Joanna Potaczek SYNTEZA ENANCJOMERÓW 8-AMINO-7-[2-HYDROKSY-3(MORFOLIN-4-YLO)PROPYLO]TEOFILINY ORAZ WSTĘPNA OCENA ICH AKTYWNOŚCI FARMAKOLOGICZNEJ

Transkrypt

1 1 Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego Wydział Farmaceutyczny Katedra Chemii rganicznej Joanna Potaczek SYTEZA EACJMERÓW 8-AMI-7-[2-HYDRKSY-3(MRFLI-4-YL)PRPYL]TEFILIY RAZ WSTĘPA CEA ICH AKTYWŚCI FARMAKLGICZEJ Rozprawa doktorska Promotor dr hab. Marek Cegła Kraków 2006

2 2 Promotorowi, Panu dr hab. Markowi Cegle za podsunięcie ciekawego problemu badawczego oraz wskazówki udzielane podczas prac laboratoryjnych i przygotowywania rozprawy, Kierownikowi Katedry, Panu Prof. dr hab. Jackowi Bojarskiemu za uważne przeczytanie pracy, wyrozumiałość i cierpliwość, Pani Prof. dr hab. Katarzynie Kieć-Kononowicz za umożliwienie przeprowadzenia pomiarów polarymetrycznych, Pani dr Elżbiecie Pękali za pomoc przy ich wykonywaniu, Pani Prof. dr hab. Barbarze Filipek za wykonanie badań farmakologicznych, Panu Prof. dr hab. Gabrielowi owakowi za wykonanie badań radioreceptorowych, dr Markowi Żylewskiemu za odkrycie przede mną kolejnego wymiaru widm MR, mgr Ani Stasiewicz-Urban za przyjaźń i spokój, Koleżankom i Kolegom z Katedry za przejęcie części obowiązków dydaktycznych, Rodzinie za pomoc i motywację, Dziękuję

3 3 SPIS TREŚCI 1.WSTĘP I CEL PRACY TŁ TERETYCZE Chiralność - podstawowe pojęcia Stereochemiczne aspekty działania leków Farmakologiczne różnice w działaniu enancjomerów Farmakokinetyczne różnice w działaniu enancjomerów Leki enancjomeryczne nowa tendencja w technologii środków leczniczych Metody pozyskiwania związków enancjomerycznie czystych Synteza z wykorzystaniem homochiralnych związków naturalnych Synteza asymetryczna Rozdział kinetyczny Metody biokatalityczne Zastosowanie chiralnych syntonów w syntezie farmaceutyków wybrane przykłady Reaktywność oksiranów Zastosowanie chiralnych syntonów C3 - wybrane przykłady Aktywność farmakologiczna i mechanizmy działania metyloksantyn Poszukiwania biologicznie aktywnych pochodnych teofiliny BADAIA WŁASE Zarys projektowanych metod syntezy enancjomerów P Próby zastosowania p-toluenosulfonianu 2,3-epoksypropylu jako chiralnego syntonu Synteza i reaktywność 7-[2-hydroksy-3-(4-tolilosulfonylo) propylo]-8bromoteofiliny Reakcja 7-(4-tolilosulfonylometylo)-1,3-dimetylo-6,7-dihydro -1,3-oksazolo-[2,3f]-1H,3H-puryno-2,4-dionu z morfoliną Próby wykorzystania 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny jako chiralnego syntonu ptymalizacja warunków reakcji z odczynnikami achiralnymi Mechanizm przegrupowania struktury 7-(aminometylo)-1,3-dimetylo-6,7dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H,3H-puryno-2,3-dionu do 7-(amino)-1,3-dimetylo-7,8dihydro-6H-[1,3]oksazyno[2,3-f]-puryno-2,3-dionu Synteza izomerów optycznych 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo] teofiliny z zastosowaniem odczynników chiralnych Wyniki badań farmakologicznych Aktywność hipotensyjna Aktywność miorelaksacyjna Powinowactwo do receptorów adrenergicznych PDSUMWAIE CZĘŚĆ DŚWIADCZALA Tabela 6.2. Warunki syntezy i skręcalność właściwa 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny ((±)-8, (-)-8, (+)-8)...115

4 4 Tabela 6.3. Warunki syntezy i skręcalność właściwa 7-(morfolinometylo)-1,3dimetylo-6,7-dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H,3H-puryno-2,4-dionu ((±)-9, (-)-9, (+)-9) Tabela 6.4. Warunki syntezy i skręcalność właściwa 8-amino-7-[2-hydroksy-3(morfolin-4-ylo)propylo]teofiliny ((±)-P23, (-)-P23, (+)-P23) Literatura LITERATURA Aneks WSTĘP I CEL PRACY W trakcie badań prowadzonych w Katedrze Chemii Farmaceutycznej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego nad pochodnymi metyloksantyny potencjalnej aktywności farmakologicznej otrzymano o 8-amino-7-[2-hydroksy-3- (morfolin-4-ylo)propylo]teofilinę, której nadano symbol P23 (ryc. 1.1) [1, 2]. a tle

5 5 innych pochodnych teofiliny z podstawnikami w pozycji 7 i 8 P23 cechuje się obiecującymi właściwościami, szczególnie w aspekcie wpływu na parametry układu oddechowego i krążeniowego. Związek ten obniża ciśnienie tętnicze krwi, zwalnia częstość pracy serca, zmniejsza obwodowy opór naczyniowy, zwiększa przepływ krwi przez serce i mięśnie kończyn, zwiększa amplitudę oddechu, a także rozszerza oskrzela. Jak wykazano w teście Porsolta, substancja ta posiada również komponentę ośrodkową działa antydepresyjnie [3]. * H H2 Ryc Amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofilina becność centrum stereogenicznego w strukturze P23 wskazuje występowanie jego dwóch form enancjomerycznych. Pochodna, którą otrzymano na w Katedrze Chemii Farmaceutycznej CMUJ i poddano późniejszym badaniom farmakologicznym, miała jednak postać mieszaniny racemicznej. Izomery optyczne związków biologicznie czynnych mogą znacznie różnić się pod względem swojej aktywności biologicznej. Podczas gdy jeden z nich może wykazywać interesującą nas właściwość, drugi może być nieaktywny, posiadać jedynie niewielką aktywność, być agonistą pierwszego, czy wreszcie cechować się innym rodzajem pożądanej lub niepożądanej aktywności. Wskazuje to na potrzebę dokładnego rozpoznania działania poszczególnych izomerów, tak by wprowadzane na rynek chiralne związki cechowały się odpowiednią jakością i skutecznością działania, a także gwarantowały bezpieczeństwo ich stosowania. Zasada rozpoznania aktywności poszczególnych izomerów optycznych została dotychczas usankcjonowana w aktach prawnych Stanów Zjednoczonych w 1992 roku (Policy Statement for the Development of ew Stereoisomeric Drugs wydane przez US Food and Drug Administration), państw członkowskich UE w 1994 roku (Rules Governing Medicinal Products in the European Community Investigation of Chiral Active Substances, CPMP/III/3501/91) oraz w Kanadzie w 1994 roku (Stereochemical

6 6 Issues in Chiral Drug Investigation wydane przez Canadian Health Protection Branch) i obecnie jest formalnym wymogiem stawianym nie tylko nowo wprowadzanym lekom, ale również pestycydom, czy dodatkom do żywności [4]. Celem otrzymywania prezentowanej izomerów pracy było opracowanie optycznych metody syntetycznego 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4- ylo)propylo]teofiliny (P23). Ich uzyskanie umożliwi przeprowadzenie dalszych badań nad ich właściwościami farmakologicznymi. Zebrane doświadczenia powinny okazać się pomocne przy otrzymywaniu innych chiralnych pochodnych metyloksantyn, stanowiących ważną grupę leków i związków o potencjalnym działaniu leczniczym TŁ TERETYCZE Chiralność - podstawowe pojęcia d czasu ogłoszenia w 1874 roku przez van t Hoffa i Le Bela pracy postulującej tetraedryczną orientację wiązań wokół atomu węgla, stereochemia, czyli dział chemii zajmujący się przestrzenną budową cząstek, stała się rozległą, dynamicznie rozwijającą

7 7 się dyscypliną, z której dokonań czerpią nie tylko inne działy chemii, jak na przykład chemia polimerów, czy chemia bioorganiczna, ale również biologia molekularna, biochemia, czy farmakologia [5]. Jednym z działów stereochemii jest izomeria przestrzenna (stereoizomeria), która koncentruje się na różnicach w trójwymiarowym ułożeniu atomów w związkach o identycznej konstytucji, tak zwanych stereoizomerach. Wyróżnia się tutaj izomerię geometryczną określającą położenie atomów lub grup atomów względem wybranej płaszczyzny oraz izomerię wynikającą z chiralności cząsteczek [6]. Pod pojęciem chiralności należy rozumieć obserwowaną na poziomie molekularnym asymetrię cząsteczki polegającą na niemożności jej nałożenia na własne lustrzane odbicie. Jedynym dopuszczalnym elementem symetrii chiralnych obiektów są osie symetrii Cn. Etymologia słowa chiralność wskazuje na greckie cheir oznaczające ręce. Para rąk doskonale ilustruje bowiem wyżej wspomnianą zasadę. Cząsteczki, dla których odbicie lustrzane jest identyczne z pierwowzorem, określa się mianem achiralnych. Typ chiralności cząsteczki określa się na podstawie ułożenia podstawników w przestrzeni wokół hipotetycznych elementów porządkujących takich jak punkt, oś, płaszczyzna, czy helisa. W konsekwencji wyróżnia się chiralność centryczną, aksjalną, planarną i helisową [5]. W większości chiralnych związków organicznych występuje chiralność centryczna, w której punktem odniesienia jest centrum chiralne określane również mianem centrum asymetrycznego lub stereogenicznego. Stanowi go zazwyczaj tetraedryczny atom węgla połączony z czterema różnymi ligandami. ależy zaznaczyć, że funkcję centrum stereogenicznego może pełnić każdy atom cztero- lub trójkoordynacyjny o niepłaskiej orientacji wiązań. Cząsteczka posiadająca taki atom może występować w postaci dwóch izomerycznych form przestrzennych mających się do siebie jak przedmiot i jego lustrzane odbicie. Formy te określa się mianem enancjomerów lub związków homochiralnych [7]. Ze względu na identyczne odległości między atomami enancjomery cechują się identycznymi właściwościami fizycznymi. Wyjątek stanowi przeciwny kierunek skręcania płaszczyzny polaryzacji światła, przy czym bezwzględne wartości skręcalności pozostają oczywiście równe. Właściwość tą nazywamy czynnością optyczną, a związki chemiczne, które ją posiadają określa się mianem związków

8 8 optycznie czynnych. Prawo- lub lewoskrętność związku określana jest doświadczalnie i oznaczana znakiem odpowiednio (+) i (-). Relacja między znakiem skręcalności optycznej i przestrzennym ułożeniem (konfiguracją) atomów w cząsteczkach chiralnych nie jest jednoznaczna. Konfigurację stereogenicznego atomu węgla można przedstawić korzystając z projekcji Fischera, która wiąże rzeczywiste rozmieszczenie podstawników przy stereogenicznym atomie węgla z konfiguracją związków wzorcowych, takich jak aldehyd glicerynowy i seryna. Konfiguracja wyznaczona względem substancji modelowej, w zapisie oznaczana symbolami D i L, nosi nazwę konfiguracji względnej. Uniwersalny sposób oznaczenia konfiguracji, bez odwoływania się do wzorca, polega na ustaleniu pierwszeństwa (rangi) podstawników przy centrum chiralnym według reguł Cahna-Ingolda-Preloga. W zapisie stosuje się wówczas skróty R i S [7]. Własności chemiczne enancjomerów pozostają identyczne jedynie w środowisku achiralnym. Produkty powstające w reakcjach z chiralnym substratem różnią się zarówno pod względem skalarnych (np.: temperatura topnienia), jak i wektorowych wielkości fizycznych (np.: skręcalność optyczna) [5]. Gdy w cząsteczce występuje więcej niż jedno centrum asymetrii, liczba kombinacji przestrzennego ułożenia podstawników wzrasta. W takich przypadkach, prócz par enancjomerów będących swoimi lustrzanymi odbiciami, wskazać można również pary różniące się konfiguracją podstawników przy co najmniej jednym (ale nie wszystkich) centrum stereogenicznym, a więc nie będące swoimi dokładnymi lustrzanymi odbiciami. W odróżnieniu od pary enancjomerów nazywa się je diastereoizomerami) [5]. Diastereoizomery wykazują podobne, lecz nie identyczne własności chemiczne. Różnią się także pod względem własności fizycznych np.: temperatury topnienia, wrzenia, rozpuszczalności, czy gęstości. Jak wspomniano wyżej, diastereoizomery nie są odbiciami lustrzanymi, dlatego cechują się różną skręcalnością właściwą, której znak może być taki sam lub przeciwny. iektóre diastereoizomery mogą być w ogóle pozbawione właściwości optycznych. Taki przypadek zachodzi dla tak zwanych związków mezo, w których cząsteczce liczba centrów chiralnych o tej samej konstytucji i równocześnie przeciwnej konfiguracji jest taka sama. Cząsteczki takie posiadając płaszczyznę symetrii nakładają się na swoje lustrzane odbicia, mimo że zawierają centra stereogeniczne [8].

9 9 Mieszanina równych ilości enancjomerów cechuje się brakiem czynności optycznej i nosi nazwę odmiany racemicznej. Ponieważ za wyjątkiem przeciwnego znaku skręcalności wszystkie właściwości fizyczne enancjomerów są identyczne, odmiana racemiczna powinna mieć analogiczne właściwości. Teza ta jest jednak słuszna jedynie przy słabych oddziaływaniach między cząsteczkami, a więc np. w fazie gazowej lub w rozcieńczonych roztworach. W stanie stałym właściwości fizyczne odmiany racemicznej zależeć będą od jej postaci: racemicznego konglomeratu, związku racemicznego (zwanego także racematem) lub stałego roztworu racemicznego. W konglomeracie sieć krystaliczna utworzona z cząsteczek homochiralnych jest trwalsza od sieci powstającej z cząsteczek o przemiennej chiralności (R) i (S), dlatego w istocie stanowi on mieszaninę kryształów obu enancjomerów. Konsekwencją takiej struktury jest obniżenie temperatury topnienia konglomeratu w porównaniu z czystymi enancjomerami. W przypadku związków racemicznych oddziaływania między formami heterochiralnymi (R i S) są silniejsze niż pomiędzy homochiralnymi (R i R lub S i S), a kryształy związku racemicznego po zmieszaniu z czystym enancjomerem zachowują się jak zanieczyszczenia obniżając temperaturę topnienia. Sam związek racemiczny wykazuje zazwyczaj wyższą temperaturę topnienia niż enancjomery, co wykorzystuje się przy określaniu czystości optycznej [5, 9]. W stałym roztworze racemicznym energia sieci kryształów tylko nieznacznie zależy od konfiguracji cząsteczek chiralnych, a cząsteczki o przeciwnej chiralności mogą zastępować się wzajemnie. Właściwości takiej sieci nie zależą od proporcji enancjomerów. Stąd temperatura topnienia stałego roztworu racemicznego praktycznie nie zależy od składu enancjomerycznego. Czystość związków homochiralnych określa się podając wartość czystości optycznej (ang. optical purity, skrót op.) oraz czystości enancjomerycznej (ang. enantiomeric excess, skrót ee). Pierwsza z nich wyraża stosunek skręcalności właściwej badanej próbki do skręcalności właściwej czystego enancjomeru: op. 100%, max gdzie: α skręcalność właściwa badanej próbki, αmax - skręcalność właściwa czystego enancjomeru. Do wyznaczenia czynności optycznej wykorzystuje się metody

10 10 chiralooptyczne (pomiar kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła, kołowa polaryzacja luminescencyjna). Czystość enacjomeryczna określa nadmiar jednego z enancjomerów w mieszaninie: ee [ R] [S ] 100%, [ R] [S ] gdzie [R] i [S] oznacza molowe zawartości enncjomerów odpowiednio prawo- i lewoskrętnych [7]. Do określenia czystości enancjomerycznej wykorzystuje się metody chromatograficzne (chromatografię cieczową - HPLC, wysokosprawną elektroforezą kapilarną - HPCE, nadkrytyczną chromatografię fluidalną - SCF, czy chromatografię gazową) oraz spektralne (magnetyczny rezonans jądrowy - MR) [10] Stereochemiczne aspekty działania leków Działanie większości leków jest wynikiem modyfikowania aktywności enzymów lub chemicznego łączenia się biologicznie aktywnych cząsteczek leków z określonymi strukturami komórkowymi - receptorami. Mianem receptorów określa się występujące w błonie komórkowej lub innej wewnątrzkomórkowej strukturze biopolimery białkowe, posiadające rejony zdolne do rozpoznania specyficznych ligandów endogennych, jak np. neuroprzekaźniki, czy egzogennych, np. leków [11].

11 11 Lek wiążąc się z receptorem w zastępstwie określonej substancji endogennej może wywołać określony efekt farmakologiczny. Zdolność rozpoznania struktury liganda przez receptor nie jest absolutna. Często jest jednak wystarczająca by spowodować selektywność wiązania określonych struktur chiralnych preparatów leczniczych [12 ]. Badania nad wpływem chiralności leków na ich aktywność farmakologiczną zaowocowały obfitą bibliografią. Jednymi z pierwszych opracowań w tym zakresie były prace Artura Cushny który zauważył, że lewoskrętny enancjomer adrenaliny wykazuje dwukrotnie większą aktywność względem receptora adrenergicznego niż enancjomer prawoskrętny [13]. W 1933 roku Easson i Stedman zaproponowali trójpunktowy, stereoselektywny model oddziaływania, w którym o możliwości połączenia się substancji aktywnej leku z receptorem decyduje względna komplementarność przestrzennego układu atomów lub grup atomów obu struktur (ryc. 2.1). iezależnie od Eassona i Stedmana podobną koncepcję zaproponowali na przełomie lat 40. i 50. także gston oraz Dalgleish [13]. Fersht wykazał [14], że enancjoselektywność wiązania chiralnych ksenobiotyków może wynikać także z oddziaływań sterycznych lub elektrostatycznych (pułapki steryczne). statnio Mesecar i Koshland zwrócili uwagę [15], że model trzypunktowego przyłączania sprawdza się jedynie w sytuacjach, gdy substrat posiada budowę planarną. W innych przypadkach wyjaśnienie różnic w biologicznej aktywności enancjomerów wymaga uwzględnienia czwartej lokalizacji (tj. dodatkowego, czwartego miejsca wiązania lub trzech miejsc wiązania i jednego kierunku) (ryc. 2.2).

12 12 Ryc Model trzypunktowego przyłączania Eassona i Stedmana ilustrujący chiralne rozpoznanie przez receptor. A wiązanie eutomeru, B wiązanie prochiralnego analogu, C trzy z sześciu możliwych sposobów przyłączania distomeru [13] Ryc Model czterech miejsc uchwytu Mesecara i Koshlanda [15]. Grupy X, Y i Z enancjomerów łączą się z odpowiednimi rejonami enzymu X, Y i Z; rozpoznanie chiralne zależy od oddziaływania między grupą W enancjomerów a rejonami W1 i W2 enzymu

13 13 W uzupełnieniu należy zaznaczyć, że każda interakcja między określonym związkiem chemicznym a receptorem, enzymem, czy transporterem przebiega w dwóch, niezależnych etapach: wiązania (tworzenia kompleksu), którego miarą jest powinowactwo, oraz aktywacji, której miarą jest zdolność (potencjał) aktywacji czy szybkość zachodzenia późniejszego procesu. Przebieg procesów farmakodynamicznych i farmakokinetycznych zależy od chiralnego rozpoznania na każdym z tych etapów. Znanym przykładem synergistycznego rozpoznania chiralnego są enancjomery metacholiny, z których (+) metacholina wykazuje 180-krotnie większe powinowactwo do muskarynowych receptorów presynaptycznych i równocześnie 650- krotnie większy potencjał aktywacji. Przykładem przeciwnym są enancjomery dobutaminy, będące częściowymi agonistami receptorów adrenergicznych. Pomimo, że enancjomery te αcechują się identycznym powinowactwem, (-) dobutamina wykazuje 6-krotnie większą aktywność [13]. W literaturze enancjomer o większej aktywności biologicznej określa się mianem eutomeru, a enancjomer o aktywności mniejszej distomeru. Stosunek eudysmiczny definiuje się jako iloraz aktywności eutomeru i distomeru, przy czym miarą tej aktywności może być zarówno powinowactwo do receptora, jak i skuteczność działania poszczególnych enancjomerów [13]. Większa wartość stosunku eudysmicznego wskazuje na większą różnicę w aktywności enancjomerów określnego związku. Biologiczna aktywność enancjomerów może różnić się tak pod względem jakościowym, jak i ilościowym. Przedstawione poniżej przykłady dowodzą, że różnice te mogą ujawniać się nie tylko przy wiązaniu z receptorem, ale również wcześniej, na etapie wiązania z białkami osocza, metabolizmu, czy transportu chiralnych leków [16] Farmakologiczne różnice w działaniu enancjomerów Ze względu na różnice w aktywności farmakologicznej poszczególnych izomerów, chiralne związki biologicznie czynne można zaliczyć do jednej z następujących kategorii [17]: oba enancjomery cechuje korzystna aktywność farmakologiczna, przy czym aktywność poszczególnych enancjomerów może różnić się ilościowo, tylko jeden z enancjomerów jest aktywny farmakologicznie,

14 14 enancjomery wykazują odmienną, aczkolwiek w obu przypadkach pożądaną aktywność farmakologiczną, podczas gdy jeden z enancjomerów wykazuje działanie terapeutyczne, drugi zachowuje się jak antagonista lub posiada aktywność farmakologicznie niepożądaną (np. toksyczną). Do grupy chiralnych leków, których enancjomery wykazują zbliżoną aktywność farmakologiczną, należą m.in. prometazyna o aktywności antyhistaminowej, ibuprofen o działaniu przeciwzapalnym, warfaryna - przeciwzakrzepowym, czy antybiotyki βlaktamowe [18]. Zaliczyć tutaj można również kilka leków przeciwarytmicznych, jak dizopiramid, werapamil, propafenon, flekainid, tokainid, czy meksyletyna. Za wyjątkiem werapamilu, który jest antagonistą kanałów wapniowych (IV grupa wg podziału Vaughana-Williamsa), mechanizm działania pozostałych spośród wymienionych leków antyarytmicznych polega na blokowaniu kanałów sodowych (I grupa wg Vaughana-Williamsa). Przy podobnym profilu działania, enancjomery mogą różnić się stopniem aktywności farmakologicznej. Dla przykładu, izomer (S)-(+)-dizopiramidu efektywniej niż enancjomer (R)-(-) wydłuża okres refrakcji w przedsionku i komorach i jednocześnie skraca go w węźle przedsionkowo-komorowym. Wysoki stopień enancjoselektywności cechuje także werapamil, którego enancjomer (S)-(-) jest lekiem w przybliżeniu dziesięć razy silniej działającym niż jego enancjomer (R)-(-). Izomery (R)-(-)-tokainidu i meksyletyny cechują się odpowiednio 4- i 2-krotnie większą efektywnością w blokowaniu kanałów sodowych w porównaniu z ich antypodami. przypadku w propafenonu, podstawowej flekainidu antyarytmicznej i enkainidu aktywności nie stwierdzono poszczególnych W różnicy enancjomerów. Zauważono natomiast, że izomer (S)-(+) propafenonu wykazuje 100-krotnie silniejsze działanie β- adrenolityczne niż izomer (R)-(-) [19]. Stereoselektywność działania enancjomerów może ujawniać się tylko w określonych aspektach ich aktywności. Tak jest w przypadku β-blokerów, które wykazują wysoką stereoselektywność względem receptora β-adrenergicznego. Różnic pomiędzy enancjomerami nie stwierdza się jednak w ich działaniu przeciwarytmicznym i miejscowo znieczulającym [16]. Znane są przypadki, gdy całkowitą aktywność farmakologiczną posiada jeden izomer, podczas gdy drugi jest nieaktywny. Przykładami takich leków może być

15 15 β-bloker (S)-(-)-propranolol, (-)-α-metyldopa lek hipotensyjny hamujący dekarboksylazę DPA [20], czy niesteroidowy lek przeciwzapalny (S)-(+)-ketoprofen (deksoketoprofen) [21]. Enancjomery mogą cechować się różnym profilem działania, prowadzącym do podobnych lub odmiennych efektów farmakologicznych. Jednym z przykładów jest sotalol, lek łączący antyarytmiczne właściwości grupy II (wg. podziału VaughanaWilliamsa) z właściwościami grupy III. Sotalol jest z jednej strony nieselektywnym blokerem receptorów adrenergicznych, za co odpowiedzialny jest enancjomer (S), drugiej zaś blokuje kanały potasowe, wydłużając czas βz trwania potencjału czynnościowego i okres refrakcji, przy czym aktywność tę wiąże się izomerem (R)[20]. Kolejnym przykładem jest propoksyfen, którego enancjomer (R) ma działanie analgetyczne, a (S) - przeciwkaszlowe. Za działanie mało selektywnego β2-adrenomimetyku salbutamolu (albuterolu), stosowanego w stanach spastycznych oskrzeli (dychawicy oskrzelowej), odpowiedzialny jest izomer (R)-levosalbutamol, podczas gdy (S)-salbutamol wykazuje działanie antagonistyczne [22]. W skrajnych przypadkach jeden ze stereoizomerów może wykazywać aktywność terapeutyczną, a drugi toksyczną. Zauważono, że działalność toksyczna w przeważającej ilości przypadków związana jest z enancjomerem (R). bjawy myastenia gravis ustąpiły po wyeliminowaniu izomeru (R) z racemicznej karnityny. Z enancjomerem (R) wiąże się także działanie wymiotne tetramizolu, racemicznego leku stosowanego przeciwczerwiowo w weterynarii. Jego odmiana lewoskrętna o konfiguracji (S) lewamizol - posiada aktywność immunostymulującą i stosowana jest w leczeniu zakażeń bakteryjnych, wirusowych oraz reumatoidalnego zapalenia stawów [20] Farmakokinetyczne różnice w działaniu enancjomerów Farmakokinetyka zajmuje się opisem fizykochemicznych przemian leku po jego wprowadzeniu do organizmu. Przemiany te mogą zachodzić na etapie uwalniania (z postaci leku), wchłaniania (transport z miejsca podania do krwi), dystrybucji (rozmieszczenie leku w tkankach i płynach ustrojowych) i eliminacji (proces obejmujący biotransformację metabolizm leku i jego wydalanie) [23].

