Oznaczanie ciężarów cząsteczkowych metodą chromatografii żelowej

Transkrypt

1 semestr VI (studia I stopnia) wersja: 10. lutego 2010 Metody badań materiałów laboratorium ćwiczenie nr 5: Oznaczanie wielkości cząstek w dyspersjach metodą DLS oraz oznaczanie ciężarów cząsteczkowych polimerów metodą GPC prowadzący: dr inż. Ireneusz Wielgus Oznaczanie ciężarów cząsteczkowych metodą chromatografii żelowej Wprowadzenie Polimery naturalne i otrzymywane przez człowieka, poza specyficznymi wyjątkami, są zawsze mieszaniną homologów o różnej długości łańcucha, a zatem różniących się ciężarem cząsteczkowym. Dlatego w ich przypadku podaje się średnie wartości ciężaru cząsteczkowego, liczone według różnych kryteriów: M n, M w, M z, M z+1. Są to ważne parametry, gdyż wiążą się z właściwościami użytkowymi i przetwórczymi tworzywa sztucznego (wytrzymałość mechaniczna i termiczna, twardość, wrażliwość na działanie rozpuszczalników, temperatura płynięcia w maszynie przetwórczej). Do oznaczenia średniej wartości ciężaru cząsteczkowego można korzystać z różnych metod pomiarowych, jednak wyznaczenie rozkładu masy (czyli podanie udziału procentowego łańcuchów o konkretnej długości w badanej próbce) jest w większości przypadków bądź niemożliwe, bądź szczególnie pracochłonne. Chromatografia żelowa, zwana też chromatografią filtracji żelowej (GPC Gel Permeation Chromatography), albo chromatografią wykluczania (SEC Size Exclusion Chromatography) jest w tym przypadku skuteczną i względnie prostą techniką analityczną. Zasada chromatografii żelowej Wypełnienie kolumny GPC składa się z porowatych ziaren, tworzących przestrzenie międzyziarnowe, przez które płynie ciecz, oraz z ogromnej liczby otwartych mikroporów (kanalików) wewnątrz ziaren wypełnienia. W przestrzeni mikroporów ciecz praktycznie nie płynie a cząstki polimeru dostają się tam spontanicznie drogą dyfuzji, której prędkość uzależniona jest od ich średnicy hydrodynamicznej, związanej z wielkością cząsteczki i średnim ciężarem cząsteczkowym. Po wprowadzeniu roztworu próbki na kolumnę zaczyna się proces jej wymywania za pomocą strumienia odpowiednio dobranego rozpuszczalnika (eluentu). Największe cząsteczki, o bardzo dużych promieniach hydrodynamicznych (i bardzo wysokich masach molekularnych), nie są w stanie wniknąć do żadnych porów wewnątrz wypełnienia kolumny i przepływają szybko przez przestrzeń w której płynie eluent, tzn. przestrzeń międzyziarnową. Mówimy wówczas, że takie molekuły są wykluczane z kolumny. Nie można opisać rozkładu ich ciężarów cząsteczkowych, gdyż nie uległy one rozdziałowi (opuszczają kolumnę jako mieszanina). Nie można także w warunkach chromatografii żelowej scharakteryzować rozkładu masy cząsteczkowej najmniejszych cząsteczek, które wnikają do wszystkich porów wypełnienia kolumny i opuszczają ją razem w mieszaninie jako jeden sygnał na elugramie. Do ich rozdzielania trzeba zastosować wypełnienie o mniejszych średnicach porów. Substancje o pośrednich rozmiarach, a więc o pośrednich masach cząsteczkowych i takichże wartościach współczynnika dyfuzji, wnikają do porów na głębokość odpowiadająca ich rozmiarom, a potem wskutek ruchów Browna opuszczają ziarna wypełnienia i są unoszone przez eluent w kierunku wylotu kolumny. Proces wnikania i opuszczania kanalików żelu powtarza się wielokrotnie, stąd sygnały retencji przyjmują wartości pomiędzy pikami dla cząstek wykluczanych a bardzo 1

2 małych. W konsekwencji uzyskuje się określoną zależność funkcyjną między wartością logarytmu masy molekularnej rozdzielanych cząsteczek i objętością ich elucji z kolumny (Rys. 1.) Rys. 1. Zależność logarytmu masy cząsteczkowej od objętości elucji (log Mw = f(ve) podczas badania rozkładu masy cząsteczkowej mieszaniny metodą chromatografii żelowej. Należy podkreślić w tym miejscu, że separacja cząstek na kolumnie żelowej jest procesem czysto mechanicznym, podobnym do działania sita. W warunkach chromatografii żelowej dąży się do wyeliminowania jakichkolwiek oddziaływań sorpcyjnych, mających kluczowe znaczenie w chromatografii cieczowej i gazowej (oddziaływania dipolowe, różnice polarności, tworzenie wiązań wodorowych) między powierzchnią wypełnienia kolumny i cząsteczkami rozdzielanych substancji. W przeciwnym razie oddziaływania konkurencyjne wobec prostego mechanizmu wykluczania będą prowadzić do pogorszenia selektywności kolumny, a w skrajnych przypadkach do całkowitego zafałszowania wyników cząstki silniej wiążące się z wypełnieniem będą opuszczać kolumnę później, niezależnie od wielkości. Kolumnę żelową dobiera się w ten sposób, aby rozkład wielkości porów był dostosowany do rozkładu wartości hydrodynamicznych średnic cząsteczek rozdzielanych substancji, a więc do rozkładu masy cząsteczkowej badanej próbki. Wypełnienia kolumn do chromatografii żelowej przygotowuje się w ten sposób, że rozkład średnic porów mieści się w określonym wąskim zakresie i jest podany w świadectwie jakości kolumny. W praktyce częste jest łączenie kolumn o różnych zakresach rozkładu wielkości porów. Wskazane jest zachowanie następującej kolejności: dozownik kolumna o największych porach kolumna o pośrednich porach kolumna o najmniejszych porach detektor. Alternatywą jest zastosowanie kolumny wypełnionej mieszaniną ziaren o różnych zakresach wielkości porów (tzw. kolumny typu mix lub mixed bed ). Stosowanie mieszanych wypełnień jest mniej korzystne ze względu na poszerzenie i rozmycie sygnałów w detektorze, lecz ze względu na niższy koszt kolumny mix bywają jednak często stosowane dla wstępnego oszacowania zakresu mas cząsteczkowych. Faza stacjonarna w chromatografii żelowej Rodzaje faz stacjonarnych w chromatografii żelowej (ze względu na oddziaływanie z eluentem): 1) Pęczniejące (wymagają przygotowania spęcznienia). Zmiana wartości przepływu (i w konsekwencji ciśnienia w kolumnie) bardzo silnie wpływa na opory przepływu i zmienia warunki wymywania. 2

3 2) Twarde nieściśliwe do pewnej wartości ciśnienia. Są to zazwyczaj silnie usieciowane kopolimery, albo wypełnienia zawierające żel krzemionkowy, szkło porowate, tlenek cyrkonu lub inne trwałe sorbenty. Ze względu na silne oddziaływania polarne wypełnienia te mają dezaktywowaną powierzchnię, np. w procesie silanizacji (reakcja ze związkami krzemoorganicznymi blokuje silnie polarne grupy OH i =O na powierzchni wypełnienia). Wypełnieniem najczęściej wykorzystywanym do rozdzielania nisko- i średniopolarnych polimerów jest kopolimer styrenu i diwinylobenzenu, przestrzennie usieciowany, o kulistych ziarnach wielkości 5 mikrometrów, będący praktycznie sorbentem twardym. W przypadku stosowania chromatografii żelowej do rozdzielania biopolimerów wykorzystuje się wypełnienia o znacznie większej polarności, np. żele dekstranowe, agarozowe, akrylowe. Ze względu na silną skłonność do adsorpcji na powierzchni żelu poza jej dezaktywacją (np. przy użyciu metylosilanu) dodatkowo w charakterze fazy ruchomej stosuje się wodne roztwory buforów z dodatkiem EDTA, mocznika, etanolu itp. Eluenty w chromatografii żelowej Chromatografia żelowa jest wykonywana w dwóch podstawowych układach separacyjnych: 1) W warunkach niewodnych, z zastosowaniem takich eluentów, jak: THF, dioksan, czterochloroetylen, chlorobenzen, dichlorobenzen, toluen, ksylen i tym podobne. Jako faza stacjonarna stosowane są odporne na działanie organiki kopolimery styrenu i diwinylobenzenu, albo poliestry. Jest to układ do badań rozkładu masy cząsteczkowej polimerów nisko i średnio polarnych, rozpuszczalnych w rozpuszczalnikach niepolarnych (np. polistyrenu w toluenie), a także lipidów (tłuszczowców), fosfolipidów, wosków itp. niepolarnych substancji pochodzenia naturalnego. 