez 20 minut; przeniesiono do buforu płuczącego. Aktywność endogennej peroksydazy blokowano stosując 3% H 2 O 2 przez 5 min w temperaturze pokojowej. Po przemyciu preparatów, były one inkubowane przez 30 minut w temperaturze pokojowej z pierwszym przeciwciałem pierwszorzędowym, przeciwciałem mysim skierowanym przeciwko ludzkiemu p16 INK4a, a następnie przemywane buforem płuczącym i umieszczane w świeżym buforze na 5 minut. Nadmiar buforu odlewano i każdą próbkę zalewano 200 µl odczynnika drugorzędowego (EnVision przeciwciało kozie skierowane przeciwko mysiemu skoniugowane z perosydazą) i inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej. Następnie, jak uprzednio, preparaty przepłukano trzy razy. Do uwidocznienia obrazu chromogenicznego zastosowano DAB (DakoCytomation), inkubując

20 20 PL B1 szkiełka wraz z kompleksem chromogenicznego substratu przez 10 min w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymywano w dejonizowanej wodzie i szkiełka umieszczano w buforze płuczącym. Po przemyciu preparatów, były one inkubowane przez 30 minut w temperaturze pokojowej z drugim przeciwciałem pierwszorzędowym, przeciwciałem króliczym skierowanym przeciwko przeciwciału ludzkiemu pki67 (Dianova, klon Ab-3), a następnie przemywane buforem płuczącym i umieszczane w świeżym buforze na 5 minut. Nadmiar buforu odlewano i każdą próbkę zalewano 200 µl odczynnika drugorzędowego (przeciwciało kozie skierowane przeciwko króliczemu znakowane alkaliczną fosfatazą/dakocytomation) i inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej. Następnie, jak uprzednio, preparaty przepłukano trzy razy. Do uwidocznienia obrazu chromogenicznego zastosowano FastRed (BioGenex), inkubując szkiełka wraz z kompleksem chromogenicznego substratu przez 30 min w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymywano w dejonizowanej wodzie. Po 2 minutowym w temperaturze pokojowej barwieniu kontrastowym z użyciem hematoksyliny (DakoCytomation), preparaty inkubowano pod bieżącą wodą przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie osadzano na szkiełku za pomocą wodnego podłoża wiążącego (Aquatex/ MERCK). Ocena mikroskopowa szkiełek pokazuje, że komórki wykazujące immunoreaktywność wobec p16 INK4a oraz wobec Ki67 mogą być zidentyfikowane na podstawie ich morfologii jako próby pochodzące z obszaru zmian dysplastycznych. Komórki wybarwione w reakcji specyficznej wobec p16 INK4a, pochodzące ze zmian metaplastycznych nie ulegały barwieniu w reakcji specyficznej dla Ki67. Ocena mikroskopowa barwienia markera proliferacji komórkowej wykazuje, że komórki metaplastyczne wykazujące nadekspresję p16 INK4a nie są immunoreaktywne dla przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67. W przeciwieństwie do nich, komórki dysplastyczne są immunoreaktywne wobec przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67 i wobec przeciwciał skierowanych przeciwko p16 INK4a. Zatem, w przeciwieństwie do komórek metaplastycznych, w przypadku komórek dysplastycznych, możliwe jest podwójne barwienie pojedynczych komórek za pomocą swoistych przeciwciał skierowanych przeciwko Ki67 oraz p16 INK4a. Wyniki przedstawione na Figurze 8 wskazują na to, że podwójne barwienie komórek z użyciem odczynników swoistych dla Ki67 oraz p16 INK4a pozwala na uzyskanie specyficznego obrazu podwójnego barwienia również w metodach barwienia chromogenicznego. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób służący do rozróżniania komórek dysplastycznych wykazujących nadekspresję produktów genu INK4a od innych komórek wykazujących ekspresję produktów genu INK4a na poziomie wykrywalnym w próbkach biologicznych, obejmujący określanie za pomocą procedury cytologicznej lub histologicznej ekspresji cząstek markerowych, znamienny tym, że określa się jednoczesną ekspresję co najmniej dwóch cząstek markerowych, w co najmniej jednej pojedynczej komórce, gdzie co najmniej jedna cząsteczka markerowa jest produktem ekspresji genu INK4a wybranego z grupy obejmującej p16 INK4a i p14arf i co najmniej jedna inna cząsteczka markerowa jest markerem proliferacji komórkowej, a marker proliferacji komórkowej wybrany jest z grupy obejmującej marker proliferacji konieczny do utrzymania proliferacji komórkowej, marker proliferacji biorący udział w replikacji DNA, marker proliferacji wchodzący w skład widełek replikacyjnych lub kodujący białko wchodzące w skład widełek replikacyjnych, marker starzenia komórkowego, marker zatrzymania cyklu komórkowego i marker apoptozy, przy czym nadekspresja co najmniej jednego produktu genu INK4a wybranego z grupy obejmującej p16 INK4a i p14arf i ekspresja na poziomie wykrywalnym co najmniej jednego markera aktywnej proliferacji komórkowej, w obrębie rzeczonej pojedynczej komórki wskazuje na stan dysplastyczny komórki, a nadekspresja co najmniej jednego produktu genu INK4a wybranego z grupy obejmującej p16 INK4a i p14arf i ekspresja na poziomie wykrywalnym co najmniej jednego markera starzenia, krańcowego różnicowania komórkowego, apoptozy lub zahamowania cyklu komórkowego, w obrębie rzeczonej pojedynczej komórki wskazuje na nie-dysplastyczny stan komórki. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wykrywany jest zestaw dwóch lub więcej markerów proliferacji komórkowej. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że co najmniej jeden produkt genu INK4a ma masę cząsteczkową pomiędzy i Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że produkt genu koniecznego do utrzymania proliferacji komórkowej jest cząsteczką wybraną z grupy obejmującej cząsteczki Ki67, Ki-S5 oraz Ki-S2.

