Oddziaływanie substancji wydzielanych przez lipofilny szczep Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 na inne drobnoustroje bytujące na skórze człowieka

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: Piotr Wysocki, Anna K. Kwaszewska, Eligia M. Szewczyk * Oddziaływanie substancji wydzielanych przez lipofilny szczep Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 na inne drobnoustroje bytujące na skórze człowieka Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik Zakładu: dr hab. n. med. E.M. Szewczyk, prof. UM Zbadano wpływ substancji wytwarzanych przez Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 na 22 szczepy (gronkowców, maczugowców i propionibakterii) wspólnie bytujących z nim na skórze i 6 klinicznych izolatów drożdżaków Candida sp. Badany szczep wydzielał do środowiska mieszaninę substancji o przeciwstawnym działaniu. Wyodrębniono substancję hamującą typu bakteriocyny i wykazano jej działanie wobec S. aureus, S., C. diphtheriae i Propionibacterium sp. Badanie drobnoustrojów jako populacji żyjących w określonych niszach ekologicznych stanowi obecnie jedno z większych wyzwań dla mikrobiologów. Kiedy poznano strukturę biofilmu stało się jasne, że drobnoustroje żyjące w naszym organizmie stanowią mieszane społeczności, w których wzajemne relacje są regulowane przez złożone mechanizmy biochemiczne zakodowane w ich materiale genetycznym (4, 10, 11, 12). Drobnoustroje bytujące na skórze człowieka jako rezydenci to przede wszystkim gronkowce koagulazoujemne, propionibakterie i lipofilne maczugowce (3, 5, 7). Ich populacja na zdrowej skórze wydaje się względnie stabilna, ale jej zaburzenie może oznaczać nadmierne namnożenie drobnoustrojów, które na skórze pojawiają się przejściowo lub są tam zwykle w bardzo niewielkiej ilości (Staphylococcus aureus, Candida sp., pałeczki Gram-ujemne). Ich dominacja może doprowadzić do miejscowych zmian chorobowych lub być źródłem zakażeń oportunistycznych. Relacje pomiędzy drobnoustrojami stanowiącymi naturalną florę skóry, warunkują jej stabilność, dzięki wewnętrznej chemicznej kontroli, której istotę próbujemy zrozumieć (8). Próba izolacji i oceny aktywności substancji wydzielanych do środowiska przez lipofilny szczep maczugowca Corynebacterium CDC G1 była przedmiotem tej pracy. MATERIAŁ I METODY Szczep producenta i szczepy do kontroli aktywności substancji typu bakteriocyny. Producentem badanych substancji był izolowany ze zdrowej skóry człowieka * Praca finansowana z funduszy Uczelnianego Tematu Badawczego nr

2 46 P. Wysocki, AK. Kraszewska, EM. Szewczyk Nr 1 lipofilny szczep maczugowca zidentyfikowany jako Corynebacterium CDC G1 w teście API Coryne 3.0 i wykorzystaniu schematu identyfikacyjnego wg. Kaźmierczak i wsp. (6). Szczep ten oznaczony numerem ZMF 3P13 należy do kolekcji Zakładu Mikrobiologii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Aktywność wytwarzanych przez szczep producenta substancji typu bakteriocyn w postaci natywnej i podczas ich wyodrębniania każdorazowo badano wobec wrażliwych szczepów Corynebacterium diphtheriae typów gravis i mitis. Szczepy badane. Aktywność substancji wytwarzanych przez szczep Corynebacterium CDC91 badano wobec 22 szczepów bakterii i 6 izolatów drożdżaków. Bakterie należały do rodzajów: Staphylococcus (S., S. capitis subsp. capitis, S. capitis subsp. urealyticus, S. haemolyticus, S. lugdunensis i S.aureus), Corynebacterium (C. jeikeium, Corynebacterium CDC G2, C. afermentans subsp. lipophilum) oraz Propionibacterium. Wszystkie szczepy z wyjątkiem S. aureus ATCC 6538P pochodziły z kolekcji Zakładu