Informacja dotycząca AMPLICOR Respiratory RSP PREP 100 Tests P/N: zamówienia Specimen Preparation Kit ART: US: 83267

Transkrypt

1 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis MTB DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. Informacja dotycząca AMPLICOR Respiratory RSP PREP 100 Tests P/N: zamówienia Specimen Preparation Kit ART: US: AMPLICOR M. tuberculosis MTB CTL 10 Sets P/N: Positive Control Kit ART: US: AMPLICOR Mycobacterium MYCO AMP 96 Tests P/N: Amplification Kit ART: US: COBAS AMPLICOR MTB DK 100 Tests P/N: M. tuberculosis Detection Kit ART: US: COBAS AMPLICOR DK 100 Tests P/N: Detection Reagents Kit ART: US: COBAS AMPLICOR CN4 200 Tests P/N: Conjugate Detection Reagent ART: US: COBAS AMPLICOR 500 Tests P/N: WB Wash Buffer ART: US: Poniższy zestaw służy do detekcji kontroli wewnętrznej Mycobacterium amplifikowanej przy użyciu zestawu do amplifikacji AMPLICOR Mycobacterium. Detekcja kontroli wewnętrznej jest opcjonalna dla użytkownika. COBAS AMPLICOR IC DK 100 Tests P/N: Internal Control Detection Kit ART: US: /2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 1/30 P/N:

2 Przeznaczenie Test COBAS AMPLICOR na obecność Mycobacterium tuberculosis (MTB) jest testem przeznaczonym do jakościowej detekcji in vitro bakterii kompleksu M. tuberculosis w próbkach klinicznych na analizatorze COBAS AMPLICOR. Test wykorzystuje łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) oraz technikę amplifikacji i hybrydyzacji kwasów nukleinowych do detekcji bakterii kompleksu M. tuberculosis w ciekłych, odkażonych i zagęszczonych próbkach pobranych z układu oddechowego ludzi, obejmujących odkrztuszoną i indukowaną plwocinę, popłuczyny oskrzelowe i popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL). Podsumowanie i objaśnienie testu Zasady procedury Prątki są to kwasooporne, nieruchome bakterie tlenowe w kształcie pałeczek, nietworzące form przetrwalnikowych. Grupa ta zawiera kilka gatunków patogennych dla ludzi. Wiele gatunków prątków jest saprofitami w glebie i wodzie. Głównymi ludzkimi patogenami są gatunki kompleksu Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum i M. microti) oraz M. leprae. M. tuberculosis jest najważniejszym patogenem z grupy prątków. M. tuberculosis występuje tylko u ludzi, którzy stanowią jego rezerwuar; prątki gruźlicy rozprzestrzeniają się w populacji w drodze zakażenia kropelkowego. Około jedna trzecia populacji na całym świecie to nosiciele M. tuberculosis obarczeni ryzykiem rozwoju choroby. Szacunkowa liczba osób aktualnie zakażonych prątkami gruźlicy w Stanach Zjednoczonych wynosi 15 milionów, a rocznie odnotowuje się przypadków czynnej gruźlicy 1. M. tuberculosis może wywoływać przewlekłą chorobę płuc, ale również może prowadzić do zakażenia dowolnego narządu ludzkiego organizmu. Z uwagi na niebezpieczeństwo rozprzestrzeniania się choroby, możliwość rozwoju szczepów lekoopornych oraz ciężki przebieg schorzenia u osób zakażonych wirusem HIV-1, szybka diagnostyka mikroorganizmów kompleksu M. tuberculosis jest niezmiernie ważna. W skali całego świata gruźlica odpowiada za 3 miliony zgonów rocznie oraz 26% przypadków zgonów osób dorosłych w krajach rozwijających się, których można by było uniknąć 1 5. Do ostatecznego rozpoznania gruźlicy konieczna jest izolacja drobnoustroju należącego do kompleksu M. tuberculosis. Rutynowe hodowle bakteryjne są czasochłonne, uzyskanie ostatecznej diagnozy może trwać do ośmiu tygodni. Najszybszą metodą detekcji prątków jest badanie mikroskopowe rozmazów kwasoopornych, jest ona jednak mało czuła i nieswoista. Techniki immunologiczne i serologiczne mają ograniczoną wartość z uwagi na słabą czułość i/lub swoistość 6,7. Analiza kwasów mykolowych pochodzących z prątków przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej stanowi użyteczne uzupełnienie hodowli i badań biochemicznych 8. Gatunkowo swoiste sondy z kwasów nukleinowych znacząco poprawiły możliwość szybkiego potwierdzenia wyników hodowli bakteryjnej w przypadku kilku gatunków prątków 9. Udowodniono, że opracowanie swoistych dla prątków testów opartych na PCR w dalszym stopniu usprawniło szybką diagnostykę gruźlicy, umożliwiając bezpośrednią detekcję prątków w próbkach klinicznych Test COBAS AMPLICOR MTB jest oparty na czterech głównych procesach: przygotowanie próbki; amplifikacja PCR 23,24 docelowego DNA przy użyciu primerów biotynylowanych; hybrydyzacja produktów amplifikacji do sond oligonukleotydowych swoistych dla elementu docelowego (elementów docelowych); oraz detekcja produktów amplifikacji związanych z sondami metodą kolorymetryczną. 2/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

