(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/DE99/02094 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/DE99/02094 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO00/01845 PCT Gazette nr 02/00 (51) Int.Cl. G01N 33/574 ( ) (54) Metoda wczesnego diagnozowania nowotworów (30) Pierwszeństwo: ,DE, (73) Uprawniony z patentu: Von Knebel Doeberitz Magnus,Heidelberg,DE DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM STIFTUNG DES OFFENTLICHEN RECHTS,Heidelberg,DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 26/01 (72) Twórca(y) wynalazku: Magnus von Knebel Doeberitz,Heidelberg,DE Dimitry Spitkovsky,Köln,DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 07/08 (74) Pełnomocnik: Rafał Witek, WITEK*TWARDOWSKA*ŚNIEŻKO, Kancelaria Rzeczników Patentowych PL B1 (57) 1. Sposób wczesnego diagnozowania nowotworów i ich prekursorów, znamienny tym, że obejmuje ustalenie nadekspresji białka regulacyjnego cyklu komórkowego w próbce ciała, a białko regulacyjne cyklu komórkowego jest inhibitorem kinazy zależnej od cykliny. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nowotwory są nowotworami górnych dróg oddechowych. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nowotwory są nowotworami dróg odbytowo - płciowych. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że nowotwór dróg odbytowo - płciowych jest rakiem szyjki macicy. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inhibitorem kinazy zależnej od cykliny jest białko p14, p15, p16, p19, p21 albo p Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbką ciała jest krew, wymazy, plwocina, mocz, kał, płyn, żółć, szpik kostny, wydzielina żołądkowo-jelitowa, punktaty lub aspiraty z narządów i biopsje, odpowiednio, i/albo limfa.

2 2 PL B1 Opis wynalazku Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wczesnego diagnozowania nowotworów, jak również ich stadiów wstępnych, a w szczególności nowotworów górnych dróg oddechowych lub dróg odbytowo - płciowych. Programy zapobiegawcze są oferowane dla większości różnorodnych nowotworów od połowy lat 50-tych. Jeśli chodzi o raka szyjki macicy, opierają się one głównie o badania morfologiczne i cytologiczne wymazów cytologicznych z szyjki macicy, co jest nazywane testem Pap, który wykonuje się na podstawie rutynowych badań ginekologicznych w regularnych odstępach czasu u kobiet powyżej dwudziestego roku życia. Na podstawie morfologii komórek wymazy dzieli się na różne stopnie nasilenia dysplastycznych zmian komórkowych. Zgodnie z Pap I - V, te stopnie nasilenia określa się jako stan normalny, łagodną dysplazję, dość poważną dysplazję, poważną dysplazję i nowotwór inwazyjny, odpowiednio. Jeżeli testy Pap prowadzą do widocznego wyniku, wykonuje się niewielką biopsję i poddaje się ją badaniu histopatologicznemu, na podstawie którego określa się rodzaj i intensywność dysplazji i klasyfikuje się jako powstawanie nowotworu śródbłonka szyjki macicy (CINI - III). Pomimo wszystkich programów zapobiegawczych rak szyjki macicy, który prowadzi do nowych zachorowań na rok jest najczęściej występującym nowotworem u kobiet. Dzieje się tak między innymi dlatego, że co najmniej 30% wyników jest fałszywie ujemnych. A zatem celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie sposobu, dzięki któremu nowotwory szyjki macicy mogą być diagnozowane wcześnie i wiarygodnie. Ponadto, możliwe powinno być rozróżnienie przy zastosowaniu tej metody łagodnych zmian zapalnych i zmian metaplastycznych przy dysplastycznych stanach przednowotworowych. Istota wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wczesnego