Mikrobiologii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi (ZMF) i wyizolowano je ze zdrowej skóry człowieka (czoło, plecy). Zbadano także wpływ substancji wytwarzanych przez Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 na drożdżaki z rodzaju Candida izolowane z materiałów klinicznych. Numery szczepów w kolekcji ZMF zostały przedstawione w tabelach I i II. Hodowla szczepu producenta i izolacja substancji typu bakteriocyny. Hodowlę szczepu producenta prowadzono w dializowanym, w celu pozbawienia białek, podłożu BHI. Lipofilny szczep Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 wymagał do wzrostu kwasów tłuszczowych, których źródłem była oliwa z oliwek dodawana w objętości 20 μl /100 ml podłoża. Hodowlę prowadzono przez 48 godzin w temperaturze 35 C. Substancje typu bakteriocyn wykrywano, po usunięciu z powierzchni hodowli oliwy i ogrzaniu zawiesiny przez 20 minut w temp. 70 o C, w dwóch rodzajach próbek. Pierwsza próbka zawierała 200 µg/ml białka, które pojawiło się w czasie hodowli w supernatancie i uzyskana została przez jego bezpośrednią liofilizację. Druga zawierała substancje wyodrębnione z supernatantu według metody Yanga (16). W tej procedurze po ogrzaniu 48 godzinnej hodowli badanego szczepu, zakwaszano ją do ph 4,5. Po odwirowaniu osad komórek przemywano 5 mm buforem fosforanowym o ph 6,5, każdorazowo odrzucając supernatant. Osad zawieszano w roztworze NaCl o ph 2 w pięciokrotnie mniejszej objętości w stosunku do wyjściowej i mieszano przez 60 minut w 4 o C. Próbki wirowano przez 15 minut przy x g. Osad odrzucano, a supernatant sączono przez filtr bakteriologiczny o średnicy porów 0,45 μm (Millipore). Przesącz doprowadzano do ph 6,5 przy użyciu 0,25 M roztworu NaOH, rozporcjowywano i liofilizowano. Do badań próbki rozpuszczano w takiej samej objętości jałowej dejonizowanej wody. Oznaczanie aktywności badanych substancji. W pierwszym etapie badań aktywność substancji wytwarzanych przez producenta badano metodą bezpośrednią (1). Szczep producenta posiewano punktowo na zestalone agarem podłoże BHI (Difco) z dodatkiem 0,1% Tween 80 o ph 7,4 i inkubowano w temperaturze 35 0 C przez 48 godzin. Komórki zabijano w oparach chloroformu (POCH) i usuwano z powierzchni podłoża. Na tak przygotowaną płytkę wylewano warstwę agaru powierzchniowego zakażonego standaryzowaną zawiesiną szczepu badanego o gęstości 0,5 według skali Mc Farlanda dla ziarenkowców i drożdżaków oraz o gęstości 0,7 dla maczugowców i propionibakterii. Biologiczną aktywność preparatów uzyskiwanych z płynnych hodowli szczepu producenta oceniano wobec badanych szczepów na podłożu BHI z dodatkiem 0,1% Tween 80. Standaryzowane zawiesiny szczepów posie-

3 Nr 1 Bakteriocyny Corynebacterium CDC G1 47 Tabela I. Działanie substancji wytwarzanych przez szczep maczugowca Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 na wzrost szczepów bakterii wspólnie bytujących na skórze. Numer w kolekcji Rodzaj; gatunek Oddziaływanie bezpośrednie w hodowli Działanie substancji typu bakteriocyn Obecnych Po wyodrębnieniu metodą w supernatancie hodowli Yanga ATCC Staphylococcus aureus Brak Brak Hamowanie 6538P ZMF 1K46 Staphylococcus capitis Hamowanie/stymulacja Brak Brak subsp. capitis ZMF 2A93 Staphylococcus capitis Hamowanie - Brak Brak subsp. urealyticus ZMF Staphylococcus Hamowanie - Stymulacja Hamowanie 3B101 ZMF 2A83 Staphylococcus Hamowanie/stymulacja Stymulacja Brak ZMF 3A45 Staphylococcus Hamowanie/stymulacja Stymulacja Brak ZMF 2A96 Staphylococcus Hamowanie/stymulacja Stymulacja Brak ZMF 2K72 Staphylococcus Hamowanie/stymulacja Brak Brak ZMF 3A66 Staphylococcus Hamowanie/stymulacja Stymulacja + Brak ZMF 2B33 Staphylococcus Hamowanie/stymulacja Brak Brak haemolyticus ZMF Staphylococcus Stymulacja Stymulacja Brak 1B144 lugdunensis ZMF 1K54 Corynebacterium afermentans subsp. lipophilum Hamowanie/stymulacja Stymulacja Brak ZMF 2R42 Corynebacterium jeikeium hamowanie Stymulacja + Brak ZMF 3A32 Corynebacterium jeikeium Hamowanie/stymulacja Stymulacja Brak ZMF 1K53 Corynebacterium jeikeium Stymulacja - Stymulacja + Brak ZMF 1A43 Corynebacterium CDC Hamowanie Stymulacja + Brak grupa G2 ZMF 1B3 Propionibacterium sp. Hamowanie Hamowanie + Hamowanie + ZMF 2P5 Propionibacterium sp. Hamowanie Hamowanie Hamowanie + ZMF 2P7 Propionibacterium sp. Hamowanie Hamowanie Hamowanie + ZMF 2K9 Propionibacterium sp. Hamowanie Hamowanie Hamowanie + ZMF 3K11 Propionibacterium sp. NB Hamowanie Brak ZMF 3K12 Propionibacterium sp. NB Hamowanie + Hamowanie + ( - reakcja słaba; + reakcja silna; NB nie badano)

4 48 P. Wysocki, AK. Kraszewska, EM. Szewczyk Nr 1 Tabela II. Działanie substancji wytwarzanych przez szczep maczugowca Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 na wzrost szczepów drożdży izolowanych z przypadków klinicznych Numer w kolekcji Rodzaj; gatunek Pochodzenie miejsce izolacji Oddziaływanie bezpośrednie Działanie substancji typu bakteriocyn obecnych w supernatancinieniu meto- Po wyodręb- hodowli dą Yanga ZMF C 1 Candida albicans wymaz z gardła NB Stymulacja + Brak ZMF C 8 Candida albicans wydzielina z Stymulacja + Stymulacja + Brak pochwy ZMF C 10 Candida albicans wydzielina z Stymulacja + Stymulacja + Brak pochwy ZMF C 13 Candida albicans plwocina NB Stymulacja Brak ZMF C 14 Candida płyn z jamy Stymulacja + Stymulacja + Brak glabrata otrzewnej ZMF C 15 Candida parapsilosis ropa z ucha środkowego NB Stymulacja Brak ( - reakcja słaba; + reakcja silna; NB nie badano) wano tak, aby po hodowli osiągnąć wzrost w postaci murawy, a następnie nanoszono na powierzchnię punktowo po 10 µl badanych próbek i pozostawiano do wyschnięcia. Hodowle inkubowano odpowiednio dla gronkowców przez 24 godziny, a hodowle pozostałych drobnoustrojów przez 48 godzin w temperaturze 35 o C w warunkach tlenowych (maczugowce, drożdżaki) lub beztlenowych z wykorzystaniem zestawu GasPak firmy Becton Dickinson (propionibakterie). Działanie substancji typu bakteriocyn wytwarzanych przez badany szczep maczugowców określano jako zahamowanie lub stymulowanie (wzmożenie) wzrostu badanych bakterii w miejscu oddziaływania substancji wytwarzanych przez producenta, ale niekiedy także jako jednoczesne zahamowanie i stymulację. Metoda pozwalała jedynie na ocenę jakościową, ale jeśli reakcja była wyjątkowo intensywna zaznaczano to znakiem +, a jeśli słaba znakiem -. WYNIKI Szczep izolowanego ze skóry maczugowca Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 należy w kolekcji Zakładu Mikrobiologii Farmaceutycznej do najaktywniejszych producentów substancji, które mają właściwość oddziaływania na inne bakterie (8). Szczep ten w sposób powtarzalny wykazywał działanie hamujące w stosunku do użytych w badaniach, jako wskaźnikowe, dwóch nietoksynotwórczych szczepów Corynebacterium diphtheriae typ gravis i mitis. Pozwoliło to wykorzystywać je do kontroli aktywności preparatów uzyskiwanych na różnej drodze. We wszystkich badanych w tej pracy próbkach zawarta była substancja silnie hamująca wzrost tych wskaźnikowych maczugowców. Nie stwierdzono oddziaływania na te i inne badane szczepy próbek kontrolnych nie zawierających produktów metabolizmu Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13. Do badań wybrano gronkowce i maczugowce, które we wcześniejszych badaniach (8, dane nieopublikowane) wykazywały reakcje różnego rodzaju i o różnym nasileniu, na