3 Mycobacterium tuberculosis Test Test COBAS AMPLICOR MTB pozwala na jednoczesną amplifikację docelowego DNA kompleksu M. tuberculosis oraz wewnętrznej kontroli DNA Mycobacterium. Odczynnik Master Mix zawiera parę biotynylowanych primerów swoistych zarówno dla MTB, jak i dla kontroli wewnętrznej Mycobacterium. Detekcja zamplifikowanego DNA kontroli wewnętrznej Mycobacterium jest opcjonalna i zależna od użytkownika. Przygotowanie próbki Amplifikacja PCR Próbki pochodzące z układu oddechowego ludzi, obejmujące odkrztuszoną lub indukowaną plwocinę, popłuczyny oskrzelowe i BAL (popłuczyny oskrzelowopęcherzykowe), upłynnione i odkażone za pomocą NALC-NaOH 25, NaOH 25 lub SDS-NaOH 26,27, po zagęszczeniu są przemywane roztworem do przemywania próbek z dróg oddechowych. Drobnoustroje ulegają lizie przez inkubację w odczynniku lizującym do próbek z dróg oddechowych, a próbka po dodaniu odczynnika neutralizującego do próbek z dróg oddechowych jest gotowa do amplifikacji. Wybór sekwencji docelowej Wybór docelowej sekwencji DNA jest uzależniony od identyfikacji regionów w obrębie genomu prątka wykazujących maksymalny konserwatyzm spośród gatunków kompleksu M. tuberculosis. Co za tym idzie, właściwa selekcja primerów i sondy ma kluczowe znaczenie dla zdolności testu do wykrycia wszystkich drobnoustrojów należących do kompleksu M. tuberculosis. Genom Mycobacterium zawiera region liczący około 1500 nukleotydów, który koduje gen dla 16S rrna. Test COBAS AMPLICOR MTB wykorzystuje swoiste dla gatunku Mycobacterium biotynylowane primery KY18 i KY75 w celu określenia sekwencji około 584 nukleotydów w tym regionie. 28,29,30 Amplifikacja sekwencji docelowej Poddane obróbce próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (A-tubes), gdzie zachodzi PCR. Mieszanina reakcyjna jest podgrzewana w celu denaturacji dwuniciowej helisy DNA oraz odsłonięcia sekwencji docelowych primerów. Po ochłodzeniu się mieszaniny, biotynylowane primery KY18 i KY75 ulegają przyłączeniu do docelowej nici DNA. Termostabilna polimeraza DNA pochodząca z bakterii Thermus aquaticus (Taq pol) w obecności jonów Mg 2+ i nadmiaru trójfosforanów dezoksynukleotydów (dntp), w tym trójfosforanu dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny, dezoksycytydyny i dezoksyurydyny (zamiast dezoksytymidyny), wydłuża zhybrydyzowane primery wzdłuż sekwencji docelowych i tworzy sekwencję DNA zwaną amplikonem. Analizator COBAS AMPLICOR automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich skutecznie podwajając ilość DNA amplikonu. Amplifikacja kontroli wewnętrznej W procesach amplifikacji wykorzystujących enzymy, takich jak PCR, zawartość inhibitorów w próbce klinicznej może skutkować zmniejszoną wydajnością amplifikacji. Do testu COBAS AMPLICOR MTB dodano kontrolę wewnętrzną Mycobacterium, aby umożliwić identyfikację poddanych obróbce próbek zawierających substancje, które mogą zakłócać amplifikację PCR. Kontrola wewnętrzna Mycobacterium jest to plazmid DNA z regionami wiążącymi primery identycznymi jak te w sekwencji DNA MTB, losową sekwencją wewnętrzną o podobnej długości i składzie zasad jak sekwencja docelowa MTB, oraz unikatowym regionem wiążącym sondę, który pozwala na odróżnienie kontroli wewnętrznej Mycobacterium od amplikonu docelowego. Powyższe cechy wybrano, aby zapewnić równoważną amplifikację DNA kontroli wewnętrznej Mycobacterium i badanego MTB. Kontrola wewnętrzna Mycobacterium jest wprowadzana do każdej z reakcji amplifikacji i ulega równoczesnej amplifikacji z DNA docelowym próbki klinicznej. Detekcja kontroli wewnętrznej MTB jest opcjonalna i zależna od użytkownika. 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 3/30

