KINETYKA WZROSTU WYBRANYCH SZCZEPÓW DROŻDŻY Z RODZAJU RHODOTORULA W PODŁOŻACH Z ZIEMNIACZANĄ WODĄ SOKOWĄ I GLICEROLEM

Transkrypt

1 KINETYKA WZROSTU WYBRANYCH SZCZEPÓW DROŻDŻY Z RODZAJU RHODOTORULA W PODŁOŻACH Z ZIEMNIACZANĄ WODĄ SOKOWĄ I GLICEROLEM ANNA MARIA KOT, STANISŁAW BŁAŻEJAK, IWONA GIENTKA, LIDIA STASIAK-RÓŻAŃSKA, MAREK KIELISZEK Streszczenie Wraz z rozwojem cywilizacji nastąpił rozwój przemysłu i związany z tym wzrost ilości produktów odpadowych. Rosnąca świadomość ekologiczna społeczeństwa oraz troska o środowisko naturalne skłoniły do poszukiwania nowych sposobów utylizacji i zagospodarowania problematycznych odpadów. Duże nadzieje pokłada się w metodach biotechnologicznych, które nie tylko umożliwiają biodegradację produktów ubocznych ale także pozyskanie nowego produktu o wartości dodanej takiego jak np. biomasa drożdży. Celem pracy było porównanie dynamiki wzrostu drożdży R. glutinis, R. mucilaginosa oraz R. gracilis w podłożach modelowych przygotowanych z dwóch surowców odpadowych. Jako źródło węgla zastosowano glicerol, a jako źródło azotu odbiałczoną ziemniaczaną wodę sokową. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że wszystkie szczepy drożdży posiadały zdolność do wzrostu w podłożach modelowych, a kinetyka wzrostu była cechą indywidualną danego szczepu zależną od stężenia glicerolu w środowisku hodowlanym. W przypadku hodowli drożdży R. mucilaginosa oraz R. gracilis zwiększanie zawartości glicerolu w podłożu skutkowało zmniejszeniem właściwej szybkości wzrostu oraz wydłużeniem czasu generacji w porównaniu do podłoży kontrolnych. Podczas hodowli drożdży R. glutinis taką samą tendencję stwierdzono w pożywkach zawierających powyżej 5% tego związku. We wszystkich podłożach modelowych najwyższy wzrost (ΔOD) oraz szybkość właściwą wzrostu (µ max ) wykazał szczep drożdży R. glutinis. Dodatek glicerolu do środowiska w ilości powyżej 10% (m/v) znacznie ograniczał wzrost badanych szczepów drożdży. Słowa kluczowe: odpady, biodiesel, Rhodotorula, Bioscreen C Wprowadzenie W przypadku niektórych odpadów przemysłowych brak jest racjonalnych koncepcji zagospodarowania, a ich utylizacja w warunkach naturalnych może doprowadzić do degradacji środowiska naturalnego. Do takich produktów ubocznych należą m.in. odbiałczona ziemniaczana woda sokowa powstająca podczas produkcji skrobi ziemniaczanej oraz frakcja glicerynowa wytworzona podczas produkcji biodiesla. Produkcja skrobi ziemniaczanej w Europie wynosiła 87

2 w ostatnich latach około 1,7 mln ton rocznie. W Polsce wartość ta utrzymuje się od kilku lat na stałym poziomie, wynoszącym około 105 tys. ton [Dzwonkowski, 2012]. Głównym produktem ubocznym powstającym podczas produkcji skrobi ziemniaczanej jest ziemniaczana woda sokowa. Szacuje się, że podczas przerobu 1000 ton ziemniaków powstaje około 600 m 3 ziemniaczanej wody sokowej [Bzducha-Wróbel i in., 2014]. Ziemniaczana woda sokowa zawiera średnio 2,9-4,3% suchej substancji, z czego białko stanowi 0,93-1,57%, cukry 0,5-0,8%, tłuszcz 0,2%, związki mineralne 1%. Odpad ten charakteryzuje się wysoką wartością wskaźnika ChZT, który wynosi co najmniej mg O 2 /L [Lubiewski i in., 2006]. Frakcja glicerynowa składa się głównie z glicerolu w ilości 50-65%, a pozostałą część stanowią metanol, wolne kwasy tłuszczowe, mono- i diacyloglicerole, fosfolipidy, tokoferole, barwniki, mydła, woda oraz resztki katalizatora [Gaca, 2006]. W 2012 roku całkowita ilość wyprodukowanego biodiesla wyniosła ponad 23 mln ton, z czego przeszło 39% wytworzono w Unii Europejskiej [Internet 2]. W Polsce sektor biopaliw