5 Nr 1 Bakteriocyny Corynebacterium CDC G1 49 działanie substancji wytwarzanych przez maczugowce. Po raz pierwszy badano działanie substancji typu bakteriocyn wydzielanych przez Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 na propionibakterie i drożdżaki. W badaniach bezpośredniego oddziaływania substancji wytwarzanych przez szczep producenta na szczepy badane (Tabela I) obserwowano zahamowanie ich wzrostu, objawiające się strefą kompletnego przejaśnienia lub wyraźnego przerzedzenia murawy w pobliżu wzrostu producenta (dwa szczepy gronkowców: ZMF 2A93 i ZMF 3B101, a także dwa szczepy maczugowców: ZMF 2R42, ZMF 1A43 oraz wszystkie badane szczepy propionibakterii). W przypadku innych szczepów widoczne było zagęszczenie murawy, co interpretowano jako stymulację wzrostu. Zjawisko to dotyczyło jednego szczepu gronkowców ZMF 1B144, jednego maczugowców ZMF 1K53 i wszystkich badanych w ten sposób drożdżaków. Niekiedy obserwowano ciekawe zjawisko zahamowania wzrostu w bezpośrednim sąsiedztwie rosnącego szczepu producenta i stymulacji wzrostu w pewnym od niego oddaleniu. Zjawisko to występowało w przypadku gronkowców (ZMF 1K46, ZMF 2A83, ZMF 3A45, ZMF 2A96, ZMF 2K72, ZMF 3A66, ZMF 2B33) i maczugowców (ZMF 1K54, ZMF 3A32). Poszukiwanie w zagęszczonych supernatantach hodowli płynnej producenta substancji odpowiedzialnych za zjawiska obserwowane w hodowlach bezpośrednich, nie przyniosło efektów w pełni zgodnych z wynikami uzyskanymi w metodzie bezpośredniej. Okazało się, że w czasie hodowli na podłożu płynnym maczugowiec ten wydzielał do środowiska substancje stymulujące wzrost wielu bakterii i grzybów. Szczepy stymulowanych bakterii należały do bytujących wspólnie z nim na skórze gatunków gronkowców koagulazoujemnych (S., S. lugdunensis) oraz skórnych maczugowców (C. afermentans subsp. lipophilum, C. jeikeium, Corynebacterium CDC grupa G2) (Tabela. I). Obserwowano również silną stymulację wzrostu badanych klinicznych szczepów drożdżaków z rodzaju Candida (C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis) (Tabela. II). Szczepy, które w czasie hodowli na tym samym podłożu stałym reagowały zahamowaniem wzrostu, nie wykazywały takiej reakcji, co sugeruje częściową utratę w czasie preparatyki aktywności komponenty hamującej, wystarczającej jednak dla hamowania C.diphtheriae. Te szczepy, które w relacji bezpośredniej reagowały wspomnianym wyżej jednoczesnym zahamowaniem i stymulacją wzrostu (Tabela I) były w większości przypadków tylko stymulowane. W przypadku jednego rodzaju bakterii Propionibacterium, ilość i siła działania substancji wydzielanej przez szczep producenta okazała się wystarczająca dla hamowania, niekiedy silnego, ich wzrostu. Procedura oddzielania substancji typu bakteriocyn opisana przez Yanga (16) polega na takich zmianach kwasowości środowiska, w których związki te najpierw przylegają do powierzchni komórek (w zastosowanej w tej pracy modyfikacji metody było to ph 4,5), a następnie są od nich oddzielane (ph 2). Metoda pozwoliła zatem na zagęszczenie bakteriocyny i oddzielenie jej od innych substancji zawartych w supernatancie hodowli. Otrzymany w wyniku takiego postępowania materiał pochodzący ze szczepu Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 był silnie aktywny w stosunku do wskaźnikowych szczepów C. diphtheriae. Nie wykazywał jednak hamującego działania na większość badanych gronkowców ani na maczugowce. Wyjątek stanowił jeden szczep S. ZMF 3B101. Bakteriocyna wyizolowana w ten sposób z hodowli badanego szczepu maczugowca hamowała też wzrost szczepu S. aureus, w stosunku do którego brak było działania bezpośredniego ze strony tego maczugowca, a także zagęszczonego supernatantu hodowli. Hamowała ona także wzrost pięciu z sześciu badanych szczepów propionibakterii izolowanych z tego samego