4 Amplifikacja wybiórcza Wybiórczą amplifikację docelowego DNA z próbki klinicznej w teście COBAS AMPLICOR MTB uzyskano dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase LD (uracylo- N-glikozylazy) 31. Enzym AmpErase LD został oczyszczony, aby usunąć potencjalne zanieczyszczenie bakteryjnym DNA. Enzym AmpErase LD rozpoznaje i katalizuje rozkład nici DNA zawierających dezoksyurydynę, nie wpływając na DNA zawierający dezoksytymidynę. Dezoksyurydyna nie jest obecna w występującym w naturze DNA, lecz jest zawsze obecna w amplikonie z uwagi na użycie trójfosforanu dezoksyurydyny w miejsce trójfosforanu dezoksytymidyny jako jednego z dntp w odczynniku Master Mix. Dlatego też tylko amplikon zawiera dezoksyurydynę. Dezoksyurydyna powoduje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na rozkład przez enzym AmpErase LD przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase LD katalizuje rozkład DNA zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym w ph zasadowym odczynnika Master Mix, łańcuch amplikonu DNA pęka w pozycji dezoksyurydyny, w ten sposób wykluczając dalszą amplifikację DNA. Enzym AmpErase LD jest nieczynny w temperaturach powyżej 55 C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, dlatego też nie niszczy on amplikonu docelowego. Po amplifikacji całość pozostałego enzymu ulega denaturacji przez dodanie roztworu denaturującego, zapobiegając w ten sposób degradacji dowolnego amplikonu docelowego. Wykazano, że enzym AmpErase LD w teście COBAS AMPLICOR MTB inaktywuje co najmniej 10 3 kopii amplikonu MTB zawierającego dezoksyurydynę na jedną reakcję PCR. Reakcja hybrydyzacji Po amplifikacji PCR, analizator COBAS AMPLICOR automatycznie dodaje roztwór denaturujący do probówek A-tube w celu chemicznej denaturacji amplikonu MTB oraz amplikonu wewnętrznej kontroli Mycobacterium i uzyskania jednoniciowego DNA. Próbki zdenaturowanego amplikonu przenosi się następnie do naczynek D używanych do oznaczeń. Do poszczególnych naczynek D dodaje się zawiesiny magnetycznych cząsteczek pokrytych sondą oligonukleotydową swoistą dla kompleksu M. tuberculosis (KY172T3) lub wewnętrznej kontroli Mycobacterium (SK535). Znakowane biotyną amplikony MTB i wewnętrzna kontrola Mycobacterium ulegają hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materiału sondami oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi. Hybrydyzacja amplikonów ze swoistą dla badanego materiału sondą zwiększa ogólną swoistość testu. Reakcja detekcji Bezpośrednio po reakcji hybrydyzacji analizator COBAS AMPLICOR przepłukuje cząstki magnetyczne w naczynkach D w celu usunięcia niezwiązanego materiału, a następnie dodaje koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej. Koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej wiąże się ze znakowanymi biotyną amplikonami, które uległy hybrydyzacji ze swoistymi dla badanego materiału sondami oligonukleotydowymi związanymi z cząsteczkami magnetycznymi. Analizator COBAS AMPLICOR usuwa niezwiązany kompleks, płucząc cząsteczki magnetyczne, a następnie do każdego naczynka D dodaje roztwór substratów zawierający nadtlenek wodoru oraz 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę (TMB). W obecności nadtlenku wodoru peroksydaza chrzanowa związana z cząsteczkami katalizuje utlenianie TMB, tworząc barwny kompleks, którego absorbancję mierzy analizator COBAS AMPLICOR przy długości fali 660 nm. 4/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

5 Mycobacterium tuberculosis Test Odczynniki AMPLICOR Respiratory RSP PREP 100 testów P/N: Specimen Preparation Kit ART: AMPLICOR zestaw do przygotowywania US: próbek z dróg oddechowych RW (roztwór do przemywania próbek z dróg oddechowych) bufor Tris-HCl < 1% substancja ułatwiająca rozpuszczanie EDTA 0,05% azydek sodu RL (odczynnik lizujący do próbek z dróg oddechowych) 0,2% wodorotlenek sodu < 1% substancja ułatwiająca rozpuszczanie EDTA 0,05% azydek sodu RN (odczynnik neutralizujący do próbek z dróg oddechowych) bufor Tris-HCl chlorek magnezu 0,05% azydek sodu 2 x 25 ml 3 x 6 ml 2 x 5 ml AMPLICOR MTB CTL 10 zestawów P/N: M. tuberculosis Positive Control Kit ART: AMPLICOR M. tuberculosis zestaw kontroli dodatniej US: MTB (+) C [kontrola (+) M. tuberculosis] bufor Tris-HCl < 0,001% niezakaźny plazmid DNA (bakteryjny) zawierający sekwencje M. tuberculosis < 0,005% poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu 10 0,75 ml AMPLICOR Mycobacterium MYCO AMP 96 testów P/N: Amplification Kit ART: AMPLICOR Mycobacterium zestaw do amplifikacji US: MYCO MMX (Odczynnik Mycobacterium Master Mix) bufor Tris-HCl glicerol < 0,01% AmpliTaq (polimeraza DNA Taq, bakteryjna) < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,005% primery KY18 i KY75, biotynylowane 0,05% azydek sodu 3 x 1,7 ml 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 5/30

