Ocena amylolitycznej aktywności szczepów gronkowców koagulazo-ujemnych

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2011, 63: Joanna Wróblewska 1, Paweł Niezgódka 1, Eugenia Gospodarek 1, Marcin Wróblewski 2 Ocena amylolitycznej aktywności szczepów gronkowców koagulazo-ujemnych 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: dr hab. n. med. E. Gospodarek, prof. UMK 2 Katedra i Zakład Chemii Ogólnej Collegium Medicum im. L. Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu Kierownik: prof. dr hab. M. Dramiński Oceniono amyloliyczną aktywność 30 szczepów gronkowców koagulazo- -ujemnych, izolowanych z powierzchni i przedsionka nosa, na agarowym podłożu wzbogaconym w 1% skrobię. Nie wykazano statystycznie istotnych różnic porównując amylolityczną aktywność szczepów Staphylococcus epidermidis i innych gatunków gronkowców koagulazo-ujemnych. Częściej wykrywano aktywność amylolityczną podczas prowadzenia hodowli w warunkach tlenowych, kiedy wyniki odczytywano po 168 godzinach inkubacji. Gronkowce koagulazo-ujemne (Coagulase Negative Staphylococci, CNS) wytwarzają szereg związków pozakomórkowych o różnych właściwościach biologicznych. Niektóre z nich, jak enzymy o aktywności proteolitycznej czy lipolitycznej mogą odgrywać istotną rolę jako czynniki wirulencji zakażeń gronkowcowych. Amylazy to enzymy hydrolizujące wiązanie α(1-4) glikozydowe, występujące między innymi w skrobi i glikogenie (5, 6). Celem pracy była ocena amylolitycznej aktywności szczepów CNS oraz stwierdzenie, czy warunki i czas inkubacji mają wpływ na ocenę tej aktywności. MATERIAŁ I METODY S z c z e p y b a k t e r i i. Do oceny amylolitycznych właściwości gronkowców użyto 30 szczepów wyosobnionych ze (15 szczepów) i przedsionka nosa (15 szczepów) podczas badań w kierunku nosicielstwa prowadzonych w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Szpitala Uniwersyteckiego nr 1 im. dr. A. Jurasza CM w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu i poradniach przyklinicznych tego szpitala. Szczepy izolowano w okresie od czerwca do października 2010 roku Każdy szczep pochodził od innego pacjenta. Badane szczepy zidentyfikowano w oparciu o powszechnie przyjęte kryteria: zdolność wytwarzania katalazy oraz koagulazy. Identyfikację gatunkową CNS przeprowadzono na podstawie wyników reakcji biochemicznych ujętych w testach API STAPH (biomérieux).

2 220 J. Wróblewska i inni Nr 3 Wynik reakcji biochemicznych odczytywano w systemie komputerowym ATB Expression (biomérieux) z zastosowaniem bazy danych wersji V W y t w a r z a n i e e n z y m ó w a m y l o l i t y c z n y c h. Zdolność do wytwarzania enzymów lipolitycznych oceniono według metody Özerdem i wsp. (6) w modyfikacji własnej. Badane szczepy posiewano na agar tryptozowo-sojowy (Tryptic Soy Agar, TSA, Becton- -Dickinson) z dodatkiem 5% krwi baraniej. Po 18 - godzinnej hodowli w temperaturze 37 o C z wyrosłych kolonii bakteryjnych przygotowywano zawiesinę w fizjologicznym roztworze NaCl o gęstości 2,0 według skali MacFarlanda. W celu jakościowej oceny aktywności amylolitycznej przenoszono 15 µl zawiesiny do studzienek w podłożu TSA z dodatkiem 1% skrobi (Sigma). Szczepy inkubowano w temperaturze 37 C w warunkach tlenowych oraz w atmosferze tlenowej wzbogaconej w 5% CO 2. Kontrolę stanowiły te same szczepy posiane na podłoże TSA bez dodatku substratu do oceny rozkładu skrobi. Wyniki odczytywano po 24 i 168 godzinach od założenia hodowli. W celu potwierdzenia występowania aktywności amylolitycznej wśród badanych szczepów, płytki zalewano płynem Lugola (1% roztwór jodu w 2% roztworze jodku potasu) (POCH). Pojawienie się żółtej strefy przejaśnienia świadczyło o dodatnim wyniku próby (Ryc. 1). a b S2 S1 S4 S3 Ryc. 1. Ocena aktywności amylolitycznej Staphylococcus sp. podłoże TSA bez skrobi, b) podłoże TSA z dodatkiem skrobi S1 i S2 szczepy hydrolizujące skrobię, S3 i S4 szczepy nie hydrolizujące skrobi O b l i c z e n i a s t a t y s t y c z n e. Zastosowano test dwóch frakcji w modyfikacji uwzględniającej próbki o niskiej liczebności. W celu weryfikacji hipotezy o równości frakcji obliczano wartość statystyki U opartej na przekształceniu arcus sinus. Funkcja arc sin x jest wyrażona w stopniach. Statystyka U ma w przybliżeniu rozkład normalny (Gaussa) [7]. WYNIKI Amylolityczną aktywność stwierdzono u 23 (76,7%) szczepów CNS, z których 11 (47,8%) izolowano z powierzchni, a 12 (52,2%) pochodziło z przedsionka nosa. Właściwości amylolityczne badanych szczepów przedstawiono w tabeli I. Nie wykazano różnic istotnych statystycznie porównując aktywność amylolityczną 21 szczepów S. epidermidis i innych gatunków należących do CNS (p > 0,05). Wśród szczepów