6 50 P. Wysocki, AK. Kraszewska, EM. Szewczyk Nr 1 środowiska co szczep producenta ze zdrowej skóry człowieka (Tabela I). Preparat ten nie wykazywał żadnej aktywności wobec badanych klinicznych izolatów drożdżaków z rodzaju Candida (Tabela II). DYSKUSJA W warunkach naturalnych bakterie uwalniają do środowiska szereg substancji. Mają one różną naturę i pomagają w zaspokojeniu żywieniowych potrzeb komórek, służą ich adhezji do kolonizowanych powierzchni, inwazji organizmu gospodarza lub utrzymaniu pozycji wśród innych drobnoustrojów w zajmowanej niszy ekologicznej. Substancje wydzielane do środowiska przez jedne bakterie mogą działać korzystnie w stosunku do innych zapewniając im dostęp do substancji odżywczych lub na przykład chroniąc przed antybiotykami np. β-laktamazy (14). Wygraną we współzawodnictwie o dostęp do substancji pokarmowych i przestrzeni życiowej gwarantują im jednak substancje szkodliwe dla innych bakterii. Mogą być to wytwarzane przez nie produkty metabolizmu: kwasy organiczne, toksyny, enzymy, antybiotyki lub bakteriocyny oraz substancje typu bakteriocyn określane niekiedy jako BLIS (ang. bacteriocin-like substances) (9,15). Substancje te stanowią dużą grupę związków, zwykle są białkami lub agregatami peptydów (9). Opisano szereg z nich, a w tej grupie substancje wytwarzane przez bakterie gramdodatnie, które są blisko związane z człowiekiem, nie stanowią rzadkości (11,13, 17). Warunki stwarzane w sztucznej hodowli zwykle dość nieudolnie naśladują warunki naturalne, niemniej dzięki dużej stabilności wielu związków tej grupy próby ich izolacji mają szansę powodzenia (2, 13). Na podstawie wyników przedstawionych tu badań można sądzić, że szczep Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13, podobnie jak wiele innych szczepów maczugowców stanowiących rezydentną florę skóry ludzkiej (8) musi walczyć o swoją pozycję w mieszanej populacji naturalnej flory. Wydzielane przez niego do środowiska substancje są mieszaniną, w której jak stwierdziliśmy, są zarówno związki hamujące jak i stymulujące wzrost innych drobnoustrojów. W stosunku do niektórych konkurujących bakterii substancje te działały jednocześnie, dając wynik: hamowanie/stymulacja. Próbując zrozumieć to szczególne zjawisko początkowo zakładaliśmy, że to efekt zależny od stężenia: wysokie stężenie działa hamująco a niskie stymuluje. Jednak okazało się, że zagęszczenie tej substancji w supernatancie hodowli nie dało oczekiwanego efektu silnego hamowania. W zagęszczonym supernatancie hodowli płynnej aktywność hamująca zachowana została tylko w stosunku do szczepów wskaźnikowych C. diphtheriae i propionibakterii. Można przypuszczać, że odpowiedzialna za nią substancja w tej preparatyce traciła częściowo aktywność lub uwalniała się z komórek w bardzo niewielkich ilościach, niewystarczających do powstrzymania wzrostu mniej wrażliwych szczepów. Próba wyodrębnienia substancji hamującej przez zastosowanie metody Yanga powiodła się. W otrzymanym tą metodą preparacie pochodzącym z pełnej, obejmującej komórki i supernatant, hodowli szczepu producenta znalazła się substancja wykazująca tylko aktywność hamującą. Skierowana ona była przeciw wskaźnikowym szczepom C. diphtheriae, jednemu szczepowi S., szczepowi S. aureus oraz szczepom Propionibacterium sp. Substancja ta będzie dalej oczyszczana i badana. Nie ulega jednak wątpliwości, że szczep wybranego do badań producenta wytwarza także inne substancje, których rola i budowa