21 PL B Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że produkt genu biorący udział w replikacji DNA jest wybrany z grupy obejmującej helikazy lub ich podjednostki, cząsteczki cyklu podziałowego komórki (cell division cycle, cdc), cząsteczki fosfataz i cząsteczki kinaz. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że helikazy lub ich podjednostki wybrane są z grupy obejmującej MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7 oraz HELAD1. 7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że cząsteczki cdc, kinazy i fosfatazy wybrane są z grupy obejmującej CDC6, kinezę białkową CDC7, Dbf4, fosfatazę białkową CDC14, CDC45 oraz MCM Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że cząsteczki wchodzące w skład widełek replikacyjnych wybrane są z grupy obejmującej PCNA i POLD. 9. Sposób według jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 8, znamienny tym, że produkt genu jest polipeptydem lub cząsteczką kwasu nukleinowego. 10. Sposób według jakiegokolwiek z powyższych zastrz., znamienny tym, że dodatkowo wykrywana jest co najmniej jedna cząsteczka markerowa w celu poprawy oceny diagnozy lub prognozy. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że dodatkowa cząsteczka markerowa jest co najmniej jedną dodatkową cząsteczką markerową proliferacji. 12. Sposób według zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że dodatkowa cząsteczka markerowa wybrana jest z grupy obejmującej marker starzenia, marker apoptozy, marker zahamowania cyklu komórkowego, marker końcowego różnicowania się komórek, marker zakażenia wirusowego, marker aktywności wirusowej, białko regulatorowe cyklu komórkowego, produkt genu konieczny do utrzymania proliferacji komórkowej, produkt genu biorący udział w replikacji DNA, produkt genu wchodzący w skład widełek replikacyjnych. 13. Sposób według jakiegokolwiek z powyższych zastrz., znamienny tym, że dodatkowo stosowana jest procedura barwienia cytologicznego wykorzystująca co najmniej jeden barwnik z grupy obejmującej DAPI, Quinacrin, chromomycynę, Alan, oranż akrydyny, hematoksylinę, eozynę, czerwień Sudan, błękit toluidyny oraz tioninę lub metodę barwienia wybraną z grupy obejmującej barwienie Pap, barwienie Giemza, barwienie metodą hematoksylina-eozyna, barwienie van-gieson, barwienie Schiff, barwienie za pomocą precypitatów metali, barwienie błękitem Tumbulls oraz barwienie za pomocą cyjanków metali. 14. Sposób według jakiegokolwiek z powyższych zastrz., znamienny tym, że komórki dysplastyczne są komórkami zmian rakowych lub przedrakowych. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że komórki dysplastyczne pochodzą z dysplazji związanej z zakażeniem wirusem brodawczaka. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że wirus brodawczaka jest wirusem brodawczaka o wysokim stopniu ryzyka wybranym z grupy obejmującej HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 66 oraz HPV Sposób według jakiegokolwiek z zastrz. od 14 do 16, znamienny tym, że zmiana wybrana jest z grupy obejmującej zmiany okolicy odbytowo-płciowej, zmiany dróg oddechowych oraz zmiany skóry i jej przydatków. 18. Sposób według jakiegokolwiek z zastrz. od 15 do 17, znamienny tym, że zmiana wybrana jest z grupy obejmującej zmiany pochodzące z szyjki macicy, pochwy, sromu, prącia, odbytu, odbytnicy, drzewa oskrzelowego, płuc, przestrzeni otrzewnowej, jamy nosowo-gardłowej, jamy ustnej lub skóry. 19. Sposób według jakiegokolwiek z powyższych zastrz., znamienny tym, że próbka biologiczna jest próbką obejmującą komórki pochodzące z okolicy odbytowo-płciowej, z układu oddechowego lub ze skóry i jej przydatków. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że komórki są komórkami pochodzącymi z szyjki macicy, pochwy, sromu, prącia, odbytu, odbytnicy, drzewa oskrzelowego, płuc, jamy nosowo- -gardłowej, jamy ustnej lub ze skóry. 21. Sposób według jakiegokolwiek z powyższych zastrz., znamienny tym, że próbka biologiczna jest preparatem cytologicznym lub histologicznym. 22. Sposób według jakiegokolwiek z powyższych zastrz., znamienny tym, że detekcja produktów genu INK4a i/lub cząstek markera proliferacji komórkowej wykonywana jest za pomocą co najmniej jednej sondy specyficznie rozpoznającej co najmniej jedną z cząstek, które mają być wykryte. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że co najmniej jedna sonda jest znakowana w sposób możliwy do wykrycia.