16 16 Stereoselektywność wchłaniania (absorpcji) może wystąpić w czasie aktywnego transportu leku przez błonę śluzową jelita lub wynikać z różnic w oddziaływaniu na miejscowy przepływ krwi. W badaniach farmakokinetyki cefalosporyn zauważono, że (S)-cefaleksyna ulega szybko degradacji (hydroliza) i nie dociera do układu krążenia, podczas gdy enancjomer (R) jest dobrze absorbowany [24]. W procesie dystrybucji chiralne białka osoczowe wiążą się z różną siłą z enancjomerami racemicznego leku. Prowadzi to do zróżnicowania efektywności dystrybucji formy związanej (nieaktywnej) i niezwiązanej z białkiem (aktywnej). Wiązanie leku z białkiem z jednej strony ogranicza jego aktywność farmakologiczną, z drugiej zaś, uniemożliwiając jego eliminację, wydłuża czas jego działania. Mała objętość dystrybucji jest pożądaną właściwością leków będących antagonistami receptora histaminowego H1. Cecha ta pozwala skrócić czas oddziaływania substancji farmakologicznych na narządy nie stanowiące celu terapeutycznego oraz zmniejszyć ryzyko wystąpienia efektów ubocznych i niepożądanych interakcji międzylekowych [25]. Przykładem leku o takiej kinetyce jest cetyryzyna, której eutomer, lewocetyryzyna, silniej wiąże się z białkami osocza i cechuje się mniejszą objętością dystrybucji niż distomer, dekstrocetyryzyna. [26]. Różnice w metaboliźmie poszczególnych izomerów mogą dotyczyć szybkości bądź kierunku reakcji. Lek może być przekształcany w nieaktywne lub aktywne metabolity, które są częściowo lub całkowicie odpowiedzialne za efekt terapeutyczny; zdarza się, że powstające pochodne wykazują działanie toksyczne. a metabolizm enancjomerów wpływ wywierają również cechy genetyczne, wiek, płeć, czy masa ciała pacjenta [27]. Enancjomery fluoksetyny z podobną siłą hamują wychwyt serotoniny działając przeciwdepresyjnie [28]. Izomer (S) jest wolniej eliminowany, a jego metabolit (S)norfluoksetyna, wykazujący około 20-krotnie większą aktywność farmakologiczną niż enancjomer (R), przy dłuższym stosowaniu wykazuje tendencję do niekorzystnej akumulacji w organiźmie [29]. ależy zauważyć, że w tym przypadku przeciwdepresyjne działanie racemicznego leku jest sumą aktywności trzech chiralnych związków [30]. Próby wprowadzenia do terapii enancjomeru (R), nie wykazującego tendencji do akumulacji w organiźmie, zostały zarzucone po stwierdzeniu jego kardiotoksycznego działania [31]. Biotransformacja przeciwzapalnych arylopropionianów często wiąże się z jednokierunkową chiralną inwersją metaboliczną [21]. W procesie tym nieaktywny

17 17 metabolit o konfiguracji (R) przekształcany jest w aktywny enancjomer (S) [33]. Do grupy niesteroidowych leków przeciwzapalnych należy racemiczny flobufen, którego główny szlak metaboliczny prowadzi przez redukcję grupy karbonylowej. stereoselektywności tej przemiany świadczy preferowanie w organiźmie enancjomeru (+), który redukowany jest do diastereoizomerycznych pochodnych o konfiguracjach (2R,4S) i (2S,4S). Flobufen, mimo że nie jest pochodną kwasu propionowego, ulega typowej dla tej grupy chiralnej konwersji z (R)-(+) na aktywny (S)-(-) [34]. Stereoselektywny metabolizm charakteryzuje także pochodną teofiliny, pentoksyfilinę, stosowaną w terapii miażdżycy kończyn dolnych oraz zaburzeniach krążenia mózgowego. W pierwszej fazie biotransformacji leku powstaje siedem metabolitów, z których dwa - oznaczone jako M1 i M5 - wykazują pożądaną aktywność farmakologiczną. Achiralna pentoksyfilina, po redukcji grupy karbonylowej łańcucha bocznego, ulega przekształceniu w chiralny związek M1. W wyniku przebiegającej z wysoką stereoselektywnością reakcji powstaje około 15 razy więcej enancjomeru (S)-M1 niż izomeru (R). W erytrocytach i komórkach wątroby związek (S)-M1 ulega szybkiej retransformacji do pentoksyfiliny [35]. Międzyosobnicze różnice występujące przy enzymatycznej transformacji leków mogą być związane z polimorfizmem genów kodujących cytochrom P450. Klasycznym przykładem są zaburzenia metabolizmu izoniazydu i difenylohydantoiny (fenytoiny), prowadzące do zwolnienia biotransformacji i wystąpienia objawów toksycznych [23]. Innym lekiem, którego biotransformacja zależy od czynników genetycznych, jest omeprazol. Główną rolę w jego przemianie odgrywa cytochrom P450, a konkretnie izoenzym CYP2C19. W części populacji nie dochodzi do ekspresji genów kodujących to białko i transformację leku przejmuje izoenzym CYP3A4. Ponieważ reakcje katalizowane przez CYP3A4 przebiegają znacznie wolniej, dlatego osoby z tą dysfunkcją enzymatyczną, tzw. wolni metabolizerzy, z uwagi na dłuższy okres ekspozycji, narażeni są na większe niż terapeutyczne dawki omeprazolu [22]. Stereoselektywną kinetykę reakcji obserwuje się również na etapie eliminacji. Formoterol jest β2-adrenomimetykiem stosowanym w leczeniu i zapobieganiu napadów duszności u chorych na astmę oskrzelową oraz w chorobach układu oddechowego z występującym skurczem oskrzeli. Formą aktywną racemicznego leku jest enancjomer (R, R), który w drugiej fazie biotransformacji ulega sprzęganiu z kwasem

18 18 glukuronowym. ieaktywny izomer (S, S) tylko w niewielkim stopniu zostaje przekształcony w pochodne glukuronowe. Eliminacja formoterolu, zarówno w formie wolnej jak i związanej z kwasem, zachodzi szybciej dla enancjomeru (R, R) [36] Leki enancjomeryczne nowa tendencja w technologii środków leczniczych Jak pokazano w poprzednim rozdziale, farmakokinetyczne i farmakologiczne różnice pomiędzy enancjomerami chiralnych leków mogą być bardzo wyraźne i mieć poważne konsekwencje dla organizmu. Z tego względu stereochemia leków stała się w ostatnich dekadach nowym, istotnym wymiarem przemysłu farmaceutycznego, rzutującym na cały cykl wprowadzania środków leczniczych, począwszy od ich projektowania i otrzymywania, poprzez testowanie, na marketingu skończywszy. Udział leków zawierających pojedyncze enancjomery w ogólnej puli dostępnych na świecie leków stale wzrasta. W 1983 roku stanowił on 26 %, 1993 roku 45 %, a w % [228]. Udział leków sprzedawanych w formie racemicznej zmniejszył się w tym samym okresie od 37 do 6 %. W wielu przypadkach stosowane dotychczas w formie racematu lub mieszaniny diastereoizomerów chiralne leki zostały zastąpione ich aktywnymi enancjomerami (ang. chiral switching). Potencjalne korzyści takiej zamiany obejmują poprawę indeksu terapeutycznego poprzez zwiększenie siły i selektywności działania enancjomerycznego leku, eliminowanie lub ograniczenie efektów ubocznych oraz zmniejszenie ryzyka interakcji lekowych. Przykładami takiej zamiany mogą być: (S)-(-)-esomeprazol, który jest aktywnym enancjomerem racemicznego leku omeprazolu stosowanego w chorobie wrzodowej żołądka i dwunastnicy. Lek ten długotrwale hamuje wydzielania kwasu solnego poprzez inhibicję pompy protonowej [22], bupiwakaina, lek miejscowo znieczulający, której enancjomer (S)-(-) zastąpił stosowany do tej pory racemat. Lewoskrętny izomer lewobupiwakaina, przy identycznej w porównaniu z racematem pożądanej aktywności, wykazuje równocześnie słabsze działanie kardiotoksyczne [30], (S)-(+)-escitalopram, który jest aktywnym terapeutycznie izomerem przeciwdepresjnego leku citalopramu. Podawany samodzielnie, escitalopram pozwala na zmniejszenie dawki bez obniżenia aktywności przeciwdepresyjnej.

19 19 dnotowano także znaczącą poprawę działania anksjolitycznego [31, 37, 38]. Kilka dalszych przykładów przedstawiono w tab Tabela 2.1. Przykłady enancjomerycznie czystych form leków wprowadzonych w latach w zastępstwie wcześniej stosowanych form racemicznych [40] azwa azwa Aktywny Działanie leku racemicznego leku generycznego enancjomer terapeutyczne ofloksacyna levofloksacyna (S)-(-)- ofloksacyna przeciwbakteryjne albuterol levalbuterol (R)-(-)- albuterol przeciwastmatyczne ibuprofen dexibuprofen (S)-(+)- ibuprofen przeciwzapalne ketoprofen dexketoprofen (S)-(+)- ketoprofen przeciwzapalne, (salbutamol) przeciwbólowe cetyryzyna levocetyryzyna (R)-(-)- cetyryzyna przeciwdepresyjne metylfenidat dexmetylfenidat (R,R)-(-)- ADHD metylofenidat Postuluje się również zastąpienie racematu aktywnym metabolitem, najlepiej silniej działającego enancjomeru (ang. metabolite switching) [39]. Taka sytuacja miała miejsce w przypadku racemicznej terfenadyny, którą zastąpiono aktywnym metabolitem feksofenadyną. Zachowała ona przeciwhistaminową aktywność związku macierzystego i jest praktycznie pozbawiona niepożądanego działania kardiotoksycznego. Inne leki, dla których taka zamiana jest brana pod uwagę, to astemizol (na norastemizol) i lorantadyna (deslorantadyna) [30]. Zamiana racematu na aktywny metabolit wymaga sprawdzenia, czy aktywny izomer nie ulega wcześniejszej spontanicznej lub metabolicznej racemizacji Metody pozyskiwania związków enancjomerycznie czystych

20 20 Większość substancji wytwarzanych przez żywe organizmy powstaje w formie chiralnej i charakteryzuje się wysoką (w niektórych przypadkach absolutną) czystością optyczną. W odniesieniu do wielu związków, w tym również szerokiego wachlarza związków o potencjalnym znaczeniu farmakologicznym, uzyskanie tak wysokiej enancjoselektywności reakcji jest w syntezie organicznej przy obecnym poziomie wiedzy ciągle jeszcze nieosiągalne. Do metod pozwalających otrzymać izomery optyczne należy rozdział mieszaniny racemicznej, synteza asymetryczna i synteza z wykorzystaniem chiralnego syntonu [41]. Źródłem nieracemicznych substancji o właściwościach leczniczych mogą być ponadto surowce naturalne. Przykładem może być atropina pozyskiwana z rośliny Atropa belladonna, czy będąca metabolitem pochodzenia drobnoustrojowego penicylina [42]. Ponieważ w części doświadczalnej tej pracy zastosowano syntezę z wykorzystaniem chiralnego syntonu, stąd przegląd metod otrzymywania substancji enancjomerycznie czystych prześledzono na przykładzie 2,3-epoksypropanolu (glicydolu, w skrócie GL) i 1-chloro-2,3-epoksypropanu (epichlorohydryny, w skrócie EP) (ryc. 2.3). H * H GL H * EP Ryc Wzory strukturalne 2,3-epoksypropanolu (GL) i 1-chloro-2,3-epoksypropanu (EP) Trójwęglowe cząsteczki glycidolu i epichlorohydryny, nazywane syntonami lub chironami C3, mogą być wprowadzane z retencją lub inwersją konfiguracji zapewniając homochiralność końcowego produktu. Zastosowanie oksiranów jako elementów budujących chiralność (ang. chiral building blocks) jest szczególnie atrakcyjne ze względu na różnorodną reaktywność pierścienia epoksydowego, stwarzającą szerokie możliwości syntetyczne. Przegląd rozpoczynają syntezy korzystające z tzw. chiralnej puli (ang. chiral pool), czyli grupy łatwo dostępnych związków homochiralnych pochodzenia

21 21 naturalnego. Szerzej zostały omówione: asymetryczna epoksydacja, za którą jej twórca Barry Sharpless otrzymał w 2001 roku agrodę obla, rozdział kinetyczny mieszaniny racemicznej oraz biokatalityczne modyfikacje obu metod. Chiralne syntezy związków leczniczych bazujące na syntonach C3 przedstawiono w rozdziale Synteza z wykorzystaniem homochiralnych związków naturalnych Łatwo dostępne, enancjomerycznie czyste związki posiadające sprzyjające chemicznym modyfikacjom grupy funkcyjne tworzą tzw. chiralną pulę. W jej skład wchodzą związki naturalne jak cukry, aminokwasy, hydroksykwasy i terpeny [41, 43]. Są one przydatne przy tworzeniu diastereoizomerycznych pochodnych umożliwiających rozdział racematów, a w syntezie asymetrycznej pełnią funkcję chiralnych pomocników (ang. chiral auxiliary) lub reagentów indukujących pożądaną konfigurację centrum chiralnego produktów [44]. Synteza nieracemicznego 2,3-epoksypropanolu (GL) i 1-chloro-2,3- epoksypropanu (epichlorohydryna, EP) obejmowała początkowo przekształcenia związków naturalnych takich jak D-mannitol [45], L-seryna [46], czy kwas Laskorbinowy [47]. Przekształcenia te wymagały utworzenia przejściowego związku 2,2dimetylo-4-hydroksymetylo-1,4-dioksolanu (A) (ryc. 2.4). W zależności od stosowanych dalej odczynników otrzymywano enancjomery glicydolu, przy czym z Lseryny tylko izomer (S), a z D-mannitolu i kwasu L-askorbinowego izomer (R).

22 22 CH2H H 3C H H H Aceton H H + H H CH2H D -Mannitol 1. Pb(Ac)4 lub ah 2. abh4 H 1.Ts, pirydyna H (R) -GL 2. H+ 3. H - H (S)-A 1. abh4 2. ah H H H Aceton H Ac H 1. abh4 2. ah + HC 3. H 4. Pb(Ac)4 H Kwas L - askorbinowy Ac - chlorek acetylu Ts - chlorek kwasu p-toluenosulfonowego 1. a2/h H2 HC L-Seryna H 2. ()2C() H 3. LiAlH 4 (R)-A 1. Ph3P/C4 2. AcH 3. a/et20 H H (S)-GL Ryc Schemat syntezy enancjomerów glicydolu (GL) z D-mannitolu, kwasu L-askorbinowego i L-seryny W 1978 Baldwin i in. opisali syntezę izomerów (R) i (S)-epichlorohydryny, które otrzymali z dobrą wydajnością wychodząc z tego samego substratu, a mianowicie z D-mannitolu [48] (ryc.2.5).

23 23 CH2H H H H H H (R) Ts H H+ H H Ts, pirydyna (S)-A CH2H Ph3P D -Mannitol DMF, C4 H (S) Ts H a glikol etylenowy (S)-EP (R)-GL H H Ms, Et3, toluen Ms (S) H H H Ms (R) H Ph3P - trifenylofosfina a glikol etylenowy Et3 - trietyloamina Ts - chlorek kwasu p-toluenosulfonowego Ms - chlorek kwasu metylosulfonowego (R)-EP Ryc Schemat syntezy enancjomerów (R) i (S)-epichlorohydryny (EP) z D-mannitolu becnie glicydole i pokrewne syntony C3 otrzymuje się na drodze asymetrycznej epoksydacji alkoholu allilowego oraz kinetycznego rozdziału materiału racemicznego przez hydrolizę enzymatyczną.

24 Synteza asymetryczna Współczesna chemia organiczna w coraz większym stopniu stosuje metody syntezy asymetrycznej, które pozwalają na otrzymanie enancjomerów o pożądanej konfiguracji bezpośrednio z achiralnych substratów. Reakcje tego typu polegają na wprowadzeniu optycznie czynnego elementu, który indukuje chiralność nowego centrum stereogenicznego. W zależności od stosowanego czynnika chiralnego wśród metod syntezy asymetrycznej wyróżnia się absolutną syntezę asymetryczną oraz reakcje z chiralnym reagentem, chiralnym związkiem pomocniczym lub chiralnym katalizatorem. Asymetryczna epoksydacja Inspiracją do podjęcia badań nad chiralnymi katalizatorami była wysoka enancjoselektywność procesów zachodzących w żywych organizmach. becnie w syntezie preparatów chiralnych wykorzystuje się syntetyczne kompleksy katalityczne lub układy biologiczne (izolowane enzymy lub całe organizmy drobnoustrojów) [49]. W latach 80. Katsuki i Sharpless [50] opracowali dogodną metodę otrzymywania glicydoli i pokrewnych syntonów C3 na drodze asymetrycznej epoksydacji alkoholi allilowych. W metodzie tej substrat traktowany jest układem katalitycznym, w którego skład wchodzi: tytanian tetraizopropylu (Ti(i-Pr)4), nieracemiczny diizopropylowy ester kwasu winowego (DET) oraz wodoronadtlenek tbutylu (TBHP). Intensywnie rozwijająca się technika asymetrycznej epoksydacji poszerzyła wachlarz komponentów układu katalitycznego. becnie, obok wcześniej wymienionych ligandów, stosowane są również nieracemiczne winiany metylowe (DMT), etylowe (DET) i cykloheksylowe (DCHT) o konfiguracji (R,R) lub (S,S), stężony roztwór wodoronadtlenku kumenu lub t-butylu (TBHP) jako utleniacz oraz alkoholan, tytanian tetra-t-butylu (ryc. 2.6) [51]. Wprowadzenie sit molekularnych eliminujących ślady wody z odczynników i środowiska reakcji umożliwiło zastosowanie katalitycznych ilości winianu (ok % mol) oraz tytanianu tetra-i-propylu (5-10 % mol), przyczyniając się tym samym szybkiej komercjalizacji metody (ryc. 2.7) [52]. do

25 25 R2C R1 Ti R1 R1 R1 - H R1 H CR2 H i-pr Ti( i-pr)4 (+)-(R,R) lub (-)-(S,S) t-bu Ti( t-bu)4 R2 - Me : DMT Et : DET i-pr : DIPT H PhC(Me)2H TBHP Ryc Komponenty układów katalitycznych stosowanych w asymetrycznej epoksydacji 6% (+)-(R, R)-DIPT H 5% Ti( i-pr)4 2 eq PhC(Me)2H Sita molekularne 3A H (S)-GL wyd % ee 90% H (R)-GL 6% (-)-(S, S)-DIPT Ryc Schemat asymetrycznej epoksydacji alkoholu allilowego z zastosowaniem katalitycznych ilości winianu i tytanianu tetraizopropylu Pod koniec lat 80. rozszerzono asymetryczną epoksydację o rozdziały kinetyczne alkoholi allilowych oraz zmodyfikowano proces epoksydowania łatwo rozpuszczalnych w wodzie alkoholi o niskiej masie cząsteczkowej [53-55]. Modyfikacja ta polegała na prowadzeniu reakcji epoksydacji z utworzeniem krystalicznej pochodnej epoksydu in situ. W przypadku wspomnianych alkoholi (np. glicydolu) pozwoliło to na zwiększenie uzyskiwanego nadmiaru enancjomerycznego (ee) poprzez pojedynczą lub wielokrotną krystalizację oraz ułatwiło izolację niestabilnego produktu z mieszaniny poreakcyjnej. Reakcje asymetrycznego epoksydowania cechuje wysoki stopień indukcji asymetrycznej, rzadko obserwowane oddziaływanie grup funkcyjnych z pierścieniem oksiranowym i brak reakcji ubocznych związanych z właściwościami kwasowymi tytanianu (wg Lewisa). Zaletą metody jest także możliwość łatwego określenia

26 26 konfiguracji absolutnej produktu, która bezpośrednio wynika z konfiguracji atomów węgla winianów. Dostępność katalizatorów i reagentów oraz dobre wydajności sprawiają, że reakcje asymetrycznego epoksydowania są szeroko wykorzystywane w syntezie chiralnych cukrów, terpenów, farmaceutyków i produktów pośrednich do syntez [56, 57]. ależy dodać, że najlepsze indukcje asymetryczne uzyskuje się dla 3-E-jedno i 2,3-dwupodstawionych alkoholi. Stwierdzono, że na obniżenie enancjoselektywności wpływ wywiera obecność dużego podstawnika w pozycji Z [58]. W 1990 roku Jacobsen i in. [59] oraz Katsuki i in. [60] równocześnie opisali asymetryczną epoksydację z wykorzystaniem chiralnego katalizatora złożonego z kompleksu metalu przejściowego manganu (III) związanego koordynacyjnie z ligandem (tzw. salenem), będącym zasadą Schiffa (ryc. 2.8). Metoda ta stanowiła przełom w epoksydacji, pozwalając na utlenienie z wysoką enancjoselektywnością alkenów pozbawionych grup funkcyjnych [61-63]. Szybki rozwój tej techniki wiązał się z wprowadzeniem nowych katalitycznych kompleksów zawierających atom kobaltu (III) lub chromu (III). W reakcjach, obok katalizatora, uczestniczą także substancje pomocnicze działające jako ligandy łączące się z metalem w kompleksie salenowym (ryc. 2.9). Są to -tlenki: 4-,dimetyloaminopirydyny, 4-fenylopirydyny lub 2-metyloimidazol. Utleniaczami stosowanymi w reakcji epoksydowania są natomiast chloran (I) sodu (a), jodozobenzen (PhI), kwas meta-chloronadbenzoesowy (m-cpba) lub nadtlenek wodoru [64]. Układy salenowe stosuje się przede wszystkim do selektywnego epoksydowania cyklicznych i acyklicznych Z-dwu- i trójpodstawionych alkenów. Mechanizm asymetrycznego epoksydowania nie jest do końca wyjaśniony. Przypuszczalnie w czasie połączenia alkenu z aktywnym chiralnym kompleksem tworzy się rodnikowy produkt pośredni, który ulega cyklizacji formując epoksyd o konfiguracji Z, rzadziej E [65].

27 27 Ligandy zaprojektowane przez Jacobsena + Mn R R Ligandy zaprojektowane przez Katsuki t-bu t-bu R R (S,S) R = -t-bu -Me R R + t-bu + Mn X Mn R Ph Ph Ph Ph R t-bu (S,S) (S,S) R = -Me -Me -TIPS [Si(iPr)3] R = -Me -H X = -Ac Ryc Chiralne ligandy kompleksów salenowych stosowane w epoksydacji asymetrycznej Utleniacze a H22 PhI - Jodozobenzen m-cpba Kwas meta-chloronadbenzoesowy Substancje pomocnicze + + -tlenek 4-,-dimetyloaminopirydyny -tlenek 4-fenylopirydyny -Metyloimidazol Ryc Utleniacze i substancje pomocnicze stosowane w asymetrycznej epoksydacji

28 Rozdział kinetyczny W kinetycznym rozdziale racemicznej mieszaniny (ang. kinetic resolution, KR) wykorzystywana jest różnica szybkości reagowania enancjomerów w obecności chiralnego reagenta lub chiralnego katalizatora. Reakcję przerywa się, gdy jeden z izomerów ulegnie całkowitemu przekształceniu - stąd maksymalna wydajność procesu wynosi 50 %. Innym sposobem kontroli przebiegu rozdziału jest stosowanie w reakcji połowy ilości odczynnika [66]. Rozdział kinetyczny terminalnych epoksydów opiera się na reakcjach nukleofilowego otwarcia pierścienia oksiranowego katalizowanych przez chiralne kompleksy salenowe z chromem [67] lub kobaltem [68-70] (ryc. 2.10). t-bu t-bu M X t-bu M = Cr, X = 3 t-bu M = Co, X = Ac M = Co, X = [C(CF3)3]H2 Ryc Chiralne kompleksy salenowe stosowane w rozdziałach kinetycznych terminalnych epoksydów Rozdziały alkilowych pochodnych terminalnych epoksydów przeprowadzono z wykorzystaniem nukleofila - azydku trimetylosililowego (TMS3) oraz kompleksu salenowego (Co)III3 (ryc. 2.11). trzymanymi produktami były 1-azydo-2-alkohole, które dalej przekształcano w 2-amino 2-alkohole (wykorzystane w syntezie (S)propranololu), oraz odzyskiwane z wysokim nadmiarem enancjomerycznym wyjściowe oksirany [71, 72]. W końcu lat 90. do rozdziałów kinetycznych katalizowanych kompleksami salenowymi zastosowano w roli odczynnika nukleofilowego wodę [73]. Proces hydrolitycznego rozdziału kinetycznego (ang. hydrolytic kinetic resolution, HKR) został po raz pierwszy opisany przez zespół Jacobsena. owa procedura pozwoliła na otrzymywanie z wysoką indukcją asymetryczną epoksydów i 1,2-dioli (ryc. 2.12).

29 29 (±) R (S,S)-(salen)Cr 3 (R,R)-(salen)Cr 3 (1mol%) TMS 3 TMS 3 (0,5 eq.) (0,5 eq.) TMS + R R H R + 3 R ee% * wyd.% H t-bu (1mol%) TMS 3 Cr 3 R t-bu t-bu Me Et n-bu CH2 t-bu (R,R)-(salen)Cr 3 * maksymalna teoretyczna wyd. = 50% Ryc Schemat kinetycznego rozdziału terminalnych epoksydów z zastosowaniem azydku trimetylosililowego i kompleksu salenowego(co)iii3 R (R,R)-(salen)CoIIIAc (0,2-2 mol%) (±) 0,55 eq. H2 H t-bu Co Ac t-bu t-bu (R,R)-(salen)CoIIIAc + R H t-bu H R ee 99% ee 94 > 99% R * wyd.% * wyd.% Me n-bu CH2 CH2Br H ** * maksymalna teoretyczna wyd. = 50% ** wyd. spowodowana DKR Ryc Schemat HKR terminalnych epoksydów katalizowanego kompleksem salenowym(co)iiiac

30 30 Ryc przedstawia hydrolityczny rozdział kinetyczny epichlorohydryny (EP) katalizowany kompleksem salenowym CoIIIAc. Dodanie THF w charakterze rozpuszczalnika zmniejsza szybkość racemizacji epichlorohydryny i pozwala na otrzymanie w reakcji z 0.5 eq. wody epoksydu i diolu o czystości enancjomerycznej 96 % z wydajnością odpowiednio 44 % i 50 % [74]. (R,R)-(salen)Co III Ac (2 mol%) H (R)-B (S)-EP THF, 4oC, 24h (±)-EP + 0,5 eq. H2 H 96% ee, wyd. 44% 96% ee, wyd. 50% Ryc Schemat HKR racemicznej epichlorhydryny (EP) katalizowanego kompleksem salenowym(co)iiiac z dodatkiem THF jako rozpuszczalnika Zmniejszenie ilości katalizatora ((S,S)-(salen)CoIIIAc z 2 do 0,5 mol %) przy hydrolitycznym rozdziale epichlorohydryny pozwala otrzymać optycznie czysty diol (R)-B z 99 % nadmiarem enancjomerycznym (ryc. 2.14). Po wydzieleniu z mieszaniny chiralnej EP i przeprowadzeniu reakcji otwarcia pierścienia oksiranowego (1eq. wody i 1mol % (R,R)-(salen)CoIIIAc) uzyskuje się enancjomery (R)- lub (S)- związku B z wydajnością 41 %. (S,S)-(salen)CoIIIAc (0,5 mol%) (R,R)-(salen)CoIIIAc (1 mol%) (±)-EP 0,55 eq. H2 THF, 4oC, 16h H (R)-EP >99% ee 1,0 eq. H2 THF, 4oC, 24h H (R)-B 99% ee, wyd. 41% Ryc Schemat HKR epichlorohydryny pozwalający uzyskać 2-(R)-3-chloro-1,2propanodiol (B) z 99 % ee Racemiczna epibromohydryna (C) w warunkach HKR tworzy chiralny epoksyd, który w odróżnieniu od EP ulega szybkiej racemizacji (ryc 2.15). Przy 50 % konwersji

31 31 otrzymywano 2-(R)-3-bromo-1,2-propanodiol (D) z 96 %, natomiast epoksyd tylko z 6 %, nadmiarem enancjomerycznym. Jest to przykład dynamicznego rozdziału kinetycznego (ang. dynamic kinetic resolution, DKR), który umożliwia racemizację in situ niepożądanego stereoizomeru, a następnie jego przekształcenie w docelowy produkt z wydajnością ilościową [74]. W przypadku epibromohydryny DKR pozwala uzyskać chiralny diol D z 93 % wydajnością. Chiralne diole (B) i (D) są bezpośrednio przekształcane w optycznie czynny glicydol (GL) pod wpływem K2C3. Przedstawiona sekwencja HKR reprezentuje prostą i skuteczną metodę syntezy wzbogaconego enancjomerycznie glicydolu z racemicznej epichloro- i epibromohydryny. H (S,S)-(salen)CoIIIAc (2 mol%) + Br Br H (R)-D 1,5 eq. H2 THF, 4oC, 24h (±)-(C) Br DKR 96% ee, wyd. 93% K2C3 (R)-GL 96% ee, wyd. 88% H Ryc Schemat dynamicznego rozdziału kinetycznego (DKR) epibromohydryny (C) W 2003 roku Larrow i współpracownicy [75] opracowali nowy sposób otrzymywania enancjomerycznie czystej epichlorohydryny na skalę przemysłową. Modyfikacja procedury polegała na rozdzieleniu procesu przygotowania (aktywacji) katalizatora od właściwej reakcji HKR. Szybka inaktywacja kompleksu (salen)coiiiac kwasem L-askorbinowym zmniejszała straty powodowane racemizacją i przekształceniem w 1,3-dichloro-2-propanol. Efektywna redukcja katalizatora (do CoII) pozwoliła na izolację epichlorohydryny na drodze destylacji próżniowej z wydajnością 88 % i nadmiarem enancjomerycznym 99 %.