stale się rozwija. W 2010 roku produkcja wynosiła około 400 tys. ton, a ilość ta pokryła jedynie 44% krajowego zapotrzebowania [Roszkowski, 2012]. Według dostępnych danych, ilość wytworzonego w 2013 roku biodiesla wzrosła do około 650 tys. ton [Internet 1]. Problemy powstające w trakcie utylizacji ziemniaczanej wody sokowej oraz glicerolu stały się podstawą do poszukiwania nowych biotechnologicznych metod ich przetwarzania, które umożliwiłyby skuteczną biodegradację z jednoczesnym wytworzeniem produktu o wartości dodanej. Drożdże z rodzaju Rhodotorula występują powszechnie w wodzie, glebie, powietrzu oraz na roślinach i zwierzętach. Do niedawna były postrzegane wyłącznie jako saprofity psujące żywność [Lewicka i in., 2009] czy też jako czynnik etiologiczny grzybic skórnych [Wirth i Goldani, 2012]. W ostatnich latach stwierdzono, że drożdże te są zdolne do syntezy wielu metabolitów o znaczeniu przemysłowym. Biomasa tych mikroorganizmów może stanowić źródło tłuszczu [Saenge i in., 2011], karotenoidów [Hernández-Almanza i in., 2014] lub enzymów takich jak amoniakoliaza fenyloalaninowa [Zhu i in., 2014] oraz α-l-arabinofuranozydaza [Martínez i in., 2006]. Ponadto drożdże z rodzaju Rhodotorula zdolne są do wzrostu i syntezy metabolitów w podłożach zawierających surowce odpadowe, co zwiększa ekonomiczną opłacalność procesów biotechnologicznych [Xue i in., 2008; Schneider i in., 2013; Błażejak i in., 2014]. Z technologicznego i ekonomicznego punktu widzenia, ważną cechą procesów biotechnologicznych jest szybkość wzrostu mikroorganizmów, ponieważ od niej zależy stopień biodegradacji odpadów oraz ilość wytworzonej biomasy komórkowej. Wygodnym narzędziem pozwalającym wstępnie ocenić zdolność wzrostu jest aparat Bioscreen C, który umożliwia prowadzenie jednocześnie 200 mikrohodowli drobnoustrojów. W urządzeniu tym monitorowanie wzrostu odbywa się podstawie zmian gęstości optycznej. 88

3 Celem pracy było porównanie kinetyki wzrostu trzech szczepów drożdży z rodzaju Rhodotorula podczas hodowli w podłożach przygotowanych z ziemniaczanej wody sokowej suplementowanej różnymi dawkami glicerolu. Materiał i metody badań Materiał biologiczny badań stanowiły trzy szczepy drożdży: Rhodotorula glutinis LOCK 0051, Rhodotorula mucilaginosa ATCC oraz Rhodotorula gracilis pochodzące z Muzeum Czystych Kultur Zakładu Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności SGGW w Warszawie. Ziemniaczaną wodę sokową przygotowano w warunkach laboratoryjnych z ziemniaków odmiany Irga, według metodyki opracowanej na podstawie etapów procesu technologicznego otrzymywania skrobi ziemniaczanej w krochmalniach. Umyte ziemniaki rozdrabniano mechanicznie, w wyniku czego nastąpiło oddzielenie soku komórkowego od pulpy ziemniaczanej. Pozostałości skrobi z wody sokowej usuwano poprzez wirowanie przy 3000g przez 20 minut (Centrifuge 5810, Eppendorf). W celu wytrącenia białka ziemniaczanego, wodę sokową zakwaszano roztworem kwasu solnego do ph 5,0 i ogrzewano w temperaturze 117 o C przez 10 minut. Białko oddzielano od roztworu przez filtrację. Uzyskaną w ten sposób ziemniaczaną wodę sokową sterylizowano (121 o C/20 min) i do czasu wykorzystania przechowywano w temperaturze pokojowej. Ziemniaczana woda sokowa zawierała 1,34% cukrów redukujących (oznaczonych metodą Millera) oraz 1,29% białka ogółem (oznaczonego metodą Kjeldahla). W badaniach zastosowano dwa podłoża kontrolne: YPD (glukoza 20 g/l, pepton 20 g/l, ekstrakt drożdżowy 10 g/l) oraz odbiałczoną ziemniaczaną wodę sokową (W). Podłoża modelowe przygotowano na bazie ziemniaczanej