22 22 PL B1 24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że co najmniej jeden znacznik jest radioizotopem, związkiem bioluminescencyjnym, związkiem chemiluminescencyjnym, związkiem fluorescencyjnym, związkiem chelatowym metalu lub enzymem. 25. Sposób według jakiegokolwiek z zastrz. od 22 do 24, znamienny tym, że co najmniej jedna sonda jest białkiem i/lub kwasem nukleinowym. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że co najmniej jedna sonda jest przeciwciałem skierowanym przeciwko produktowi genu kodowanego przez INK4a lub produktem genu markera proliferacji komórkowej. 27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że obejmuje procedurę barwienia immunocytochemicznego. 28. Sposób według zastrz. 23 albo 24, znamienny tym, że co najmniej jedna sonda jest kwasem nukleinowym hybrydyzującym specyficznie z produktem genu INK4a lub produktem genu markera proliferacji komórkowej. 29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że obejmuje reakcje hybrydyzacji in situ. 30. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że obejmuje reakcje amplifikacji kwasu nukleinowego. 31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, że reakcją amplifikacji kwasu nukleinowego jest PCR, NASBA lub LCR. 32. Sposób według jakiegokolwiek z powyższych zastrz., znamienny tym, że reakcje detekcji wykorzystujące sondy kwasu nukleinowego oraz sondy polipeptydowi przeprowadzane są jednocześnie. 33. Zestaw do przeprowadzania sposobu jak zdefiniowano w jednym z powyższych zastrzeżeń, znamienny tym, że jest zestawem diagnostycznym lub badawczym, zawierającym co najmniej jedną sondę, służącą do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu nadekspresji co najmniej jednego produktu genu INK4a wybranego z grupy obejmującej p16 INK4a i p14arf, i co najmniej jednego produktu genu markera proliferacji komórkowej w próbkach biologicznych, przy czym marker proliferacji komórkowej wybrany jest z grupy obejmującej marker proliferacji konieczny do utrzymania proliferacji komórkowej, marker proliferacji biorący udział w replikacji DNA, marker proliferacji wchodzący w skład widełek replikacyjnych lub kodujący białko wchodzące w skład widełek replikacyjnych, marker starzenia komórkowego, marker zatrzymania cyklu komórkowego i marker apoptozy. 34. Zestaw według zastrz. 33, znamienny tym, że produkty genu markera proliferacji komórkowej są wybierane z grupy obejmującej CDC6, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7, kinazę białkową CDC7, Dbf4, fosfatazę białkową CDC14, CDC45 oraz MCM10, Ki67, Ki-S2, PCNA lub POLD. 35. Zestaw według jakiegokolwiek z zastrz. od 33 do 34, znamienny tym, że zawiera dodatkowo co najmniej jeden z poniższych elementów: a. próbkę p16 INK4a do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej b. próbkę p14arf do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej c. próbkę Ki67 do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej d. próbkę Ki-S2 do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej e. próbkę MCM5 do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej f. próbkę MCM2 do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej g. próbkę PCNA do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej h. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu p16 INK4a i. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu p14arf j. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu Ki67 k. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu Ki-S2 l. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu MCM5 m. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu MCM2 n. odczynniki do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu PCNA o. jedną lub więcej próbek produktów genu INK4a do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej p. jedną lub więcej próbek produktów genu markera proliferacji komórkowej do przeprowadzenia reakcji kontroli dodatniej q. jeden lub więcej odczynników do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu produktów genu INK4a r. i jeden lub więcej odczynników do wykrywania obecności lub braku i/lub poziomu innych produktów genu markera proliferacji komórkowej.

23 PL B1 23 Rysunki

24 24 PL B1

25 PL B1 25

26 26 PL B1

27 PL B1 27

28 28 PL B1

29 PL B1 29

30 30 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)