32 32 Wysoki nadmiar enancjomeryczny epichlorohydryny (99 %) uzyskano także stosując przy jej rozdziale przeciwjony PF6ˉ, BF4ˉ oraz Brˉ w kompleksach salenowych CoIII [76]. Zaletą nowych katalizatorów była możliwość ich wielokrotnego użycia bez straty aktywności. W obecności CoIII-(PF6) i (BF4) nie dochodzi do racemizacji epichlorohydryny ani w czasie HKR, ani podczas destylacji enancjomerycznego produktu. Problem ten występował, gdy stosowano (salen)coiiiac. Hydrolityczny rozdział kinetyczny z zastosowaniem kompleksów Jacobsena stał się jedną z najczęściej stosowanych transformacji w syntezie nieracemicznych związków w laboratoriach badawczych i w przemyśle. Zdobyczami tej technologii z ostatnich lat są: - użycie katalizatorów związanych ze stałym nośnikiem [77], - prowadzenie reakcji bez rozpuszczalnika (solvent-free) oraz ich katalizowanie kompleksem salenowym zawierającym fluor (C8F17CH) [78] lub oligomerycznym kompleksem salenowym z silnie elektronossącym ligandem sulfonowym ( p-tosyl) [79], - stosowanie jako ligandów kwasów Lewisa np.: BF3 w oligomerycznych kompleksach CoIII [80]. Przegląd najnowszych osiągnięć asymetrycznej epoksydacji z zastosowaniem homo- i heterogenicznej katalizy dają w swoich pracach Xia i in. [64] oraz McGarrigle i Gilheany [81] Metody biokatalityczne Dynamiczny rozwój metod biokatalitycznych sprawił, że są one z powodzeniem wykorzystywane do pozyskiwania chiralnych produktów zarówno na drodze enancjoselektywnych przekształceń prochiralnego substratu [82-84], jak również separacji enancjomerów z mieszanin racemicznych [85]. Do niewątpliwych zalet procesów katalizowanych przez enzymy należą wysoka stereo-, regio- i chemoselektywność, dobra wydajność, a także łagodne i przyjazne dla środowiska warunki reakcji (niska temperatura, wodne środowisko, ciśnienie atmosferyczne, brak szkodliwych substratów) [86].

33 33 Asymetryczna epoksydacja z udziałem enzymów Bakterie takie jak ocardia corallina, Rhodococcus equi czy Pseudomonas oleovorans stereoselektywnie epoksydują etery i chlorki allilowe do pochodnych glicydolu (np.: pochodne arylowe stosowane w syntezie β-blokerów) i epichlorohydryny (ryc. 2.16). Warto podkreślić, że o ile dla alkoholi allilowych wyższe wydajności uzyskuje się stosując utlenianie Sharplessa, to w przypadku chlorków do tej pory nie opisano metody efektywniejszej niż asymetryczna epoksydacja z udziałem enzymów [45, 87]. R ocardia corallina R (S) Rhodococcus equi lub R Pseudomonas oleovorans (S) R Ryc Asymetryczna epoksydacja eterów allilowych z udziałem mikro-organizmów Alternatywną reakcją pozwalającą uzyskać tlenowe pochodne glicydolu jest enzymatyczna redukcja prochiralnych ketonów katalizowana przez drożdże piekarskie Saccharomyces cerevisiae. Powstający pośredni diol jest przekształcany w pierścień oksiranowy pod wpływem chlorku tosylowego (ryc. 2.17) [51]. Chiralny glicydol i epichlorohydrynę można otrzymać przez rozdział kinetyczny racemicznego materiału z wykorzystaniem procesów enzymatycznych [88]. Rozdział ten może być katalizowany przez lipazy, dla których materiałem wyjściowym są estrowe pochodne glicydoli, bądź przez hydrolazy epoksydowe bezpośrednio separujące racemiczne epoksydy. Trzecią grupę enzymów generującą optycznie czynne syntony C3 stanowią dehalogenazy halogenohydryn [89]. Poniżej podana została krótka charakterystyka stosowanych enzymów oraz przykłady ich zastosowań.

34 34 Saccharomyces cerevisiae H H H (S) 1.Ts, pirydyna 2. ah, CH22 (S) Ryc Schemat enzymatycznej redukcji prochiralnych ketonów prowadzącej do pochodnych glicydolowych Enzymatyczny rozdział kinetyczny W rozdziałach racemicznego substratu najczęściej stosowane są lipazy - enzymy z grupy hydrolaz, które w warunkach fizjologicznych katalizują m. in. reakcje estryfikacji, transestryfikacji, syntezy peptydów, a także hydrolizy estrów, amidów i peptydów. Lipazy dostępne są jako całe komórki (żywe lub w stanie spoczynku) lub jako częściowo oczyszczone preparaty białkowe pozyskiwane z mikroorganizmów grzybów i bakterii: Porcine pancreatic (PPL), Pseudomonas fluorescens (PFL), Candida antarctica (CAL-B), Rhizopus oryzae (RL). Enzymy te cechuje niska specyficzność substratowa, co czyni je uniwersalnymi katalizatorami rozdziałów kinetycznych. Techniki immobilizacji, czyli powierzchniowej adsorpcji na modyfikowanych nośnikach, umożliwiły wielokrotne wykorzystanie enzymów lub mikroorganizmów i produkcję w trybie ciągłym. Podobnie jak w metodach chemicznych, enzymatyczny rozdział kinetyczny opiera się na różnej szybkości reakcji enancjomerów. Zazwyczaj, aby nie dopuścić do reakcji wolniejszego enancjomeru, stosuje się połowę reagenta w stosunku do racematu lub ogranicza czas prowadzenia syntezy [51]. gólna procedura katalizowanego lipazami rozdziału kinetycznego umożliwiającego uzyskanie optycznie czynnych glicydoli bazuje na estryfikacji racemicznych alkoholi lub hydrolizie racemicznych estrów [51]. a ryc przedstawiono schemat metody pozwalającej na otrzymywanie glicydolu w wyniku kinetycznego rozdziału maślanu glicydolu (E) [89, 90].

35 35 Lipazy I lub II lub III + H H H (R)-E (R)-GL Lipazy H III H (±)-E H Lipazy IV H (S)-E + (S)-GL H H (S)-GL Metoda I: Lipazy z Porcine pancreatic (PPL) Metoda II: Lipazy z Rhizopus oryzae (RL) Metoda III: Lipazy z Porcine pancreatic (PPL) Metoda IV: Lipazy z Candida antarctica frakcja B (CAL-B) Ryc Schemat rozdziału kinetycznego katalizowanego lipazami umożliwiający syntezę optycznie czynnego glicydolu (GL) [84,90] W metodzie II i III stosowane są immobilizowane lipazy z Rhizopus oryzae (RL) i wyselekcjonowana lipazopodobna frakcja o ciężarze 25 kda, oczyszczona z Porcine pancreatic (PPL). W obu procesach uzyskano produkt z ponad 99 % nadmiarem enancjomerycznym przy 50 % konwersji. Enzymatyczna hydroliza chiralnego związku (R)-GL pozwoliła otrzymać enancjomer (S)- glicydolu (ryc Metoda III) [90]. statnio Palomo i in. [90] przeprowadzili kinetyczny rozdział maślanu glicydolu (E) stosując lipazy z Candida antarctica (CAL-B), które immobilizowano różnymi technikami. Katalityczne właściwości (aktywność, specyficzność i enancjoselektywność) preparatów oraz właściwy dobór warunków reakcji pozwoliły uzyskać (S)-GL z wysokim nadmiarem enancjomerycznym (99 %) (ryc. 2.18, Metoda IV). ależy podkreślić, że do tej pory żadna z technik korzystających z enzymów lipolitycznych jako biokatalizatorów nie pozwoliła uzyskać enancjomeru (S)-glicydolu z tak wysoką wydajnością. Enancjomer (R)-epichlorohydryny otrzymano w wyniku rozdziału racemicznego 2,3-dichloro-1-propanolu (F) (ryc. 2.19). W reakcji katalizowanej immobilizowanymi

36 36 lipazami z Pseudomonas sp. tworzył się chiralny związek (S)-F, który pod wpływem zasady ulegał przekształceniu w epoksyd EP [45, 91, 92]. H Pseudomonas sp. H (S)-F (±)-F zasada (R)-EP Ryc Schemat enzymatycznego rozdziału racemicznego 2,3-dichloro-1-propanolu (F) Połączenie enzymatycznych metod kinetycznego rozdziału z racemizacją zachodzącą pod wpływem metaloorganicznych katalizatorów lub odpowiedniego środowiska pozwala na zwiększenie wydajności otrzymywanych epoksydów i stanowi przykład DKR. Lipazy ze względu na swoją trwałość w układach racemizujących okazały się skutecznymi katalizatorami DKR [93]. W ostatnim czasie coraz powszechniej do produkcji optycznie czynnych epoksydów i ich diolowych pochodnych stosuje się hydrolazy epoksydowe i dehalogenazy fluorowcohydryn [94]. Hydrolazy epoksydowe (HE) wydają się być wszechobecne w świecie przyrody [95, 96]. Występują w organizmach roślinnych, zwierzęcych (ssaki i owady), a także w bakteriach i grzybach, gdzie katalizują reakcje przyłączenia cząsteczki wody do pierścienia oksiranowego [97]. To przekształcenie w bardziej polarny, łatwo eliminowany z ustroju diol odgrywa istotną rolę w biochemicznych procesach degradacji epoksydów, które często powstają jako produkty pośrednie w metabolicznych transformacjach różnych ksenobiotyków. Toksyczne działanie epoksyzwiązków związane jest z dużą reaktywnością pierścienia oksiranowego, który posiadając silne elektrofilowe własności może reagować z biologicznymi odczynnikami nukleofilowymi. Ze względu na swoją aktywność detoksykacyjną HE są intensywnie badaną grupą enzymów. Wśród nich najlepiej poznanymi są hydrolazy wyizolowane z komórek ssaków [98, 99]. Enzymy te znalazły zastosowanie w asymetrycznej

37 37 hydrolizie recemicznych epoksydów, pozwalającej na uzyskanie stereoizomerów epoksyzwiązków i wicinalnych dioli z wysokim nadmiarem enacjomerycznym [100]. Dehalogenazy halogenohydryn (DHH) katalizują odwracalną reakcję formowania pierścienia oksiranowego przez oderwanie cząsteczki halogenowodoru z vicinalnych halogenohydryn [101]. Hydrolazy epoksydowe i dehalogenazy halogenohydryn zastosowano w tandemowej reakcji otrzymywania chiralnych halogenohydryn, epoksydów i dioli (ryc. 2.20) [ ]. Mieszanina racemiczna (S) H + H (R) nie ulega konwersji DHH -H HE + H H HD H +H2 (S) HE + H DHH -H (R)-EP HE (S)-EP H -H DHH DHH - Dehalogenazy halogenohydryn z Agrobacterium radiobacter (AD1) HE - Hydrolazy epoksydowe z Agrobacterium radiobacter (AD1) Ryc Schemat tandemowej reakcji z zastosowaniem dehalogenaz halogenohydryn (DHH) i hydrolaz epoksydowych (HE)

38 Zastosowanie chiralnych syntonów w syntezie farmaceutyków wybrane przykłady 2.4.1Reaktywność oksiranów Epoksydy są grupą związków szeroko wykorzystywaną w syntezie organicznej [ ]. Swoją uniwersalność zawdzięczają nietypowej dla zwykłych eterów dużej reaktywności wiązania C-, która wynika z naprężeń trójczłonowego pierścienia oksiranowego (ryc. 2.21) [108]. Reakcjom epoksydów często towarzyszy otwarcie układu cyklicznego i podstawienie grupy hydroksylowej (glicydolu GL) lub fluorowca (epichlorohydryny EP) w łańcuchu bocznym (C-1). C-3 C-1 C-2 X X -H Glicydol GL - Epichlorohydryna EP Ryc Pozycje w pochodnych epoksydowych podatne na atak odczynników elektroi nukleofilowych twarcie pierścienia oksiranowego twarcie pierścienia epoksydowego w pozycji C-2 lub C-3 zależy od czynników sterycznych i elektronowych substratu oraz od warunków reakcji. Wiązania eterowe C ulegają bowiem rozszczepieniu zarówno w wyniku oddziaływania odczynników nukleofilowych [109] i elektrofilowych [110] w warunkach stechiometrycznych, jak również w reakcjach katalizowanych przez kwasy [111] i zasady [112]. Z literatury znane są reakcje przeprowadzone na stałym nośniku lub w układach dwufazowych [ ]. W środowisku zasadowym lub obojętnym podstawienie nukleofilowe przebiega z otwarciem pierścienia w pozycji C-3 (ryc. 2.22). Zazwyczaj reakcja zachodzi zgodnie z mechanizmem substytucji S2, która prowadzi do inwersji konfiguracji atomu węgla o niższej rzędowości (C-3) [116].

39 39 + R 2 u: R 3 H Hu1 u 3 R + u1: u Ryc Regioselektywne otwarcie pierścienia epoksydowego w środowisku zasadowym W warunkach zasadowych 2,3-epoksyalkohole i ich pochodne (np. tosylowe) mogą podlegać przegrupowaniu Payne a, które jednak nie wiąże się ze zmianą konfiguracji asymetrycznego atomu węgla (ryc. 2.23) [45, 116]. (2R) H (2R) Ryc Przegrupowanie Payne a Regioselektywność otwarcia pierścienia przy atomie węgla C-3 zwiększa się, gdy w reakcji uczestniczą jony metali (Ti, Mg, Al) [57, 117, 118]. Bonini i in. prześledzili wpływ kationów litu i magnezu na preferencje halogenków (, Br, I) w nukleofilowej addycji do 2,3-epoksyalkoholi. Stwierdzili oni, że odczynnik nukleofilowy preferuje atom węgla C-3 względem C-2 [ ]. Mechanizm ten w pełni koresponduje z teoretycznym modelem dyferencjałów energetycznych stanów przejściowych [122]. Z uwagi na wysoką regio- i stereoselektywność procesu, otwarcie pierścienia epoksydowego stanowi dogodną metodę otrzymywania 1,2-dwupodstawionych struktur [ ]. Reakcje te katalizowane są kwasami Lewisa lub silnymi zasadami i zazwyczaj przebiegają z utworzeniem drugiego centrum chiralnego [ ]. ptycznie czynne wicinalne halogeno-, amino-, czy alkoksyalkohole są często wykorzystywane w syntezie farmaceutyków [ ]. W nukleofilowej, katalizowanej przez kwasy addycji epoksyd ulega przekształceniu w kation oksoniowy, który w kolejnym etapie jest atakowany przez nukleofil (ryc. 2.24). Podstawienie zachodzi przy atomie węgla C-2, a mechanizm tej reakcji jest najczęściej mieszany (S1/S2) [108, 116]. Atak odczynnika nukleofilowego

40 40 na atom węgla C-2 jest rzadziej obserwowany, co wynika z faktu dezaktywacji tej pozycji przez czynniki steryczne i elektronowe [140, 141]. 1 H + R H R R H 2 u u: Ryc Regioselektywne otwarcie pierścienia epoksydowego w środowisku kwaśnym W 2003 roku grupa japońskich naukowców, kontynuując swoje badania nad zastosowaniem związków boru (()3B) w nukleofilowych reakcjach otwarcia pierścienia oksiranowego, zauważyła, że regioselektywność procesu zwiększa się na korzyść atomu węgla C-2 po dodaniu kwasu octowego [ ]. Substytucja jodków w trans-2,3-epoksyalkoholach zawierających dodatkowy atom tlenu w łańcuchu bocznym (np.: grupa benzenosulfonylowa) prowadziła do powstania jodohydrynowych pochodnych C-2 z bardzo wysoką selektywnością (dla grupy benzenosulfonowej C-2/C-3 99/1). Autorzy zaproponowali mechanizm regioselektywnego otwarcia pierścienia, w którym dodatek kwasu stabilizuje pośrednią strukturę i uniemożliwia jej przekształcenie w przegrupowaniu Payne a (ryc.2.25) [145]. Tworzenie krystalicznych pochodnych glicydoli Ze względu na swoją wysoką reaktywność glicydole są zazwyczaj transformowane w trwalsze krystaliczne pochodne [53, 55, 146]. Proces ten przeprowadzany jest in situ po asymetrycznej epoksydacji alkoholi allilowych i obejmuje reakcje tworzenia tlenowych pochodnych eterowych (arylowych i sililowych) lub estrowych (sulfonowych i karboksylowych). Metody derywatyzacji można podzielić na zabezpieczające i aktywujące podstawioną grupę hydroksylową (ryc. 2.26) [45].

41 41 H R ()3B ai Me R B Me Me I Me B Me R R B Me H 2 H R I I I CH Me B C-2/C-3 wyd. % Pr - 82 : : 8 99 : 1 87 : BnCH2- + H R R I Ph2SCH2BnC2H Ryc Regioselektywne otwarcie pierścienia oksiranowego w pozycji C-2 katalizowane związkami boru Zabezpieczenie polega na podstawieniu grupy funkcyjnej grupą mniej reaktywną, chroniącą przed niepożądanymi reakcjami. Zablokowanie pierwszorzędowej grupy alkoholowej glicydolu umożliwia przyłączenie odczynnika nukleofilowego do atomu węgla C-3 i otwarcie pierścienia epoksydowego. Związkami zabezpieczającymi są zazwyczaj chlorki p-nitrobenzoilu (PB), trifenylu (Tr) przy czym te ostatnie, ze względu na swoją bierność wobec kwasów i benzylu (Bn), i zasad, są stosowane najczęściej [45]. Proces aktywacji wiąże się z przekształceniem grupy funkcyjnej w pochodną, która w kolejnych reakcjach umożliwia selektywne wprowadzenie odczynnika nukleofilowego w pozycję C-1. Zazwyczaj tworzy się estry kwasu sulfonowego, takie jak p-toluenosulfoniany (epoksytosylany), metylosulfoniany (epoksymesylany), czy o-, m-, p-nitrobenzenoslfoniany (epoksynosylany).

42 42 R Aktywacja Zabezpieczenie R: Bn PB Ts CH2 C s S2 S2 2 Tr C(C6H5)3 Ms S2 Ryc Grupy zabezpieczające i aktywujące glicydol Generalnie, silne nukleofile takie jak aminy, reszty alkoksylowe i aroksylowe reagują selektywnie z pochodnymi sulfonowymi z bezpośrednim podstawieniem przy C-1 [147]. Addycja związków metaloorganicznych (słabsze nukleofile) oraz reakcje katalizowane przez kwasy zachodzą przy atomie węgla C-3 i powodują otwarcie pierścienia epoksydowego. Większą regioselektywność na korzyść podstawienia przy C-1 można uzyskać stosując pochodne benzenosulfonowe podstawione w pierścieniu aromatycznym grupą z deficytem elektronowym. Stąd, w reakcjach wymagających bezpośredniego podstawienia pierścienia arylosulfonowego, dogodnym substratem jest pochodna m-nitrobenzenosulfonowa (ryc. 2.27, A C-1 ). Selektywne otwarcie pierścienia oksiranowego przy atomie węgla C-3 gwarantuje zastosowanie tosylanu (ryc. 2.27, A C-3 ) [141, 148]. Podobnie jak reszty estrowe i eterowe w pochodnych glicydolu, w cząsteczce epichlorohydryny (EP) substytucji może ulegać atom fluorowca. Pozycje C-1 i C-3 nie są jednak równocenne i regioselektywny atak odczynnika nukleofilowego promuje atom węgla C-3, prowadząc do powstania halogenohydryny [148]. Ta w środowisku zasadowym traci cząsteczkę halogenowodoru formując układ cykliczny (ryc. 2.28). Jeśli reagujący odczynnik posiada dodatkowe centra nukleofilowe, to po przyłączeniu w pozycję C-3 EP następuje kolejny atak, tym razem w pozycji C-2, i tworzy się układ bicykliczny (spiro) (ryc. 2.28). Transformacja ta została przedstawiona w dalszej części rozdziału na przykładzie syntezy (+)-trehazolinu.

43 H 1 Utlenianie A przy C3 Aktywacja Zabezpieczenie H H u u A Z A przy C3 A przy C3 A przy C1 H H u Z u A u Z - Zabezbieczenie A - Aktywacja A - Addycja nukleofilowa u u - ukleofil Ryc Możliwe przekształcenia uaktywnionych i zabezpieczonych pochodnych glicydolu u C u 3 1 C-3 u H- u u + H u H u C-3 C-2 u u H Ryc Substytucja nukleofilowa w cząsteczce epichlorohydryny (EP)

44 Zastosowanie chiralnych syntonów C3 - wybrane przykłady Reakcje otrzymywana chiralnych syntonów C3 (tzw. chironów) często stanowią pośredni etap bardziej złożonych syntez. Znajdują w nich zastosowanie nie tylko glicydol i epichlorohydryna, ale także ich arylosulfonowe i benzylowe pochodne. Te ostatnie, reagując z odczynnikami nukleofilowymi bardziej selektywnie niż związki macierzyste, pozwalają otrzymać produkt o pożądanej konfiguracji centrum chiralnego. a H (R)-GL Br H H C-3 Ac HBr, AcH (+)DIPT Ti( i- Pr)4 CHP ah H (-)DIPT Ti( i- Pr)4 H CHP H Ts C-1 Ts (S)-GL i-prh2 C-1: wyd. 70% H H C-3: wyd. 48% (S)-Propranolol Ryc Schemat syntezy (S)-propranololu z enancjomerów glicydolu (GL) uzyskanych w wyniku asymetrycznej epoksydacji alkoholu allilowego

45 45 H Metoda 1 C-3: Metoda 2 wyd. 75%; ee 98,4% C-1: wyd. 90%; ee 99,4% CH2CH2 CsF CsF (R) S C-3 C-1 (S) 2 H ah i-prh2 H H CH2CH2 CH2CH2 CH2CH2 (S)-Atenolol Leki otrzymane wg. Metody 2 (S) H H H H (S)-ksprenolol (S)-Bisoprolol wyd. 95%; ee 99,5% H H wyd. 90%; ee 98,8% H (S)-Pindolol wyd. 83%; ee 99,2% H. H H (S)-Propranolol H wyd. 98%; ee 99,8% Ryc Schemat syntezy (S)-atenololu oraz przykłady leków β-adrenolitycznych otrzymanych z arylosulfonowych pochodnych glicydolu Chirony wykorzystano w syntezie wielu związków stosowanych jako leki w schorzeniach układu sercowo-naczyniowego. Jednym z nich jest propranolol (1-

46 46 izopropylo-3-(1-naftyloksy)-2-propanol), którego enancjomer (S) jest nieselektywnym β-blokerem podawanym w chorobie niedokrwiennej serca (chorobie wieńcowej) [149]. Generalnie, synteza propranololu, a także innych przedstawionych na ryc preparatów o podobnym działaniu, obejmowała reakcję przyłączenia reszty aminowej do atomu węgla C-3 pochodnych 1-aryloksy-2,3-epoksypropanu otrzymywanych wcześniej z chiralnych syntonów. Syntony te uzyskiwano ze związków naturalnych tzw. chiralnej puli w wyniku enzymatycznego rozdziału kinetycznego mieszaniny racemicznej [83, ]. Asymetryczna epoksydacja, ze względu na możliwość przeprowadzenia szybkiej funkcjonalizacji nietrwałego glicydolu w pochodne arylosulfonowe, wydaje się być najdogodniejszą z metod pozwalających otrzymać β-adrenolityki z bardzo dobrą wydajnością i czystością optyczną (ryc. 2.30) [148, 154, 155]. Me H S H G C2 H H S I H H H S H H H H J H S Ryc Wzory strukturalne związków o niespecyficznym działaniu na receptory adrenergiczne: G działanie kardiotoniczne, I hipotensyjne, J adrenergiczne, H stosowany w leczeniu jaskry a ryc przedstawiono przykłady związków o niespecyficznej aktywności adrenergicznej, w syntezie których zastosowano epichlorohydrynę (G), glicydol (H) oraz jego tosylową (I) i -benzylową (J) pochodną [45]. Ze strukturą glicydolu i jego tosylową pochodną wiąże się także synteza asymetryczna fostrecinu (ryc. 2.32) - substancji o działaniu przeciwnowotworowym [156].

47 47 (H)2P H H H Fostrecin Ryc Wzór strukturalny fostrecinu W 1995 roku Camps i in. przedstawili syntezę obu enancjomerów przeciwgrzybiczego leku ketokonazolu z (R)- i (S)-epichlorohydryny (ryc. 2.33) [157]. S C R H H R C (2R, 4S)-(+)-Ketokonazol S (2S, 4R)-(-)-Ketokonazol Ryc Wzory strukturalne enancjomerów ketokonazolu Z kolei w syntezie dwóch antydepresyjnych leków fluoksetyny i tomoksetyny wykorzystano enancjomery (2S,3S)-(-)- i (2R,3R)-(+)-3-fenylo-2,3-epoksypropan-1-olu, które otrzymano w wyniku asymetrycznej epoksydacji alkoholu cynamonowego (ryc. 2.34) astępne etapy obejmowały otwarcie pierścienia epoksydowego przy atomie węgla C-2 w reakcji regioselektywnej redukcji [158]. CF3 S (S)-Fluoksetyna H S H (S)-Tomoksetyna

48 48 Ryc Wzory strukturalne (S)-fluoksetyny i (S)-tomoksetyny W reakcji (R)-epichlorohydryny z cyklopentanodienem litu tworzy się optycznie czynny związek spiro (1-(hydroksymetylo)spiro[2,3]hepta-4,6-dien) będący strukturą pośrednią w syntezie biologicznie aktywnego (+)-trehazolinu (ryc. 2.35). Jako inhibitor glikozydazy, ten naturalny pseudodisacharyd należy do substancji odgrywających istotną rolę w immunologii, wirusologii i onkologii. Pochodne trehazolinu mogą w przyszłości być skutecznymi lekami stosowanymi w nieinsulinozależnej cukrzycy [159]. ah H - (R)-EP + Li H H H H H H H H H (+)-Trehazolin Ryc Schemat syntezy (+)-trehazolinu Chiralną epichlorohydrynę (R)-(-) wykorzystano również do syntezy 3(R)HETE (kwasu (R,5Z,8Z,11Z,14Z)-3-hydroksyeikoza-5,8,11,14-tetraenowego) i 3(R)HTDE (kwasu (R,5Z,8Z)-3-hydroksytetradeka-5,8-dienowego) (ryc. 2.36) [160]. pracowana metoda stanowi interesującą alternatywę dla kłopotliwej procedury biotechnologicznego pozyskiwania tzw. 3(R)-hydroksy-oksylipidów. Wykazano, że 3(R)-HETE i jego pochodne odgrywają kluczowa rolę w morfogenezie grzyba Candida albicans [161]. Związki te są ponadto silnymi mediatorami stanu zapalnego, wpływając na procesy chemotaksji, fagocytozy, czy wydzielania leukotrienów w ludzkim organizmie. Wyjaśnienie mechanizmu działania HETE i HTDE jest niezwykle istotne, ponieważ inhibitory 3(R)-hydroksy-oksylipidów mogą stać się skutecznymi lekami w zakażeniach grzybiczych.

49 49 H H CH CH (3R)-HETE (3R)-HTDE Ryc Wzory strukturalne (3R)-HETE i (3R)-HTDE (R)-(-)-karnityna (witamina BT) odgrywa istotna rolę w przemianach energetycznych żywych organizmów pobudzając degradację długołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Stosowana bywa pomocniczo w leczeniu otyłości, jako środek obniżający stężenie lipidów we krwi u hemodializowanych pacjentów oraz w chorobach niedokrwiennych serca [162]. Ponieważ, jak wspomniano w rozdziale 2.2, enancjomer (S)-karnityny odpowiedzialny jest za niepożądane działanie uboczne, syntetyzowany jest tylko aktywny izomer (R). pracowane metody otrzymywania optycznie czynnej witaminy BT obejmują syntezę asymetryczną [163], techniki fermentacyjne [164] oraz wykorzystanie chiralnego substratu [165]. a ryc przedstawiono dwie metody syntezy (R)-(-)-karnityny, w których materiałem startowym była chiralna epichlorohydryna. bie metody związane są z nukleofilową addycją do atomu węgla C-3 pierścienia epoksydowego. W pierwszej z nich, na (S)-EP działano równocześnie trimetyloaminą i cyjanohydryną acetonu (ryc. 2.37, Metoda 1) [164, 166], w drugiej bromkiem winylomagnezowym na enancjomer (R)-EP (ryc.2.37, Metoda 2) [167].