wody sokowej, która stanowiła źródło azotu oraz glicerolu stanowiącego źródło węgla (POCH, Polska), który dodawano w ilości 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 oraz 25% (m/v). W dalszej części pracy podłoża modelowe oznaczono odpowiednio następującymi skrótami: W+G2%, W+G3%, W+G4%, W+G5%, W+G10%, W+G15%, W+G20% oraz W+G25%. Kwasowość czynną podłoży ustalono na początku hodowli poziomie 5,0 ± 0,1. Do przygotowania inokulum zastosowano płynne podłoże YPD o początkowej kwasowości czynnej 5,0 ± 0,1. Hodowle badanych szczepów drożdży prowadzono w kolbach płaskodennych, na wytrząsarce posuwisto-zwrotnej przy 200 rpm/min (SM-30 Control, Edmund Bühler) w temperaturze 28 o C przez godziny, tak aby w inokulum znajdowało się ok.1x10 6 jtk/cm 3 (liczbę komórek drożdży określano w komorze Thoma). Po tym czasie pobierano jałowo 1 cm 3 podłoża i odwirowywano (2000g/10 minut, MiniSpin Plus, Eppendorf), następnie biomasę drożdży przemywano jałową solą fizjologiczną i wirowano. Supernatant zlewano, a biomasę zawieszano w 1 cm 3 odpowiedniego podłoża kontrolnego lub modelowego. Następnie inokulum przenoszono ilościowo do probówek zawierających 9 cm 3 odpowiedniego podłoża kontrolnego lub modelowego. 89

4 Hodowle wybranych szczepów drożdży w podłożach kontrolnych oraz modelowych prowadzono w automatycznym aparacie Bioscreen C (Oy Growth Curves Ab Ltd, Finlandia). Do jednej mikrostudzienki znajdującej się na płytce wprowadzano 300 µl zaszczepionego podłoża (ok. 1x10 5 jtk/cm 3 ). Jednocześnie w celu kontroli jałowości przygotowano próbki niezaszczepione. Hodowle prowadzono przez 120 godzin, w temperaturze 28 o C przy intensywnym wytrząsaniu. Pomiaru gęstości optycznej dokonywano co 2 godziny przy zastosowaniu filtra szerokopasmowego λ= nm. Na podstawie wyników uzyskanych z pięciu równoległych powtórzeń sporządzono wykresy zależności pomiędzy gęstością optyczną hodowli (OD), a czasem jej trwania w arkuszu programu Microsoft Office Excel Następnie wyznaczono czas trwania fazy adaptacyjnej (Δt lag ), fazy logarytmicznej (Δt log ) oraz minimalną i maksymalną wartość OD w fazie wzrostu logarytmicznego. Współczynnik właściwej szybkości wzrostu (µ max ) obliczono wykorzystując wzór: µ max = (lnod max lnod min )/Δt log. Czas generacji (g) wyznaczono ze wzoru: g=ln2/µ max. Ponadto określono również całkowity przyrost gęstości optycznej hodowli (ΔOD). Wyniki i dyskusja Charakterystyki wzrostu wybranych szczepów z rodzaju Rhodotorula dokonano na podstawie zmian wartości gęstości optycznej w poszczególnych godzinach hodowli w aparacie Bioscreen C. Uzyskane wyniki przedstawiono w Tab. 1, 2 oraz 3. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że badane drożdże z rodzaju Rhodotorula były zdolne do wzrostu w podłożach kontrolnych oraz wybranych podłożach modelowych. We wszystkich przypadkach najwyższy całkowity przyrost gęstości optycznej hodowli odnotowano w syntetycznym podłożu kontrolnym YPD oraz podłożu zawierającym ziemniaczaną wodę sokową. Czas trwania poszczególnych faz wzrostu w tych podłożach był zależny od szczepu. Najszybciej do nowego środowiska przystosowały się komórki drożdży Rhodotorula mucilaginosa, a czas trwania fazy adaptacyjnej wynosił 4 godziny (tab. II). Podczas hodowli drożdżyrhodotorula glutinis oraz Rhodotorula gracilis czas trwania tej fazy był dłuży i wynosił odpowiednio 10 i 16 godzin (Tab. 1 i 3). Drożdże R. mucilaginosa oraz R. gracilis wykazały najszybsze tempo wzrostu, wyrażone jako współczynnik µ max, w podłożach kontrolnych. Czas generacji w podłożach YPD oraz W wynosił ok. 14 godzin dla R. mucilaginosa (Tab. 2) oraz ok. 24 godzin dla R. gracilis (Tab. 3). Drożdże R. glutinis wykazały natomiast najwyższe tempo wzrostu w podłożach modelowych zawierających ziemniaczaną wodą sokową suplementowaną 2, 3 i 4% dodatkiem glicerolu. We wszystkich przypadkach zarówno czas trwania fazy adaptacyjnej jak i logarytmicznej był zbliżony i wynosił h. Najwyższą wartość współczynnika µ max stwierdzono w podłożu z 3% dodatkiem glicerolu (0,0533 h -1 ). W przypadku podłoży W+G2%, 90