7 Nr 1 Bakteriocyny Corynebacterium CDC G1 51 musi zostać wyjaśniona, jeśli chce się, choć w nikłej części zrozumieć zależności między drobnoustrojami zasiedlającymi skórę jako jej rezydenci. P. Wysocki, A.K. Kwaszewska. E.M. Szewczyk Influence of substances produced by lipophilic Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 on the microorganisms inhabiting human skin SUMMARY Lipophilic species of Corynebacterium inhabiting skin as residents produces substances that can regulate the composition of natural flora. Research that was carried out concerned an influence of the substances produced by Corynebacterium CDC G1 ZMF 3P13 on the set of 22 bacterial strains (Staphylococcus spp., Corynebacterium spp., Propionibacterium spp.) mutually existing on the skin and the set of 6 Candida spp. isolated from patients. It was found out that the strain gives off into environment a mixture of substances with opposite effects. In the course of research an inhibiting substance (BLIS) was isolated with its evident effect on S. aureus, S., C. diphtheriae i Propionibacterium spp. PIŚMIENNICTWO 1. Balusek J, Hájek V. Antagonistic activities of coagulase-positive Staphylococci. J Hyg Epidem Microbiol Immun 1985; 29: Crupper SS, Gies AJ, Iandolo JJ. Purification and characterization of staphylococcin BacR1, a broad-spectrum bacteriocin. Appl Environ Microbiol 1997; 63: Dekio I, Hayashi H, Sakamoto M i inni. Detection of potentially novel bacterial components of the human skin microbiota using culture independent molecular profiling. J Med Microbiol 2005; 54: Donlan RM, Costerton JW. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev 2002; 15: Gao Z, Tseng C, Pei Z, Blaser MJ. Molecular analysis of human forearm superficial skin bacterial biota. PNAS 2007; 104: Kaźmierczak AK, Szarapińska-Kwaszewska J, Szewczyk EM. Opportunistic coryneform organisms residents of human skin. Pol J Microbiol 2005; 54: Kaźmierczak AK, Szewczyk EM. Bacteria forming a resident flora of the skin as a potential source of opportunistic infections. Pol J Microbiol 2004; 53: Kwaszewska A,Szewczyk EM. Wytwarzanie substancji przeciwbakteryjnych przez maczugowce rezydujące na skórze człowieka. Med Dośw Mikrobiol 2007; 59: Maqueda M, Sanchez-Hidalgo M, Fernandez M i inni. Genetic features of circular bacteriocins produced by Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol Rev 2008; 32: Nadel CD, Xavier JB, Foster KR. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev 2009; 33: Olson ME, Ceri H, Morck DG i inni. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics. Can J Vet Res 2002; 66: Romero T, Aguilar C, Anderson GG i inni. Bacterial Biofilms. Current Topics in Microbiology and Immunology. Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2008.

8 52 P. Wysocki, AK. Kraszewska, EM. Szewczyk Nr Tait K, Sutherland IW. Antagonistic interactions amongst bacteriocin-producing enteric bacteria in dual species biofilms. J Appl Microbiol 2002; 93: Tancrède C. Role of human microflora in health and disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1992; 11: Tauch A, Trost E, Tilker A i inni. The lifestyle of Corynebacterium urealyticum derived from its complete genome sequence established by pyrosequencing. J Biotechnol 2008; 136: Yang R, Monty JC, Bibek R. Novel method to extract large amounts of bacteriocins from lactic acid bacteria, Appl Environ Microbiol 1992; 10: Otrzymano: 15 XI 2010 Adres Autora: ul. Pomorska 137, Łódź, Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi