WYZNACZANIE MAS CZĄSTECZKOWYCH BIOPOLIMERÓW

Transkrypt

1 MATERIAŁY POMOCNICZE DO WYKŁADÓW Z PODSTAW BIOFIZYKI IIIr. Biotechnologii prof. dr hab. inż. Jan Mazerski WYZNACZANIE MAS CZĄSTECZKOWYCH BIOPOLIMERÓW Określenie masy cząsteczkowej było zawsze jednym z podstawowych zagadnień przy charakteryzowaniu biopolimerów. Przy poszukiwaniu metod rozwiązania tego zagadnienia napotykano wiele różnorakich przeszkód. Podstawową była sama masa cząsteczkowa, która dla typowych białek zawiera się w przedziale od kilkunastu do kilkuset tysięcy daltonów. Żadna z technik stosowanych przy oznaczaniu masy cząsteczkowej związków chemicznych nie może być stosowana dla tak dużych cząsteczek. Rozpoczęto więc na przełomie XIX i XX w. poszukiwanie specjalnych technik pozwalających na choćby przybliżone oszacowanie masy cząsteczkowej biopolimerów. Metody sedymentacyjne Pierwsze próby dotyczyły zastosowania metod sedymentacyjnych opierających się na wykorzystaniu różnic w gęstości rozpuszczalnika i biopolimeru. Sedymentacja zawiesin makroskopowych Podczas sedymentacji zawiesin makroskopowych w polu grawitacyjnym obserwujemy charakterystyczny przebieg zjawiska: bezpośrednio po zakończeniu mieszania cząstki zawieszone są w całej objętości - ich stężenie jest jednakowe w każdym naczynia. upływ czasu Po pewnym czasie, na skutek opadania cząstek zawiesiny górna część płynu nie zawiera zawiesiny, a na dnie pojawia się osad. Pomiędzy zawiesiną i czystym płynem występuje ostra granica. W miarę upływu czasu granica ta przesuwa się ku dołowi. Rośnie również grubość osadu na dnie. Na szybkość sedymentacji ma wpływ: różnica gęstości pomiędzy cząstkami zawiesiny a cieczą lepkość płynu decydująca o tarciu pomiędzy cząstkami zawiesiny a płynem. 1

2 Zjawisko opadania makroskopowych cząstek zawiesiny można znacznie przyspieszyć umieszczając roztwór w wirówce. Pojawiająca się podczas wirowania siła odśrodkowa może mieć wielokrotnie większa wartość niż siła ciężkości. Sedymentacja makrocząsteczek W przypadku zawiesiny makrocząsteczek biologicznych różnica gęstości pomiędzy silnie hydratowanym biopolimerem a roztworem wodnym jest tak mała, że w polu grawitacyjnym nie obserwujemy zjawiska sedymentacji. Dochodzi do tego jeszcze efekt dyfuzji: aby pojawiła się sedymentacja siłą działająca na cząsteczkę (ciężar lub siła odśrodkowa) musi przewyższać przeciwnie skierowana siłę dyfuzji wynikającą z ruchów termicznych. Dopiero gdy poddamy próbkę działaniu sił odśrodkowych setki lub tysiące razy większych niż siła grawitacyjna pojawia się zjawisko sedymentacji. Uzyskanie dostatecznie dużych sił odśrodkowych wymaga zastosowania wirówek o specjalnej konstrukcji, tzw. ultrawirówek. Współczesne ultrawirówki umożliwiają uzyskanie sił odśrodkowych nawet razy przekraczających siłę grawitacji. W polu sił odśrodkowych makrocząsteczki mogą ulegać sedymentacji lub przeciwnie skierowanej flotacji. Jeżeli gęstość makrocząsteczek jest większa od gęstości rozpuszczalnika, to biopolimer sedymentuje. Biopolimery o gęstości mniejszej od gęstości rozpuszczalnika, np. lipidy, ulegają flotacji, czyli kierują się w stronę menisku Technika ultrawirowania znajduje obecnie szerokie zastosowanie w badaniu makrocząsteczek. Umożliwia ona m.in. wyznaczenie bezwzględnych mas cząsteczkowych biopolimerów. Poza zastosowaniami analitycznymi ma też wielkie zastosowanie przy rozdzielaniu organelli komórkowych, białek, kwasów nukleinowych, lipoprotein i lipopolisacharydów. Podstawy teoretyczne Podczas wirowania na cząsteczkę biopolimeru w roztworze działają 3 siły: siła odśrodkowa F 2 [1] F = mω r = ma = Vρa gdzie: m masa cząsteczki ω - prędkość kątowa rotora r odległość od osi obrotu a - przyspieszenie odśrodkowe V objętość cząsteczki ρ - gęstość cząsteczki W F T 2

3 przeciwnie skierowana siła wyporu W 2 ρs [2] W = Vρsω r = Vρsa = m a ρ [3] gdzie: ρ s - gęstość cieczy tarcie dynamiczne T zależne od szybkości ruchu cząsteczki dr T = f dt gdzie: f współczynnik tarcia Przyjmując sferyczny kształt cząsteczki oraz laminarny przepływ cieczy można zastosować wzór Stokesa: [4] T = 6πηd dr dt gdzie: d - promień makrocząsteczki η - lepkość cieczy W roztworze szybko dochodzi do ustalenia się stanu równowagi, w którym siła tarcia równoważy siłę odśrodkową pomniejszoną o siłę wyporu i cząsteczka porusza się ruchem jednostajnym. Warunek równowagi ma zatem postać: [5] F W = V( ρ ρ ) s 2 ω r = 6πηd Można go przekształcić do postaci: [6] ρs 1 dr ρ 1 = 6πηd. ρ ω r dt V 2 dr dt Wielkością charakteryzującą ruch danej cząsteczki w danym rozpuszczalniku jest stała sedymentacji S: [7] 1 dr S =. 2 ω r dt Jest ona równa przyrostowi prędkości sedymentacji cząsteczki w wyniku jednostkowego przyrostu przyspieszenia odśrodkowego. Jednostką stałej sedymentacji jest 1 S (swedberg) = s. Korzystając ze współczynnika sedymentacji można wzór[6] zapisać w postaci: ρs [8] Vρ 1 = 6πηdS. ρ Masę pojedynczej cząsteczki biopolimeru, m, można wyrazić wzorem: [9] m = Vρ = M N A 3

4 gdzie: M - masa cząsteczkowa w gramach N A - liczba Avogadro. Podstawiając powyższą zależność do wzoru [6] i mnożąc obustronnie przez N A otrzymujemy: ρs [10] M 1 = 6πηdsN A ρ Ze wzoru tego można wyznaczyć masę cząsteczkową makrocząsteczki znając stałą sedymentacji s: [11] 6πηdsN A M = ρs 1 ρ Powróćmy jeszcze do równania [5]. Można je tak przekształcić, aby uzyskać wzór na szybkość ruchu cząsteczek: [12] dr dt ( ρ ρ ) V s a = 6πηd Uwzględniając sferyczny kształt cząsteczki można wyrazić objętość jako funkcję średnicy: V = πd 3 /6. Prowadzi to do zmodyfikowanej postaci wzoru [12]: [12a] dr dt d = 2 ( ρ ρ ) 36η s a Tak więc przy danym przyspieszeniu odśrodkowym, a, szybkość ruchu sferycznej cząsteczki biopolimeru jest wprost proporcjonalna do kwadratu promienia i różnicy gęstości cząsteczki i rozpuszczalnika oraz odwrotnie proporcjonalna do lepkości roztworu. Cząsteczki niektórych biopolimerów istotnie odbiegają od kształtu sferycznego. W takiej sytuacji wzór [12] przyjmuje postać: [12b] dr dt d = k 2 ( ρ ρ ) 36η gdzie: k - współczynnik kształtu. s a Dla cząsteczek o kształcie dysku wartość k jest większa od 1, a dla cząsteczek o kształcie pręta lub cygara mniejsza od 1. Wirówki i ultrawirówki Wirówki można umownie podzielić ze względu na uzyskiwaną liczbę obrotów na: niskoobrotowe - do obr/min, średnioobrotowe - do obr/min, ultrawirówki - powyżej obr/min. 4

5 Natomiast ze względu na przeznaczenie, wirówki można podzielić na: analityczne; zwykle mają bardzo dużą liczbę obrotów i wyposażone są w układ do analizy przemieszczania się cząsteczek podczas wirowania; preparatywne; przystosowane do wirowania względnie dużych objętości roztworów; specjalnego przeznaczenia; np. wirówki hematokrytowe. Ponieważ jednym z ważnych parametrów podczas wirowania jest temperatura roztworu, więc wirówki i ultrawirówki wyposażone są w układy termostatujące umożliwiają kontrolę temperatury nawet z dokładnością do 0,1 stopnia. W ultrawirówkach i wirówkach średnioobrotowych rotor jest ponadto umieszczony w komorze próżniowej, aby wyeliminowań nagrzewanie się rotora od tarcia o powietrze. Jeżeli wirowanie odbywa się w próżni próbki muszą być hermetycznie zamknięte. W zależności od budowy rotora hermetyzacja może dotyczyć całego jego wnętrza lub pojedynczych próbek. Rodzaje rotorów Rotor wirówki to odpowiedni blok lub konstrukcja przymocowana do osi wirówki, w której umieszcza się probówki wirownicze. Podstawowe typy rotorów to: rotor horyzontalny (pojemniki na probówki są uchylne) rotor kątowy rotor analityczny W przypadku rotora horyzontalnego, Rys.1A, gilzy probówek wirówkowych są zawieszone na osiach prostopadłych do osi rotora i podczas wirowania ustawiają się wraz z probówkami pod kątem 90 do osi obrotu. Podczas wirowania cząstki poruszają się w polu siły odśrodkowej wzdłuż promienia obrotu w kierunku dna probówki. W miarę oddalania się od menisku działa na nie coraz większa siła odśrodkowa Rotor kątowy wykonany jest z jednolitego bloku metalu w którym znajdują się gniazda do umieszczenia probówek wirówkowych. Jeżeli wirowanie odbywa się w próżni, to rotor zamykany jest hermetyczną pokrywę. W rotorze kątowym, Rys.1B, probówki wirówkowe nie zmieniają swego położenia i ustawione są w stosunku do osi obrotu pod kątem α innym niż 90, najczęściej 30, 45 lub 60. Cząsteczki poruszają się prostopadle do osi obrotu i osadzają się na bocznej ścianie probówki. W rotorze tego typu różnice w odległościach cząsteczek od osi obrotu są znacznie mniejsze niż w rotorze horyzontalnym, więc i różnice w sile odśrodkowej w różnych miejscach probówki są mniejsze. 5

6 A) S S B) α C) Rys.1. Schemat budowy rotorów stosowanych w wirówkach laboratoryjnych i ultrawirówkach: A) rotor horyzontalny (po lewej w spoczynku, po prawej w czasie wirowania), B) rotor kątowy, C) rotor analityczny Rotor analityczny wykonany jest z duraluminium, stali lub tytanu i ma kształt spłaszczonej elipsoidy, Rys.1C. W rotorze znajdują się dwa cylindryczne otwory, których osie są równoległe do osi obrotu. Otwory te znajdują się symetrycznie po obu stronach osi obrotu. Umieszcza się w nich dwie kuwety: pomiarową z badanym roztworem i balastową o identycznej masie jako przeciwwagę. Kuwety stosowane w rotorach analitycznych mają specyficzną budowę, Rys.2. Rys.2. Budowa kuwety analitycznej Korpus kuwety analitycznej wykonany jest z metalu, wewnątrz niego znajduje się rdzeń wykonany z tworzywa lub szkła ze zbiorniczkiem sektorowym. Zbiorniczek zamknięty jest z dwóch stron przez okienka kwarcowe. Całość jest hermetycznie zamknięta. W połowie wysokości kuwety znajduje się otwór do jej napełniania. Istnieje kilka podstawowych typów kuwet analitycznych. Najprostsza jest kuweta jednosektorowa, Rys.3a. Kuweta dwusektorowa, Rys.3b, ma dwa zbiorniczki. Jeden z nich jest napełniany badanym roztworem, a drugi rozpuszczalnikiem. Taka kuweta pozwala rejestrować sedymentację badanego roztworu na tle rozpuszczalnika. Rys.3. Typy kuwet analitycznych W takich klasycznych kuwetach granice sedymentacji mogą być nieostre, co powoduje dużą niepewność wyznaczenia współczynnika sedymentacji, zwłaszcza substancji o małych masach 6

7 cząsteczkowych. Zastosowanie kuwety ze sztuczną granicą sedymentacji, Rys.3c, pozwala wyeliminować ten efekt. Jest to kuweta jednosektorowa z dwoma dodatkowymi zbiorniczkami połączonymi ze sobą i z dnem kuwety kapilarnymi kanałami. W głównym zbiorniczku sektorowym umieszcza się rozpuszczalnik, a w dodatkowych zbiorniczkach badany roztwór o większej gęstości. Gdy rotor osiągnie 7-8 tys. obr/min badany roztwór przemieszcza się na dno kuwety wypierając rozpuszczalnik w kierunku osi obrotu. Powstaje ostra granica sedymentacji, której położenie zmienia się w trakcie wirowania. We wszystkich typach kuwet analitycznych przesuwanie się granicy sedymentacji śledzi się metodami optycznymi przez pomiar współczynnika załamania światła, który jest proporcjonalny do stężenia substancji rozpuszczonej. Wykorzystywana może być metoda Pilpota-Svensona lub metoda interferencyjna Rayleigha. W obu metodach stosuje się wąską, monochromatyczną wiązkę światła. Pierwszy z układów rejestruje wartość pochodnej współczynnika załamania światła, dn/dr, wzdłuż promienia. Pochodna ta jest proporcjonalna do pochodnej stężenia badanej substancji dc/dr. Na granicy sedymentacji występuje szybka zmiana stężenia, co na wykresie pochodnej przejawia się występowaniem maksimum, Rys.4. dc/dr c A) r B) r Rys.4. Profile sedymentacji: A) wartość pierwszej pochodnej dc/dr i B) stężenie c w funkcji odległości od osi obrotu Układ interferencyjny Rayleigha umożliwia bezpośrednio wyznaczenie współczynnika załamania światła w każdym punkcie kuwety. Wymaga jednak grubszych kuwet, co z kolei prowadzi do wydłużenia czasu wirowania nawet do kilkudziesięciu godzin. 7

8 Wyznaczanie stałej sedymentacji Najczęściej stosowanym sposobem wyznaczania stałej sedymentacji jest metodą graficzną bazująca na zależności uzyskanej po scałkowaniu równania [7]: [13] 2 ln r = Sω t + const gdzie: r położenie granicy sedymentacji po czasie wirowania t z prędkością kątową ω. Wykonując wykres zależności ln(r) od ω 2 t powinniśmy otrzymać linię prostą. Nachylenie tej prostej równe jest współczynnikowi sedymentacji S. Aby uzyskać możliwie dokładną wartość S należy dokonać co najmniej kilku pomiarów położenia granicy sedymentacji. Wykorzystuje się w tym celu rotory analityczne. Określanie masy cząsteczkowej W początkowym okresie rozwoju metod sedymentacyjnych aby określić wielkość jakiegoś białka lub organelli komórkowej podawano jej stałą sedymentacji, np. rybosom 70 S. Z czasem opracowano techniki pozwalające na mniej lub bardziej dokładne oszacowanie masy cząsteczkowej na podstawie wyników pomiarów sedymentacyjnych. Dwie najpopularniejsze techniki omówimy poniżej. z zastosowaniem szybkości sedymentacji Ze wzoru [11] wynika, że znając stałą sedymentacji S można wyznaczyć masę cząsteczkową. We wzorze tym występują jednak kłopotliwe do eksperymentalnego wyznaczenia wielkości η i d. Można je wyeliminować korzystając ze wzoru Einsteina na współczynnik dyfuzji D: [14] RT D = 6πηdN A gdzie: R - stała gazowa, T - temperatura w kelwinach. Otrzymujemy wtedy I. równanie Svedberga: [16] RTS M = ρs D 1 ρ Pomiary stałej sedymentacji S i współczynnika dyfuzji D oraz gęstości rozpuszczalnika ρ s i gęstości makrocząsteczki ρ pozwalają na wyznaczenie masy cząsteczkowej. 8

9 metodą równowagi sedymentacyjnej Sedymentacja makrocząsteczek powoduje powstanie gradientu stężenia w roztworze. Po pewnym czasie wirowania ustala się stan równowagi pomiędzy przeciwnie skierowanymi procesami sedymentacji i dyfuzji, zwany równowagą sedymentacyjną. Stan równowagi sedymentacyjnej występuje przy niewielkiej liczbie obrotów (zwykle poniżej obr/min). W stanie równowagi sedymentacyjnej substancja rozpuszczona wypełnia całą kuwetę, a jej stężenie wzrasta od menisku do dna kuwety. Z warunku równowagi termodynamicznej wyprowadzić można wzór na masę cząst. substancji rozpuszczonej: [17] c2 2RTln c 1 M = ρ N 1 ω r r ρ ( 1 ) s A 2 Aby zastosować ten wzór należy określić stężenia makrocząsteczki c 1 i c 2 w odległości r 1 i r 2 od osi obrotu. W praktyce doświadczenie nie jest jednak takie proste. Osiągnięcie równowagi sedymentacyjnej wymaga zwykle kilkudziesięciu godzin wirowania. Znacznie szybszą wersję omawianej metody zaproponował Archibald. W wersji tej nie jest niezbędne osiągniecie stanu równowagi. Podczas dochodzenia do stanu równowagi w kuwecie występują dwa przekroje, przez które nie przemieszczają się sedymentujące cząsteczki. Jest to powierzchnia menisku (a) i dno kuwety (b). Warunek ten zachodzi niezależnie od tego czy został osiągnięty stan równowagi czy jeszcze nie: [18] 1 dc 1 dc Sω = = r c dr r c dr D a a a b b b 2 Zależność tą można sprowadzić do układu dwóch równań z których można wyznaczyć m.cz. biopolimeru odpowiednio przy menisku i przy dnie kuwety: [19a] [19b] M M a b dc RT dr = ρ ω ρ s 2 1 raca dc RT dr = ρ ω ρ a b s 2 1 rbcb Dla roztworu zawierającego jeden rodzaj biopolimeru M a = M b. Jeżeli w roztworze znajduje się mieszanina biopolimerów, to M a M b 9

10 Elektroforeza żelowa Elektroforezą nazywamy ruch cząsteczek obdarzonych ładunkiem w roztworze w polu elektrycznym. Siła F działająca na cząsteczkę w polu elektrycznym jest proporcjonalna do natężenia pola elektrycznego E i ładunku cząsteczki Q: [20] F = EQ Na skutek oporu hydrodynamicznego T cząsteczka porusza się podczas elektroforezy ze stałą prędkością v. Podstawą rozdziału cząsteczek podczas elektroforezy jest różnica w prędkości migracji. Rozdział elektroforetyczny może być prowadzony zarówno w roztworach (elektroforeza swobodna, elektroforeza kapilarna) jak i w nośnikach: na bibule, płytkach cienkowarstwowych lub w różnego rodzaju żelach. Rozdział biopolimerów prowadzi się zwykle na nośniku. Największe zastosowanie znajdują przezroczyste żele o różnym stopniu usieciowania, np. żele poliakryloamidowe. Podczas elektrolizy żelowej, poza ładunkiem cząsteczki, szybkość migracji zależy również od relacji pomiędzy wielkością cząsteczki a wielkością porów w żelu. Elektroforeza w obecności SDS Prędkość migracji natywnych białek w żelu poliakryloamidowym zależy nie tyle od masy czast. ile od ładunku i kształtu cząsteczki. W obecności soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS) cząsteczki białka ulegają denaturacji i tworzą z SDS micelle o ładunku ujemnym. SDS denaturacja SDS micellizacja Wykazano, że ładunek takiej micelli jest praktycznie niezależny od ładunku natywnego białka. Tym samym szybkość migracji białek w żelu w obecności SDS powinna zależeć przede wszystkim od wielkości cząsteczki, a pośrednio od m.cz. 10

11 Badania nad elektroforezą żelową 40 białek o znanych m.cz. w obecności SDS wykazały, że ich względna ruchliwość elektroforetyczna R f : [21] R f = odległość migracji białka/ odległość migracji markera jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu ich masy cząst. W praktyce wykonuje się elektroforezę badanego białka w mieszaninie z białkami wzorcowymi o znanych m.cz. oraz markerem (np. błękitem bromofenolowym). Wykonując dla białek wzorcowych wykres zależności logarytmu m.cz. od Rf otrzymuje się prostoliniową krzywą wzorcową. Z uzyskanego wykresu lub równania regresji odczytuje się m.cz. badanego białka. W pokazanym poniżej przykładzie mamy 2 badane białka o wartościach R f odpowiednio 0,209 i 0,227. Na podstawie uzyskanej zależności można oszacować ich m.cz. na odpowiednio i ,20 5,10 5,00 logm = -11,035Rf + 7,2025 4,90 4,80 log M 4,70 4,60 4,50 4,40 4,30 4,20 0,17 0,19 0,21 0,23 0,25 0,27 0,29 Rf Technika elektroforezy w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS pozwala oszacować masę cząsteczkową z dokładnością ±10% dla białek o m.cz. z zakresie Da. W zakresie tym dostępne są handlowo zestawy białek wzorcowych. Filtracja molekularna W metodzie tej jako wypełnienie kolumn chromatograficznych wykorzystuje się żele pęczniejące pod wpływem fazy ruchomej. Przy filtracji żelowej biopolimerów fazą ruchomą są najczęściej bufory wodne. Najczęściej używanymi żelami są usieciowane polisacharydy. W środowisku wodnym ziarna żelu pęcznieją, a w ich wnętrzu pojawiają się wypełnione wodą pory. Stopień spęcznienia żelu zależy od stopnia usieciowania polisacharydu. Określa się go 11

12 przy pomocy tzw. indeksu retencji wody wyrażającego ile gramów wody wiąże się z 1 g suchego żelu. Jeżeli przez kolumnę wypełnioną spęczniałym żelem będziemy przepuszczać mieszaninę substancji o zróżnicowanych wielkościach cząsteczek, to substancje o dużych rozmiarach cząsteczek (żółte) przemieszczać się będą w kolumnie tylko w przestrzeniach pomiędzy ziarnami żelu. Cząsteczki o mniejszych rozmiarach (zielone i czerwone) wnikać będą do wnętrza ziaren. Im mniejsze są rozmiary cząsteczek, tym dłużej będą one błądzić wewnątrz porowatych ziaren. Rozdział substancji podczas filtracji żelowej opiera się więc na różnicy w wielkości cząsteczek. Kolumnę będą opuszczały najpierw cząsteczki o największych rozmiarach, potem cząsteczki średniej wielkości, a na końcu cząsteczki najmniejsze. Zastosowanie filtracji żelowej biopolimerów jest bardzo szerokie. Można ją wykorzystać do: i) preparatywnego rozdziału mieszanin makrocząsteczek, ii) usuwania z roztworów biopolimerów substancji małocząsteczkowych, w tym soli, oraz do iii) oznaczania mas cząsteczkowych. Dobór złoża W handlu dostępne są złoża do filtracji żelowej o bardzo szerokim zakresie rozmiarów pór wewnątrz spęczniałych ziaren żelu. Poniższa tabela zawiera przykładowe rodzaje złóż typu Sefadeks. Złoża tego typu są najczęściej stosowane w filtracji molekularnej biopolimerów. Rodzaj Indeks retencji Roboczy zakres m.cz. Sefadeksu wody Peptydy i białka Polisacharydy G-10 1 < 700 < 700 G-15 1,5 < < G-25 2, G G-75 7, G G G Do filtracji molekularnej obiektów o jeszcze większych rozmiarach (kompleksy białkowe, organelle komórkowe) otrzymano złoża typu Sefaroza lub Bio-Żel pozwalające na rozdział biopolimerów o masach cząsteczkowych do Da. 12

13 Oznaczanie mas cząsteczkowych Rozdział substancji podczas filtracji molekularnej oparty jest na rozmiarach cząsteczek, a nie na ich masie cząst. Jednakże w przypadku biopolimerów danego rodzaju (np. białek) ich gęstość jest bardzo zbliżona. Tym samym cząsteczka o większej masie posiada również większe rozmiary. Stwierdzono doświadczalnie, że dla filtracji molekularnej istnieje liniowa zależność pomiędzy objętością wycieku z kolumny przy której pojawia się dany biopolimer a logarytmem jego m.cz. Ze względu na słabą powtarzalność parametrów rozdziału każdorazowo należy wykonać linię kalibracyjną stosując białka wzorcowe o znanych m.cz. Przykład Chcemy oznaczyć masy cząst. heksokizaz typu I IV z homogenatu wątroby szczura. Jako białka wzorcowe stosujemy: dehydrogenazę Glc-6-P ( Da), albuminę ludzką ( Da), pepsynę ( Da) oraz trypsynę ( Da). Podczas filtracji molekularnej mieszaniny tych białek z badanymi heksokinazami na złożu Sefadeks G-200 zaobserwowano 6 pasm o obj. elucji: Pasmo Obj. elucji Białko A 2,6 ml dehydrogenaza B 3,7 ml heksokinazy I, II i III C 4,4 ml albumina D 5,05 ml heksokinaza IV E 5,9 ml pepsyna F 6,85 ml trypsyna Na podstawie uzyskanych wyników sporządzono zależność kalibracyjną przedstawioną na poniższym wykresie: 5,20 5,10 5,00 log M = 5,475-0,157 Ve log M 4,90 4,80 4,70 4,60 4,50 4,40 4, obj. elucji Dla białek tworzących pasma B i D o objętościach elucji odpowiednio 3,7 i 5,05 ml można oszacować m.cz. odpowiednio i Da. 13

14 Spektrometria mas Aż do końca lat 70 XXw jedynymi metodami umożliwiającymi oszacowanie masy cząsteczkowej biopolimerów były ultrawirowanie, elektroforeza i chromatografia. Wyniki otrzymane przy pomocy tych metod były bardzo nieprecyzyjne (błąd względny wynosił średnio %) ponieważ zależały od innych niż masa cząsteczkowa właściwości: kształtu cząsteczki, gęstości i hydrofobowości. Jedyna bezpośrednia metoda pomiaru masy cząsteczkowej spektrometria mas znajdowała się jeszcze na bardzo wczesnych etapach rozwoju i ograniczona była do substancji lotnych. W latach 70 pojawiła się metoda desorpcji polem (FD) pozwalająca na otrzymanie widm substancji nielotnych o masach cząst. do ok Da. Rozwój metod jonizacji przez desorpcję, opartych na emisji wcześniej istniejących jonów z powierzchni cieczy lub ciała stałego (desorpcja plazmą PD, bombardowanie szybkimi atomami FAB, desorpcja laserowa LD) umożliwił po raz pierwszy wprowadzenie spektroskopii mas do analizy biopolimerów. Od tego czasu problemem stało się już nie wytwarzanie jonów, lecz poprawna analiza ich masy. Jony o pojedynczym ładunku i dużej masie są technicznie trudne do detekcji z dużą czułością i do analizy ich masy z dobrą rozdzielczością. Na początku lat 90 pojawiły się dwie nowe metody jonizacji (rozpylanie w polu elektrycznym, elektrosprej ESI oraz desorpcja laserowa ze stałej matrycy MALDI), dzieki którym można było uniknąć tych niedogodności. Metody te umożliwiają bardzo precyzyjną analizę biopolimerów o dużych masach. Jonizacja biopolimerów Obecnie w spektrometrii mas biopolimerów stosuje się powszechnie trzy techniki wytwarzania jonów. Zostaną one omówione poniżej. FAB Technika bombardowania szybkimi atomami (FAB, ang. Fast Atom Bombardment) może być stosowana dla roztworów zawierających jony w nielotnych rozpuszczalnikach. W praktyce używa się najczęściej glicerynę, tioglicerynę, alkohol m-nitrobenzylowy (NBA) lub w trybie rejestracji jonów ujemnych trietanoloaminę. Metoda ta nie może więc być stosowana dla substancji niepolarnych takich jak np. lipidy obojętne. Wiązka szybkich atomów (najczęściej argonu, niekiedy ksenonu) otrzymywana jest pośrednio z wykorzystaniem jonów argonu. Jony są przyspieszane w polu elektrycznym o różnicy potencjałów 14

15 rzędu kilku do kilkunastu kv i trafiają do komory zderzeniowej, w której na skutek zderzeń z zawartymi w niej atomami argonu przekazują im swój pęd lub ładunek. Proces zachodzący w komorze zderzeniowej można opisać równaniem: Ar + szybki + Ar powolny = Ar + powolny + Ar szybki Emiter elektronów anoda Wiązka jonów komora Ar zderzeniowa Wychwyt jonów Wiązka szybkich jonów Roztwór biopolimeru Jony pozostałe w wiązce są usuwane podczas przejścia pomiędzy elektrodami. Szybka wiązka obojętnych atomów uderzając w roztwór analizowanej substancji wytwarza falę uderzeniową, która powoduje wyrzucenie z roztworu jonów i cząsteczek obojętnych. Wyrzucone jony są przyspieszane w polu elektrycznym i kierowane do analizatora. Metoda FAB nie powoduje lub prawie nie powoduje jonizacji. Z roztworu są bowiem wyrzucane jony już wcześniej w nim istniejące. W zależności od budowy chemicznej analizowanych substancji oraz ph roztworu w metodzie FAB zbierane mogą być jony o ładunku dodatnim (wynik protonowania cząsteczki) lub ujemnym (wynik oddysocjowania protonu od cząsteczki). W widmach masowych otrzymywanych techniką FAB obserwuje się przede wszystkim jony o m/z = [M+H] + lub [M-H] -, czyli tzw. pozorne jony molekularne. Jeżeli cząsteczka posiada więcej niż jedno miejsce jonizacji, np. n, to występują również jony [M+nH] n+ lub [M-nH] n-. Ponieważ w metodzie FAB występują głównie jony molekularne, więc można ją zastosować do mieszanin bez potrzeby ich rozdzielania. Jest to szczególnie wygodne w przypadku analizy 15

16 produktów enzymatycznego trawienia dużych białek. Poniższy rysunek pokazuje widmo FAB peptydów uzyskanych podczas trawienia przeciwciała monoklonalnego. Jest to doskonała metoda wytwarzania pozornych jonów molekularnych substancji polarnych o dużych masach cząsteczkowych, szczególnie peptydów i polinukleotydów. W rutynowych pomiarach górny zakres mas metody FAB ograniczony jest do ok Da. Dla większych mas (biopolimery) stosuje się jedną z poniżej opisanych metod jonizacji. MALDI Jonizacja przez desorpcję laserową z wykorzystaniem matrycy (MALDI, ang. Matrixassociated Laser Desorption/Ionization) polega na zmieszaniu analizowanej substancji z roztworem małych cząsteczek organicznych zwanych matrycą i odparowaniu rozpuszczalnika. Cząsteczki matrycy muszą silnie absorbować promieniowanie laserowe (zwykle w zakresie UV). Pod wpływem wiązki laserowej dochodzi do lokalnego wzbudzenia elektronów w cząsteczkach matrycy. Jony powstałe przez przeniesienie protonów z fotowzbudzonej matrycy do analizowanej cząsteczki ulegają następnie desorpcji polem elektrycznym. + Desorpcja polem elektrycznym m* + B => [m-h] - + [BH] + Metoda MALDI posiada wiele korzystnych cech. Należą do nich przede wszystkim: 16

17 zastosowanie matrycy ogranicza tworzenie agregatów i ułatwia tworzenie jonów molekularnych nie ma potrzeby dostrajania długości fali wiązki laserowej do zakresu absorpcji analizowanej substancji ponieważ proces desorpcji nie zależy od rozmiarów analizowanej cząsteczki można zdesorbowac i zjonizować biopolimery o m.cz. do ok Da metoda charakteryzuje się znaczną czułością możliwa jest analiza pikomolowych ilości białka Poniższy rysunek przedstawia widmo masowe przeciwciała monoklonalnego o m.cz. ok. 150 kda uzyskane techniką MALDI. W widmach uzyskanych tą techniką najsilniejszy jon odpowiada zwykle jonowi molekularnemu. Pojawić się mogą również jony odpowiadające cząsteczce wielokrotnie zjonizowanej (M 2+, M 3+ ) oraz jony agregatów biopolimeru o różnym stopniu zjonizowania, np. 2M +, 3M 2+, 2M 3+ itp. Na szczęście ich intensywność jest zwykle dużo mniejsza niż jonu molekularnego. ESI Rozpylanie w polu elektrycznym, czyli elektrosprej polega na wprowadzeniu strumienia cieczy w silne pole elektryczne (różnica potencjałów 3 6 kv) pod ciśnieniem atmosferycznym. Pole powoduje akumulacje ładunków na powierzchni cieczy opuszczającej kapilarę. Strumień cieczy ulega rozbiciu na drobne, silnie naładowane kropelki. Odparowywanie rozpuszczalnika powoduje kurczenie się kropelek aż do momentu, gdy odpychanie elektrostatyczne przewyższy siły spójności cieczy. Spowoduje to rozerwanie kropel na mniejsze kropelki. 17

18 Takie kaskadowe rozdrabnianie roztworu trwa tak długo, aż pole elektryczne na ich powierzchni stanie się dostatecznie duże, aby spowodować desorpcje jonów substancji rozpuszczonej. Jeżeli analizowana cząsteczka posiada więcej niż jedno miejsce zdolne do jonizacji, to najczęściej powstają jony o ładunku wielokrotnym. Widma masowe ESI biopolimerów stanowią najczęściej serie pików odpowiadających kolejnym, wielokrotnie naładowanym pozornym jonom molekularnym [M+zH] z+. Widma takie nie zawierają praktycznie jonów fragmentacyjnych. Otrzymanie jonów wielokrotnie naładowanych pozwala na analizowanie cząsteczek o bardzo dużych masach cząst. za pomocą analizatorów o znacznie niższym nominalnym zakresie mas. Należy bowiem pamiętać, że spektrometry mas nie mierzą masy jonu, lecz stosunek masy do ładunku m/z. Analiza widm masowych W widmach masowych uzyskanych metodą FAB lub MALDI obserwuje się bezpośrednio jony molekularne. Dopóki analizujemy peptydy lub produkty hydrolizy białek o m.cz. rzędu kilku tysięcy Da możemy stosować typowe analizatory i detektory. Przy cząsteczkach o większych masach należy zastosować oprzyrządowanie specjalne pozwalające określić stosunek m/z z zadawalającą rozdzielczością. Problemy tego typu nie pojawiają się przy jonizacji metoda elektrospreju. W metodzie tej powstają jony wielokrotne, dla których stosunek m/z przypada w klasycznym zakresie. Jednakże jednoznaczne ustalenie m.cz. na podstawie widma ESI wymaga specjalnego podejścia. Załóżmy, że jon o zmierzonym stosunku m/z = µ 1 posiada ładunek z 1. Dla jonu takiego obowiązuje zależność: 18

19 z 1 µ 1 = M + z 1 m H w której m H oznacza masę protonu a M m.cz. analizowanego biopolimeru. Jest to jedno równanie o 2 niewiadomych: z 1 i M. Aby uzyskać drugie równanie pozwalające na określenie obu niewiadomych rozważmy j-ty kolejny pik w kierunku wzrastającego stosunku m/z. Dla tego piku zmierzona wartość stosunku m/z = µ 2 i niesie on ładunek z 2 = z 1 -j: (z 1 -j)µ 2 = M + (z 1 -j)m H Powstały układ równań można rozwiązać ze względu na obie niewiadome: z j µ m 2 H 1 = M = z1( µ 1 mh) µ 2 µ 1 Na powyższym rysunku przedstawiono widmo ESI dla lizozymu z faga λ. Można na nim zidentyfikować co najmniej 9 pików o masach: 892,4, 939,2, 991,5, 1049,8, 1115,5, 1189,6, 1274,0, 1372,5 i 1486,6. Do układu równań użyjmy dwóch skrajnych pików: j = 8. Otrzymamy wtedy: 1486, 6 1, 0073 z1 = 8 = 20, , 6 892, 4 ( ) M = ,4 1,0073 = ,9 Analogiczne obliczenia przeprowadzić można dla kolejnych pików. Otrzymamy wtedy następujące wyniki: z 1 = 20 M = ,9 z 1 = 19 M = ,7 z 1 = 18 M = ,9 z 1 = 17 M = ,5 z 1 = 16 M = ,9 z 1 = 15 M = ,9 z 1 = 14 M = ,9 z 1 = 13 M = ,4 z 1 = 12 M = ,1 Po uśrednieniu powyższych wyników otrzymamy: wartość średnią m.cz. M= ,9 Da odch. standardowe M = 2,8 Da 19

20 20