3 Nr 3 Amylolityczna aktywność gronkowców 221 Tabela 1. Amylolityczna aktywność Staphylococcus sp. Gatunek S. epidermidis S. chromogenes S. hominis S. capitis S. sciuri S. xylosus Miejsce izolacji Liczba szczepów badanych S. epidermidis skrobię rozkładało 17 (80,9%) szczepów, z których 10 (58,8%) izolowano z powierzchni oraz 7 (41,2%) z przedsionka nosa. Wśród 9 szczepów pozostałych gatunków CNS skrobię rozkładało 6 (66,7%) szczepów, z których cztery (66,7%) wyosobniono ze a dwa (33,3%) z przedsionka nosa. Szczepy CNS znamiennie częściej wykazują aktywność amylolityczną, gdy wyniki odczytuje się po 168 godzinach, a nie po 24 godzinach (p < 0,004). Wykazano statystycznie istotne różnice porównując aktywność amylolityczną CNS ocenianą w atmosferze tlenowej i w obecności 5% CO 2 (p < 0,01). DYSKUSJA Warunki hodowli Tlenowe 5% CO 2 Odczyt po 24 godzinach 168 godzinach 24 godzinach 168 godzinach n % n % n % n % ,5 6 75,0 1 12,5 4 20,0 Przedsionek nosa , ,9 0 0,0 5 38,5 Ogółem , ,2 1 4,8 9 42, ,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 Przedsionek nosa 2 0 0, ,0 1 50, ,0 Ogółem 3 0 0,0 2 66,6 1 33,3 2 66, ,0 1 50,0 0 0,0 0 0, ,0 0 0,0 0 0,0 1 50, , ,0 0 0,0 0 0, , , , ,0 Ogółem gatunki inne niż S. epidermidis n - liczba szczepów hydrolizujących skrobię ,2 3 33,3 2 22,2 4 44,4 W dostępnym piśmiennictwie tylko nieliczni autorzy oceniali aktywność amylolityczną gronkowców. Według Akhtar i wsp. [1] wyizolowane z soli, między innymi, szczepy Staphylococcus arletta i Staphylococcus gallinarum, wykazywały aktywność amylolityczną. Vaz-Moriera i wsp. [8] oceniali aktywność enzymatyczną bakterii występujących w kompostach (handlowym i domowym). Z odpadów drobiowych wyosobnili, między innymi, gronkowce i stwierdzili, że aktywność amylolityczna występuje u 30,0% badanych szcze-