diagnozowania nowotworów i ich prekursorów charakteryzujący się tym, że obejmuje ustalenie nadekspresji białka regulacyjnego cyklu komórkowego w próbce ciała, a białko regulacyjne cyklu komórkowego jest inhibitorem kinazy zależnej od cykliny. Korzystnie diagnozowane nowotwory są nowotworami górnych dróg oddechowych albo nowotworami dróg odbytowo - płciowych, w szczególności nowotwór dróg odbytowo - płciowych jest rakiem szyjki macicy. Korzystnie inhibitorem kinazy zależnej od cykliny jest białko p14, p15, p16, p19, p21 albo p27. Korzystnie próbką ciała jest krew, wymazy, plwocina, mocz, kał, płyn, żółć, szpik kostny, wydzielina żołądkowo - jelitowa, punktaty lub aspiraty z narządów i biopsje, odpowiednio i/albo limfa. Korzystnie nadekspresję ustala się na poziomie kwasu nukleinowego albo na poziomie białka, przy czym korzystnie do ustalania stosuje się przeciwciało skierowane przeciw białku regulacyjnemu cyklu komórkowego. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw do zastosowania sposobu według wynalazku charakteryzujący się tym, że zawiera: (a) odczynnik do wykrywania ekspresji białka regulacyjnego cyklu komórkowego, (b) konwencjonalne czynniki wspomagające, takie jak bufory, nośniki, markery, i ewentualnie (c) środki do kontrolowania reakcji. Korzystnie odczynnik jest przeciwciałem skierowanym przeciw białku regulacyjnemu cyklu komórkowego albo kwasem nukleinowym kodującym białko regulacyjne cyklu komórkowego lub jego części. Równie korzystnie środek jest białkiem regulacyjnym cyklu komórkowego albo kwasem nukleinowym kodującym to białko lub jego części, albo środkiem jest preparat komórkowy albo komórki utrwalone na szkiełku. Szczegółowe omówienie wynalazku Niniejszy wynalazek jest oparty o odkrycie zgłaszającego, że w wielu nowotworach ma miejsce nadekspresja białek regulacyjnych cyklu komórkowego, na przykład w nowotworach górnych dróg oddechowych lub nowotworach dróg odbytowo - płciowych, a w szczególności nowotworach szyjki macicy i wczesnych stadiach tych nowotworów, odpowiednio. Przykładami białek regulacyjnych cyklu komórkowego są cykliny. W szczególności należy wspomnieć kinazy zależne od cyklin, które regulują cykliny. Jeszcze bardziej godne uwagi są inhibitory kinaz zależnych od cyklin, które z kolei regulują kinazy zależne od cyklin. Przykładami inhibitorów kinaz zależnych od cyklin są białka p14, p15, p16, p19, p21 i p27. Zgłaszający stwierdzili, że intensywność nadekspresji białka regulacyjnego cyklu komórkowego koreluje ze stopniem dysplazji komórkowej.

3 PL B1 3 Według wynalazku odkrycie zgłaszającego ma zastosowanie w metodzie wczesnego diagnozowania nowotworów i ich stadiów wstępnych, która obejmuje określenie nadekspresji białek cyklu komórkowego w próbce ciała. Wyrażenie nowotwory i ich stadia wstępne obejmuje nowotwory dowolnego rodzaju i pochodzenia oraz ich stadia wstępne, odpowiednio. Przykładowo, mogą to być nowotwory górnych dróg oddechowych lub dróg odbytowo - płciowych. Wyrażenie nowotwory i ich stadia wstępne obejmuje nowotwory dowolnego rodzaju i pochodzenia oraz ich stadia wstępne, odpowiednio. Przykładowo, mogą to być nowotwory górnych dróg oddechowych lub dróg odbytowo - płciowych, a w szczególności raka szyjki macicy. W przypadku tego ostatniego należy wspomnieć w szczególności jego stadia wstępne, tj. powstawanie nowotworu śródbłonka szyjki macicy (CINI - III), nowotwór in situ (CIS), itd. Wyrażenie białka regulacyjne cyklu komórkowego obejmują białka regulacyjne cyklu komórkowego dowolnego rodzaju i pochodzenia. Przykładowo, białkami mogą być cykliny. W szczególności mogą to być kinazy