2) W roztworach wodnych, albo z zastosowaniem silnie polarnych niewodnych eluentów, takich jak dimetyloformamid, metanol, acetonitryl i ich mieszaniny z wodą i z wodnymi roztworami soli, kwasów i zasad, z zastosowaniem wypełnień kolumn wykonanych z polarnych materiałów, takich jak polidekstrany i inne policukry, poliwęglany, szkła porowate, silanizowany żel krzemionkowy. Takie układy stosowane są do rozdzielania, a także do charakteryzowania rozkładu ciężaru cząsteczkowego polimerów polarnych (np. poli(glikol etylenowy) w wodzie), a zwłaszcza biopolimerów (policukry, białka, nukleotydy). Warunkiem stosowania chromatografii do oznaczania rozkładu ciężarów cząsteczkowych, poza oczywistym warunkiem całkowitej rozpuszczalności próbki w eluencie, jest taka siła elucyjna fazy ruchomej, aby eliminowała ona adsorpcję cząsteczek polimeru na powierzchni wypełnienia kolumny. Dla przypomnienia w chromatografii cieczowej LC i HPLC siłą napędową procesu rozdzielania jest właśnie wykorzystanie różnicy powinowactwa składników badanej substancji do fazy ruchomej i stacjonarnej wywołana różnicami polarności. W przypadku średnio polarnych polimerów syntetycznych w charakterze eluentu stosuje się najczęściej tetrahydrofuran (THF), będący dobrym rozpuszczalnikiem wielu polimerów i jednocześnie substancją dobrze minimalizującą adsorpcję nawet do żelu krzemionkowego a także oddziaływania hydrofobowe. W niektórych przypadkach stosuje się chloroform, który wymaga specjalnej uwagi ze względu na działanie korodujące (wobec czynników utleniających niszczy stal nierdzewną). Polimery niepolarne są na ogół trudno rozpuszczalne. Do ich rozpuszczania i elucji wykorzystuje się rozpuszczalniki takie jak toluen, ksylen, dekalina i podwyższoną temperaturę. W chromatografii żelowej biopolimerów w roli eluentu stosuje się roztwór buforowy będący dobrym rozpuszczalnikiem polimeru, a jednocześnie zapewniający minimalne oddziaływania sorpcyjne. Niekiedy dodaje się acetonitryl CH 3 CN, lub alkohol izopropylowy, aby ograniczyć oddziaływania hydrofobowe z powierzchnią fazy stacjonarnej. 3

4 Problemy i zakłócenia w czasie pracy Jeśli polimer rozpuszcza się tylko na gorąco, np. polietylen w ksylenie, niezbędne jest termostatowanie kolumny, zaworu dozującego i, o ile to możliwe, detektora. Należy zwrócić uwagę aby również przewody łączące miały odpowiednia izolację termiczną. Inne problemy i zakłócenia, które trzeba brać pod uwagę: Możliwość oddziaływań sorpcyjnych rozdzielanych polimerów. Pęcznienie i kurczenie się ziaren wypełnień kolumn do chromatografii żelowej pod wpływem różnych eluentów. Pochopna zmiana eluentu w kolumnach do chromatografii żelowej może trwale zniszczyć kolumnę! Określony stopień ściśliwości żelów (nawet twardych) ograniczona odporność na ciśnienie. Wolna dyfuzja makromolekuł i konieczność ograniczenia prędkości przepływu eluentu w celu niedopuszczenia do nadmiernego rozmycia pików. Przeszkadzanie sobie nawzajem przez duże molekuły penetrujące wnętrze porów i zatykanie niektórych porów przez cząsteczki makropolimerów. Możliwość polikondensacji makromolekuł w warunkach podwyższonego ciśnienia i wzrost ciężaru cząsteczkowego próbki w trakcie pomiaru lub wręcz zaklejenie kolumny przez powstający polimer. W przypadku stosowania kolumn do chromatografii żelowej należy zachować ostrożność przy wymianie eluentu na inny. Przede wszystkim trzeba przestrzegać ściśle zaleceń producenta kolumny. Gdy dane takie są niedostępne, należy przestrzegać ogólnej reguły, aby w przypadku kolumn przeznaczonych do rozdzielania nisko i średnio polarnych polimerów syntetycznych nie zastosować cieczy polarnych, takich jak woda, metanol, etanol, izopropanol, acetonitryl. W przeciwnym razie może dojść do nieodwracalnego skurczenia się ziaren wypełnienia kolumny i w konsekwencji utraty zarówno jej selektywności, jak i sprawności. Podobnie ma się sprawa z hydrofilowymi żelami miękkimi i półtwardymi, których spęcznienia dokonuje się z użyciem roztworów wodnych. W takim przypadku zastosowanie heksanu czy toluenu może zniszczyć porowatą strukturę ziaren wypełnienia, a aceton, albo THF mogą spowodować nadmierne spęcznienie sorbentu, a nawet go rozpuścić zawartość kolumny wypłynie do detektora (i przy okazji trwale go uszkodzi!!! Detektory wykorzystywane w chromatografii żelowej W chromatografii żelowej stosuje się przede wszystkim detektory, których sygnał jest proporcjonalny (choćby w przybliżeniu) nie tylko do stężenia badanych składników eluatu, ale i do masy cząsteczkowej. Są to detektor refraktometryczny (RID) najczęściej wykorzystywany, reaguje na zmianę współczynnika załamania światła roztworu zawierającego rozpuszczoną substancję w stosunku do czystego rozpuszczalnika, detektor laserowy światła rozproszonego (LLSD Laser Light Scattering Detector), spektrometr mas do pracy w układzie HPLC-MS, detektor pomiaru lepkości. Natomiast unika się stosowania detektora UV, gdyż pomijając brak proporcjonalności sygnału od ciężaru cząsteczkowego większość polimerów nie absorbuje światła w tym zakresie. Ostatnio w coraz większym zakresie znajduje zastosowanie detektor mierzący intensywność rozproszenia przez cząstki badanej substancji wiązki światła laserowego pod różnymi kątami równocześnie. Na tej podstawie można bezpośrednio obliczyć rozkład ciężarów cząsteczkowych polimeru bez stosowania kalibracji za pomocą wzorców. Jednoczesne użycie połączonych szeregowo detektorów RID, pomiaru lepkości oraz LLSD też umożliwia uniknięcie stosowania polimerów kalibracyjnych. Sposób ten jest jednak kosztowny. 4

5 Kalibracja Chromatograf żelowy podaje zawartość składnika o konkretnej wielkości promienia hydrodynamicznego w funkcji czasu wymywania a w praktyce w funkcji objętości eluatu. Aby poznać odpowiadającą mu wartość ciężaru cząsteczkowego konieczne jest wykonanie kalibracji, czyli zmierzenie czasów retencji kilku wzorców o znanym ciężarze cząsteczkowym i odpowiednie przeliczenie skali. Czyni się przy tym założenie, że ciężary cząsteczkowe związków chemicznych określonego typu (tzn. o bardzo podobnej budowie chemicznej) są proporcjonalne do ich promieni hydrodynamicznych i szybkości retencji z kolumny (w odpowiedniej potędze). Kalibracja jest tym bardziej wiarygodna, im bardziej cząsteczki badanego polimeru i polimeru, który został wykorzystany do kalibracji, zbliżone są budową i kształtem (budowa liniowa, cykliczna, rozgałęziona). Teoretycznie więc, aby zmierzyć rozkład ciężarów np. poliamidu-6,6, należy wykonać kalibrację stosując wzorce z poliamidu, i to najlepiej PA-66. W praktyce jednak handlowo dostępne są tylko nieliczne polimery, a samodzielne przygotowanie wzorca np. metodą frakcjonowania przez wytrącanie nierozpuszczalnikiem jest niesłychanie żmudne i nie zawsze wykonalne. W badaniach polimerów nisko i średnio polarnych do kalibracji wykorzystywane są zazwyczaj wzorce polistyrenowe, dla których stosunek maksymalnej i minimalnej masy cząsteczkowej substancji M max / M min zawiera się w granicach od 1,05 do 1,20. Z wzorca polistyrenowego korzysta się również w przypadku, gdy nie dysponujemy odpowiednim polimerem. W takim przypadku konieczne jest zaznaczenie w opisie metody pomiaru ciężar wyznaczono w oparciu o wzorce PS, zaś wyznaczone wartości ciężarów nie muszą odpowiadać rzeczywistości służą do porównań z innymi próbkami. Wzorzec polistyrenowy jest więc w pewnym sensie uniwersalny. W zależności od możliwości i wymagań jakościowych stosuje się następujące metody prowadzenia kalibracji: Kalibracja z wykorzystaniem serii odpowiednio dobranych wzorców o wąskich frakcjach masy cząsteczkowej. Jest to metoda najdokładniejsza. Kalibracja z wykorzystaniem jednej próbki polimeru polidyspersyjnego, ale o znanym rozkładzie masy molekularnej. Rozkład ten wyznacza się według metody z punktu poprzedniego albo np. przez frakcjonowanie. Kalibracja uniwersalna określa się zależność: log([η] M w ) = f (V e ) gdzie: [η] jest ekstrapolowaną do zerowego stężenia lepkością dynamiczną wzorca masy molekularnej o średniej masie cząsteczkowej M (tzw. graniczna liczba lepkościowa), M w wagowo średni ciężar cząsteczkowy, V e objętość elucji mierzona do maksimum albo do środka ciężkości piku. Zastosowanie chromatografii żelowej Główny zakres zastosowań chromatografii żelowej to rozdzielanie substancji różniących się ciężarem cząsteczkowym (i związaną z nim wielkością cząsteczek), a w pierwszej kolejności różnego typu polimerów, a na mniejszą skalę smarów, olejów, kosmetyków. Poza badaniem składników podstawowych (głównych) chromatografia żelowa wykorzystywana jest także do oznaczania zawartości dodatków modyfikujących i uszlachetniających, a zatem do oznaczania zawartości plastyfikatorów, antyutleniaczy, konserwantów, barwników. Służy wówczas do wyodrębnienia składników próbki, które różnią się zasadniczo masą molową od pozostałych, np. plastyfikatora w polimerze, zagęszczacza w oleju smarowym, modyfikatora polimerowego w masie bitumicznej (np. asfalcie drogowym) itp. 5

6 Inną grupą zastosowań chromatografii żelowej jest przygotowanie próbek do oznaczania niskocząsteczkowych zanieczyszczeń w żywności, produktach naftowych i w środowisku. Zasada postępowania polega na wydzieleniu frakcji o niskich wartościach ciężaru cząsteczkowego i poddaniu wyizolowanej frakcji analizie z zastosowaniem innego rodzaju układu chromatograficznego, najczęściej w układzie odwróconych faz. Można w ten sposób przygotować próbki do oznaczania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych, pestycydów, toksycznych związków metaloorganicznych (tetraetyloołów) i podobnych im zanieczyszczeń w glebie, żywności (mięsie, warzywach i owocach, zbożach, mleku i przetworach), w materiale biologicznym pochodzenia roślinnego, zwierzęcego i ludzkiego (analiza toksykologiczna i kryminalistyka) a także w olejach technicznych, asfaltach (związki siarki i azotu, tzw. trucizny katalizatora). Chromatografię żelową wykorzystuje się powszechnie do wstępnego frakcjonowania badanych materiałów w badaniach biochemicznych, mikrobiologicznych i w biotechnologii, a także w preparatyce, np. przy pozyskiwaniu substancji biologicznie czynnych w medycynie, chemii kosmetyków, czy do odsalania roztworów peptydów i białek, otrzymanych po zastosowaniu wysalania frakcyjnego, albo strącania w punkcie izoelektrycznym. Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie z działaniem zestawu do chromatografii żelowej, oraz scharakteryzowanie próbki polimeru (technicznego polistyrenu) metodą GPC. Literatura D. Berek, M. Dressler, M. Kubin, K. Marcinka Chromatografia żelowa PWN Warszawa Pytania dla PT Studentów Wymień angielskie akronimy używane w literaturze na określenie chromatografii żelowej. Opisz zasadę działania kolumny do chromatografii żelowej. Wskaż na istotną cechę odróżniającą chromatografię żelową i chromatografię cieczową. W jaki sposób można rozdzielić na kolumnie żelowej mieszaninę związków o bardzo dużym rozrzucie ciężarów cząsteczkowych. Wymień przykład eluentu i materiału wypełnienia do prowadzenia rozdziału: a) polistyrenu, b) mieszaniny peptydów. Dysponujesz wzorcami M cz z polistyrenu. Czy można użyć ich do kalibracji kolumny, w której oznaczany będzie rozgałęziony poli(tlenek etylenu) / poli(kwas akrylowy)? Dlaczego wypełniacze tlenkowe (np. SiO 2 ) stosowane w chromatografii żelowej traktuje się przed użyciem silanami? Czy można przyśpieszyć cykl pracy zwiększając kilkakrotnie przepływ w czasie rozdzielania substancji białkowych na żelu dekstranowym? Wymień rodzaje detektorów najczęściej używane w zestawach do chromatografii żelowej. 6

7 Oznaczanie wielkości cząstek metodą dynamicznego rozproszenia światła DLS Wprowadzenie Cząsteczki związków chemicznych tego samego rodzaju w pewnych warunkach mogą łączyć się tworząc większe struktury zwane ogólnie cząstkami. W roztworach zasocjowane cząsteczki osiągając pewien rozmiar (stopień asocjacji) mogą tworzyć niejednorodną mieszaninę dwufazową, w której wyróżniamy cząstki rozproszone (zawieszone) i fazę rozpraszającą (ciągłą). Jeżeli rozdrobnienie (czyli dyspersja) substancji rozproszonej jest odpowiednio duże, to fizycznie mieszanina sprawia wrażenie substancji jednorodnej, jednak nie jest to wymieszanie na poziomie pojedynczych cząsteczek. Według IUPAC układ dyspersyjny jest układem koloidalnym, gdy rozmiary cząstek fazy rozproszonej albo rozmiary nieciągłości układu koloidalnego są w zakresie od 1 nm do 1 µm przynajmniej w jednym kierunku. W koloidach stopień dyspersji (stosunek powierzchni fazy rozproszonej do objętości tej fazy) wynosi od 10 5 do 10 7 cm -1 wówczas wielkość cząstek fazy zawieszonej (zdyspergowanej) sprawia, że ważne są zarówno oddziaływania pomiędzy nią i fazą dyspergującą, jak i oddziaływania wewnątrz obu faz. Aglomeracja cząsteczek lub cząstek w cieczach jest spowodowana oddziaływaniami wynikającymi z ich struktury i właściwości oraz czynnikami zewnętrznymi. Należą do nich m.in.: budowa cząsteczek i wynikająca z niej polarność, zdolność do tworzenia wiązań wodorowych, koordynacyjnych czy jonowych, rozwinięcie powierzchni cząstek (cząstki o dużej powierzchni właściwej dążą samorzutnie do jej zredukowania), polarność fazy rozpraszającej, kwasowość (ph) w przypadku wodnej fazy rozpraszającej, temperatura, stężenie substancji w fazie rozpraszającej, możliwość wzajemnych oddziaływań pomiędzy fazą rozpraszającą a rozproszoną. Jeżeli z jakiegoś powodu proces aglomeracji nie kończy się na utworzeniu koloidalnego układu cząstek (trwałej dyspersji) to następuje proces koagulacji fazy rozproszonej koloidu. Wynikiem tego procesu może być zjawisko żelowania, tworzenia się past i materiałów stałych, sedymentacji lub pokrywania powierzchni mieszaniny warstwą fazy rozproszonej. Istnieje koagulacja odwracalna i nieodwracalna, a także spontaniczna i wymuszona. Z punktu widzenia chemii i technologii polimerów procesy aglomeracji są ważne między innymi w odniesieniu do proszkowych napełniaczy tworzyw sztucznych. Napełniaczami takimi są zazwyczaj nieorganiczne lub hybrydowe (organiczno-nieorganiczne) związki (tlenki, sole) metali, które dodaje się do tworzyw w celu zmiany ich właściwości mechanicznych, reologicznych (przetwórstwo), obniżenia palności czy obniżenia ceny. Otrzymanie tworzywa o dobrych właściwościach jest uzależnione między innymi od stopnia dyspersji cząstek napełniacza, czyli od ich rozmiaru. Jedną z najnowszych grup napełniaczy są nanonapełniacze, czyli proszki, których cząstki charakteryzują się tym, że przynajmniej jeden z ich rozmiarów mieści się w zakresie nm. Jednakże po wprowadzeniu ich do tworzywa lub żywicy mogą one aglomerować (separacja faz). Określenie wielkości cząstek napełniaczy zarówno w dyspersjach rozpuszczalnikowych czy też w nieusieciowanych żywicach oraz w gotowych kompozytach (utwardzona żywica, przetworzony termoplast) ma bardzo duże znaczenie z punktu widzenia potencjalnego i praktycznego zastosowania napełniaczy. Rozmiary cząstek są istotnym parametrem także materiałów biologicznych, w medycynie, przemyśle spożywczym, farb i lakierów, poligrafii i innych. 7

8 Dynamiczne rozpraszanie światła DLS (Dynamic Light Scattering) Jeżeli na małą cząstkę pada wiązka światła (np. laserowego), następuje rozproszenie tej wiązki we wszystkich kierunkach. Gdy w odpowiednio bliskiej odległości od rozważanej cząstki umieszczony jest ekran (detektor), to zostanie on oświetlony przez światło rozproszone. Zastąpienie pojedynczej cząstki tysiącami nieruchomych cząstek spowodowałoby pojawienie się na ekranie wzoru z złożonego wielu jasnych i ciemnych plamek (Rys. 1a). Jasne plamki pochodzą od nakładających się fal rozproszonego światła, które są w tej samej fazie i wzmacniają się w wyniku interferencji, podczas gdy ciemne obszary powstają wtedy, gdy nakładające się fale są w fazie przeciwnej i ulegają wygaszeniu (Rys. 1b). a) b) Rys. 1. Obraz interferencyjny światła rozproszonego na dyspersji i zasada jego powstawania. W przedstawionym przykładzie założono, że cząstki nie poruszają się, dlatego obraz na ekranie jest statyczny. W rzeczywistości cząstki zdyspergowane w cieczy są w ciągłym ruchu (ruchy Browna). Zjawisko to zostało odkryte przez brytyjskiego biologa Roberta Browna, który obserwując przez mikroskop pyłki kwiatowe w zawiesinie wodnej dostrzegł, iż znajdują się one w nieustannym, chaotycznym ruchu, a nie jak sądził stoją w miejscu. Ruchy Browna definiuje się jako przypadkowe ruchy małych cząstek w cieczy, spowodowane bombardowaniem ich przez cząsteczki cieczy (fazy rozpraszającej) Rys. 2. Rys. 2. Ruchy Browna. To bombardowanie drobiny otaczającymi cząsteczkami jest statystycznie biorąc takie samo z każdej strony. Jednak jeśli rozpatrywana cząstka jest wystarczająco mała, to zdarza się, że liczba cząsteczek zderzających się z nią z jednej strony będzie w jakimś momencie inna (większa lub mniejsza) od cząsteczek uderzających z przeciwnej strony. W efekcie drobina dostaje co jakiś czas silniejszy impuls w stronę wyznaczoną przez uderzenia większej (w danej chwili) grupy cząsteczek (mówimy w takiej sytuacji o tzw. fluktuacji). Ważną cechą ruchów Browna jest fakt, że większe 8

9 cząstki poruszają się wolniej a mniejsze szybciej. Zależność pomiędzy wielkością cząstek a szybkością ich ruch Browna jest opisana równaniem Stokesa-Einsteina: R h kt = 6πη D gdzie: R h promień hydrodynamiczny cząstki, k stała Boltzmanna, T temperatura (K), η - lepkość rozpuszczalnika a D współczynnik dyfuzji. Jako że cząstki są w ciągłym ruchu, plamisty wzór na ekranie również będzie sprawiał wrażenie ruchu. Wzmacniające i wygaszające nakładanie się fal światła rozproszonego od poruszających się cząstek będzie powodowało, że ciemne i jasne obszary będą zmniejszały i zwiększały swoją intensywność w czasie. Takie zjawisko nazywa się fluktuacją światła rozproszonego. Szybkość zmian intensywności światła rozproszonego zależy od wielkości cząstek i dlatego może posłużyć do obliczenia ich rozmiaru. Metoda ta nosi nazwę dynamicznego rozproszenia światła (ang. Dynamic Light Scattering, DLS). Dla dużych cząstek sygnał zmienia się wolniej, dla mniejszych szybciej, jednak ogólnie rzecz biorąc są to zjawiska zachodzące z dużą prędkością skala czasu wyrażona jest w mikro- a nawet w nanosekundach (Rys. 3). intensywność duże cząstki czas intensywność małe cząstki czas Rys. 3. Fluktuacje intensywności światła rozproszonego w zależności od wymiaru geometrycznego cząstek rozpraszających. W wyniku odpowiednich przekształceń i zastosowania odpowiednich algorytmów matematycznych zarejestrowane przez detektor zmiany intensywności światła rozproszonego zostają przekształcone w wykres rozkładu wielkości cząstek (czyli udziału procentowego cząstek w zależności od ich rozmiaru). Przykładowy (typowy) wykres przedstawia Rys Rozkład wielkości po intensywności Intensywność (%) e+4 Średnica (nm) Rys. 4. Rozkład wielkości cząstek w próbce (przykład). W metodzie DLS bezpośredni pomiar dotyczy intensywności światła rozproszonego i jest to podstawowy wykres prezentowany jako rezultat (size by intensity). Jednak przy analizie wyników 9

10 istotniejsze od porównania intensywności rozproszenia dwu próbek może być określenie objętości fazy rozpraszającej, lub liczby cząstek rozpraszających w obu próbkach. Przez odpowiednie przeliczenia, wykorzystujące teorię Mie, oprogramowanie sterujące aparatem udostępnia również wykres size by volume i size by number. Dla właściwej interpretacji wyników niezbędne jest zrozumienie różnic między nimi. Rozważmy próbkę, w której znajdują się jednakowe liczby cząstek o średnicy 5 nm i o średnicy 50 nm. Na Rys. 5. na pierwszym od lewej wykresie przedstawiony jest wynik pomiaru rozkładu wielkości cząstek liczonego względem liczby tych cząstek. Jak należało się spodziewać przy odpowiednich wartościach średnicy (na osi odciętych) występują dwa piki tej samej wielkości (stosunek pików 5 nm i 50 nm wynosi 1:1), ponieważ zgodnie z założeniem w próbce jest ta sama liczba cząstek obu rozmiarów. Na środkowym wykresie pokazano wyniki dla rozkładu liczonego po objętości cząstek. Powierzchnia piku dla cząstek o średnicy 50 nm jest 1000 razy większa od tej dla cząstek o mniejszej średnicy (stosunek 1:1000). Wynika to z tego, że objętość cząstek o średnicy 50 nm jest 1000 razy większa od łącznej objętości cząstek o średnicy 5 nm (objętość kuli jest równa V d = 4/3 πr 3 ; V 5nm = 65,45 nm 3, V 50nm = nm 3 ). W przypadku trzeciego wykresu, na którym przedstawiono rozkład wielkości cząstek liczonych po intensywności światła rozproszonego, stosunek powierzchni piku cząstek 50 nm jest razy większy od piku dla 5 nm (stosunek 1: ). Dzieje się tak dlatego, że większe cząstki rozpraszają znacznie więcej światła niż małe według przybliżenia Rayleigha intensywność rozproszenia światła jest proporcjonalna do średnicy cząstek rozpraszających w szóstej potędze. Może się więc zdarzyć się tak, że rozkład wielkości cząstek o małej średnicy może być niemalże niewidoczny na wykresie, jeżeli w dyspersji występują również cząstki o dużo większej średnicy. Dlatego zawsze należy sprawdzać rozkłady po objętości i liczbie cząstek. ILOŚĆ OBJĘTOŚĆ INTENSYWNOŚĆ 4 = πr 3 3 = d 6 Względny % 1 1 Względny % 1000 Względny % 1,000, Średnica (nm) Średnica (nm) Średnica (nm) Rys. 5. Wpływ wybranej metody obliczania na prezentację wyników DLS (opis w tekście). Stabilność dyspersji potencjał Zeta Ważnym parametrem charakteryzującym dyspersję cząstek w cieczy jest jej stabilność, to znaczy zdolność do utrzymywania cząstek w formie dyspersji koloidalnej. Niestabilne dyspersje ulegają procesom sedymentacji czy też koagulacji w czasie, w wyniku czego po pewnym okresie może okazać się, że badana próbka składa się z dwóch warstw: osadu i cieczy nad nim. Każdy z Państwa widział zapewne starą farbę dyspersyjną kiedyś nazywano je emulsyjnymi, która rozwarstwiła się uległa sedymentacji, albo zwarzyła się uległa nieodwracalnej koagulacji. Do liczbowego określenia stabilności dyspersji stosuje się tzw. potencjał Zeta. Jest to parametr wyznaczany z pomiarów elektroforetycznych ruchliwości cząstek w polu elektrycznym. Prędkość 10

11 cząstek między elektrodami mierzy się w aparacie Malvern przy wykorzystaniu efektu Dopplera (LDV Laser Doppler Velocimetry) w specjalnych kuwetach z zainstalowanymi elektrodami. Przyjmuje się, że dyspersja jest stabilna wtedy, gdy wartość bezwzględna potencjału Zeta jest większa od 30 mv (Zeta > +30 mv lub Zeta < 30 mv). Największy wpływ na potencjał Zeta ma wartość ph badanej próbki. Wraz ze zmianą ph dodatni potencjał Zeta może zmniejszać swoją wartość do zera a następnie osiągać wartości ujemne. Wartość ph przy której potencjał Zeta osiąga zero i następuje zmiana jego znaku nazywa się punktem izoelektrycznym. Budowa aparatu Zetasizer Nano ZS Na Rys. 6. przedstawiono schemat analizatora wielkości cząstek Nano ZS firmy Malvern Instruments. Urządzenie zbudowane jest z lasera, układu pomiarowego wielkości cząstek i układu pomiarowego potencjału Zeta, komory pomiarowej, korelatora i komputera z odpowiednim oprogramowaniem. Komputer z oprogramowaniem Korelator Sprzęganie wiązek Tłumik sygnału (Zeta) Tłumik sygnału (rozmiar) Układ kompensacyjny (Zeta) Komora pomiarowa Zespół soczewek Detektor mocy lasera Wiązka odniesienia (Zeta) Rys. 6. Analizator wielkości cząstek Malvern Zetasizer Nano ZS (schemat budowy). Wykonanie ćwiczenia Z wykorzystaniem analizatora wielkości cząstek Malvern Zetasizer Nano ZS oznaczyć wielkość cząstek hybrydowego napełniacza w postaci wodnej dyspersji lub innej dyspersji dostarczonej przez prowadzącego. Przed pomiarem właściwym sprawdzić poprawność działania urządzenia mierząc wzorcowy lateks polistyrenowy. 11