50 50 Metoda 1 30% Me3 Me3+ Me2C(C)H (R) (S)-EP Me3+ H C H st. Me3+ CH H (R)-(-)-Karnityna Metoda 2 MgBr Me3 (R)-EP Me3+ H IRA-410(H) (R) 3, AcH H H- Me3+ H22 CH (R)-(-)-Karnityna Ryc Schemat syntezy (R)-(-)-karnityny z (S) i (R)-epichlorohydryny

51 Aktywność farmakologiczna i mechanizmy działania metyloksantyn Metylowe pochodne ksantyny, jak teofilina (1,3-dimetyloksantyna), kofeina (1,3,7-trimetyloksantyna) i teobromina (3,7-dimetyloksantyna) (ryc. 2.38), zostały po raz pierwszy wyodrębnione z surowców roślinnych (z liści herbaty Camelia sinesis, nasion kawy Coffea arabica, nasion drzewa kakaowego Theobroma cacao) i zakwalifikowane do grupy alkaloidów purynowych [42] Kofeina 1,3,7-Trimetyloksantyna 1 3 H H 3 Teofilina 1,3-Dimetyloksantyna 7 Teobromina 3,7-Dimetyloksantyna Ryc Wzory strukturalne kofeiny, teofiliny i teobrominy Wymienione metyloksantyny wykazują wielokierunkową aktywność farmakologiczną. Działają rozkurczająco na mięśnie gładkie oskrzeli (działanie bronchodilatacyjne), naczyń krwionośnych i przewodu pokarmowego. Wpływają także pobudzająco na centralny układ nerwowy, stymulują czynności układu sercowo-naczyniowego oraz mięśni szkieletowych. Zwiększając przepływ krwi przez nerki wzmagają przesączanie kłębuszków, stąd wykazują działanie diuretyczne. Zastosowanie w farmakologii metylowych pochodnych ksantyny uzależnione jest od siły, z jaką wpływają na poszczególne układy. Teofilina posiadająca najsilniejsze działanie bronchodilatacyjne stosowana jest w dychawicy oskrzelowej oraz innych schorzeniach związanymi ze stanami spastycznymi oskrzeli [23]. Jej działanie terapeutyczne w astmie obejmuje także pobudzenie ośrodka oddechowego i zwiększenie jego wrażliwości na C2 oraz działanie przeciwzapalne, wynikające z upośledzenia aktywności eozynofili [168]. Dane eksperymentalne i kliniczne wykazały,

52 52 że w dawkach leczniczych teofilina hamuje późną odpowiedź immunologiczną inicjowaną wziewnymi alergenami, powstrzymując chemotaksję, a następnie rozpad mastocytów i eozynofili [169]. Te ostatnie, oprócz mediatorów stanu zapalnego (histamina, serotonina, rodniki tlenowe, leukotrieny i prostaglandyny), uwalniają także kationowe białka, jak EP (ang. eosinophil peroxidase), ECP (ang. eosinophil cationoc protein), ED (ang. eosinophil-derived neurotoxin), MBP (ang. major basic protein), które powodują uszkodzenie śródbłonka dróg oddechowych i nadwrażliwość oskrzeli [170]. Wpływ teofiliny na układ krążenia jest wypadkową ośrodkowego i obwodowego działania leku. Pobudzając ośrodek naczynio-ruchowy i bodźcoprzewodzący serca prowadzi do wzrostu ciśnienia krwi, który to efekt jest antagonizowany centralną stymulacją nerwu błędnego (bradykardia) i relaksacją naczyń obwodowych [3]. Wpływ na układ sercowo-naczyniowy może odbywać się również za pośrednictwem katecholamin, przypuszczalnie przez układ renina agiotensynaaldosteron (RAA). ajważniejszymi efektami sercowymi powodowanymi przez teofilinę są dodatni efekt inotropowy i chronotropowy (zwiększenie odpowiednio siły i częstości skurczu mięśnia sercowego) oraz działanie arytmogenne [171]. Zwiększając elastyczność błon komórkowych erytrocytów oraz hamując agregację trombocytów metyloksantyny wpływają na właściwości reologiczne krwi. Zmniejszając lepkość krwi zapobiegają tworzeniu się zakrzepów, stąd ich zastosowanie (np.: pentoksyfiliny) w schorzeniach przebiegających ze zwężeniem naczyń kończyn dolnych, jak zakrzepowe-zarostowe zapalenie naczyń (choroba Bürgera) [23]. Wpływ metyloksantyn, a szczególnie teofiliny, na kurczliwość mięśni szkieletowych poprawia aktywność przepony u pacjentów z chroniczną, obturacyjną chorobą płuc [172]. Wśród metyloksantyn kofeina i teofilina są lekami silnie stymulującymi ośrodkowy układ nerwowy (U). Lecznicze dawki kofeiny pobudzają ośrodki autonomiczne podwzgórza i rdzenia przedłużonego jak ośrodek naczynioruchowy, oddechowy, termoregulacji i przemiany materii, a stymulując korę mózgu powodują nasilenie aktywności psychicznej i poprawę kojarzenia. Kofeina znosi uczucie zmęczenia i senności, wzmaga koncentrację, usprawnia procesy myślowe. Ze względu na swoją aktywność analeptyczną lek ten stosowany jest w zapaści, niedociśnieniu, ale także jako środek tonizujący w stanach wyczerpania psychicznego i fizycznego [173].

53 53 W zwiększonych dawkach powoduje uczucie niepokoju, bezsenności, nudności, wymioty i drżenia mięśniowe [174]. Przy przekroczeniu maksymalnego stężenia we krwi o 50 % może powodować drgawki pochodzenia korowego; silniej w tym zakresie działa teofilina. Pobudzający wpływ metyloksantyn na ośrodek oddechowy wykorzystywany jest w stanach patologicznych, jak bezdech u wcześniaków, oddech Cheyne-Stokes a oraz depresja ośrodka oddechowego po przedawkowaniu opioidów lub w zatruciu barbituranami (kofeina) [171]. ajsłabiej działającą metyloksantyną jest teobromina. Stosowana bywa równocześnie z innymi lekami w nadciśnieniu tętniczym, zaburzeniach krążenia obwodowego i astmie oskrzelowej [3, 175]. Działanie farmakologiczne metyloksantyn jest wypadkową ich wpływu na kilka mechanizmów biochemicznych. Zazwyczaj wiąże się je z inhibicją fosfodiesterazy, a także z nieselektywnym antagonizmem względem receptorów adenozynowych [176]. Sugeruje się również wpływ ksantyn na wewnątrzkomórkowe stężenie jonów Ca2+ poprzez blokowanie zależnych od receptorów kanałów wapniowych i ograniczenie uwalniania tych jonów z zapasów wewnątrzkomórkowych. W efekcie ksantyny ograniczają gromadzenie się w komórce kationów wapnia (Ca2+) wyzwalających mechanizm skurczu [177, 178]. becny w komórkach enzym fosfodiesteraza odpowiedzialny jest za rozkład cyklicznych nukleotydów camp i cgmp do odpowiednich 5-monofosforanów. Hamowanie fosfodiesterazy przez metyloksantyny powoduje nagromadzenie cyklicznego 3 5 -adenozynomonofosforanu (camp), co prowadzi do relaksacji mięśni gładkich [174]. Krótkotrwały wzrost stężenia camp zwiększa transport jonów wapniowych do wnętrza komórki, wzmagając kurczliwość włókien mięśniowych. Z mechanizmem tym wiąże się wpływ metyloksantyn na właściwości reologiczne krwi. Syntetyczna pochodna metyloksantyn, pentoksyfilina, podwyższając poziom komórkowego ATP i camp, zwiększa elastyczność erytrocytów, hamuje agregację trombocytów, a także zmniejsza lepkość krwi [179]. W mniejszym stopniu hamowanie fosfodiesterazy przez teofilinę wpływa na jej aktywność chrono- i inotropową. Wpływ na fosfodiesterazę, choć obserwowany, nie stanowi jednak głównego mechanizmu działania metyloksantyn. Stwierdzono bowiem, że teofilina w warunkach in vitro hamuje aktywność enzymu dopiero w stężeniu 5-krotnie wyższym niż to powodujące

54 54 rozkurcz mięśni oskrzeli [3]. Pozwala to powiązać aktywność terapeutyczną metyloksantyn z ich antagonistycznym wpływem na receptory adenozynowe (RA). Występujące na powierzchni większości komórek organizmu człowieka receptory adenozynowe, zostały podzielone na cztery podtypy: A1, A2A, A2B, A3. Te glikoproteinowe struktury należą do receptorów metabotropowych sprzężonych z regulującą proteiną G [180]. Badania nad receptorami purynergicznymi (P), których podrodzinę stanowią receptory adenozynowe (RA), zapoczątkował Burnstock, postulując występowanie specyficznych błonowych struktur dla ATP [182]. Wyodrębnił dwa typy receptorów purynergicznych: P2, łączące się z ATP, oraz P1 (adenozynowe), dla których naturalnym agonistą jest adenozyna. Do tej pory wyróżniono 4 podtypy receptorów P1 i 11 podtypów receptorów P2 [183, 184]. Bronchodilatacyjny mechanizm działania teofiliny, leku stosowanego w terapii dychawicy oskrzelowej od 1937 roku, wiąże się najprawdopodobniej z jej wpływem na receptory adenozynowe typu A1 i A2 [176]. Blokując je, uniemożliwia przyłączenie się silnie kurczącego mięśnie gładkie nukleozydu - adenozyny. Przeciwzapalną aktywność metyloksantyn adenozynowych łączy się także występujących z na antagonistycznym powierzchni działaniem eozynofili (typ receptorów A3) [170] i mastocytów ( typ A2B) [185, 186]. Stosowane w niewydolności serca metyloksantyny (głównie teofilina i syntetyczne pochodne: aminofilina i diprofilina), łącząc się z obecnymi w mięśniu sercowym RA1, znoszą powodowane adenozyną niepożądane działanie chrono-, dromoi inotropowe [187]. Selektywna blokada występujących w nerkach RA1, prowadząca do naddiurezy, łagodzi objawy ostrej niewydolności nerek [188]. ieselektywne blokowanie receptorów A1, A2A i A2B występujących ośrodkowym układzie nerwowym odpowiedzialne jest za analeptyczne w i stymulujące metabolizm działanie metyloksantyn [189]. Dużej skuteczności teofiliny w leczeniu astmy towarzyszy niestety jej niekorzystny wpływ na układ sercowo-naczyniowy, ośrodkowy układ nerwowy i układ pokarmowy. Podawanie teofiliny nasila pracę serca i prowadzi do zwiększenia zapotrzebowania na tlen. Towarzyszą temu często bóle wieńcowe i zaburzenia rytmu serca. Przekroczenie stężenia teofiliny we krwi powyżej 30 μg/cm3 zwiększa niebezpieczeństwo wystąpienia migotania komór oraz niedotlenienia U, co prowadzi

55 55 do drgawek i śpiączki [190, 191]. Działania uboczne pochodzenia centralnego są efektem pobudzenia ośrodków nerwowych zlokalizowanych w korze, pniu mózgu oraz rdzeniu przedłużonym. W zwiększonych dawkach lek wywołuje niepokój, bezsenność, a także nudności, wymioty i drżenia mięśniowe [192]. Pochodne metyloksantyny wywołują również wzmożone wydzielanie soku żołądkowego, co nasila dolegliwości w chorobie wrzodowej. Rozluźnienie mięśnia zwieracza przełyku i zwiększenie refleksu bywa przyczyną zgagi i pieczenia za mostkiem [193]. Tabela 2.2. Stosowane w lecznictwie syntetycznych pochodnych teofiliny (przykłady) R1 - R7 R3 R1 R8 R3 R7 R8 - -CH2-CH2(H)-CH2(H) -H Doksofilina CH2 - C2H5 azwa Diprofilina -H CH2 Bamifilina C2H5-H Pentoksyfilina -CH2-(CH2)3-C - - -H Przyczyną często pojawiających się działań ubocznych jest wąski indeks terapeutyczny związany z niską biodostępnością oraz słabą rozpuszczalnością związku w wodzie. W przypadku teofiliny, by ograniczyć ryzyko objawów niepożądanych, stosuje się preparaty o przedłużonym działaniu pozwalające na względną kontrolę stężenia leku we krwi [171]. W tab. 2.2 przedstawiono przykłady syntetycznych pochodnych teofiliny, które znalazły zastosowanie w lecznictwie Poszukiwania biologicznie aktywnych pochodnych teofiliny

56 56 d kilkudziesięciu lat trwają poszukiwania nowych pochodnych teofiliny, które zachowując aktywność związku macierzystego pozbawione byłyby jej działań ubocznych. Generalnie badania obejmują poszukiwania związków o silniejszym działaniu przeciwastmatycznym, wybiórczym działaniu na układ krążenia (działanie hipotensyjne) i U. dkrycie receptorów adenozynowych i powiązanie aktywności farmakologicznej metyloksantyn z antagonistycznym wpływem na te struktury skutkuje w ostatnim czasie rosnącą liczbą doniesień o nowych, biologicznie aktywnych pochodnych. Modyfikacje chemiczne obejmują cały układ teofiliny i wiążą się nie tylko z wprowadzeniem podstawników w pozycję -7, -9, C-8 (ryc. 2.39), czy zamianą grup metylowych w pierścieniu pirymidyny, lecz także tworzeniem skondensowanych układów trójcyklicznych. R1 R7 R8 R3 R9 Ryc Miejsca chemicznych przekształceń w układzie ksantyny Generalnie, każdy typ przekształceń pociąga za sobą zmianę preferencji względem receptorów adenozynowych. a tej podstawie sformułowano kilka zależności pomiędzy strukturą nowych pochodnych ksantyny a ich oddziaływaniem na podtypy RA. Pochodne z dużym cyklicznym podstawnikiem w pozycji C-8 oraz zawierające alkilowy (np.: n-propylowy) fragment przy atomach -1 i -3 ksantyny stanowią grupę selektywnych antagonistów receptora A1 (ryc. 2.40). Sugeruje się ponadto, że brak podstawnika w pozycji -7 odgrywa kluczową rolę w aktywności receptorowej tego typu związków [194].

57 57 H H CPX H DPCPX KW-3902 Ryc Wzory strukturalne selektywnych antagonistów receptora A1 Selektywna blokada RA1 prowadzi do naddiurezy z minimalnym wpływem na kaliurezę, nerkowy przepływ krwi i filtrację kłębuszkową. Stąd blokowanie tego receptora może być użyteczne w leczeniu niewydolności mięśnia sercowego, a także ostrej niewydolności nerek [195]. Wprowadzenie w pozycję C-8 styrylu o konfiguracji E pozwala uzyskać struktury działające antagonistycznie względem receptorów A2A (ryc. 2.41). W tym przypadku podstawienie w -7 nie wpływa na aktywność farmakologiczną. H3 C - - H3 C KW H MSX-2 Ryc Wzory strukturalne selektywnych antagonistów receptora A2A Selektywni antagoniści A2A mogą w przyszłości okazać się skutecznymi lekami stosowanymi w chorobach neurodegeneracyjnych (choroba Parkinsona, pląsawica Huntingtona) [196, 197]. Związki z grupy selektywnych antagonistów A2B mogą z kolei znaleźć zastosowanie w leczeniu astmy, niedotlenieniu mięśnia sercowego, reakcji

58 58 alergicznych oraz w nieinsulinozależnej cukrzycy i związanych z nią retinopatiach [176]. ależą tu m.in. 1,3-dialkilowe pochodne ksantyny zawierające w pozycji C-8 podstawiony pierścień fenylowy [188, 198, 199] lub też niedawno opisane struktury bez podstawnika w -3 [200] (ryc. 2.42). R= C MRS CH C MRS CH CH2-R -CH MRS 1595 CVT 5440 R1 R1 = 2Me3Me- Ryc Wzory strukturalne selektywnych antagonistów receptora A2B becność reszty fenylowej zwiększa powinowactwo do receptora A3 [201]. Wśród ligandów tego receptora poszukuje się związków o działaniu przeciwastamtycznym, przeciwzapalnym i przeciwarytmicznym (ryc. 2.43) [202]. CH2CH R R = H2 R = HC Ryc Wzory strukturalne przykładowych ligandów receptora A3 Przekształcenia w obrębie układu ksantyny obejmują również reakcje cyklokondensacji i tworzenia trójpierścieniowych układów (ryc. 2.44). Przykładem są

59 59 pochodne triazolopuryny, w której dodatkowy pierścień heterocykliczny jest przyłączony w pozycji A lub B (ryc. 2.45). Związki te wykazują antagonistyczne właściwości względem RA1 i RA3 [203]. Związki z dodatkowym układem perhydropirymidyny skondensowanym w pozycji C i z noradamantylową pochodną przy atomie węgla C-8 selektywnie łączą się z receptorem A1 szczura (ryc. 2.46). D R1 A R7 E R8 R3 B C Ryc Pozycje dodatkowych pierścieni heterocyklicznych w trójcyklicznych pochodnych ksantyny [203] R1 R4 R2 n R4 R2 R1 n = 1, 2 Ryc Struktury ligandów receptorów adenozynowych A1 i A3 utworzonych wyniku przekształceń w pozycji A i B n n = 1, 2 w

60 60 Ryc Przyłaczenie dodatkowego pierścienia w pozycję C układu ksantyny becny w położeniu D pierścień imidazoliny jest charakterystycznym elementem strukturalnym silnych antagonistów podtypów A1, A2A i A3 (ryc. 2.47) [204]. R1 H Ryc Struktura antagonistów receptorów A1, A2A i A3 powstających po przyłączeniu pierścienia imidazoliny w pozycję D układu ksantyny Antagonistyczne właściwości względem RA wykazują także związki heterocyklicznym pierścieniem skondensowanym w położeniu E. z Pochodne pirolidynowe podstawione w pozycji C-7 układem arylowym lub heteroarylowym posiadają słabe powinowactwo i niską selektywność względem receptorów A1 i A2A [205]. atomiast pochodne ksantyny zawierające pierścień triazolowy podstawiony dodatkowo ugrupowaniem aromatycznym (np. aniliną) posiadają właściwości antagonistyczne względem RA2A i A3 (ryc. 2.48) [206]. H 3C R1 H2

61 61 Ryc Pochodne pirolino[2,1-f]purynodionu o niskim powinowactwie do receptorów adenozynowych oraz pochodna 1,2,4-triazolo[3,4-f]purynodionu, antagonista receptorów A2A i A3 Wśród pochodnych zawierających przyłączony pierścień uwodornionej pirymidyny otrzymano związki będące selektywnymi antagonistami receptora A2A. Ich aktywność zależy między innymi od długości łańcucha węglowego łączącego ugrupowanie aromatyczne z macierzystą strukturą, przy czym najlepsze wyniki uzyskano dla związków z mostkiem etylenowym (z oktylowym łańcuchem w pozycji C-7) [203]. Również wśród pochodnych 8-pirymidynonu znaleziono aktywne struktury wykazujące powinowactwo do receptorów A1 i A2A [207] (ryc. 2.49). (CH2)n Ar (CH2)n CH(CH2)m-R Ar = X = -, F R= X -()2 -(C2H5)2 n = 0, 1, 2 n = 1, 2, 4 m = 2, 3 Ryc Pochodne tetrahydropirymido[2,1-f]purynodionu i pirymid-8-on[2,1f]purynodionu o selektywnych antagonistycznych właściwościach względem RA2A Przyłączenie w pozycji 7,8-teofiliny dodatkowego, heterocyklicznego pierścienia: imidazolowego, pirymidynowego lub diazepinowego modyfikuje także aktywność ośrodkową macierzystej teofiliny. Pochodne te, podstawione odpowiednio w -8, -9 i -10 grupami zasadowymi (np.: piperazynoalkilową lub piperazynoarylową), posiadają silne działanie analgetyczne i sedatywne (ryc. 2.50) [208, 209].

62 62 8 H 3C (CH2)n Y 9 (CH2)3 Y 10 X = CH2 C X (CH2)3 Y Y = -Ar -R Ryc Trójcykliczne pochodne teofiliny o działaniu sedatywnym i analgetycznym Wykazano, że siła działania sedatywnego zależy od ugrupowania aminowego i jest najsilniejsza w przypadku pochodnych imidazolo[2,3-f]purynodionu, zawierających w pozycji -8 podstawnik fenylopiperazynopropylowy lub fenylopiperazynobutylowy (ryc. 2.51) [210]. Z kolei pochodne imidazolo[2,3-f]purynodionu posiadające w pozycji -8 ugrupowanie benzylowe a przy C-7 fragment aminopropyloamidowy lub alkoksypropyloamidowy wykazywały, podobnie jak macierzyste metyloksantyny, pobudzający wpływ na U (ryc. 2.52) [211]. 8 Ar = (CH2)n Ar n = 2, 3 Ryc Pochodne imidazolo[2,3-f]purynodionu o działaniu sedatywnym ośrodkowy układ nerwowy na

63 63 CH(CH2)3-R 3 1 -()2 - -C2H5 5 R= 7 -(C2H5)2 Ryc Pochodne imidazolo[2,3-f]purynodionu o działaniu pobudzającym ośrodkowy układ nerwowy Poszukując aktywnych analogów teofiliny uzyskano także jej pochodne oksazolowe, wśród których związek podstawiony w C-7 fragmentem n-oktylowym posiadał wysokie powinowactwo do receptora A2A oraz aktywność przeciwdrgawkową (ryc. 2.53) [212]. Jak wspomniano wyżej, antagoniści RA2A mogą mieć znaczenie jako leki neuroprotekcyjne, stosowane w między innymi w chorobie Parkinsona. (CH2)7- Ryc Pochodna oksazolo[2,3-f]purynodionu antagonista RA2A 2.7. Aktywność farmakologiczna i metody syntezy P23 a początku lat 90. w grupie 7,8-dwupodstawionych pochodnych teofiliny otrzymano związek 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofilinę (P23) (ryc. 1.1), który u zwierząt wykazywał działanie krążeniowe. Pod względem aktywności przewyższał stosowaną w lecznictwie aminofilinę, cechował się natomiast mniejszą od niej toksycznością [3]. Podany jednorazowo powodował obniżenie ciśnienia krwi, zwolnienie akcji serca i przyspieszenie oddychania. Zapobiegał rozwojowi nadciśnienia

64 64 naczyniowonerkowego. P23 zwiększał także ukrwienie serca, mięśni prążkowanych i mózgu. Mechanizm działania hipotensyjnego najprawdopodobniej związany jest z efektem ośrodkowym i obwodowym, w którym miolityczna aktywność jest wynikiem hamowania fosfodiesterazy camp i łączenia się z receptorami adenozynowymi A1 i A2. Ponieważ po podaniu dokomorowym związek P23 obniżał ciśnienie krwi, jego działanie obwodowe wiązano z wpływem na receptory α2. Wykluczono natomiast mechanizm blokowania receptorów adrenergicznych α1 [3]. a ryc przedstawiono trzy metody syntezy związku P23, różniące się sposobem wymiany fluorowca na grupę aminową w pozycji C-8 układu teofiliny. Związkiem wyjściowym była zawsze 7-(2 -hydroksy-3 -chloropropylo)-8- bromoteofilina (K), którą otrzymywano w wyniku przyłączenia racemicznej epichlorohydryny do 8-bromoteofiliny (ryc. 2.54). H Br pirydyna H Br K Ryc Schemat syntezy 8-bromo-7-(2-hydroksy-3-chloropropylo)teofiliny (K) Dwie z opisanych metod obejmują bezpośrednie podstawienie atomu bromu w strukturze K, w reakcji z benzyloaminą (ryc. 2.55, Metoda A) lub amoniakiem (ryc. 2.55, Metoda B). W kolejnym etapie na otrzymane pochodne, odpowiednio 8-benzyloamino-7-(2-hydroksy-3-chloropropylo)teofilinę (L) i 8-amino-7-(2- hydroksy-3-chloropropylo)teofilinę (), działano stechiometryczną ilością morfoliny w obecności wodorotlenku potasu. W wyniku tej reakcji związek ulegał przekształceniu do P23, natomiast 8-benzyloamino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofilina (M) wymagała dodatkowo debenzylacji przeprowadzonej stężonego kwasu siarkowego. w środowisku

65 65 Metoda A K Metoda C H Br etanol t.w. benzyloamina etanol t.w. ah Metoda B dioksan / H2, t.p. 25 % H3 H H L etanol t.w. 25% H3 H H2 morfolina etanol t.w. KH M morfolina etanol t.w. KH H H 90% H2S4 H H2 P23 Ryc Metody syntezy 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo] teofiliny (P23) chronione patentem [1] W trzeciej z metod (ryc. 2.55, Metoda C) wykorzystano reakcje tworzenia pochodnych 2,3 -oksazolidyno-7,8-teofiliny z 7-(2-hydroksy-ropylo) i 7-(2- hydroksy-3-chloropropylo)8-chlorowcopodstawionej teofiliny [ ]. Amonoliza otrzymanego w ten sposób związku, przeprowadzona pod ciśnieniem w etanolowowodnym roztworze amoniaku, prowadziła do otwarcia pierścienia oksazolidyny

66 66 i wprowadzenia w pozycję C-8 grupy aminowej. statni etap, przyłączenia morfoliny, przebiegał analogicznie jak w Metodzie B. 3. BADAIA WŁASE Związek P23 otrzymano w postaci racemicznej i w takiej formie został on poddany wstępnym badaniom farmakologicznym. Z przedstawionych w rozdziale 2.2 przykładów wynika, że stereoizomery mogą wykazywać różnorodną aktywność farmakologiczną. Stereoizomery chiralnych, biologicznie aktywnych substancji

67 67 podlegają obecnie obligatoryjnym badaniom toksykologicznym, farmakodynamicznym i farmakokinetycznym [217]. Ich przeprowadzenie wymaga wcześniejszego wyodrębnienia enancjomerów, co stanowi cel prezentowanej pracy Zarys projektowanych metod syntezy enancjomerów P23 Zaprezentowane w rozdziale 2.6 metody otrzymywania racemicznego związku 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofiliny (P23) zasugerowały możliwość przeprowadzenia podobnych reakcji z wykorzystaniem chiralnych syntonów C3. W tym celu wybrano dwie pochodne epoksydowe: p-toluenosulfonian 2,3epoksypropylu (nazywany dalej: epoksy tosylanem ET) oraz 4-(2,3-epoksypropylo)morfolinę (8) (ryc. 3.1). Pierwsza z nich jest dostępnym w handlu odczynnikiem, natomiast drugą otrzymano w reakcji chiralnej epichlorohydryny (EP) z morfoliną. * Ryc Struktura so2 * (S)-(+)-ET (R)-(-)-ET p-toluenosulfonianu epoksypropylo)-morfoliny (8) (S)-(-)-8a (R)-(+)-8b 2,3-epoksypropylu (ET) i 4-(2,3-

68 68 H3 C * 1 Br (R)-(-)-ET lub (S)-(+)-ET H (-)- 8a lub (+)- 8b so2 H Br 2 * H Br * Br 38% ah H morfolina * H3 gaz. 25% H3 9 * * H H2 P23 25% H3 Ryc Projekt syntezy 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofiliny (P23) a ryc. 3.2 przedstawiono dwie koncepcje syntezy enancjomerów P23. W pierwszej z nich, po utworzeniu tosylowej pochodnej w reakcji 8-bromoteofiliny (1) z ptoluenosulfonianem 2,3-epoksypropylu (ET), zaplanowano wymianę reszty arylosulfonowej na morfolinę. Powstający związek 2 powinien w środowisku

69 69 zasadowym ulegać cyklizacji tworząc 1,3-oksazolidynową pochodną puryny (9), a ta z kolei, poddana aminolizie, tworzyć 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4- ylo)propylo]teofilinę (P23). Drugi z wariantów zakłada wprowadzenie syntonu 4-(2,3epoksypropylo)-morfoliny (8), utworzenie oksazolinowej pochodnej i jej późniejszą aminolizę Próby zastosowania p-toluenosulfonianu 2,3-epoksypropylu jako chiralnego syntonu Synteza i reaktywność 7-[2-hydroksy-3-(4-tolilosulfonylo) propylo]-8-bromoteofiliny 7-[2-hydroksy-3-(4-tolilosulfonylo)propylo]-8-bromoteofilinę działając na 8-bromoteofilinę (1) enancjomerami (2) otrzymano p-toluenosulfonianu 2,3- epoksypropylu (ET) (ryc. 3.3). Dodatek katalitycznych ilości pirydyny, wiążącej atom wodoru w pozycji -7, zwiększał nukleofilowy charakter 8-bromoteofiliny ułatwiając jej atak na atom węgla C-3 pierścienia oksiranowego. W wyniku tej reakcji dochodziło do otwarcia pierścienia epoksydowego z równoczesnym przyłączeniem reszty teofiliny oraz utworzeniem grupy hydroksylowej w pozycji C-2 powstającego łańcucha propylowego. (R)-(-)-ET lub (S)-(+)-ET H3 C 1 so2 H Br pirydyna, n-propanol so2 H Br 2 Ryc Synteza 7-[2-hydroksy-3-(4-tolilosulfonylo)propylo]-8-bromoteofiliny (2)

70 70 Analiza widma 1H MR potwierdziła strukturę otrzymanego produktu 2. bok sygnałów pochodzących od protonów dwóch grup metylowych teofiliny (dwa singlety przy 3,55 i 3,37 ppm) obserwowano dwa charakterystyczne dublety przy 7,82 i 7,36 ppm oraz singlet przy 2,48 ppm, odpowiadające wprowadzonemu układowi aromatycznemu z podstawieniem grupą metylową w pozycji para. W widmie występowały również sygnały pochodzące od grupy hydroksylowej (3,80 ppm) oraz trójwęglowego łańcucha bocznego. Kolejne przekształcenia, jakim poddano 7-[2-hydroksy-3-(4-tolilosul- fonylo)propylo]-8-bromoteofilinę (2), przedstawiono na ryc bejmowały one wymianę ugrupowania arylosulfonowego w reakcji z morfoliną i benzyloaminą oraz tworzenie trójcyklicznej 1,3-oksazolidynowej pochodnej puryny. Planując reakcję 7-[2-hydroksy-3-(4-tolilosulfonylo)propylo]-8-bromoteofiliny (2) z morfoliną przypuszczano, że wymianie ulegać będzie tylko reszta kwasu p- toluenosulfonowego (ryc. 3.2). Analiza widm 1H MR produktu (3) reakcji sugerowała jednak równoczesne podstawienie przez morfolinę grupy tosylowej i atomu bromu w pozycji C-8. Postulowaną strukturę związku 7-[2-hydroksy-3-(morfolino-4ylo)-propylo]-8--morfolinoteofiliny (3) potwierdziło widmo masowe zawierające pik jonu molekularnego M+ przy m/z = 408 odpowiadający masie cząsteczkowej produktu, oraz wskazujące na brak atomu bromu w cząsteczce. Większej selektywności oczekiwano od reakcji związku 2 z benzyloaminą. Już w trakcie ogrzewania mieszaniny wytrącił się osad, który na podstawie analizy widma 1 H MR zidentyfikowano jako sól benzyloaminy z kwasem p-toluenosulfonowym. Analiza spektralna tworzącego się drugiego produktu (4) wskazywała na wymianę ugrupowania tosylowego na benzyloaminę. W widmie MS nie obserwowano piku izotopowego pochodzącego od atomu bromu z pozycji C-8 teofiliny. Wartość jonu molekularnego wynosząca M+ m/z = 341 wykluczała obecność drugiej cząsteczki benzyloaminy, sugerując jednocześnie trójcykliczną strukturę związku 4 (ryc. 3.4). Ze względu na niską wydajność reakcji (28,6 %) zrezygnowano z dalszych przekształceń 7(-benzyloaminometylo)-1,3-dimetylo-6,7-dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H,3Hpuryno-2,4-dionu (4), które wymagałyby wymiany reszty benzylowej na morfolinę.