5 W+G3% oraz W+G4% czas generacji był niższy niż w obu podłożach kontrolnych, natomiast dla hodowli w podłożu W+G5% zbliżony do wartości uzyskanej w podłożu zawierającym wyłącznie ziemniaczaną wodę sokową (Tab. 1). Tab. 1. Parametry charakteryzujące wzrost drożdży Rhodotorula glutinis LOCK 0051 w podłożach kontrolnych oraz modelowych zawierających różne stężenia glicerolu Podłoże Δt lag [h] Δt log [h] µ max [h -1 ] g [h] ΔOD YPD , ,8 1,741 W , ,2 1,482 W+G2% , ,5 1,436 W+G3% , ,0 1,383 W+G4% , ,4 1,411 W+G5% , ,7 1,363 W+G10% , ,5 1,320 W+G15% , ,0 1,259 W+G20% , ,1 0,610 W+G25% , ,6 0,639 Tab. 2. Parametry charakteryzujące wzrost drożdży Rhodotorula mucilaginosa ATCC w podłożach kontrolnych oraz modelowych zawierających różne stężenia glicerolu Podłoże Δt lag [h] Δt log [h] µ max [h -1 ] g [h] ΔOD YPD , ,8 1,612 W 4 8 0, ,5 1,452 W+G2% , ,2 1,394 W+G3% , ,1 1,304 W+G4% , ,4 1,287 W+G5% , ,4 1,234 W+G10% , ,6 1,170 W+G15% , ,5 1,096 W+G20% 80 faza logarytmiczna nie zakończyła się 0,812 do 120 h W+G25% brak wzrostu 91

6 Tab. 3. Parametry charakteryzujące wzrost drożdży Rhodotorula gracilis w podłożach kontrolnych oraz modelowych zawierających różne stężenia glicerolu Podłoże Δt lag [h] Δt log [h] µ max [h -1 ] g [h] ΔOD YPD , ,0 1,293 W , ,7 1,246 W+G2% , ,5 1,138 W+G3% , ,3 1,144 W+G4% , ,5 1,141 W+G5% , ,6 1,109 W+G10% , ,7 0,932 W+G15% , ,4 0,666 W+G20% 60 faza logarytmiczna nie zakończyła się 0,540 do 120 h W+G25% brak wzrostu Podobnie jak w przypadku hodowli R.glutinis, szybkość wzrostu drożdży R. mucilaginosa w podłożach modelowych z 2, 3, 4 i 5% dodatkiem glicerolu była do siebie zbliżona, jednak niższa niż w obu podłożach kontrolnych. Podczas hodowli drożdży R. mucilaginosa w podłożach W+G2% oraz W+G3% czas trwania fazy adaptacyjnej był taki sam jak w podłożach kontrolnych. Zmniejszeniu uległa natomiast właściwa szybkość wzrostu do 0,0382 h -1 (W+G2%) oraz 0,0362 h -1 (W+G3%), co skutkowało wydłużeniem czasu podwojenia biomasy do 18 i 19 godzin. W podłożach suplementowanych w 4 i 5% dodatek glicerolu również stwierdzono obniżenie właściwej szybkości wzrostu do 0,0339 h -1 (W+G4%) oraz 0,0309 h -1 (W+G5%) oraz wydłużenie czasu generacji do nieco ponad 20 godzin (Tab. 2). Najsłabszy wzrost w podłożach suplementowanych w 2, 3, 4 i 5% glicerolu wykazał szczep Rhodotorula gracilis. Odnotowano, że podczas hodowli w tych podłożach komórki drożdży długo przystosowywały się do nowego środowiska, a czas trwania fazy adaptacyjnej był znacznie dłuży niż w przypadku pozostałych dwóch szczepów. Również znacznie wydłużył się czas generacji, w porównaniu do pozostałych szczepów (Tab. 3). Podczas hodowli testowanych szczepów drożdży w podłożach modelowych stwierdzono, że wraz ze zwiększeniem stężenia glicerolu w środowisku zmniejszał się całkowity przyrost gęstości optycznej. Suplementacja podłoży modelowych glicerolem w stężeniach 10 i 15% spowodowała zmniejszenie właściwej szybkości wzrostu badanych szczepów drożdży oraz wydłużenie czasu generacji. Najlepszy wzrost w tych podłożach wykazały drożdże R. glutinis, a współczynniki właściwej szybkości wzrostu równe były 0,0395 h -1 (W+G10%) oraz 0,0266 h -1 (W+G15%) (Tab. 1). Najsłabszym wzrostem natomiast charakteryzował się szczep R. gracilis. Wyznaczone wartości µ max wynosiły jedynie 0,0166 h -1 oraz 0,0071 h -1, a czas generacji zwiększył się 92