4 222 J. Wróblewska i inni Nr 3 pów gronkowców. W przedstawionej pracy odsetek szczepów o aktywności amylolitycznej był znacznie wyższy i wynosił w badanej populacji CNS 76,7%. Herranen i wsp. (2) oraz Özerdem i wsp. (6) nie wykazali aktywności amylolitycznej u badanych szczepów CNS. Gronkowce te były izolowane z otrębów owsianych (2) oraz od osób zawodowo zajmujących się żywnością czy też pacjentów szpitalnych (6). Być może, zarówno źródło izolacji szczepu jak i warunki hodowli, czy też substrat użyty w badaniu, odgrywają istotną rolę w zdolności wytwarzania amylaz gronkowcowych. W obecnej pracy ocena aktywności amylolitycznej związana była zarówno z czasem, który upłynął od założenia hodowli do odczytywania wyników, jak i warunkami hodowli. W dostępnym piśmiennictwie brak danych na temat wpływu czasu i warunków hodowli na ocenę aktywności amylolitycznej. Janicka i wsp. (3) oraz Wojda i wsp. (9) wykazały, że warunki hodowli nie wpływają znacząco na zdolność gronkowców do wytwarzania innych enzymów hydrolitycznych proteaz. Natomiast Krzemiński i wsp. (4) sugerowali, że w przypadku gronkowców zwiększone stężenie CO 2 w atmosferze może sprzyjać ujawnianiu aktywności elastolitycznej. W niniejszej pracy przeprowadzone badania pozwoliły na stwierdzenie, że aktywność amylolityczna jest dość powszechną cechą szczepów CNS izolowanych z powierzchni i przedsionka nosa. Powszechnie wiadomo, że produkty spożywcze mogą ulec zepsuciu pod wpływem amylaz wytwarzanych przez bakterie i grzyby. Pracownik przemysłu spożywczego może być rezerwuarem gronkowców o aktywności amylolitycznej i przy braku zachowania higieny osobistej może wpłynąć na zanieczyszczenie produktu spożywczego swoją mikroflorą fizjologiczną. Ponadto, szczepy gronkowców o aktywności amylolitycznej prawdopodobnie mogą ułatwiać zasiedlanie przez drobnoustroje przedsionka nosa, gdyż śluz będący wydzieliną układu oddechowego zawiera w swoim składzie mucyny. Zbudowane są one z glikoprotein o dużej zawartości oligosacharydów, w których poszczególne cukry połączone są wiązaniami O-glikozygowymi. Powstające po hydrolizie monosacharydy mogą stanowić pożywkę, a tym samym sprzyjają bytowaniu badanych gatunków gronkowców. Mucyny zawierają również epitopy węglowodanowe będące składnikiem determinant antygenowych [5]. Pomimo, że mucyny pełnią funkcję ochronną na powierzchni komórek nabłonkowych mogą stanowić doskonałą pożywkę dla wielu drobnoustrojów wytwarzających egzogenne enzymy hydrolizujące polisacharydy. J. Wróblewska, P. Niezgódka, E. Gospodarek, M. Wróblewski The evaluation of amylolytic activity of strains of coagulase negative staphylococci SUMMARY Amylase activity of 30 strains of Staphylococcus spp. was determined by Tryptic Soy Agar on supplemented with 1.0% starch as the substrate. After incubation (time incubation 24 h or 168 h), the plates were flooded with Lugol solution. A clear zone around the colonies indicated amylase activity. The 23 (76.7%) strains CNS demonstrated the amylase activity. It was observed that 17 (80.9 %) strains of S. epidermidis, and 6 (66.7%) strains non - S. epidermidis, starch hydrolyzed. Amylase production depends of time incubation (frequently 168 h) and growth atmosphere (frequently oxygen atmosphere)

5 Nr 3 Amylolityczna aktywność gronkowców 223 PIŚMIENNICTWO 1. Akhtar N, Ghauri MA, Iqbal A i inni. Biodiversity and phylogentic analysis of culturable bacteria indigenous to khewra salt mine of Pakistan and their industial importance. Braz J Microbiol 2008; 39: Herranen M, Kariluoto S, Edelmann M i inni. Isolation and characterization of folate-producing bacteria from oat bran and rye flakes. Int J Food Microbiol 2010; 142: Janicka G. Ocena właściwości proteolitycznych gronkowców koagulazo-ujemnych. Diag Lab 1999; 35: Krzemiński Z, Raczyńska A. Elastolityczna aktywność gronkowców jamy ustnej człowieka. Med Dośw Mikrobiol 1990; 42: Murray RK, Granner DK, Rodwell VW. Biochemia Harpera. PZWL. Warszawa Özerdem B, Güneş H, Koç A i inni. Biochemical and molecular characterization of extracellular enzyme producing staphylococci isolated from different origins. Sila APPAK Sachs L. Applied Statistics. Berlin Springer Verlg Vaz-Moriera I, Silvia ME, Manaia CM i inni. Diversity of bacterial isolates from commercial and homemade composts. Microb Ecol 2008; 55: Wojda M, Janicka G, Wróblewski M i inni. Właściwości proteolityczne metycylinowrażliwych (MSSA) i metycylinoopornych (MRSA) gronkowców złocistych. Diag Lab 2001; 37: Otrzymano: 17 VIII 2011 r. Adres Autora: Bydgoszcz, ul. M. Curie-Skłodowskiej 9, Katedra i Zakład Mikrobiologii, Collegium Medicum im. Rydygiera w Bydgoszczy, Uniwersytet M. Kopernika w Toruniu

6