71 71 H H 3C H 2 3 so2 H Br H2 H H3 g bzw. etanol wyd. 80% 4 wyd. ~10% so2 lub 5 Ryc Schemat przekształceń 7-[2-hydroksy-3-(4-tolilosulfonylo)propylo]-8bromoteofiliny (2) Innym sposobem otrzymywania oksazolidynowej pochodnej teofiliny jest przeprowadzenie reakcji 7-[2-hydroksy-3-(4-tolilosulfonylo)propylo]-8-bromoteo-filiny (2) z gazowym amoniakiem lub trzeciorzędową aminą (np.: pirydyną czy -

72 72 metylomorfoliną). Przepuszczając gazowy amoniak przez schłodzony etanolowy roztwór związku 2 otrzymano 7-(4-tolilosulfonylometylo)-1,3-dimetylo-6,7- dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1h,3h-puryno-2,4-dion (5) z 80 % wydajnością (ryc. 3.4). Trójcykliczną strukturę związku 5 potwierdziła analiza widm 1H MR oraz MS. W widmie protonowym widoczne były dwa dublety odpowiadające protonom ugrupowania aromatycznego podstawionego w pozycji para (ppm (δ: 7,79 ppm i 7,42 ppm ) oraz singlet - przy wartościach przesunięcia 2,50 ppm - pochodzący od trzech protonów grupy metylowej z reszty tosylowej. Zarejestrowano także dwa multiplety: przy 5,60-5,57 ppm, odpowiadający protonowi przy asymetrycznym atomie węgla, i 4, ppm, który przypisano czterem protonom nowego heterocyklicznego pierścienia. W widmie MS nie stwierdzono pików izotopowych pochodzących od atomu bromu. Pik jonu molekularnego M+ przy m/z = 406 odpowiadał strukturze z dodatkowym pierścieniem oksazolinowym skondensowanym z układem teofiliny. Związek 5 otrzymano także w reakcji z trzeciorzędowymi aminami jednak z niską wydajnością (10 %) Reakcja 7-(4-tolilosulfonylometylo)-1,3-dimetylo-6,7-dihydro -1,3-oksazolo-[2,3-f]-1H,3H-puryno-2,4-dionu z morfoliną Dalsze przekształcenia 7-(4-tolilosulfonylometylo)-1,3-dimetylo-6,7- dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1h,3h-puryno-2,4-dionu (5) miały na celu wymianę grupy tosylowej na morfolinę, a następnie amonolizę otrzymanego produktu 9 (ryc. 3.5). Przyłączenie grupy aminowej w pozycję C-8 teofiliny prowadziłoby do powstania końcowej struktury P23. a podstawie danych spektralnych (analizy widm MS i 1H MR) stwierdzono, że produktem jaki otrzymano w reakcji 5 z morfoliną była 7-[2-hydroksy-3-(4toliloosulfonylo)-propylo]-8-(morfolin-4-ylo)teofilina (7). Świadczyła o tym obecność sygnałów pochodzących od protonów ugrupowania tosylowego (dwa dublety δ: 7,81 i 7,42 ppm, oraz singlet 2.50 ppm), dwa charakterystyczne multiplety od protonów morfoliny (δ: 3,40 i 3,88 ppm) oraz poszerzony sygnał wskazujący na obecność w cząsteczce protonów grupy hydroksylowej (δ: 5,52 ppm). W widmie MS pik jonu molekularnego M+ przy m/z = 499 odpowiadał masie cząsteczkowej postulowanej struktury.

73 73 Wymiana ugrupowania tosylowego w związku 2 i w związku 5 nie prowadziła jednak do produktów, z których można otrzymać chiralną 8-amino-7-[2-hydroksy-3(morfolin-4-ylo)propylo]teofilinę (P23) bez wydłużania szlaku syntetycznego, stąd zaniechano dalszych prób. H etanol so2 H 9 Ryc. 25% H3 etanol bzw. etanol so2 H 5 Schemat przekształceń H H2 P23 7-(4-tolilosulfonylometylo)-1,3-dimetylo-6,7- dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1h,3h-puryno-2,4-dionu (5)

74 Próby wykorzystania 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny jako chiralnego syntonu Drugi szlak syntezy enancjomerów związku P23 obejmował reakcje z wykorzystaniem izomerów optycznych 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny ((-)-8 i (+)-8). Przebieg syntezy 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofiliny (P23), z uwzględnieniem tworzącego się produktu ubocznego (10), przedstawiono na ryc Ze względu na wysoki koszt chiralnych odczynników optymalizację warunków reakcji przeprowadzono na związkach racemicznych. H 1 ah EP H 8 Br pirydyna % H3 P23 H H2 Ryc Przebieg syntezy 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo) propylo] teofiliny (P23) z uwzględnieniem tworzącego się produktu ubocznego (10)

75 ptymalizacja warunków reakcji z odczynnikami achiralnymi Synteza racemicznej 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny (8) Racemiczną 4-(2,3-epoksypropylo)-morfolinę ((±)-8) otrzymano korzystając z metody opracowanej przez Heywood a i Phillips a [218]. Reakcję, w której na racemiczną epichlorohydrynę działano morfoliną z dodatkiem katalitycznej ilości wody, prowadzono przez 1 h utrzymując temperaturę w granicach C (ryc. 3.7). ukleofilowemu atakowi, przebiegającemu zgodnie z mechanizmem S2, ulegał atom węgla C-3 tworząc związek pośredni 3-chloro-1-(4-morfolino)-2-propanol (ryc. 3.7). Mniejszą reaktywność nieprotonowanego epoksydu rekompensowano wzmocnieniem zasadowości odczynnika nukleofilowego powstającego w reakcji morfoliny z wodą. H + H2 + H3+ H H3+ (±)-EP H 38% ah a (±)-8 Ryc Schemat syntezy racemicznej 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny ((±)-8) Utworzenie pierścienia oksiranowego wymagało wprowadzenia zasady (38 % roztwor ah) wiążącej wydzielający się chlorowodór (ryc. 3.7). Po ekstrakcji i oddzieleniu warstwy wodnej, otrzymany produkt oczyszczono przez destylację pod zmniejszonym ciśnieniem. Właściwości fizykochemiczne i spektroskopowe racemicznego produktu 8 były zgodne z danymi opublikowanymi w piśmiennictwie [219].

76 76 Synteza 7-(morfolinometylo)-1,3-dimetylo-6,7-dihydro-1,3-oksazolo [2,3-f]-1H,3Hpuryno-2,4-dionu (9) oraz 1,3-dimetylo-7-morfolin-4-ylo-7,8-dihydro-6H-[1,3]oksazyno[2,3-f]-1H,3H-puryno-2,4-dionu (10) Działając na 8-bromoteofilinę (1) 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliną ((±)-8) otrzymano dwa produkty, którym nadano symbole (±)-9 i (±)-10 (ryc. 3.8). a podstawie spektralnych analiz przedstawionych w podrozdziale ustalono, że są to izomeryczne związki z dodatkowym pierścieniem heterocyklicznym - odpowiednio pięcio- (9) i sześcioczłonowym (10) - skondensowanym z układem teofiliny w położeniu 7-, 8- pierścienia imidazolowego Ryc Wzory strukturalne izomerycznych związków 7-(morfolinometylo)-1,3dimetylo-6,7-dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H,3H-puryno-2,4-dionu (9) i 1,3-dimetylo-7morfolin-4-ylo-7,8-dihydro-6H-[1,3]-oksazyno[2,3-f]-1H,3H-puryno-2,4-dionu (10) Uzyskanie w jednoetapowej reakcji związku 9 było satysfakcjonujące. a podstawie przesłanek literaturowych [213] spodziewano się bowiem utworzenia trwałej łańcuchowej pochodnej 7-[2-hydroksy-3-(-morfolino)propylo]-8-bromoteofiliny (6) (ryc. 3.9). W pracach dotyczących tworzenia 1,3-oksazolidynowych pochodnych teofiliny [213] sugerowano, że czynnikiem wymuszającym taką przemianę jest dodatek stechiometrycznych ilości zasady. a podstawie własnych doświadczeń z zastosowaniem 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny ((±)-8) stwierdzono, że reakcja nie zatrzymywała się jednak na łańcuchowej pochodnej 6, lecz prowadziła bezpośrednio do utworzenia dwóch trójcyklicznych związków. Można przypuszczać, że zasadowe środowisko reakcji zapewniał dodawany w nadmiarze odczynnik ((±)-8) zawierający cząsteczkę drugorzędowej aminy (morfoliny).

77 77 H Br 6 Ryc Wzór strukturalny 7-[2-hydroksy-3-(-morfolino)propylo]-8-bromoteofiliny (6) W trakcie prowadzenia syntezy zauważono, że 7-(morfolinometylo)-6,7dihydrooksazolo[2,3-f]-puryna (9) tworzyła się jako pierwsza i przy dalszym ogrzewaniu ulegała szybkiej izomeryzacji do związku 10. Podjęto więc próby wyznaczenia warunków reakcji pozwalających otrzymać w sposób selektywny związek 9. Synteza, a następnie izomeryzacja struktury 9 do 10 przebiegała najszybciej w rozpuszczalnikach polarnych (2-metoksyetanol > n-butanol > n-propanol) o wysokich temperaturach wrzenia (2-metoksyetanol 125 C n-butanol 117 C). Istotny wpływ miał także dodatek katalizatora zasadowego (pirydyny lub trietylaminy). Przykładowo, prowadząc reakcję w 2-metoksyetanolu z dodatkiem pirydyny jako katalizatora, już po 5 minutach pojawiał się związek 9, który po kolejnych 10 minutach ulegał całkowitemu przekształceniu w związek 10. W przypadku, gdy stosowano rozpuszczalniki o podobnej polarności jak n-propanol czy n-butanol, o szybkości reakcji decydowały ich temperatury wrzenia (odpowiednio 98 C i 117 C). a podstawie przeprowadzonych prób stwierdzono, że syntezę 7- (morfolinometylo)-6,7-dihydrooksazolo[2,3-f]-puryny (9) najkorzystniej jest prowadzić w n-propanolu z dodatkiem pirydyny jako katalizatora. W tych warunkach po ok. 45 minutach 8-bromoteofilina ulegała całkowitej przemianie tworząc głównie pożądany produkt 9. Synteza achiralnej 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofiliny (P23)

78 78 Zgodnie z oczekiwaniami, poddana aminolizie pochodna oksazolidynowa ulegała przekształceniu do 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo] teofiliny (P23). Przedstawioną na ryc syntezę prowadzono ogrzewając pod ciśnieniem etanolowo-wodny roztwór amoniaku i związku 9. W reakcji dochodziło do otwarcia pierścienia oksazolidyny z równoczesnym utworzeniem grupy hydroksylowej w pozycji 2 łańcucha bocznego oraz przyłączenia w pozycji C-8 ksantyny grupy aminowej. W widmie MS związku P23 pik jonu molekularnego M+ przy m/z = 338 odpowiadał masie cząsteczkowej oczekiwanej struktury. Z kolei w widmie 1H MR obserwowano singlet przy 5,71 ppm pochodzący od dwu protonów grupy H2 w pozycji C-8 oraz singlet (szeroki) od protonu grupy hydroksylowej przy 4,59 ppm. W widmie obecne były także sygnały od protonów dwóch grup metylowych teofiliny (dwa singlety przy 3,55 i 3,37 ppm) oraz dwa multiplety pochodzace od ośmiu wodorów morfoliny (3,69 i 2,60 ppm). Protonom grupy metylenowej, umiejscowionej przy pierścieniu morfoliny, przypisano sygnał przy 2,58 ppm (multiplet), natomiast protonom przy C-1 i C-2 odpowiednio sygnały przy wartościach ppm 4,43 (dublet) i 4,18 (multiplet). (±)-9 25% H3 etanol 110o C, p H H2 (±)-P23 Ryc Aminoliza 7-(morfolinometylo)-1,3-dimetylo-6,7-dihydro-1,3-oksazolo[2,3f]-1H,3H-puryno-2,4-dionu ((±)-9)

79 Mechanizm przegrupowania struktury 7-(aminometylo)-1,3dimetylo-6,7-dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H,3H-puryno-2,3-dionu do 7-(amino)-1,3-dimetylo-7,8-dihydro-6H-[1,3]oksazyno[2,3-f]puryno-2,3-dionu Potwierdzenie struktury związków 7-(morfolinometylo)-1,3-dimetylo-6,7- dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1h,3h-puryno-2,4-dionu (9) i 1,3-dimetylo-7-morfolin-4-ylo-7,8-dihydro-6H-[1,3]-oksazyno[2,3-f]-1H,3H-puryno-2,4-dionu (10) W widmach MS związków 9 i 10 pik jonu molekularnego M+ występował przy wartości m/z = 321, a jonu głównego przy m/z = 100. W obu przypadkach brak było pików izotopowych pochodzących od atomu bromu, co sugerowało trójcykliczną budowę otrzymanych związków. W widmach 1H MR sygnał w postaci multipletu od jednego protonu H-7 odnotowano dla związku 9 i 10 odpowiednio przy wartości przesunięcia 5,51 ppm i 2,98 ppm (tab. 3.1). Dwa multiplety przy 4,48 i 4,24 ppm o intensywności dwóch protonów przypisano protonom H-6, a multiplet przy 2,82 ppm protonom z pozycji H-1 struktury 9. Protonom H-8 w związku 10 odpowiadał multiplet przy wartości przesunięcia 4,50 ppm. Widma obu związków zawierały charakterystyczne dwa singlety od protonów grupy metyloksantyny z pozycji 1 i 3- przy 3,50 i 3,35 ppm oraz dwa multiplety przy 3,60 i 2,60 ppm, które przypisano protonom morfoliny H-2 i H-3. Dwuwymiarowe widma MR (CSY, ESY, gradientowa wersja HSQC, HMBC) pozwoliły na jednoznaczne przypisanie sygnałów poszczególnym protonom obu związków. W tab. 3.1 zebrano wyniki spektralnych analiz 1D i 2D MR. Analiza widma CSY związku 9 wskazała na stałe sprzężenia pomiędzy protonami H-6 i H-7, oraz pomiędzy H-7 i H-1. Izomeryczny związek 10 posiadał podobny zestaw korelacji pomiędzy protonami H-6, H-7 i H-8. Z eksperymentu HSQC odczytano bezpośrednie powiązania pomiędzy protonami a atomami węgla oraz rzędowość grup CHn. Dalekozasięgowe korelacje 1H 13C wyznaczone z widm HMBC pozwoliły na kompletne przypisanie struktury do sygnału (tab. 3.1, strzałki zielone).

80 80 Tabela 3.1. Wartości przesunięć chemicznych [δ] dla związków 9 i 10 odczytane z widm 1D i 2D MR 1 Protony H, δ [ppm] CSY 1 H- 13C HMBC ESY Związek ' H6 H6 H7 1Me 3Me H1 H2 H3 3'' 4,48 (m) 4,24 (m) 5,50 (m) 3,50 (s) 3,38 (s) 2,82 (m) 3,63 (t, J = 4,4 Hz) 2,60 (t, J = 4,4 Hz) CH2 C H2 2'' H7 H7 H6, H1 H7 H3 H2 CH C7, C1 C7, C1 C2 C2, C4 C6, C7, C3 C3 C2, C1 C C H2 H2 H1 H1 H6, H7, H3 H1 Związek a 7 8 3' 4,35 (m) 2,98 (m) 4,50 (m) 3,46 (s) 3,32 (s) 3,66 (t, J = 4,4 Hz) 2,62 (t, J = 4,4 Hz) CH 2' H6 H7 H8 1Me 3Me H2 H3 H2 C H2 C C H2 C H2 C H2 H7 H6, H8 H7 H3 H2 C7, C8, C9a C3 C6, C7, C9a C2, C10a C2, C4 C2 C3 H7, H3 H6, H8, H3 H7, H3 H6, H7, H8 ajbardziej istotne korelacje dla struktury 9, wynikające z eksperymentu HMBC, obejmują odziaływania pomiędzy H-1 C-7, H-1 C-3, co lokuje grupę metylenową w pozycji 1 jako łącznik pomiędzy morfoliną a układem oksazolopuryny.

81 81 Dla związku 10 protony z grup metylenowych z pozycji C-6 i C-8 zostały skorelowane z atomami wegla C-7 i C-9a, natomiast proton z pozycji C-7 wykazuje sygnał korelacyjny do atomu węgla C-3 morfoliny. Taki zestaw sygnałów jest możliwy tylko dla układu oksazynopuryny bezpośrednio związanej w pozycji C-7 z pierścieniem morfoliny. Aby potwierdzić tak wyznaczone struktury wykonano dla obu związków widma ESY (tab. 3.1, strzałki czerwone). Jak oczekiwano, dla związku 9 obserwowano Es H-3 - H-1, H-1 H-7 oraz H-1 H-6, natomiast dla izomerycznej struktury 10 odnotowano Es H-3 -H-6, H-3 -H-8. Podsumowując, uzyskane wyniki potwierdzają postulowane struktury związków 9 Mechanizm przegrupowania struktury i (aminometylo)-1,3-dimetylo-6,7- dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1h,3h-puryno-2,3-dionu (12) do 7-(amino)-1,3-di- metylo-7,8-dihydro-6h-[1,3]oksazyno[2,3-f]-puryno-2,3-dionu (13) W dalszej części podjęto próbę wyjaśnienia mechanizmu tworzenia się związku 10. Z wcześniejszych ustaleń wynikało, że proces ten zależy od polarności rozpuszczalnika, temperatury w jakiej zachodzi reakcja oraz dodatku zasadowego katalizatora. Związek 10, pojawiający się w reakcji 8-bromoteofiliny (1) i 4-(2,3epoksypropylo)-morfoliny (8) jako drugi produkt (obok 9), powstawał również przy ogrzewaniu samej tylko pochodnej oksazolidynowej (9) z katalityczną ilością pirydyny. W kolejnych doświadczeniach ustalono, jaki wpływ na szybkość przekształcenia struktury oksazolidynowej w oksazynową ma nukleofilowość fragmentu aminowego oksiranometylowych pochodnych reagujących z 8-bromoteofiliną (1). Wybrano dwie cykliczne aminy, piperydynę i indolinę, jako cząsteczki o odpowiednio większej i mniejszej nukleofilowości w porównaniu z morfoliną (ryc. 3.11). astępnie przeprowadzono reakcję amin z racemiczną epichlorohydryną modyfikując nieco metodę opisaną przez Bosc a i in. [220]. Wynikiem przeprowadzonych reakcji były dwie epoksydowe pochodne: -(2,3-epoksypropylo)-piperydyna (11A) i -(2,3epoksypropylo)-indolina (11B).

82 oC H (±)-EP H oC H A 38%aH B 11(A, B) Ryc Schemat syntezy: -(2,3epoksypropylo)-piperydyny (11A) i -(2,3epoksypropylo)-indoliny (11B) Kolejny etap obejmował reakcje związków 11A i 11B z 8-bromoteofiliną (1), które prowadzono w dwóch rozpuszczalnikach: n-propanolu lub n-butanolu z dodatkiem pirydyny jako katalizatora (ryc. 3.12). Produktami były trójcykliczne pochodne teofiliny zawierające pierścień 1,3-oksazolidyny 12 (A i B) lub 1,3-oksazyny 13 (A i B). W dalszej części pracy dla struktur z pięcio i sześcioczłonowym pierścieniem heterocyklicznym przyjęto oznaczenia odpowiednio 12 i 13. Czas syntezy wspomnianych struktur ulegał zmianie w zależności od wprowadzanego epoksydowego fragmentu. ajszybciej zachodziła reakcja z -(2,3epoksypropylo)-piperydyną (11A) w n-butanolu - już po 5 minutach w mieszaninie reakcyjnej obok struktury 12 zarejestrowano obecność produktu 13. Kontrolując przebieg reakcji chromatograficznie stwierdzano zwiększanie się ilości struktury 13 kosztem 12. Po 1 h rejestrowano jedynie śladowe ilości struktury 12. Z niewiele mniejszą szybkością zachodziła reakcja w n-propanolu. Znacznie wolniej zachodziła reakcja pomiędzy -(2,3-epoksypropylo)-indoliną (11B) a 8-bromoteofiliną (1). grzewanie reagentów w temperaturze wrzenia n- propanolu przez 3 h prowadziło do otrzymania tylko struktury 12B. Przekształcenie pochodnej pięcioczłonowej (12B) w związek 13B przebiegało wolniej również n-butanolu (41 h). w

83 83 H Br 1 A 11(A, B) 12(A, B) B 13(A, B) Ryc Schemat syntezy związków 12 (A i B) i 13 (A i B) Przeprowadzone doświadczenia potwierdziły, że istotnym czynnikiem wpływającym na przebieg reakcji tworzenia struktur 12 i 13 jest zasadowość fragmentu aminowego w oksiranowych pochodnych (11A, 11B). Zmniejszenie nukleofilowości podstawnika, zmieniające się w szeregu: piperydyna > morfolina > indolina, sprawia, że w przewadze tworzy się struktura 12, a przekształcenie w 13 zachodzi coraz wolniej. a podstawie zebranych informacji zaproponowano mechanizm przekształcenia struktury oksazolidynowej w oksazynową. Przemiana przedstawiona na ryc jest nowym, nieopisanym dotąd przegrupowaniem chemicznym [221]. Wszystkie syntetyzowane pochodne teofiliny z dodatkowym heterocyklicznym pierścieniem, zarówno pięcio- jak i sześcioczłonowym, podstawionym w C-7 resztą aminową, są również nowymi związkami chemicznymi. Struktura 1,3-oksazynowa puryny jest wprawdzie znana, jednak do tej pory żadna z syntetycznych metod nie wiązała się z izomeryzacją pięcioczłonowego pierścienia oksazolidyny [222].

84 84 H 1 Br (8, 11A, 11B) H Br HBr + (9, 12A, 12B) + (10, 13A, 13B) Ryc Zaroponowany mechanizm przekształcenia struktury oksazolidynowej (9, 12A, 12B) w oksazynową (10, 13A, 13B) 3.3.3Synteza izomerów optycznych 8-amino-7-[2-hydroksy-3(morfolin-4-ylo)propylo] teofiliny z zastosowaniem odczynników chiralnych Synteza enancjomerów 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny ((-)-8, (+)-8) Enancjomery 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny ((-)-8, (+)-8) otrzymano zgodnie z procedurą przedstawioną dla związku racemicznego ((±)-8). Ze względu na wysoki koszt chiralnego odczynnika, zmniejszono skalę prowadzonych reakcji (0,3 do 0,06 mola). Ponieważ destylacja pod zmniejszonym ciśnieniem małych ilości produktu

85 85 wiązała się z większymi stratami, przeprowadzono próby chromatograficznego oczyszczenia związku (kolumna chromatograficzna) [223]. Stwierdzono jednak, że w opisanych warunkach chiralny produkt ulega racemizacji, o czym świadczą przedstawione w tab. 3.2 wartości skręcalności właściwej. W dalszych reakcjach przy oczyszczaniu wykorzystywano tylko destylację pod zmniejszonym ciśnieniem. Tabela 3.2. Wartości skręcalności właściwej [α]d wyznaczone dla izomerów optycznych 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny ((-)-8, (+)-8) oczyszczanych metodą chromatograficzną oraz przez destylację pod zmniejszonym ciśnieniem Sposób Skręcalność Wydajność oczyszczenia właściwa [α]d * reakcji kolumna [ ] - 4,13 [%] 68,0 kolumna - 6,43 58,5 destylacja -15,34 42,4 destylacja - 19,99 43,4 destylacja - 20,24 / - 25,36** 45,0 kolumna + 5,64 68,0 destylacja + 21,32 40,7 destylacja + 20,37 / + 24,07** 34,0 * Stężenie próbki 5 %; solwent / objętość: metanol / 10 cm3; długość rurki polarymetrycznej: 10 cm; wartość średnia z 3 serii pomiarów ** Stężenie próbki 10 %; solwent / objętość: toluen / 5 cm3; długość rurki polarymetrycznej: 10 cm; wartość średnia z 3 serii pomiarów warunki porównywalne z [224] Jak wspomniano w rozdziale 2.4.2, otwarcie pierścienia oksiranowego jest reakcją regioselektywną i jej wynik zależy od rodzaju katalizatora. W zasadowym środowisku reakcji chiralnej epichlorohydryny z morfoliną i katalityczną ilością wody proces przebiega według mechanizmu S2. Tworzący się odczynnik nukleofilowy przyłącza się do odsłoniętego atomu C-3 pierścienia epoksydowego (ryc. 3.14). Ponieważ ten atom węgla nie jest asymetryczny, nie dochodzi do zmiany konfiguracji, a

86 86 powstająca halogenohydryna posiada konfigurację identyczną ze związkiem wyjściowym. + H2 H + H3+ H+ H H H H (S)-(+)-EP Ryc Stereochemiczny aspekt reakcji (S)-epichlorohydryny z morfoliną Cyklizacja prowadząca do powstania pierścienia oksiranowego przebiega w środowisku zasadowym (ah), które jest niezbędne do utworzeniu anionów alkoholanowych, pełniących w tej wewnątrzcząsteczkowej substytucji rolę nukleofila (ryc. 3.15). Eliminacja cząsteczki chlorowodoru z β-halogenohydryny i formowanie nowego wiązania C- przebiega zgodnie z mechanizmem S2 [108], stąd warunkiem zamknięcia pierścienia jest antyperiplanarna konformacja atomu tlenu przy C-2 i grupy odchodzącej (tj. atomu chloru przy C-1). Inwersja konfiguracji zwykle towarzysząca przemianie zachodzącej zgodnie z mechanizmem S2 zachodzi przy atomie węgla połączonym z grupą odchodzącą. Ponieważ w tym przypadku reakcja nie przebiega na centrum chiralnym, należy spodziewać się zachowania konfiguracji. ie zmienia się także ustalona według reguł Cahna-Ingolda-Preloga ranga podstawników przy centrum stereogenicznym produktów. Dlatego tworzącym się enancjomerom 4(2,3-epoksypropylo)-morfoliny (-)-8 i (+)-8 przypisano konfiguracje odpowiednich wyjściowych izomerów optycznych epichlorohydryny.