zależne od cyklin, które regulują cykliny. Przykładami kinaz zależnych od cyklin są białka cdk4 i cdk6. Bardziej konkretnie, mogą być nimi inhibitory kinaz zależnych od cyklin, które z kolei regulują kinazy zależne od cyklin. Przykładami inhibitorów kinaz zależnych od cyklin są białka p14, p15, p16, p19, p21 i p27, przy czym najbardziej korzystne jest p16. Wyrażenie próbka ciała obejmuje dowolne próbki ciała, w których można wykryć białka regulacyjne cyklu komórkowego. Przykładami takich próbek ciała są krew, wymazy, plwocina, mocz, kał, płyn, żółć, wydzielina żołądkowo - jelitowa, limfa, szpik kostny, punktaty lub aspiraty z narządów i biopsje. W szczególności wskazane są wymazy i biopsje kiedy bierze się pod uwagę wykrywanie nowotworów odbytowo - płciowych, np. nowotworów szyjki macicy. Wyrażenie określenie nadekspresji białka regulacyjnego cyklu komórkowego obejmuje dowolny sposób, który jest odpowiedni do wykrywania ekspresji białek regulacyjnych cyklu komórkowego i kodujących je mrna oraz amplifikacji odpowiadających im genów, odpowiednio. W celu określenia nadekspresji jest rzeczą oczywistą porównanie próbki ciała, która ma być badana z odpowiednią próbką ciała, która pochodzi od osoby zdrowej. Taka próbka może być obecna w postaci wystandaryzowanej. (Nad)ekspresję białek regulacyjnych cyklu komórkowego można wykryć na poziomie kwasu nukleinowego i na poziomie białka, odpowiednio. Jeśli chodzi o wykrywanie na poziomie białka, możliwe jest zastosowanie np. przeciwciał, które są skierowane przeciw 10 białkom cyklu komórkowego. Te przeciwciała można zastosować w najrozmaitszych metodach, takich jak analiza Western, ELISA lub immunoprecypitacja. Może być korzystne dla przeciwciał związanie z nośnikami stałymi, takimi jak paski testowe lub cząstki lateksu. Dzięki niniejszemu wynalazkowi możliwe jest wczesne diagnozowanie nowotworów tj. w ich stadiach wstępnych. Dalszy przedmiot niniejszego wynalazku dotyczy zestawu do zastosowania sposobu według wynalazku. Taki zestaw zawiera: (a) odczynnik do wykrywania ekspresji białka regulacyjnego cyklu komórkowego, np. przeciwciało skierowane przeciw takiemu białku lub kwas nukleinowy kodujący takie białko lub jego część, odpowiednio. (b) konwencjonalne czynniki wspomagające, takie jak bufor, nośniki, markery itd., i ewentualnie (c) czynnik do kontrolowanie reakcji np. białko regulacyjne cyklu komórkowego, kwas nukleinowy kodujący takie białko lub jego część, odpowiednio, lub preparaty komórek np. skrawek tkanki lub komórki utrwalone na szkiełku. Powyższe stwierdzenia znajdują zastosowanie odpowiednio do poszczególnych składników zestawu. Ponadto, może być obecny jeden lub kilka przedstawicieli poszczególnych składników. Dzięki zastosowaniu niniejszego wynalazku możliwe jest wczesne diagnozowanie nowotworów. W szczególności można wcześnie wykrywać wstępne stadia nowotworów. Należy również podkreślić, że możliwe jest rozróżnienie łagodnych zmian zapalnych i zmian metaplastycznych przy dysplastycznych stanach przednowotworowych. Inną cechą jest to, że wyniki otrzymane metodą według wynalazku nie są przedmiotem subiektywnej oceny, a zatem można na przykład uniknąć fałszywie ujemnych i fałszywie dodatnich wyników uzyskiwanych odpowiednio, dla testów Pap lub preparatów histologicznych. Ponadto, niniejszy wynalazek wyróżnia się szybkością i łatwością przeprowadzania, tak, że może być zastosowany do szeroko zakrojonych badań przesiewowych, w szczególności również w krajach trzeciego świata. A zatem niniejszy wynalazek reprezentuje ważny wkład do dzisiejszej diagnostyki chorób nowotworowych.

4 4 PL B1 Krótki opis rysunków Figura 1 pokazuje wykrywanie nadekspresji cdk4 w komórkach raka szyjki macicy CaSki transformowanych HPV16. Oznaczenia 4 godz., 8 godz., 12 godz., 24 godz. dotyczą czasów pobrania ekstraktu komórkowego. Skrót co oznacza kontrolę, podczas gdy arr oznacza dodanie surowicy. Figura 2 pokazuje wykrywanie nadekspresji cdk6 i p19 w komórkach NIH3T3 transformowanych HPV16. Skrót co oznacza kontrolę. Wynalazek jest wyjaśniony przez następujące przykłady. P r z y k ł a d 1: Wykrywanie nadekspresji p16 w biopsjach szyjki macicy. (A) Skrawki parafinowe o grubości od 3 do 5 µm otrzymano z 20 biopsji szyjki macicy, które obejmują wszystkie stopnie rozwoju dysplazji od tkanki normalnej (n=2) poprzez zmiany CIN I (n=4), II (n=4), III (n=5) do nowotworu inwazyjnego (n=5). Parafinę usuwa się ksylenem przez 2 x 10 min. i ponownie uwodorowuje przy zastosowaniu etanolu. Antygeny odsłania się w 10 mm buforze cytrynianiowym (ph 6,0) w autoklawie w 110 C przez 10 min. Następnie endogenne peroksydazy inaktywuje się przy zastosowaniu 0,25% H w PBS. Po zablokowaniu niespecyficznych miejsc wiązania surowicą końską (zestaw do wykrywania Vectastain ABC, Vector Laboratories, Burlingame, California, USA) w temperaturze pokojowej przez 20 minut, skrawki inkubuje się z przeciwciałem monoklonalnym specyficznym wobec p16 (Neomarkers, Fremont, California, USA) w obecności 3% płodowej surowicy cielęcej w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Do wykrywania wiązania przeciwciało - p16 dodaje się następnie biotynylowane przeciwciało drugorzędowe (końskie anty-mysie IgG, zastaw Vectastain) na 30 minut. Następnie związane drugorzędowe przeciwciało wykrywa przy zastosowaniu odczynników według instrukcji zestawu Vectastain i dokonuje się barwienia kontrastowego przy zastosowaniu roztworu hemalum Mayera. Pokazuje to, że w komórkach dysplastycznych istnieje nadekspresja p16. Pokazuje to również, że intensywność nadekspresji p16 koreluje ze stopniem dysplazji komórkowej. (B) Ponadto, skrawki parafinowe przygotowano z 78 biopsji raka szyjki macicy. Biopsje odpowiadają od tkance normalnej (n=12), zmianom dysplastycznym w stadium CIN I (n=15), II (n=14), III (n=18), jak również nowotworom inwazyjnym (n=19). Skrawki parafinowe traktowano tak, jak opisano w (A). Otrzymano dane wskazane w Tabeli 1. T a b e l a 1 Intensywność ekspresji p16 histologia n= prawidłowa CIN I CIN II CIN III CxCa razem Z danych w Tabeli 1 widać, że nadekspresja p16 ma miejsce w komórkach z dysplazjami i nowotworami inwazyjnymi, przy czym nadekspresja wzrasta wraz ze stopniem dysplazji w kierunku nowotworu inwazyjnego. (C) Ponadto, skrawki parafinowe z 180 biopsji raka szyjki macicy traktowano tak, jak opisano w (A). Dodatkowo określono udział procentowy komórek, które reagują ze wspomnianym powyżej przeciwciałem specyficznym wobec p16. Dokonano również rozróżnienia pomiędzy dysplazjami HPV - dodatnimi i HPV - ujemnymi oraz nowotworami inwazyjnymi, odpowiednio. Uzyskane dane pokazano w Tabeli 2.

5 PL B1 5 T a b e l a 2 Procent komórek z nadekspresją p16 n Średni procent ± odchylenie standardowe CIN I 32 54,9 ± 24,0 HPV - ujemny 17 54,0 ± 27,2 HPV - dodatni 15 55,9 ± 21,0 CIN II 32 70,8 ± 18,9 HPV - ujemny 14 76,0 ± 15,8 HPV - dodatni 18 66,8 ± 20,5 CIN III 60 92,4 ± 10,2 HPV - ujemny 9 94,4 ± 7,5 HPV - dodatni 51 92,1 ± 10,7 Nowotwór inwazyjny 58 97,8 ± 5,2 HPV - ujemny 5 96,4 ± 8,1 HPV - dodatni 53 97,9 ± 4,9 Dane z Tabeli 2 pokazują, że nadekspresją p16 ma miejsce zarówno w HPV - dodatnich i HPV - ujemnych komórkach dysplastycznych, jak i nowotworach inwazyjnych. Wynik ten jest potwierdzony przez kontrolę normalnych tkanek. Dane te pokazują również, że udział procentowy komórek reagujących z p16 wzrasta wraz ze stopniem dysplazji w kierunku nowotworu inwazyjnego. P r z y k ł a d 2: Wykrywanie nadekspresji białek regulacyjnych cyklu komórkowego w komórkach transformowanych HPV. (A) Komórki raka szyjki macicy CaSki, które były transformowane HPV16 hodowano w nieobecności surowicy przez 72 godz. Po dodaniu surowicy, ekstrakty komórkowe zbierano w różnym czasie, poddawano SDS-PAGE i przenoszono na filtry PVDF (Du Pont). Ekspresję cdk4 określano przy zastosowaniu poliklonalnej antysurowicy (1:1000) z Santa Cruz. Ponadto, ekspresję białka HPV16-E7 oceniano przy zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych przeciw HPV16-E7 (1:50) z Triton. Poszczególne odpowiedzi immunologiczne określano przy zastosowaniu drugorzędowych przeciwciał połączonych z peroksydazą i chemiluminescencyjnego systemu wykrywania (NEN, Du Pont). Okazuje się, że nadekspresja csdk4 ma miejsce (patrz Fig. 1). (B) Komórki NIH3T3 transformuje się HPV16 tak, aby otrzymać ekspresję białka HPV16-E7. Otrzymuje się ekstrakty komórkowe z transformowanych komórek i traktuje tak, jak opisano w (A). Do wykrawania ekspresji cdk6 i p19, odpowiednio, stosuje się poliklonalne antysurowice (1:1000) z Santa Cruz. Jeżeli chodzi o wykrywanie ekspresji białka HPV16-E7 i wykrywanie poszczególnych odpowiedzi immunologicznych, odniesieniem są dane zawarte w punkcie (A). Okazuje się, że ma miejsce nadekspresja cdk6 i p19 (patrz Fig. 2).

6 6 PL B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wczesnego diagnozowania nowotworów i ich prekursorów, znamienny tym, że obejmuje ustalenie nadekspresji białka regulacyjnego cyklu komórkowego w próbce ciała, a białko regulacyjne cyklu komórkowego jest inhibitorem kinazy zależnej od cykliny. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nowotwory są nowotworami górnych dróg oddechowych. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nowotwory są nowotworami dróg odbytowo - płciowych. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że nowotwór dróg odbytowo - płciowych jest rakiem szyjki macicy. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że inhibitorem kinazy zależnej od cykliny jest białko p14, p15, p16, p19, p21 albo p Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbką ciała jest krew, wymazy, plwocina, mocz, kał, płyn, żółć, szpik kostny, wydzielina żołądkowo - jelitowa, punktaty lub aspiraty z narządów i biopsje, odpowiednio, i/albo limfa. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nadekspresję ustala się na poziomie kwasu nukleinowego. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nadekspresję ustala się na poziomie białka. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że do ustalania stosuje się przeciwciało skierowane przeciw białku regulacyjnemu cyklu komórkowego. 10. Zestaw do zastosowania sposobu według zastrz. od 1 do 9, znamienny tym, że zawiera: (a) odczynnik do wykrywania ekspresji białka regulacyjnego cyklu komórkowego, (b) konwencjonalne czynniki wspomagające, takie jak bufory, nośniki, markery, i ewentualnie (c) środki do kontrolowania reakcji. 11. Zestaw według zastrz. 10, znamienny tym, że odczynnik jest przeciwciałem skierowanym przeciw białku regulacyjnemu cyklu komórkowego. 12. Zestaw według zastrz. 10, znamienny tym, że odczynnik jest kwasem nukleinowym kodującym białko regulacyjne cyklu komórkowego lub jego części. 13. Zestaw według zastrz. 10, znamienny tym, że środek jest białkiem regulacyjnym cyklu komórkowego albo kwasem nukleinowym kodującym to białko lub jego części. 14. Zestaw według zastrz. 10, znamienny tym, że środkiem jest preparat komórkowy albo komórki utrwalone na szkiełku.

7 PL B1 7 Rysunki

8 8 PL B1 Departament Wydawnictw UP RP Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.