7 aż do 41,7 oraz 97,4 godzin odpowiednio dla hodowli w podłożach W+G10% i W+G15%. Warto również podkreślić, że w tych podłożach czas trwania fazy przystosowawczej równy był aż 52 godziny (Tab. 3). Drożdże R. glutinis wykazały zdolność do wzrostu w podłożach zawierających ziemniaczaną wodę sokową oraz najwyższe dawki glicerolu, tj. 20 i 25%. Podczas tych hodowli nastąpiło znaczne wydłużenie trwania fazy adaptacyjnej (24 i 20 h), logarytmicznego wzrostu (44 i 54 h) oraz spowolnienie tempa wzrostu komórek (Tab. 1). Dynamika wzrostu drożdży R. mucilaginosa oraz R. gracilis w podłożu W+G20% była podobna. Nastąpiło znaczące wydłużenie fazy adaptacyjnej, odpowiednio do 60 i 80 godzin, a faza wzrostu logarytmicznego nie zakończyła się do 120 h, w związku z tym niemożliwe było wyznaczenie parametrów charakteryzujących wzrost. Drożdże R. mucilaginosa oraz R. gracilis nie były zdolne do wzrostu w podłożu suplementowanym 25% dodatkiem glicerolu (Tab. 2 i 3). Saenge i in. [2011] prowadzili hodowle drożdży R. glutinis TISTR 5159 w podłożach zawierających jako źródło azotu siarczan amonu, a jako źródło węgla glicerol w stężeniu 5, 9,5 i 14%. Wzrost określano na podstawie plonu biomasy komórkowej. Podobniej jak w niniejszej pracy stwierdzono, że wysokie stężenie glicerolu w środowisku hodowlanym znacznie spowalnia wzrost drożdży R. glutinis. Błażejak i in. [2014] zastosowali w hodowlach wgłębnych drożdży R. gracilis ziemniaczaną wodę sokową jako źródło azotu oraz glicerol (5, 10, 15 i 20%) jako źródło węgla. Najwyższy wzrost badanego szczepu drożdży (wyrażony jako plon biomasy) uzyskano w podłożu z 5% dodatkiem glicerolu. Również odnotowano, że wzrastające stężenie ograniczało wzrost drożdży. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że czynnikiem determinującym wzrost badanych szczepów w podłożach modelowych była zawartość glicerolu w środowisku hodowlanym. W przypadku drożdży R. mucilaginosa oraz R. gracilis zwiększanie jego stężenia w podłożu skutkowało zmniejszeniem właściwej szybkości wzrostu oraz wydłużeniem czasu generacji w porównaniu do podłoży kontrolnych. Podczas hodowli R. glutinis taką samą tendencję stwierdzono w pożywkach zawierających powyżej 5% tego związku. Spowolnienie wzrostu badanych szczepów prawdopodobnie wynikało ze stresu osmotycznego wywołanego zwiększonym stężeniem glicerolu. Ciśnienie osmotyczne środowiska hodowlanego jest bowiem jednym z ważniejszych parametrów warunkujących wzrost drobnoustrojów [Sochocka i Boratyński, 2011]. Glicerol, jako substancja o wysokiej lepkości [Quispe i in., 2013], mógł również w pewnym stopniu oblepić komórki drożdży, utrudniając im wykorzystywanie składników odżywczych obecnych w środowisku. 93

8 Wnioski 1. Badania wykazały, że glicerol oraz odbiałczona ziemniaczana woda sokowa mogą stanowić składniki podłoży hodowlanych stosowanych do produkcji biomasy drożdży z rodzaju Rhodotorula. 