87 ah - a + a H (S) 1 (S)-(-)-8 Ryc Zamknięcie pierścienia oksiranowego i utworzenie chiralnej 4-(2,3epoksypropylo)-morfoliny (S)-(-)-8 W celu porównania wartości skręcalności właściwej [α]d z danymi literaturowymi [224], przeprowadzono pomiar kierunku skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego dla obu związków (-)-8 i (+)-8 w porównywalnych warunkach. Achmatowicz i in. [224] przekształcając (S)-(-)-2,2-dimetylo-4-hydroksymetylo-1,3dioksolan lub jego tosylową pochodną, otrzymali chiralną (-)-4-(2,3-epoksypropylo)morfolinę o skręcalności właściwej [α]d= -20,02, której przypisali konfigurację (S) (ryc. 3.16). H 4(S) 4(R) S2 Ryc Wzory strukturalne (S)-(-)-2,2-dimetylo-4-hydroksymetylo-1,3-dioksolanu i (R)-(-)-2,2-dimetylo-4-(4-tolilosulfonylometylo)-1,3-dioksolanu Ponieważ kierunek skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego był dla enancjomeru (-)-8 identyczny z cytowanym wyżej, przyjęto, że posiada on taką samą konfigurację (tab. 3.3) i tworzącej się z (2S)-(+)-epichlorohydryny (-)-4-(2,3epoksypropylo)-morfolinie ((-)-8) przyporządkowano konfigurację (S). Przyłączenie

88 88 morfoliny do enancjomeru (2R)-(-)-epichlorohydryny prowadziło do otrzymania związku (+)-8 o konfiguracji (R) (ryc.3.17). (S)-(+)-EP (R)-(-)-EP ah H ah (R)-(+)-8 (S)-(-)-8 Ryc Przypisanie konfiguracji enancjomerom 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny (8) Wartość skręcalności właściwej [α]d związku (-)-8, określona w warunkach w pełni porównywalnych do tych przedstawionych w pracy Achmatowicza i in. [224], wyniosła -25,36. W cytowanej pracy autorzy powołując się na wcześniejsze dane [45, 225] sugerowali, że w bezpośredniej reakcji morfoliny z chiralną epichlorohydryną powstaje produkt o niskiej czystości optycznej. Uzyskane wyniki dowodzą jednak, że przy odpowiednio dobranych warunkach syntezy można otrzymać produkt o porównywalnej czystości. Synteza izomerów optycznych związku 7-(morfolinometylo)-1,3-dimetylo-6,7dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H,3H-puryno-2,4-dionu ((-)-9, (+)-9) Warunki syntezy ustalone w eksperymentach na związkach racemicznych zakładały prowadzenie reakcji w n-propanolu z dodatkiem katalitycznych ilości pirydyny (tab. 3.2). Stwierdzono również, że związek 9 tworzy się jako pierwszy i łatwo ulega przekształceniu w 10, a szybkość tego procesu zależy miedzy innymi od temperatury i czasu reakcji. Aby ograniczyć ilość powstającego izomerycznego związku 10 należało unikać długotrwałego ogrzewania mieszaniny reakcyjnej i możliwie szybko wyizolować powstający produkt 9. d chwili rozpuszczenia się osadu 8-bromoteofiliny i zmiany zabarwienia roztworu na kolor słomkowy reakcja nie powinna trwać dłużej niż minut. W podjętych próbach syntezy enancjomerów 7-(morfolinometylo)-1,3- dimetylo-6,7-dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1h,3h-puryno-2,4-dionu ((-)-9 i (+)-9) nie

89 89 udało się jednak otrzymać zadowalających ilości chiralnego produktu. W czasie reakcji dochodziło zarówno do opisanej wcześniej izomeryzacji, jak również do częściowego rozkładu powstającego produktu. Kontrolując chromatograficznie przebieg reakcji zauważono, że punktem krytycznym jest moment rozpuszczenia się osadu 8bromoteofiliny (1). Dlatego w kolejnych doświadczeniach przerywano ogrzewanie w chwili rozpuszczenia się osadu i powstawania klarownego roztworu, co trwało od 1 do 5 minut. Po oziębieniu z mieszaniny wydzielał się osad, który zidentyfikowano jako związek 9. Tą metodą otrzymano dwa jego izomery optyczne. iska wydajność opisanych reakcji, wahająca się w granicach %, wskazywała na konieczność prowadzenia dalszych prób. Przeprowadzono serię reakcji, w których, po pierwsze, stosowano dwukrotny nadmiar chiralnego syntonu, po drugie, zrezygnowano z ogrzewania mieszaniny, i po trzecie, zastąpiono n-propanol bezwodnym etanolem. Czas trwania reakcji wahał się w zależności od ilości zastosowanych reagentów od 9 do 32 dni. Kontrolując jej przebieg chromatograficznie stwierdzano narastającą ilość produktu 9 ((-) lub (+)). Reakcję przerywano, gdy obok związku (-)-9 lub (+)-9 i śladowych ilości 8-bromoteofiliny (1) zaczynały pojawiać się niewielkie ilości izomerycznej struktury 10. Po chromatograficznym oczyszczeniu produktu przeprowadzono pomiar skręcalności właściwej, który potwierdził optycznie czynne właściwości związku 9((-) lub (+)). Zarówno reakcja przyłączenia 8-bromoteofiliny (1) do pierścienia epoksydowego 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny ((-)-8 lub (+)-8), jak również późniejsza cyklizacja prowadząca do powstania oksazolidynowej pochodnej (-)-9 lub (+)-9, przebiegały według mechanizmu substytucji nukleofilowej S2 (ryc. 3.18). Także w tym przypadku zmiany konfiguracyjne nie dotyczyły centrum asymetrycznego, gdyż podstawienie zachodziło przy achiralnym atomie węgla C-3 4-(2,3-epoksypropylo)morfoliny. Ponieważ w żadnej z reakcji nie dochodziło do rozerwania wiązania przy asymetrycznym atomie węgla, stąd można przypuszczać, że produkt końcowy ma konfigurację zgodną z chiralnym substratem ((-)-8 lub (+)-8). ie zmieniała się także kolejność podstawników przy centrum asymetrycznym określona zgodnie z regułami Cahna-Ingolda-Preloga. a tej podstawie pochodnej (-)-9 otrzymanej z (S)-(-)-4- (2,3-epoksypropylo)-morfoliny ((-)-8) przypisano konfigurację (S).

90 90 Wydajność reakcji wynosząca % umożliwiła przeprowadzenie kolejnego etapu syntezy, a mianowicie tworzenia izomerów optycznych 8-amino-7-[2-hydroksy-3(morfolin-4-ylo)propylo]teofiliny (P23). H + Br 1 + H Br + + Br (S)-(-)-8 - Br + + H Br H (S)-(-)-9 Ryc Stereochemiczny aspekt tworzenia 7-(morfolinometylo)-1,3-dimetylo-6,7dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H,3H-puryno-2,4-dionu ((S)-(-)-9) Synteza enancjomerów 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo] teofiliny

91 91 Amonolizę chiralnej struktury 9 przeprowadzono zgodnie z ustalonymi wcześniej warunkami syntezy dla związku racemicznego, otrzymując w rezultacie enancjomery 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofiliny ((+)-P23 i (-)-P23). Reakcję prowadzono w szczelnie zamkniętej kolbie, stosując 25 % roztwór amoniaku i jako rozpuszczalnik etanol. ajwyższą wydajność (90 %) uzyskano ogrzewając mieszaninę reakcyjną przez 6 h w temperaturze 110 C. Analiza spektralna oraz pomiar skręcalności właściwej potwierdziły tożsamość związków (+)-P23 i (-)-P23 oraz ich czynność optyczną. Ponieważ w mieszaninie reakcyjnej nie stwierdzono innych produktów poza śladową ilością struktury wyjściowej (9), przyjęto, że syntezie nie towarzyszy rozerwanie wiązania przy centrum chiralnym C-7 (ryc. 3.19). twarcie pierścienia oksazolidynowego, prowadzące do utworzenia grupy hydroksylowej w łańcuchu bocznym, oraz przyłączenie grupy aminowej w pozycji C-8 teofiliny nie zmienia także rangi podstawników przy chiralnym atomie węgla. a tej podstawie enancjomerowi powstającemu z izomeru (S)-(-)- związku 9 przypisano analogiczną konfigurację. etanol 110o C, p H3 (S)-(-)-9 H + 3 H H2 (S)-(+)-P23 Ryc Mechanizm otwarcia pierścienia oksazolidyny (9) pod wpływem amoniaku

92 92 H H2 (S)-(+)-P23 Me DCC DMAP CH22 bzw. CH (S)-(+)-MPA C H2 Me (S,S)-14 Ryc Schemat syntezy diastereoizomerycznej pochodnej enancjomeru (S)-(+)-P23 z kwasem (S)-(+)-α-metoksyfenylooctowym Ryc Przykładowe widmo 1H MR diastereoizomerycznej pochodnej (S)-(+)-P23

93 93 admiar enancjomeryczny związków (+)-P23 i (-)-P23 określono na podstawie analizy widm 1H MR ich diastereoizomerycznych pochodnych, otrzymanych w reakcji z enancjomerami (R) i (S) kwasu α-metoksyfenylooctowego (MPA) w obecności cykloheksylokarbodiimidu (DCC) oraz katalizatora 4-(dimetyloamino)pirydyny (DMAP) (ryc. 3.20) [226]. Metoda obliczeniowa bazowała na różnej intensywności sygnałów pochodzących od diastereotopowych atomów wodoru (ryc. 3.21). admiar enancjomeryczny określony dla otrzymanych związków (+)-P23 i (-)-P23 wyniósł odpowiednio 54 % i 58 %. Wartości te odpowiadają 77zawartości poszczególnych enancjomerów. i 79-procentowej

94 94 4. WSTĘPE BADAIA AD AKTYWŚCIĄ FARMAKLGICZĄ EACJMERÓW P23 W ramach wstępnych badań farmakologicznych oznaczono aktywność hipotensyjną i miorelaksacyjną (spazmolityczną) oraz określono powinowactwo do receptorów α1-, α2- i β1-adrenergicznych enancjomerów związku P23. Badania farmakologiczne zostały wykonane w Pracowni Wstępnych Badań Farmakologicznych Katedry Farmakodynamiki CMUJ, natomiast badania radioreceptorowe wykonano w Pracowni Farmakobiologii Zakładu Cytobiologii i Histochemii CMUJ Wyniki badań farmakologicznych Aktywność hipotensyjna Wszystkie badane związki (±)-P23, (-)-P23 i (+)-P23 podane w dawce 10 mg/kg i.v. wykazywały aktywność hipotensyjną (ryc. 4.1). W przypadku związku (±)-P23 wyraźny spadek ciśnienia tętniczego obserwowano już po 5 min. od podania. Związki (-)-P23 i (+)-P23 działały z opóźnieniem: w pierwszym przypadku wyraźny spadek ciśnienia obserwowano po 10 min. od podania, a w drugim dopiero po 20 min. Tendencja spadku ciśnienia utrzymywała się w przypadku związków (±)-P23 i (-)-P23 do 60 minuty prowadzenia obserwacji, a w przypadku związku (+)-P23 do 50 minuty (ryc. 4.1). ależy podkreślić, że zarysowujące się różnice należy interpretować ostrożnie z uwagi na skriningowy charakter przeprowadzonych badań Aktywność miorelaksacyjna Jak wynika z tab. 4.1 związki (±)-P23, (-)-P23 i (+)-P23 nie wykazały działania spazmolitycznego. Uzyskane wyniki nie potwierdzają więc hipotezy, że aktywność hipotensyjna związków (±)-P23, (-)-P23 i (+)-P23 powiązana jest z ich działaniem spazmolitycznym. bserwowano natomiast wpływ związków (±)-P23 oraz (+)-P23 na siłę skurczu jelita cienkiego królika (tab. 4.2). W pierwszym przypadku różnice statystycznie istotne odnotowano przy stężeniu 10-7, a w drugim przy stężeniach 10-7, 10-6 i 10-5.

95 95 Związek (±)-P23 ciśnienie skurczowe ciśnienie [mmhg] 140 ciśnienie rozkurczowe czas [min.] Związek (-)-P23 ciśnienie [mmhg] czas [min.] Związek (+)-P23 ciśnienie [mmhg] czas [min.] Ryc Wpływ związków (±)-P23, (-)-P23 i (+)-P23 na ciśnienie tętnicze krwi u normotensyjnego szczura (10 mg/kg, i.v.)

96 96 Tabela 4.1. Średnia i odchylenie standardowe częstotliwości skurczów izolowanego jelita cienkiego królika (na min.) przy różnym stężeniu związków (±)-P23, (-)-P23 i (+)-P23 Stężenie [M] Związek (±)-P23 (+)-P23 (-)-P ,4 ± 0,37 15,1 ± 0,23 13,4 ± 0,37 13,7 ± 0,34 13,8 ± 0,25 14,0 ± 0, ,4 ± 0,43 15,3 ± 0,21 13,4 ± 0,43 13,6 ± 0,31 14,6 ± 0,22 14,7 ± 0, ,6 ± 0,27 15,0 ± 0,21 14,1 ± 0,23 13,8 ± 0,25 14,2 ± 0,33 14,4 ± 0, ,2 ± 0,20 14,7 ± 0,15 13,5 ± 0,43 13,6 ± 0,37 14,5 ± 0,35 14,9 ± 0, ,8 ± 0,25 14,7 ± 0,21 13,1 ± 0,43 12,7 ± 0,42 14,6 ± 0,31 14,5 ± 0,37 bjaśnienia: stężenie 0 oznacza wariant kontrolny Tabela 4.2. Średnia i odchylenie standardowe amplitudy skurczów izolowanego jelita cienkiego królika (na min.) przy różnym stężeniu związków (±)-P23, (-)-P23, (+)-P23 Stężenie [M] Związek (±)-P23 (+)-P23 (-)-P ,63 ± 0,17 7,69 ± 0,54 7,33 ± 0,41 7,10 ± 0,34 3,39 ± 0,33 3,41 ± 0, ,41 ± 0,41 9,20 ± 0,81 ** 9,41 ± 0,42 13,56 ± 0,35 *** 3,26 ± 0,34 3,73 ± 0, ,56 ± 0,82 11,45 ± 1,40 12,76 ± 0,32 16,26 ± 0,26 *** 3,67 ± 0,33 3,76 ± 0, ,60 ± 1,00 12,34 ± 1,66 14,13 ± 0,49 15,51 ± 0,35 * 3,89 ± 0,32 3,80 ± 0, ,91 ± 1,09 12,20 ± 1,75 16,24 ± 0,37 15,90 ± 0,39 4,04 ± 0,35 4,08 ± 0,35 bjaśnienia: różnice statystycznie istotne na poziomie 0,05, 0,01 i 0,001 oznaczono odpowiednio *, ** i ***. Stężenie 0 oznacza wariant kontrolny

97 Powinowactwo do receptorów adrenergicznych Wiązanie związków (±)-P23, (-)-P23 i (+)-P23 do receptorów adrenergicznych oznaczono w stężeniach 10-4 M. Analiza uzyskanych wyników wykazała, że badane związki nie wypierały z miejsc wiążących w korze mózgowej szczura znakowanej [3H]prazosyny, co świadczy o braku powinowactwa tych związków do receptorów α1adrenergicznych (tab. 4.3). Tabela 4.3. Powinowactwo związków (±)-P23, (-)-P23 i (+)-P23 do receptorów α1-, α2-, β1-adrenergicznych [3H]-Prazosyna α1 [3H]-Klonidyna α2 [3H]-CGP12177 β1 IC50 [μm] Ki [μm] C50 [μm] Ki [μm] IC50 [μm] Ki [μm] (±)-P23 > 100 > 100 > 100 > ± ± 3.1 (+)-P23 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 (-)-P23 > 100 > ± ± 2.0 > 100 > 100 Związek Związek (-)-P23 wykazał słabe powinowactwo do receptorów α2- adrenergicznych (Ki = 41,2 μm), natomiast związek (±)-P23 do receptorów β1adrenergicznych (Ki = 21,0 μm) (tab. 4.3). Badania radioreceptorowe wskazują więc, że działanie hipotensyjne związków (±)-P23, (-)-P23 i (+)-P23 nie wiąże się z ich wpływem na receptory adrenergiczne.

98 Metodyka badań farmakologicznych Materiały W badaniach wykorzystano następujące leki i odczynniki: Mg2 (PCH), K (PCH), a (PCH), Ca2 (PCH), ahc3 (PCH), glukoza bezwodna (PLFA), heparyna (PLFA), [3H]-prazosyna (aktywność specyficzna 19,5 Ci / mmol, E), [3H]-klonidyna (aktywność specyficzna 70,5 Ci / mmol, E), [3H]-CGP (aktywność specyficzna 48 Ci / mmol, AMERSHAM), fentolamina (SIGMA), klonidyna (SIGMA), propranolol (PLFA), tiopental (HELFA FRE ARZTMITTEL - GERMAY), płyn scyntylacyjny Akwasynt (BI CARE). Badania hipotensyjne przeprowadzono na szczurach normotensyjnych szczepu Wistar (samce o masie ciała g), a oznaczenia aktywności spazmolitycznej na królikach rasy mieszanej (masa ciała 2,5 3,5 kg). Zwierzęta przebywały w standardowych klatkach, odpowiednich do ich rozmiarów, w pomieszczeniu o temperaturze C, wilgotności 60 % w 12 godzinnym cyklu świetlnym. Zwierzęta karmiono granulowaną paszą przeznaczoną dla zwierząt laboratoryjnych. Do picia otrzymywały wodę wodociągową w dowolnych ilościach. Do pomiarów ciśnienia wykorzystano aparat do pomiaru ciśnienia tętniczego u małych zwierząt DATAMAX (firmy Columbus Instruments). Inna wykorzystana aparatura: aparat typu Magnusa, filtry WHATMA GF/C, homogenizator: ULTRA TURAX, T 25 basic (IKA LABRTECHIK), licznik scyntylacyjny: WALLAC 1409 DSA (firmy Wallac y, Finland), rejestrator TZ 4100, termostat UTU-4, wirówka MPW Metody Aktywność hipotensyjna Doświadczenia wykonano na 3 normotensyjnych, znieczulonych tiopentalem (60 mg/kg i.p.) szczurach. odpowiadających 1/10 LD Badane 50 związki podawano dożylnie w dawkach i.v.. Ciśnienie mierzono w tętnicy szyjnej wspólnej przed

99 99 podaniem oraz po 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 minutach po podaniu związków. Aktywność miorelaksacyjna Wpływ badanych związków (±)-P23, (+)-P23 i (-)-P23 na mięśniówkę gładką badano na izolowanym jelicie królika według klasycznej metody Magnusa [227]. Zwierzęta uśmiercano, wypreparowywano i wycinano odcinki jelita cienkiego o długości 3-4 cm, które umieszczano w natlenianym karbogenem (mieszanina 95 % 2 i 5 % C2) płynie odżywczym Tyrode a. astępnie odcinek jelita mocowano jednym końcem do uchwytu w naczyńku termostatowanym o pojemności 50 cm3, zawierającym natleniony płyn Tyrode a o temperaturze 37 C. Drugi koniec jelita mocowano do izometrycznego przetwornika. Spontaniczne skurcze jelita zapisywano przy obciążeniu 1 g. Badane związki podawano we wzrastających stężeniach 10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4 mol/l, rejestrując wpływ każdej pojedynczej dawki przez 5 minut na 10 odcinkach jelita. Częstotliwość i amplitudę skurczów odcinków jelita po podaniu związków porównano z wariantem kontrolnym (jelito w czystym płynie odżywczym). Przy weryfikacji statystycznej istotności różnic wykorzystano jednoczynnikową analizę wariancji (AVA)[229]. Powinowactwo do receptorów α1-, α2-, β1-adrenergicznych Powinowactwo do receptorów adrenergicznych typu α1, α2, β1 oznaczono w korze mózgowej szczura. Tkankę homogenizowano (homogenizator ULTRA TURAX) w 10 cm3 50 mmol/l schłodzonego buforu Tris-H o ph 7,6, a następnie wirowano przez 20 minut ( g) w temperaturze 0-4 C. trzymany pelet homogenizowano w tej samej objętości buforu i ponownie wirowano przez 20 minut. stateczny pelet zawieszono w buforze Tris-H w proporcji 1 g tkanki na 35 cm3 buforu. Receptory α1- adrenergiczne

100 100 Powinowactwo do receptora α1-adrenergicznego badano przy zastosowaniu [3H]prazosyny jako specyficznego liganda. Do mieszaniny inkubacyjnej zawierającej 240 μl zawiesiny tkankowej i 30 μl 0,2 nm [3H]-prazosyny dodawano 30 μl badanych związków w buforze w 8 wzrastających stężeniach ( ). Inkubacja była prowadzona na płytkach (MAFCB 10, Millipore). Wiązanie niespecyficzne oznaczono w obecności 10 μm fentolaminy. Próbki w dwóch powtórzeniach inkubowano w temperaturze 30 C przez 30 minut. Inkubację przerywano filtracją (filtry WHATMA GF/C, dwukrotne płukanie 100 μl zimnego buforu). Filtry umieszczano w naczyńkach scyntylacyjnych, zalewano płynem scyntylacyjnym i mierzono radioaktywność. Wartość stężenia badanego związku, które powodowało hamowanie wiązania radioliganda o 50 % (IC50) oznaczono przy zastosowaniu programu komputerowego GraphPAD/Prism. Stałą hamowania (Ki) obliczono stosując wzór Chenga-Prusoffa [227]: Ki IC50, L 1 KD gdzie: L - stężenie znakowanego liganda, KD stała dysocjacji wiązania znakowanego liganda. Wiązanie specyficzne określono jako różnicę pomiędzy wiązaniem całkowitym a wiązaniem niespecyficznym. Receptory α2-adrenergiczne Powinowactwo do receptora α2-adrenergicznego badano przy zastosowaniu [3H]klonidyny jako specyficznego liganda. Mieszanina inkubacyjna o objętości 300 μl zawierała 240 μl zawiesiny tkankowej, 30 μl radioliganda [3H]-klonidyny (w stężeniu 2 nm) oraz 30 μl buforu zawierającego badane związki w 8 wzrastających stężeniach ( ). Inkubację prowadzono na płytkach (MAFCB 10, Millipore), a wiązanie niespecyficzne oznaczono w obecności 10 μm klonidyny. Dalej postępowano analogicznie jak w przypadku receptorów α1-adrenergicznych.

101 101 Wartość stężenia badanego związku, które powodowało hamowanie wiązania radioliganda o 50 % (IC50) oznaczono jak wyżej. Wiązanie specyficzne określono jako różnicę pomiędzy wiązaniem całkowitym a wiązaniem niespecyficznym. Receptory β1-adrenergiczne Powinowactwo do receptora β1-adrenergicznego badano przy zastosowaniu [3H]CGP jako specyficznego liganda. Mieszanina inkubacyjna o objętości 300 μl zawierała 240 μl zawiesiny tkankowej, 30 μl radioliganda (w stężeniu 0,2 nm) oraz 30 μl buforu zawierającego badane związki w 8 wzrastających stężeniach ( ). Inkubację prowadzono na płytkach (MAFCB 10, Millipore), a wiązanie niespecyficzne oznaczono w obecności 1 μm propranololu. Dalej postępowano analogicznie jak przypadku receptorów α1-adrenergicznych. Wartość stężenia badanego związku, które powodowało hamowanie wiązania radioliganda o 50 % (IC50) oznaczono jak wyżej. Wiązanie specyficzne określono jako różnicę pomiędzy wiązaniem całkowitym a wiązaniem niespecyficznym.

102 PDSUMWAIE 1. W pracy podjęto próbę opracowania syntetycznej metody otrzymywania enancjomerów 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofiliny (P23). Ich otrzymanie umożliwiło następnie przeprowadzenie wstępnych badań farmakologicznych. 2. Związkiem wyjściowym w zaproponowanej metodzie syntezy jest 8- bromoteofilina (1), na którą następnie działano chiralnym syntonem 4-(2,3epoksypropylo)-morfoliną ((-)- lub (+)-8). Związek ten można otrzymać w reakcji morfoliny z dostępnymi w handlu enancjomerami epichlorohydryny (EP). Epoksydowa pochodna, przyłączając się w pozycję C-7 metyloksantyny, wprowadza do jej cząsteczki centrum stereogeniczne tworząc chiralną oksazolidynową pochodną teofiliny (9). Ta poddana aminolizie ulega przekształceniu do 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofiliny (P23). Zaproponowana metoda syntezy pozwala na otrzymanie zawartości enancjomerów %, przy ogólnej wydajności reakcji 93 %. 3. Reakcja 8-bromoteofiliny (1) z 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliną (8) przebiega według interesującego, dotąd w literaturze nieopisanego mechanizmu. ksazolidynowa pochodna ulegała przekształceniu do izomerycznego związku 10 zawierającego 6-członowy pierścień heterocykliczny skondensowany w pozycji 7-8 z układem teofiliny. Ustalono, że istotne znaczenie dla przebiegu tej reakcji ma zasadowość fragmentu aminowego epoksydowych pochodnych cyklicznych amin reagujących z 8-bromoteofiliną (1) oraz temperatura, w jakiej zachodzi reakcja. Kontrolowanie warunków tej reakcji jest kluczowym elementem opracowanej metody syntezy, ponieważ tylko aminoliza związku 9 prowadzi do 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofiliny (P23). 4. iepowodzeniem zakończyły się próby wykorzystania jako chiralnego syntonu ptoluenosulfonianu 2,3-epoksypropylu (ET).

103 W skriningowych badaniach farmakologicznych aktywność hipotensyjną stwierdzono w przypadku obu enancjomerów związku P23. Wykazano także, że działania tego nie można wiązać ani z receptorami adrenergicznymi ani z aktywnością spazmolityczną. Weryfikacji wymaga hipoteza, że działanie hipotensyjne jest wynikiem nieselektywnego hamowania aktywności enzymu fosfodiesterazy (PDE) lub blokowania receptorów adenozynowych.

104 CZĘŚĆ DŚWIADCZALA Badania fizykochemiczne i dane aparaturowe Temperatury topnienia oznaczono bez korelacji przy użyciu aparatu Mel-Temp 2 (Laboratory Devices Inc.). Widma magnetycznego rezonansu jądrowego wykonano w Pracowni Spektroskopii Magnetycznego Rezonansu Jądrowego przy Katedrze Chemii rganicznej CMUJ. Widma 1D 1H-MR, 13C-MR i korelacyjne widma 2D MR CD3 wykonano na spektrometrze Varian 300 MHz stosując jako wzorzec wewnętrzny deuterowany tetrametylosilan (TMS) lub chloroform (CD3). W opisie multipletowości zastosowano skróty: s-singlet, d-dublet, t-triplet, Widma spektroskopii Spektrometrii mas Masowej wykonano w w q-kwartet, m-multiplet. Pracowni Środowiskowym Wysokorozdzielczej Laboratorium Analiz Fizykochemicznych i Badań Strukturalnych. Eksperyment przeprowadzono na spektrometrze Finnigan MAT 95S, techniką EI z użyciem wiązki elektronów o energii 70 ev. Pomiar polarymetryczny wykonano w Katedrze Technologii i Biotechnologii Środków Leczniczych CMUJ, korzystając z polarymetru firmy JASC, model DIP 1000 Digital Polarimeter, przy długości fali λ = 589 nm (a). Chromatografię kolumnową wykonano stosując szklaną kolumnę (70 cm długości, 28 mm średnicy - Aldrich) oraz żel krzemionkowy Silica Gel 60 (0,040-0,063 mm) (Merck). Chromatografię rotacyjną wykonano z wykorzystaniem Chromatotronu (model 8924, Harrison Research), stosując żel krzemionkowy Silica Gel PF254 (z gipsem) (Merck). Chromatografię cienkowarstwową (TLC) wykonano stosując stantardowe płytki z folii aluminiowej pokrytej żelem krzemionkowym Silica Gel PF254 (Merck). Mieszaniny rozpuszczalników stosowane w chromatografii oraz w pomiarach polarymetrycznych przedstawiono w stosunkach objętościowych. Tabela 6.1. dczynniki stosowane w pracach laboratoryjnych Charakterystyka

105 105 dczynnik czystość 98,5 % (GC) R)-(-)-Epichlorohydryna (EP) (FLUKA) d 420 = 1,18 g cm 3, 20 α 546 = 52 ± 1, [α]20d = 44,5 ± 1 [ciecz] czystość 98,5 % (GC) (S)-(+)-Epichlorohydryna (EP) (FLUKA) (LACASTER) (±)-Epichlorohydryna (EP) (FLUKA) 20 = + 52 ± 1, α 20 α 546 D = 44,5 ± 1 [ciecz] 20 α 546 = + 35 [c = 1, MeH] czystość: 99,5 % (GC) czystość: 99 % (GC) 2(R)-(-)- 4-Toluenosulfonian-2,3epoksypropylu (ET) (FLUKA) 2(S)-(+)- 4-Toluenosulfonian-2,3epoksypropylu; (ET) (FLUKA) 20 α 546 = 20,1 ± 1, α 20 D = 17 ± 1 [c = 2,5, CH22] czystość: 97 % (GC) Teofilina (PLFA KRAKÓW) tt: C Morfolina (ALDRICH) 99 % Indolina (ALDRICH) 99 % Piperydyna (ALDRICH) 99 % Benzyloamina (ALDRICH) 99 % Amoniak (PCH) 25 % aq. n-butanol (PCH) cz.d.a. n-propanol (PCH) cd. Tabela 6.1. cz.d.a. dczynnik Charakterystyka

106 106 Etanol bezwodny (PCH) 99,8 % Etanol (PCH) cz.d.a. 2-Metoksyetanol (PCH) cz.d.a. Ksylen (mieszanina izomerów) (PCH) cz.d.a. n-heksan (PCH) cz.d.a. Toluen (PCH) cz.d.a. Chloroform (PCH) cz.d.a. Chlorek metylenu (PCH) cz.d.a. Trietyloamina (PCH) cz.d.a. czystość 99 % Kwas 2(R)-(-)-2-fenylo-2-metoksyoctowy (MPA), (LACASTER) α 20 D = [c = 0,5, EtH] czystość 99 % Kwas 2(S)-(+)-2-fenylo-2-metoksyoctowy (MPA), (LACASTER) α 20 D = [c = 0,5, EtH], -Dicykloheksylokarbodiimid (DCC), (LACASTER) 99 % 4-(, -Dimetyloamino)pirydyna (DMAP), (LACASTER) 99 % CD3 (DEUTER GmbH - IEMCY) 99,8 % 8-Bromoteofilina (1)

107 107 W kolbie trójszyjnej, zaopatrzonej we wkraplacz, chłodnicę zwrotną i termometr, umieszczono uwodnioną teofilinę (79,2 g, 0,4 mola), 320 cm3 lodowatego kwasu octowego oraz 59 cm3 (0,291 mola) 40 % bromowodoru. Mieszaninę ogrzewano na łaźni wodnej w temperaturze 50 C do rozpuszczenia się osadu. astępnie w ciągu godziny wkroplono roztwór 14,2 g (0,133 mola) chloranu sodowego w 32 cm3 wody, utrzymując temperaturę reakcji w granicach C. Po upływie 2 h ogrzewania, mieszaninę pozostawiono w temperaturze pokojowej do następnego dnia. Wydzielony osad 8-bromoteofiliny po przemyciu kolejno zimną i ciepłą wodą, a następnie etanolem, przekrystalizowano w n-butanolu. Wydajność: 86 %. C7H742Br (258,062); 1H-MR (300 MHz DMS) δ: 3,37 (3H, s, ), 3,31 (1H, s, H), 3,19 (3H, s, ); t.t.: C. 7-[2-Hydroksy-3-(4-tolilosulfonylo)propylo]-8-bromoteofilina (2) Do mieszaniny 8-bromoteofiliny (1) (0,2 g, 0,77 mmola) w 2,5 cm3 n-propanolu z katalityczną ilością pirydyny (0,02 g, 0,23 mmola) dodano enancjomeru (R) lub (S) 4toluenosulfonian-2,3-epoksypropylu (ET) (0,27 g, 1,2 mmola). Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez 1 h, a następnie pozostawiono do ochłodzenia. Rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a produkt oczyszczono metodą chromatografii preparatywnej (chromatotron; 2 mm, Silica Gel PF254; faza ruchoma: CH22 : MeH 49:1). Wydajność 43 % dla każdego z zastosowanych izomerów związku ET. C17H1946SBr (487,337); 1H-MR (300 MHz CD3) δ: 7,85 (2H, d, J = 8,5 Hz, CH), 7,38 (2H, d, J = 8,5 Hz, CH), 4,48 (2H, d, J = 1,4 Hz, CH2), 4, (3H, m, CHCH2), 3,80 (1H, d, J = 6,6 Hz H), 3,56 (3H, s, ), 3,38 (3H, s, ), 2,46 (3H, s, ); t.t.: C. 7-[2-Hydroksy-3-(morfolino-4-ylo)-propylo]-8--morfolinoteofilina (3) Mieszaninę związku (2) (0,050 g, 0,1026 mmola) i morfoliny (0,018 g, 0,2066 mmola) w 5 cm3 toluenu, ogrzewano pod chłodnicą zwrotną w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez 1,5 h. astępnie oddestylowano rozpuszczalnik, a produkt oczyszczono chromatograficznie (chromatotron; 2 mm, Silica Gel PF254; faza ruchoma: CH22 : MeH 49:1). Wydajność 69 %.

108 108 C18H2865 (408,1); 1H-MR (300 MHz CD3)δ: 4,32-4,27 (1H, m, CH), 4,19-4,17 (1H, dd, CHH), 4,82-4,06 (2H, m, CHH, H), 3,847-3,815 (4H, m, CH2), 3,712-3,683 (4H, m, CH2), 3,537 (3H, s, ), 3,374 (3H, s, ), 3,500-3,427 (2H, m, CH2), 3,261-3,188 (2H, m, CH2), 2,601-2,653 (2H, m, CH2), 2,365-2,563 (4H, m, CH2); MS (EI) m/z = 408,1 (M+, 10), 308,1 (50), 265,1 (10), 126,1 (50), 100,1 (100); t.t.: C. 7-(-benzyloaminometylo)-1, 3-dimetylo-6,7-dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H,3Hpuryno-2,4-dion (4) Mieszaninę związku (2) (0,050 g, 0,1026 mmola) i benzyloaminy (0,022 g, 0,2053 mmola) w 5 cm3 toluenu ogrzewano pod chłodnicą zwrotną w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Przebieg reakcji kontrolowano chromatograficznie [TLC; Silica Gel 60 F254, faza ruchoma: CH3 : MeH - 9:1 ]. Tworzący się w trakcie ogrzewania osad soli benzyloaminy z kwasem toluenosulfonowym, odsączono po około 1,5 h. Przesącz ogrzewano jeszcze przez 1 h, następnie oddzielono od nowej porcji osadu soli i zagęszczono na wyparce. Powstałą mieszaninę produktów rozdzielono metodą chromatograficzną na płycie preparatywnej [TLC; Silica Gel 60 F254, grubość 2 mm; faza ruchoma: CH3 : MeH - 9:1]. Produkt wyodrębniono przez ekstrakcję z żelu mieszaniną CH3 : MeH - 9:1, którą następnie oddestylowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność 28,6 %. C17H1953 (341,37); 1H-MR (300 MHz CD3) δ: 7,22-7,38 (5H, m, CH), 4,93-4,68 (2H, dd, J = 15 Hz, CH2), 4,45-4,51 (1H, d, J = 11,1 Hz, CHH), 4,38 (1H, m, CH), 4,15-4,80 (1H, d, J = 11,1 Hz, CHH), 3,80 (1H, s, H) 3,49 (3H, s, ), 3,3 (3H, s, ) 3,35 (2H, s, CH2); MS (EI) m/z = 341 (M+, 100), 250 (25), 91 (36); t.t.: 252 C. 7-(4-Tolilosulfonylometylo)-1,3-dimetylo -6,7-dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H,3Hpuryno-2,4-dion (5) ziębiony roztwór związku 2 (0,269 g 0.6 mmola) w 10 cm3 bezwodnego etanolu nasycano gazowym amoniakiem przez 3 h. Wydzielony, nie rozpuszczalny w etanolu osad związku 5 odsączono i wysuszono na powietrzu. Wydajność: 80 %. C17H2846S (406,0); 1H-MR (300 MHz CD3)δ: 7,80 (2H, d, J = 8,5 Hz, CH), 7,42 (2H, d, J = 8,5 Hz, CH), 5,60-5,57 (1H, m, CH), 4,52-4,28 (4H, m, CH2), 3,55 (3H, s,

109 109 ), 3,42 (3H, s, ), 2,50 (3H, s, ); MS (EI) m/z = 406,0 (M+, 100), 234,1 (25), 91 (30); t.t.: C. 7-[2-Hydroksy-3-(4-toliloosulfonylo)-propylo]-8-(morfolin-4-ylo)teofilina (7) Związek 5 (0,03 g, 0,08 mmola) oraz morfolinę (0,014 g, 0,16 mmola) mieszano w 2 cm3 etanolu przez 24 h w temperaturze pokojowej. astępnie oddestylowano rozpuszczalnik, a produkt oczyszczono chromatograficznie (chromatotron; 2 mm, Silica Gel PF254; faza ruchoma: CH22 : MeH 49:1). Wydajność: 20 %. C21H2757S (493,546); 1H-MR (300 MHz CD3) δ: 7,82 (2H, d, J = 8,2 Hz, CH), 7,42 (2H, d, J = 8,2 Hz, CH), 5,52 (1H s-szeroki, H), 4, (4H, m, CH 2), 3,94 (1H, m, CH), 3,88 (4H, m, CH2), 3,57 (3H, s, ), 3,40 (3H, s, ), 3,31 (4H, m, CH2,), 2,50 (3H, s, ); t.t: C. 4-(2,3-Epoksypropylo)-morfolina (związek (±)-8, (-)-8, (+)-8) (Tab. 6.2) Procedura ogólna Do mieszaniny morfoliny z wodą wkraplano epichlorohydrynę, utrzymując temperaturę reakcji w granicach 18-35ºC. Po 1,5 h od rozpoczęcia się reakcji egzotermicznej wkroplono 38 % roztwór ah i całość mieszano przez 1 h. Wytrącony osad a odsączono na lejku ze spiekiem, a przesącz ekstrahowano świeżo destylowanym eterem dietylowym (3 x 30 cm3). Połączone ekstrakty osuszono nad bezwodnym K2C3, a po oddzieleniu od środka suszącego przesącz zagęszczono na wyparce rotacyjnej. trzymaną oleistą ciecz oczyszczano stosując kolumnę chromatograficzną (Silica Gel 60 (0,040-0,063 mm), układ rozwijający CH 3 : MeH 49:1) lub destylację pod zmniejszonym ciśnieniem. C7H132 (143,199); 1H-MR (300 MHz CD3) δ: 3,70 (6H, m, CH2), 3,06 (1H, m, CH), 2,77 2,70 (1H, m, CHH), 2,60 2,46 (4H, m, CH2), 2,28 2,28 (1H, m, CHH). t.w.: 45-48ºC (2 mm Hg). 7-(Morfolinometylo)-1,3-dimetylo-6,7-dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H,3Hpuryno-2,4-dion (związek (±)-9, (-)-9, (+)-9) (Tab. 6.3) Procedura ogólna Do roztworu 8-bromoteofiliny (1) w rozpuszczalniku organicznym energicznie dodano 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny ((±)-8 lub (-)-8, lub (+)-8) oraz kilka kropli pirydyny

110 110 jako katalizatora. astępnie postępowano zgodnie z jedną z przedstawionych niżej metod (Metodą 1 lub 2) Surowy produkt oczyszczono metodą chromatograficzną na chromatotronie [płyta 2 mm, Silica Gel PF254; faza ruchoma: CH3 : MeH 49:1]. Metoda 1. Całość ogrzewano do momentu zmiany zabarwienia na kolor słomkowy i uzyskania klarownego roztworu. Gorącą mieszaninę przesączono na lejku ze spiekiem i pozostawiono w lodówce na 24 h. Z mieszaniny krystalizuje biały drobny osad, który odsączono, przemyto na lejku zimnym metanolem i wodą. Metoda 2. Całość pozostawiono w temperaturze pokojowej stale mieszając. Reakcję, której przebieg kontrolowano chromatograficznie, zakończono, gdy nie stwierdzono obecności 8-bromoteofiliny (1) lub, gdy w mieszaninie pojawiały się śladowe ilości związku 10 [TLC; Silica Gel 60 F254; faza ruchoma CH3 : MeH - 9:1 i CH3 : ET3-9:1 ]. Biały osad odsączono i przemyto na lejku zimnym metanolem i wodą. C14H1954 (321,323); 1H-MR (300 MHz CD3) δ: 5,50 (1H, m, CH), 4,48 (1H, m, CHH), 4,24 (1H, m, CHH) 3,63 (4H, t, J = 4,4 Hz, CH2), 3,50 (3H,s, ), 3,38 (3H, s, ), 2,82 (2H, m, CH2), 2,60 (4H, t, J = 4,4 Hz, CH2); MS (EI) m/z = 321(M+, 27), 234 (40), 126 (54), 113 (18), 100 (100), 83 (24), 56 (C3H4, 23). 1,3-Dimetylo-7-morfolin-4-ylo-7,8-dihydro-6H-[1,3]-oksazyno[2,3-f]-1H,3Hpuryno-2,4-dion (10) Metoda 1. W kolbie okrągłodennej umieszczono 8-bromoteofilinę (0,388 g, 0,0015 mola) (1), 4-(2,4-epoksypropylo)-morfolinę (0,314 g, 0,002 mola) ((±)-8), kilka kropel pirydyny oraz 3 cm3 2-metoksyetanolu. Całość ogrzewano w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez 45 minut kontrolując przebieg reakcji chromatograficznie [TLC; Silica Gel 60 F254; faza ruchoma CH3 : MeH - 9:1 i CH3 : ET3-9:1] (do zaniku plamy 8-bromoteofiliny). astępnie mieszaninę pozostawiono w temperaturze + 5 C. Po 24 h wytrącił się biały drobnokrystaliczny osad, który odsączono oczyszczono na chromatotronie [płyta 2 mm, Silica Gel PF254; faza ruchoma: i CH3 : MeH 49:1]. Wydajność: 91 %. Metoda 2. Związek (±)-9 (0,4 g, 0,0012 mola) z dodatkiem katalizatora ogrzewano w 2-metoksyetanolu (3 cm3), kontrolując przebieg reakcji chromatograficznie [TLC; Silica Gel 60 F254; faza ruchoma CH3 : MeH - 9:1 i CH3 : ET3-9:1]. Po ochłodzeniu z mieszaniny krystalizował biały, drobnokrystaliczny osad, który

111 111 odsączono i oczyszczono na chromatotronie [płyta 2 mm, Silica Gel PF254; faza ruchoma: CH3 : MeH 49:1]. Wydajność: 93 %. C14H1954 (321,323); 1H-MR (300 MHz CD3) δ: 4,50 (2H, m, CH2-), 4,35 (2H, m, CH2-), 3,66 (4H, t, J = 4,4 Hz, CH2), 3,46 (3H, s, ), 3,32 (3H, s, ), 2,98 (1H, m, CH), 2,62 (4H, t, J = 4,4 Hz, CH2); MS (EI) m/z = 321(M+, 100), 234 (58), 126 (38), 100 (46), 83 (10); t.t.: 234ºC. 8-Amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofilina (związek (±)-P23, (+)-P23, (-)-P23) (Tab.6.4) Procedura ogólna Związek 9 ((±)-9 lub (-)-9, lub (+)-9), 25 % roztwór amoniaku oraz 15 cm3 etanolu ogrzewano przez 6 h w łaźni olejowej o temperaturze 110ºC. Kolbę okrągłodenną w której prowadzono reakcję szczelnie zamknięto korkiem. Po ostudzeniu z mieszaniny reakcyjnej oddestylowano rozpuszczalnik, a pozostałość oczyszczono chromatograficznie (chromatotron: płyta 2 mm; Silica Gel PF254; faza ruchoma: CH3 : MeH 49:1). C14H2264 (338,2); 1H-MR (300 MHz CD3) δ: 5,74 (2H, s, H2), 4,50 (1H, s, H), 4,43-4,38 (2H, d, CH2), 4,19-4,17 (1H, m, CH), 3,69-3,62 (4H, m, CH2), 3,50 (3H, s, ), 3,37 (3H, s, ), 2,64-2,49 (4H, m, CH2), 2,47-2,39 (2H, m, CH2); MS (EI) m/z = 338,2 (M+, 20), 238 (45), 126 (50), 100 (100). -(2,3-Epoksypropylo)-piperydyna (11A) Do mieszaniny piperydyny (8,5 g, 0,1 mola) z dodatkiem wody (0,5 cm3) wkraplano epichlorohydrynę (9,25 g, 0.1 mola) utrzymując temperaturę reakcji w granicach 18-35ºC. Po 1,5 h od rozpoczęcia się reakcji egzotermicznej dodano 38 % roztwór ah (12,2 g) i całość mieszano przez 1 h. Wytrącony osad a odsączono na lejku ze spiekiem, a przesącz ekstrahowano świeżo destylowanym eterem dietylowym (3 x 30 cm3). Połączone ekstrakty osuszono nad bezwodnym K2C3, a po oddzieleniu od środka suszącego przesącz zagęszczono na wyparce rotacyjnej. trzymaną oleistą ciecz oczyszczono przeprowadzając destylacje pod zmniejszonym ciśnieniem i natychmiast stosowano w kolejnych reakcjach. Wydajność 40 %. C8H15 (141,2); t.w.: 58-60ºC (20 mm Hg) [218].

112 112 -(2,3-epoksypropylo)-indolina (11B) Do indoliny (7,62 g, 0,064 mola) z dodatkiem wody (0,2 cm3) wkraplano epichlorohydrynę (5,9 g, 0,0638 mola) utrzymując temperaturę reakcji w granicach C. Po 1,5 h od wkroplenia całości epichlorohydryny dodano kolejno bezwodnego etanolu (10 cm3), a po 20 h ah (2,55 g 0,0637 mola). Całość pozostawiono na 28 h w temperaturze pokojowej stale mieszając. astępnie zdekantowano ciecz znad resztek ah, a pozostałość przepłukano etanolem i suszono nad bezwodnym MgS4. Po oddzieleniu od środka suszącego oleistą ciecz zagęszczono na wyparce rotacyjnej i zalano eterem dietylowym pozostawiając mieszaninę w temperaturze +5 C do następnego dnia. Wydzielony osad a odsączono, a otrzymany przesącz zagęszczono pod zmniejszonym ciśnieniem. Do dalszych reakcji stosowano surowy związek 11B. Wydajność 41 %. C11H13 (175,229) 7-(Piperydyn-1-ylometylo)-1,3-dimetylo-6,7-dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H,3Hpuryno-2,4-dion (12A) Do roztworu 8-bromoteofiliny (1) (0,518 g, 2,0 mmola) w 20 cm3 n-propanolu dodano -(2,3-epoksypropylo)-piperydynę (11A) (0,432 g, 3,0 mmola) oraz kilka kropel pirydyny. Całość ogrzewano przez 4 minuty w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika, a następnie pozostawiono do ostygnięcia. Wydzielony osad odsączono i przemyto kolejno zimnym metanolem i wodą. Produkt oczyszczono chromatograficznie [chromatotron: płyta 2 mm, Silica Gel PF254; faza ruchoma: CH22 : MeH - 47: 3]. Wydajność 56 %. C15H2153 (319,37); 1H-MR (300 MHz CD3) δ: 5,58-5,42 (1H, m, CH), 4,52-4,43, 4,30-4,21 (2H, t, CH2), 3,59 (3H, s, ), 3,42 (3H, s, ), 2,88-2,73 (2H, m, CH2), 2,59-2,45 (4H, m, CH2), 1,59 (4H, m CH2), 1,48 ( 2H, m CH2). MS (EI) m/z = 319,3 (M +, 30), 234 (40), 124 (40), 98 (100); t.t.: C. 7-(Indolin-7-ylometylo)-1,3-dimetylo-6,7-dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H,3Hpuryno-2,4-dion (12B) Do roztworu 8-bromoteofiliny (4) (0,519 g, 0,002 mola) w 20 cm3 n-propanolu dodano -(2,3-epoksypropylo)-indoliny (11A) (0,88 g, 0,005 mola) oraz kilka kropli pirydyny. Całość ogrzewano w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika przez 3 h kontrolując przebieg reakcji chromatograficznie [TLC; Silica Gel 60 F254; faza ruchoma CH3 :

113 113 MeH - 9:1] (do zaniku plamy 8-bromoteofiliny). astępnie mieszaninę pozostawiono na 24 h w temperaturze + 5 C. Wydzielony osad związku 12B odsączono i oczyszczono przez krystalizację z n-propanolu. Wydajność 57 %. C18H1953 (353,38); 1H-MR (300 MHz CD3) δ: 7,15-7,08 (2H, t, J = 7,69 Hz, CH), 6,80-6,70 (1H, t, J = 7,3 Hz, CH), 6,51-6,48 (1H, d, J = 7,69 Hz, CH), 5,70-5,59 (1H, m, CH), 4,58-4,50 (1H, t, J = 9,8 Hz CHH) 4,29-4,20 (1H, t, J = 9,8 Hz CHH), 3,86-3,45 (7H, m, CH2, ); 3,42-3,18 (3H, s), 3,08-2,98 (2H, t, J = 8,3 Hz, CH2). MS (EI) m/z = 353,3 (M+, 28), 234 (38), 158 (48), 132 (100); t.t.: C. 1,3-Dimetylo-7-piperydyn-1-ylo-7,8-dihydro-6H-[1,3]-oksazyno[2,3-f]-1H,3Hpuryno-2,4-dion (13A) Do roztworu 8-bromoteofiliny (1) (0,518 g, 2.0 mmola) w 5 cm3 n-propanolu dodano (2,3-epoksypropylo)-piperydynę (11A) (0,432 g, 3,0 mmola) oraz kilka kropli pirydyny. Całość ogrzewano przez 1 h w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Po ochłodzeniu z mieszaniny krystalizował osad, który odsączono i przemyto na lejku zimnym metanolem, a następnie wodą. Surowy produkt oczyszczono chromatograficznie [chromatotron: płyta 2 mm, Silica Gel PF254; faza ruchoma: CH22 : MeH - 47: 3]. Wydajność 87 %. C15H215 3 (319,37); 1H-MR (300 MHz CD3) δ: 4,60-4,30 (4H, m, CH2), 3,59 (3H, s, ), 3,42 (3H, s, ), 3,18 (1H, m, CH) 2,64-2,60 (4H, m, CH2), 1,59 (4H, m, CH2), 1,48 (2H, m, CH2). MS (EI) m/z = 319,3 (M+, 100), 234 (60), 124 (40), 98 (45); t.t.: C. 1,3-Dimetylo-7-indolin-7-ylo-7,8-dihydro-6H-[1,3]-oksazyno[2,3-f]-1H,3Hpuryno-2,4-dion (13B) Związek 12B (0,12 g, 0.3 mmola) z dodatkiem katalitycznych ilości pirydyny ogrzewano przez 41 h w n-butanolu (10 cm3) kontrolując przebieg reakcji chromatograficznie [TLC; Silica Gel 60 F254; faza ruchoma n-heksan : CH22 : EtH; 5:2:1]. astępnie mieszaninę pozostawiono na 24 h w temperaturze +5 C. Wydzielony osad zawierający obok produktu 13B śladowe ilości związku wyjściowego rozdzielono chromatograficznie [chromatotron: płyta 2 mm, Silica Gel PF254; faza ruchoma: nheksan : CH22 : EtH - 7:2:1]. Produkt krystalizowano Wydajność 82 %. w n-propanolu.

114 114 C18H1953 (353,38); 1H-MR (300 MHz CD3) δ 7,15-7,08 (2H, t, J = 7,69 Hz, CH), 6,80-6,70 (1H, t, J = 7,3 Hz, CH), 6,51-6,48 (1H, d, J = 7,69 Hz, CH), 4,68 (2H, m, CH2), 4,58 (2H, m, CH2), 4,27 (1H, m, CH), 3,51 (3H, s, ), 3,49-3,40 (2H, m, CH2), 3,36 (3H, s, ), 3,05-2,95 (2H, m, CH2). MS (EI) m/z = 353,3 (M+, 100), 234 (58), 158 (38), 132 (45); t.t.: C. 2-Metoksyfenylooctan 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofiliny (14) gólna procedura Estrowe pochodne otrzymano działając na enancjomer (-)-P23 lub (+)-P23 (0,25 mmola) kwasem 2-metoksyfenylooctowym (MPA) (0,25 mmola) w obecności dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) (0,3 mmola) i katalitycznych ilości 4-(dimetyloamino)pirydyny (DMAP). Całość mieszano w chlorku metylenu (3 cm3) w temperaturze pokojowej przez około 0,5 h, kontrolując przebieg reakcji chromatograficznie [TLC; Silica Gel 60 F254; faza ruchoma CH3 : MeH - 9:1]. astępnie mieszaninę przefiltrowano w celu usunięcia osadu dicykloheksylomocznika, z przesączu oddestylowano rozpuszczalnik, a suchą pozostałość oczyszczono chromatograficznie [chromatotron: płyta 2 mm, Silica Gel PF254; chloroform / metanol 49 : 1]. faza ruchoma

115 Tabela 6.2. Warunki syntezy i skręcalność właściwa 4-(2,3-epoksypropylo)-morfoliny ((±)-8, (-)-8, (+)-8) umer reakcji a EPa Morfolina / H2 ah 38% Wydajność [g]([mol]) [g]([mol]) [g]([mol]) [g] ([%]) (±) 27,7 (0,300) (±) 1,0 (0,010) S(+) 1,0 (0,010) S(+) 2,0 (0,020) S(+) 5,9 (0,064) S(+) 5,9 (0,064) S(+) 5,9 (0,064) R(-) 1,0 (0,010) R(-) 5,9 (0,064) R(-) 5,9 (0,064) 26,14 (0,3) / 0,90 0,873 (0,01) / 0,03 0,873 (0,01) / 0,03 1,746 (0,02) / 0,06 5,57 (0,064) / 0,20 5,57 (0,064) / 0,20 5,57 (0,064) / 0,20 0,873 (0,010) / 0,03 5,57 (0,064) / 0,20 5,57 (0,064) / 0,20 36,50 (0,3500) Sposób oczyszczania b Skręcalność właściwa [α]c [ ] 19,3 (45) DP x 1,40 (0,0134) 0,98 (63) KC x 1,40 (0,0134) 1,06 (68) KC - 4,13 2,80 (0,0268) 1,81 (58) KC - 6,40 7,68 (0,0134) 3,87 (42) DP - 15,34 7,68 (0,0134) 3,96 (43) DP - 20,02 7,68 (0,0134) 4,07 (45) DP 1,40 (0,0134) 1,06 (68) KC - 20,24-25,36d + 5,64 7,68 (0,0134) 3,72 (41) DP + 21,32 7,68 (0,0134) 3,72 (41) DP + 20, ,06d epichlorohydryna (EP) KC - kolumna chromatograficzna, DP - destylacja pod zmniejszonym ciśnieniem c stężenie próbki: 5 %, solwent: MeH, długość rurki polarymetrycznej: 10cm, d 10 %, toluen, 10cm b

116 Tabela 6.3. Warunki syntezy i skręcalność właściwa 7-(morfolinometylo)-1,3-dimetylo-6,7-dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H, 3H-puryno-2,4-dionu ((±)-9, (-)-9, (+)-9) Związek 1a Związek 8 b [g] ([mol]) 1 0,93 (0,0034) 2 2,66 (0,0103) 3 0,30 (0,0012) 4 0,45 (0,0017) 5 1,80 (0,0069) 6 2,23 (0,0086) 7 1,66 (0,0064) 8 1,80 (0,0069) umer reakcji a b Solwent/ katalizator Temp. reakcji [g] ([mol]) [cm3] [ C] (±) 0,97 (0,0067) (±) 1,80 (0,0126) (±) 0,40 (0,0028) (-) 0,50 (0,0035) (-) 2,00 (0,014) (+) 1,80 (0,0126) (+) 1,46 (0,0102) (+) 1,97 (0,0137) n-prh, 5,0/ pirydyna n-prh, 15,0/ pirydyna bzw. EtH 5,0/ pirydyna n-prh, 5,0/ pirydyna bzw. EtH 45,0/ pirydyna bzw. EtH 50,0/ pirydyna bzw. EtH 55,0/ pirydyna bzw. EtH 45,0/ pirydyna 97 1h 0,46 (40) min bromoteofilina (związek 1) 4-(2,3-epoksypropylo)-morfolina [związek (±)-8, (-)-8a, (+)-8b] Czas reakcji Wydajność Temp. topnienia Solwent Skręcalno ść właściwa [α]d [ ] Stężenie próbki x x x 1,15 (36) x x x 23 dni 0,13 (35) x x x min. 0,20 (36) ,69 2,4 CH22: MeH 49: dni 1,18 (65) ,67 2, dni 1,15 (51) ,28 2,88 CH22: MeH 49: dni 1,14 (63) ,02 2,88 CH22: MeH 49: dni 1,18 (65) ,36 2,87 CH22: MeH 49:1 [g] ([mol]) [ C] [ %] CH22: MeH 49:1

117 Tabela 6.4. Warunki syntezy i skręcalność właściwa 8-amino-7-[2-hydroksy-3-(morfolin-4-ylo)propylo]teofiliny ((±)-P23, (-)-P23, (+)-P23) Związek 9a H3aq. Etanol [g] ([mmol]) [cm3] 1 (±) 0,114 (0,355) 2 r reakcji Czas reakcji Wydajność [cm3] Temp. reakcji [ C] Skręcalność właściwa [α] [ ] Stężenie próbki [%] Solwent [g] ([%]) Temp. topnienia [ C] [h] 0,8 1, ,10 (83) x x x (±) 0,100 (0,311) 1,0 10, ,04 (40) x x x (±) 0,200 (0,622) 2,0 3 15, ,20 (93) x x x 4 (-) 0,213 (0,663) 2,0 15, ,16 (72) ,22 2,00 CH3: MeH 9:1 5 (-) 0,140 (0,436) 2,0 15, ,10 (68) ,66 1,56 CH22: MeH 49:1 (-) 0,150 (0,467) 2,3 16, ,15 ( 93) ,13 2,20 6 CH22: MeH 49:1 (-) 0,237 (0,007) 3,0 16, ,25 (94) ,47 2,20 7 CH22: MeH 49:1 (-) 0,230 (0,007) 3,0 16, ,23 (94) ,46 2,20 8 CH22: MeH 49:1 (+) 0,165 (0,513) 2,4 16, ,10 (71) (+) 0,200 (0,622) 3,0 16, ,16 (95) ,00 2,20 10 CH22: MeH 49:1 a 7-(morfolinometylo)-1,3-dimetylo-6,7-dihydro-1,3-oksazolo[2,3-f]-1H,3H-puryno-2,4-dion [ związek (±)-9, (-)-9, (+)-

118 118 Literatura LITERATURA Pawłowski M., Gorczyca M., Bobkiewicz Kozłowska T., Chodera A., Mrozikiewicz A., Patenty: PL B1, PL B1, Pawłowski M., Rozprawa habilitacyjna, AM im. M. Kopernika, Kraków Bobkiewicz-Kozłowska T., Rozprawa habilitacyjna, AM im. K. Marcinkowskiego, Poznań Shah R.R., Branch S.K., w Stereochemical aspects of drug action and disposition (red. Eichelbaum M., Testa B., Somogyi A.), Springer, Berlin 2003, s ógrádi M., Stereochemia podstawy i zastosowania, PW, Warszawa Smith D.F., Pharmacol.Toxicol. 1989, 65, Eliel E., Wilen A, Mander S., Stereochemistry of organic compounds, Wiley and Sons, ew York Morrison R.T, Boyd R.., Chemia organiczna, Wydawnictwo aukowe PW, Warszawa Gu C.-H., Grant D.J., w Chirality in drug design and development (red. Reddy I.K., Mehvar R.), Marcel Dekker, ew York 2004, s Cybulski J., Chilmonczyk Z., Acta Pol. Pharm., 1993, 50, Zejc A., w Chemia leków (red. Zejc A., Gorczyca M.), Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1998, s Cegła M., Duszyńska B., Post. Hig. Med. Dośw., 1990, 44, Testa B., Mayer J.M., w Stereochemical aspects of drug action and disposition (red. Eichelbaum M., Testa B., Somogyi A.), Springer, Berlin 2003, s Fersht A.R., Trends Biochem. Sci., 1987, 12, Mesecar A.D., Koshland D.E., ature, 2000, 403, Triggle D., Drug Discov. Today, 1997, 2, Shah R.R., w Stereochemical aspects of drug action and disposition (red. Eichelbaum M., Testa B., Somogyi A.), Springer, Berlin 2003, s Czarnecki A., Maciejczyk A., Kosek M., Mazurek A.P., Acta Pol. Pharm., 1993, 50, 5.

119 119 Literatura 19. Mehvar R., Brocks D.R., Vakily M., in. Pharmacokinet., 2002, 41, Reddy I.K., Kommuru T.R., Zaghloul A.A., Khan M.A., Ther. Drug Carrier Syst., 2000, 17, Barbanoj M.-J., Antonijoan R.-M., Gich I., in. Pharmacokinet., 2001, 40, Andersson T., in. Pharmacokinet., 2004, 43, Mészáros J., w Farmakologia. Podstawy farmakoterapii i farmakologii klinicznej (red. Kostowski W., Kubikowski P.), Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1996, s Spahn-Langguth H., Dressler C., Leisen C., w Stereochemical aspects of drug action and disposition (red. Eichelbaum M., Testa B., Somogyi A.), Springer, Berlin 2003, s Walsh G.M., Annuziato L., Frossard., Knol K., Levander S., icolas J.M., Taglialatela M., Tillement M.D., Timmerman H., Drugs, 2001, 61, Tillement J.P., Testa B., Brée F., Biochem. Pharmacol., 2003, 66, Gross A.S., Somogyi A., Eichelbaum M., w Stereochemical aspects of drug action and disposition (red. Eichelbaum M., Testa B., Somogyi A.), Springer, Berlin 2003, s Wong D.T., Bymaster F.P., Engleman E.A., Life Sci., 1995, 57, Lane R.M., Baker G.B., Cell. Molec. eurobiol., 1999, 19, Tucker G.T., Lancet 2000, 355, Sánchez C., Bøgesø K.P., Ebert B., Reines E.H., Braestrup C., Psychopharmacology, 2004, 174, Hindmarch I., Human Psychopharmacol. in. Exp., 2001, 16, García-Martín E., Martínez C., Tabares B., Frías J., Agúndez J.A.G., in. Pharmacol. Ther., 2004, Skálova L., Král R., Szotáková B., Babú Y.., Pichard-Garcia L., Wsól V., Chirality, 2003, 15, icklasson M., Björkman S., Roth B., Jönsson M., Höglund P., Chirality, 2002, 14, Zhang M., Fawcett J.P., Shaw J.P., Br. J. in. Pharmacol., 2002, 54, Montgomery S.A., Loft H., Sánchez C., Reines E.H., Papp M., Pharmacol. Toxicol., 2001, 88, Mørk A., Kreilgaard M., Sánchez C., europharmacology, 2003, 45, 167.

120 Literatura Caner H., Groner E., Levy L., Drug Discov.Today, 2004, 9, Agrant I., Canner H., Caldwell J., ature Rev. Drug Discov., 2002, 1, Achmatowicz., Grynkiewicz G., Acta Pol. Pharm., 1993, 50, Kohlmünzer S., Farmakognozja, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa Blaser H.-U., Chem. Rev., 1992, 92, Blockloc T.J., Shiman R.F., Buchter J.W., Shearin W.E., Budoveri J., Grenda V.J., J. rg. Chem., 1988, 53, Hanson R.M., Chem. Rev., 1991, 91, Lok M.C., Ward J.P., Van Dorp D.A., Chem. Phys. Lipids, 1976, 16, Jung M., Shaw T., J. Am. Chem. Soc., 1980, 102, Baldwin J.J., Raab A.W., Mensler K, Arison H.B., Mcure D.E., J. rg. Chem., 1978, 43, Du X.-D., Yu X.-D., J. Mol. Catal. A: Chem., 1997, 126, Katsuki T., Sharpless K.B., J. Am. Chem. Soc., 1980, 102, Gawroński J., Gawrońska K., Kacprzak K., Kwit M., Współczesna synteza organiczna, Wydawnictwo aukowe PW, Warszawa Hanson R.M., Sharpless K.B., J. rg. Chem., 1986, 51, Gao Y., Hanson R.M., Klunder J.M., Ko S.Y., Masamune H., Sharpless K.B., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, Sharpless K.B., Janssen Chimica Acta 1988, 1, Ko S.Y., Masamune H., Sharpless K.B., J. rg. Chem., 1987, 52, Barta.S., Sidler D.R., Somerville K.B., Weissman S.A., Larsen R.D., Reider P.J., rg. Lett., 2000, 2, Bonini C., Righi G., Tetrahedron, 2002, 58, Besse P., Veschambre H., Tetrahedron, 1994, 50, Zhang W., Loebach J.L., Wilson S.R., Jacobsen E.., J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, Irie R., oda K., Ito Y., Matsumoto., Katsuki T., Tetrahedron Lett., 1990, 31, Jacobsen E.., Zhang W., Guler M.L., J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, Zhang W., Jacobsen E.., J. rg. Chem., 1991, 56, Palucki M., McCormick G.J., Jacobsen E.., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 5457.

121 Literatura Xia Q.-H., Ge H.-Q., Ye C.-P., Liu Z.-M., Su K.-X., Chem. Rev., 2005, 105, Katsuki T., J. Mol. Catal. A: Chem., 1996, 113, Lebel H., Jacobsen E.., Tetrahedron Lett., 1999, 40, Bandini M., Cozzi P.G., Umani-Ronchi A., Chem. Commun., 2002, Svle P.S., Lamoreaux M.J., Berry J.F., Gandour R.D., Tetrahedron: Asymmetry, 1998, 9, Ready J.M., Jacobsen E.., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, Schaus S.E., Brandes B.D. Larrow J.F., Tokunaga M., Hansen K.B., Gould A.E., Furrow M.E., Jacobsen E.., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, Larrow J.F., Schaus S.E., Jacobsen E.., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, Hansen K.B., Leighton J.L., Jacobsen E.., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, Tokunaga M., Larrow J. F., Kakiuchi F., Jacobsen E.., Science, 1997, 277, Furrow M.E., Schaus S.E, Jacobsen E.., J. rg. Chem., 1998, 63, Larrow J.F., Hemberger K.E., Jasmin S., Kabir H., Morel. P., Tetrahedron: Asymmetry, 2003, 14, Kim G.J., Lee H., Kim S.J., Tetrahedron Lett., 2003, 44, Annis D.A., Jacobsen E.., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, Cavazzini M., Quici S., Pozzi G., Tetrahedron, 2002, 58, White D.E., Jacobsen E.., Tetrahedron: Asymmetry, 2003, 14, Shin C.K., Kim S.J., Kim G.J., Tetrahedron Lett., 2004, 45, McGarrigle E.M., Gilheany D.G., Chem. Rev., 2005, 105, Rodriguez S., Kayser M., Stewart J. D., J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, Lagos F.M., Campo C., Llama E.F., Sinisterra J.V., Enzyme Microb. Technol., 2002, 30, Patel R.., Enzyme Microb. Technol., 2002, 31, Ladner W.E., Whitesides G. M., J. Am. Chem. Soc., 1984, 106, Pesti J.A., Docosimo R., Curr. pin. Drug Discov. Dev., 2000, 18, Mahmoudian M.A., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992, 37, Hamaguchi S., hashi T., Wantanabe K., Agric. Biol. Chem., 1986, 50, 375.

122 Literatura akamura T., agasawa T., Yu F., Wantanabe I., Yamada H., Appl. Environ. Microbiol., 1994, 60, Palomo J.M., Segura R.L., Mateo C., Fuentes M., rtiz C.C., Guisán J.M., Fernández-Lafuente R., Enzyme Microb. Technol., 2006, 38, De Bont J.A.M., Tetrahedron: Asymmetry, 1993, 4, Kasai., Tsujimuro K., Unoura K., Suzuki T., J. Ind. Microbiol., 1992, 9, Pàmies., Bäckvall J.-E., Chem. Rev., 2003, 103, Steinreiber A., Mayer S.F., Staf R., Faber K., Tetrahedron: Asymmetry, 2001, 12, Blée E., Schuber F., Eur. J. Biochem., 1995, 230, Liderman R.J., Walker E.A., Haney C., Roe R.M., Tetrahedron, 1995, 51, Archelas A., Furstoss R., Trends Biotechnol., 1998, 16, Argiriadi M.A., Morisseau C., Goodrow M.H., Dowdy D.L., Hammock B.D., Christianson D.W., J. Biol. Chem., 2000, 129, Karboune S., Archelas A., Furstoss R., Baratti J., J. Mol. Catal B: Enzym., 2005, 32, Steinreiber A., Faber K., Curr. pin. Biotechnol., 2001, 12, Assis H.M.S., Bull A.T., Hardman D.J., Enzyme Microb. Technol., 1998, 22, Jacob M.H.J., van den Wijngaard A.J., Pentenega M., Janssen D.B., Eur. J. Biochem., 1991, 202, Rink R., Fennema M., Smids M., Dehmel U., Janssen D.B., J. Biol. Chem., 1997, 272, Spelberg L.J.H, van Hylckama Vlieg J.E.T., Bosma T., Kellogg R.M., Janssen D.B., Tetrahedron: Asymmetry, 1999, 10, Bonini C., Righi G., Synthesis, 1994, Suwiński J., Szczepankiewicz W., Świerczek K., Walczak K., Eur. J. rg. Chem., 2003, Tries F., Schaumann E., Eur. J. rg. Chem., 2003, Młochowski J., Chemia związków heterocyklicznych, Wydawnictwo aukowe PW, Warszawa Iskra J., Bonnet-Delpon D., Bégué J.-P., Eur. J. rg. Chem., 2002, 3402.

123 Literatura Perov V.A., Synthesis, 2002, Iranpoor., Firouzabadi H., Shekarize M., rg. Biomol. Chem., 2003, 1, Denmark S.E., Wynn T., Jellerichs B.G., Angew. Chem. Int. Ed., 2001, 40, Fási A., Pálinkó I., Gömöry Á., Kiricsi I., J. Cata., 1999, 188, Fási A., Pálinkó I., Gömöry Á., Kiricsi I., J. Cata., 2001, 200, Fási A., Pálinkó I., Gömöry Á., Kiricsi I., J. Mol. Catal. A: Chem., 2004, 208, March J., Advanced organic chemistry, John Wiley and Sons, ew York Caron M., Sharpless K.B., J. rg. Chem., 1985, 50, Regio J., Costa A., Saa J.M., Chem Lett., 1986, Bonini C., Righi G., Sotgiu G., J. rg. Chem., 1991, 56, Bonini C., Checconi M., Righi G., Rossi L., Tetrahedron, 1995, 22, Bonini C., Federici C., Rossi G., Righi L., J. rg. Chem., 1995, 60, Infante I., Bonini C., Lelj F., Righi G., J. rg. Chem., 2003, 68, Sharghi H., iknam K., Pooyan M., Tetrahedron, 2001, 57, Reddy M.A., Surendra K., Bhanumathi. Rao K.R., Tetrahedron, 2002, 58, Rodrígez J.R., avarro A., Tetrahedron Lett., 2004, 45, Chakraborti A.K., Kondaskar A., Tetrahedron Lett., 2003, 44, Hodgson D.M., Gibbs A.R., Lee G.P., Tetrahedron, 1996, 52, Jacobsen E.., Kakiuchi F., Konsler R.G., Larrow J.F., Tokunaga M., Tetrahedron Lett., 1997, 38, Sharghi H., asseri A.M., iknam K., J. rg. Chem., 2001, 66, Cossy J., Bellosta V., Hamoir C., Desmurs J.-R., Tetrahedron Lett., 2002, 42, Li Z., Zhou Z., Li K., Wang L., Zhou Q., Tang C., Tetrahedron Lett., 2002, 42, Mirkhani V., Tangestaninejad S., Yadollahi V., Alipanah L., Tetrahedron, 2003, 59, Moghadam M., Tangestaninejad S., Mirkhani V., Shaibani R., Tetrahedron, 2004, 60, Eisch J.J., Lu Z.R., Ma X., Zheng G.X., J. rg. Chem., 1992, 57, Ager D.J., Prakash I., Schaad D., Chem. Rev., 1996, 96, 835.

124 Literatura Jnaneshwara G.K., Deshpande V.H., Lalithambika M., Ravindranathan T., Bedekar A.V., Tetrahedron Lett., 1998, 39, Joossens J., van der Veken P., Lambier A.M., Augustyns K., Haemers A., J. Med. Chem., 2004, 47, Rao A.S., Pakinkar S.K., Kirtune J.G., Tetrahedron, 1983, 39, Smith J.G., Synthesis, 1984, Behrens C.H., Sharpless K.B., J. rg. Chem., 1985, 50, Kluder J.M., nami T., Sharpless K.B., J. rg. Chem., 1989, 54, Tius M.A., Fauq A.H., J. rg. Chem., 1983, 48, Sasaki M., Tanino K., Miyashita M., rg. Lett., 2001, 3, Sasaki M., Tanino K., Harai A., Miyashita M., rg. Lett., 2003, 5, Tomata Y., Sasaki M., Tanino K., Miyashita M., Tetrahedron Lett., 2003, 44, Kluder J.M., Sharpless K.B., J. rg, Chem., 1986, 51, Mcure D.E., Arison B.H., Baldwin J.J., J. Am. Chem. Soc., 1979, 101, Kitaori K., Furukawa Y., Yoshimoto H., tera J., Tetrahedron, 1999, 55, Campo C., Llama E.F., Bermúdez J.L., Sinisterra J.V., Biocatal. Biotransform., 2001, 19, Jurczak J., Pikul S., Bauer T., Tetrahedron, 1986, 42, Jung M.E., Shaw T.J., J. Am. Chem. Soc., 1980, 102, Bevinakatti H.S., Banerji A.A., J. rg. Chem., 1991, 56, Kluder J.M, Ko S.Y., Sharpless K.B., J. rg. Chem., 1986, 51, Wnüsche K., Schwaneberg U., Bornscheuer U.T., Meyer H.H., Tetrahedron: Asymmetry, 1996, 7, Kitaori K., Takehira Y., Furukawa Y., Yoshimoto H., tera J., Chem. Pharm. Bull., 1997, 50, Kiyotsuka Y., Igarashi J., Kobayashi Y., Tetrahedron Lett., 2002, 43, Camps P., Ferrés X.,. García M.L, Ginesta J., Pscual J., Mauleón D., Carganico G., Tetrahedron: Asymmetry, 1995, 6, Gao Y., Sharpless K.B., J. rg. Chem. 1988, 53, Kobayashi Y., Carbohydr. Res., 1999, 315, Groza.V., Ivanov I.V., Romanov S.G., Myagkova G.I., igam S., Tetrahedron, 2002, 58, 9859.

125 Literatura Deva R., Ciccoli R., Schewe T., Kock J.G.L., igam S., Biochim. Biophys. Acta, 2000, 1486, Woster P.M., Murray W.J., J. Med. Chem., 1986, 29, Kolb H.C., Bennani Y.L., Sharpless K.B., Tetrahedron: Asymmetry, 1993, 4, Kasai., Sakaguchi K., Tetrahedron Lett., 1992, 33, Bols M., Lundi I., Pedersen C., Tetrahedron, 1992, 48, Kasai., Suzuki T., Furukawa Y., J. Mol. Catal. B: Enzym., 1998, 4, Kabat M.M., Daniewski A.R., Burger W., Tetrahedron: Asymmetry, 1997, 8, 16, Page C.P., J. in. Pharmacol., 1999, 39, Tenor H., Hatzelmann A., Church M.K., Schudt C., Shute J.K., Br. J. Pharmacol., 1996, 118, Ezeamuzie C.I., Biochem. Pharmacol., 2001, 61, Chazan R., Med. po Dypl., 2003, 464, Caramori G., Adcock I., Pulm. Pharmacol. Ther., 2003, 16, Pawłowski M., w Chemia leków (red. Zejc A., Gorczyca M.), Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1998, s Rang H.P., Dale M.M., Ritter J.M., Farmakologia kliniczna, Wydawnictwo Czelej, Lublin Kostowski W., w Farmakologia. Podstawy farmakoterapii i farmakologii klinicznej (red. Kostowski W., Kubikowski P.), Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1996, s Zablocki J., Kalla R., Perry T., Palle V., Varkhedkar V., Xiao D., Piscopio A., Maa T., Gimbel A., Hao J., Chu., Leung K., Zeng D., Bioorg. Med. Chem. Lett., 2005, 15, Chazan R., Alergologia, 1998, 5, Fearon I.M., Palmer A.C.V., Balmoroth A.J., Ball S.G., Mikala G., Peers C., Eur. J. Pharmacol., 1998, 342, Chrostowska-Wynimko J., Post. auk Med., 2001, 1, Poulsen S-A., Quinn R.J., Bioorg. Med. Chem., 1998, 6, Linden J., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2001, 41, 775.

126 126 Literatura 182. Fredholm B.B., Abbracchio M.P., Burnstock G., Dubyak G.R., Harden T.K., Jacobson K.A., Schwabe U., Williams M., Trends Pharmacol. Sci., 1997, 18, Ralevic V., Burnstock G., Pharmacol. Rev., 1998, 50, King B.F., Townsend-icholson A., Burnstock G., Trends Pharmacol. Sci., 1998, 19, Feoktistov I., Polosa R., Holgate S.T., Biaggoni I., Trends Pharmacol. Sci., 1998, 19, Feoktistov I., Garland E.M., Goldstein A.E., Zeng D., Belardinelli L., Wells J.., Biaggoni I., Biochem. Pharmacol., 2001, 62, Shryock J.C., Belardinelli L., Am. J. Cardiol., 1997, 79, Williams M., Jarvis M.F., Biochem. Pharmacol., 2000, 59, Pawłowski M., w Chemia leków (red. Zejc A., Gorczyca M.), Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1998, s Kazimierczak A., owa Med., 2001, 1, Trachalska-Kryńska B., w Farmakologia. Podstawy farmakoterapii i farmakologii klinicznej (red. Kostowski W., Kubikowski P.), Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1996, s Płaźnik A., w Farmakologia - podstawy farmakoterapii i farmakologii klinicznej (red. Kostowski W., Kubikowski P.), Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1996, s Raghu P.M., Bahekar R.H., Rao A.R., Pharmazie, 2000, 55, Müller C.E., Farmaco, 2001, 56, Kaiser S.M., Quinn R.J., Drug Discov. Today, 1999, 4, ngini E., Monopoli B., Cacciari B., Baraldi P.G., Farmaco, 2001, 56, Sauer R., Maurinsh J., Reith U., Fülle F., Klotz K.-., Müller C.E., J. Med. Chem., 2000, 43, Kim Y.-C., Ji X.-D., Melman., Linden J., Jacobson K.A., J. Med. Chem., 2000, 43, Berk B., Akgün H., Erol K., Sirmagül B., Gao Z.-G., Jacobson K.A., Farmaco, 2005, 60, Hayallah A.M., Sandoval-Ramirez J., Reith U., Schobert U., Preiss B., Schumacher B., Daly J.W., Müller C.E., J. Med. Chem., 2002, 45, 1500.

127 Literatura Kim Y.-C., Karton Y., Ji X.-D., Melman., Linden J., Jacobson K.A., Drug Dev. Res., 1999, 47, Ezeamuzie C.I., Philips E., Br. J. Pharmacol., 1999, 127, Drabczyńska A., Schumacher B., Müller C.E., Karola-Wojciechowska J., Michalak B., Pękala E., Kieć-Kononowicz K., Eur. J. Med. Chem., 2003, 38, Müller C.E., Thorand M., Qurishi R., Diekmann M., Jacobson K.A., Padgett W.L., Daly J.W., J. Med. Chem., 2002, 45, Baraldi P.G., asser A.Z., Fruttarolo F., Tabrizi M.A., eunez M.C., Spalluto G., Romagnoli R., Synthesis, 2001, 56b, Pastorin G., Bolcato C., Cacciari B., Kachler S., Klotz K.-., Montopoli C., Moro S., Spalluto G., Farmaco, 2005, 60, Fhid., Pawłowski M., Jurczyk S., Müller C.E., Schumacher B., Farmaco, , Pawłowski M., Drabczyńska A., Gorczyca M., Malec D., Modzelewski J., Pharmazie, 1995, 50, Pawłowski M., Katlabi J., Rys B., Szneler E., Pharmazie, 1997, 52, Pawłowski M., Drabczyńska A., Katlabi J., Gorczyca M., Malec D., Modzelewski J., Eur. J. Med. Chem., 1999, 34, Pawłowski M., Katlabi J., Jurczyk S., Malec D., Modzelewski J., Farmaco, 2002, 57, Drabczyńska A., Müller C.E., Schumacher B., Hinz S., Karolak-Wojciechowska J., Michalak B., Pękala E., Kieć-Kononowicz K., Bioorg. Med. Chem., 2004, 12, Eckstein M., Dissert. Pharmaceticae, 1962, 14, Szebeni R., Korbonits D., Tetrahedron Lett., 1978, 23, Werner U., Haller R., Arch. Pharm., 1978, 309, Pawłowski M., Pol. J. Chem., 1983, 57, Agranat I., Caner H., Drug Discov. Today, 1999, 4, Heywood D., Phillips B., J. Am. Chem. Soc., 1958, 80, Chezlov I.G., Zavlin P.M., Kuznetsov L.L., Russ. J. Appl. Chem., 1998, 71, Bosc J.J., Jarry C., Martinez B., Molimard M., J. Pharm. Pharmacol., 2001, 53, 923.

128 Literatura Cegła M., Potaczek J., Żylewski M., Strekowski L. Tetrahedron Lett., 2005, 46, Zajączkowska J., Eckstein M., Dissert. Pharm. Pharmacol., 1971, 23, Papaj A., Praca magisterska, Katedra Chemii rganicznej CMUJ, Kraków, Achmatowicz., Malinowska I., Wiśniewski A., Gładecki Z., Fruziński A., Polish. J. Chem., 1996, 70, Świrska A., Acta. Pol. Pharm., 1962, 19, Seco M.J., Quiñoá E., Riguera R., Tetrahedron: Asymmetry, 2001, 12, Cheng Y.C., Prusoff W.H., Biochem. Pharmacol., 1973, 22, Caner H., Groner E., Levy L., Agranat I., Drug Discov. Today, 2004, 9, Tadeusiewicz R., Izworski A., Majewski J., Biometria, Wydawnictwa AGH, Kraków 1993.

129 129 Aneks 8. AEKS

130 Aneks 130

131 Aneks 131

132 Aneks 132