2. Szybkość wzrostu drożdży w podłożach modelowych była zależna od zawartości glicerolu w środowisku hodowlanym. Najwyższy wzrost (ΔOD) oraz szybkość właściwą wzrostu (µ max ) w tych podłożach stwierdzono podczas hodowli drożdży Rhodotorula glutinis LOCK Glicerol w stężeniu powyżej 10% (m/v) hamował wzrost badanych szczepów drożdży z rodzaju Rhodotorula. Literatura [1] Adamczak M., Bornscheuer U.T., Bednarski W.: The application of biotechnological methods for the synthesis of biodiesel. European Journal of Lipid Science and Technology, 2009, 111(8), [2] Błażejak S., Gientka I., Bzducha-Wróbel A., Stasiak-Różańska L., Maszewska M. 2014: Ocena zdolności biosyntezy tłuszczu przez drożdże Rhodotorula gracilis w podłożach zawierających ziemniaczaną odpadową wodę sokową wzbogaconą glicerolem. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 2014, 576, [3] Bzducha-Wróbel A., Błażejak S., Molenda M., Reczek L.: Biosynthesis of β(1,3)/(1,6)-glucans of cell wall of the yeast Candida utilis ATCC 9950 strains in the culture media supplemented with deproteinated potato juice water and glycerol. European Food Research and Technology, 2014, doi: /s [4] Dzwonkowski W.: Perspektywy rynku skrobi i produkcji ziemniaków skrobiowych w kontekście zmian Wspólnej Polityki Rolnej. Biuletyn Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, 2012, 265, [5] Gaca J.: Faza glicerynowa po produkcji biodiesla - odpad czy cenny surowiec? Czysta Energia, 2006, 11, [6] Hernández-Almanza A., Montanez J.C., Aguilar-González M.A., Martínez- Ávila C., Rodriguez-Herrera, Aguilar C.A.: Rhodotorula glutinis as source of pigments and metabolites for food industry. Food Bioscience, 2014, 5, [7] Internet1: biopal/dane dotyczace-rynku-b, dostęp w dniu [8] Internet 2: dostęp w dniu [9] Lewicka A., Błażejak S., Migdal M.: Tradycyjne i nowe kierunki biotechnologicznego wykorzystania drożdży z rodzaju Rhodotorula. ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2009, 3 (64), [10] Lubiewski Z., Śmigielska H., Lewandowicz G., Balcerek W.: Charakterystyka odcieku po koagulacji białka pozyskiwanego w toku kampanii 94

9 krochmalniczej. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 2006, 511, [11] Martínez C., Gertosio C., Labbe A., Pérez R., Ganga M.A.: Production of Rhodotorula glutinis: a yeast that secretes α-l-arabinofuranosidase. Electronic Journal of Biotechnology, 2006, 9(4), doi: /vol9-issue4- fulltext-8. [12] Quispe C.A.G., Coronado C.J.R., Carvalho J.A.: Glycerol: Production, consumption, prices, characterization and new trends in combustion. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 2013, 27, [13] Roszkowski A.: Biodiesel w UE i Polsce - obecne uwarunkowania i perspektywy. Problemy Inżynierii Rolniczej, 2012, 77(3), [14] Saenge Ch., Cherisilp B., Suksaroge T., Bourtoom T.: Potential use of oleaginous red yeast Rhodotorula glutinis for the bioconversion of crude glycerol from biodiesel plant to lipids and carotenoids. Process Biochemistry, 2011, 46, [15] Schneider T., Graeff-Hönninger S., French W.T., Hernandez R., Merkt N., Claupein W., Hetrick M., Pham P.: Lipid and carotenoid production by oleaginous red yeast Rhodotorula glutinis cultivated on brewery effluents. Energy, 2013, 61, [16] Sochocka M., Boratyński J: Osmoregulacja - ważny parametr rozwoju bakterii. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 2011, 65, [17] Wirth F., Goldani L.Z.: Epidemiology of Rhodotorula: an emerging pathogen. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases, 2012, doi: /2012/ [18] Xue F., Miao J., Zhang X., Luo H., Tan T.: Studies on lipid production by Rhodotorula glutinis fermentation using monosodium glutamate wastewater as culture medium. Bioresource Technology, 2008, 99, [19] Zhu L., Zhou L., Cui W., Liu Z., Zhou Z.: Mechanism-based site-directed mutagenesis to shift the optimum ph of the phenylalanine ammonia-lyase from Rhodotorula glutinis JN-1. Biotechnology Reports, 2014, 3,