6 AmpErase LD enzyme (uracylo-n-glikozylaza z niską zawartością DNA) bufor Tris-HCl < 0,01% uracylo-n-glikozylaza (bakteryjna) EDTA ditiotreitol glicerol < 1% substancja ułatwiająca rozpuszczanie chlorek sodu 0,05% azydek sodu 3 x 0,1 ml MYCO IC 3 x 0,1 ml (kontrola wewnętrzna Mycobacterium) bufor Tris-HCl < 0,001% niezakaźny plazmid DNA (bakteryjny) zawierający sekwencje wiążące Mycobacterium, identyczne z docelowym DNA MTB i unikatowy region wiążący sondę. < 0,005% poly ra RNA (syntetyczny) EDTA barwnik amarantowy 0,05% azydek sodu MYCO ( ) C [kontrola ( ) Mycobacterium] bufor Tris-HCl < 0,005% poly ra RNA (syntetyczny) EDTA 0,05% azydek sodu 1 x 0,75 ml COBAS AMPLICOR MTB DK 100 testów P/N: M. tuberculosis Detection Kit ART: COBAS AMPLICOR zestaw do detekcji M. tuberculosis US: MT PS1 1 x 100 testów (zawiesina 1 sondy MTB) bufor MES < 0,3% zawiesina cząsteczek Dynabeads (o właściwościach paramagnetycznych) pokrytych oligonukleotydową sondą wychwytującą, swoistą dla MTB (KY172T3) 0,09% azydek sodu MT4 (zawiesina 2 sondy MTB) bufor fosforanu sodu 29,9% tiocyjanian sodu chlorek sodu < 0,2% substancja ułatwiająca rozpuszczalność + Xn 29,9% (udział wagowy) tiocyjanian sodu 1 x 100 testów Produkt szkodliwy 6/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

7 Mycobacterium tuberculosis Test COBAS AMPLICOR DK 100 testów P/N: Detection Reagents Kit ART: COBAS AMPLICOR zestaw odczynników do detekcji US: DN4 (roztwór denaturujący) 1,6% wodorotlenek sodu EDTA błękit tymolowy + Xi 1,6% (udział wagowy) wodorotlenek sodu 1 x 100 testów Produkt drażniący CN4 1 x 100 testów (koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) bufor Tris-HCl < 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej surowicza albumina bydlęca (ssacza) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% substancja konserwująca ProClin 150 SB3 (substrat A) roztwór cytrynianu 0,01% nadtlenek wodoru 0,1% substancja konserwująca ProClin 150 SB (substrat B) 0,1% 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB) 40% dimetyloformamid (DMF) 5 x 75 testów 5 x 5 ml T 40% (udział wagowy) dimetyloformamid (DMF) Produkt toksyczny R: 61-20/21-36 Może działać szkodliwie na dziecko w łonie matki. Działa szkodliwie przez drogi oddechowe i w kontakcie ze skórą. Działa drażniąco na oczy. S: Unikać narażenia - przed użyciem zapoznać się z instrukcją. W przypadku awarii lub jeżeli źle się poczujesz, niezwłocznie zasięgnij porady lekarza - jeżeli to możliwe, pokaż etykietę. 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 7/30

8 COBAS AMPLICOR CN4 200 testów P/N: Conjugate Detection Reagent ART: COBAS AMPLICOR odczynnik do detekcji koniugatu US: CN4 2 x 100 testów (koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) bufor Tris-HCl < 0,001% koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej surowicza albumina bydlęca (ssacza) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% substancja konserwująca ProClin 150 COBAS AMPLICOR WB 500 testów P/N: Wash Buffer ART: COBAS AMPLICOR bufor płuczący US: WB (10X-koncentrat płuczący) < 2% bufor fosforanowy < 9% chlorek sodu EDTA < 2% detergent 0,5% substancja konserwująca ProClin x 250 testów Ostrzeżenia i środki ostrożności Do stosowania w diagnostyce in vitro. Niniejszy test jest przeznaczony do użycia wyłącznie z upłynnionymi, odkażonymi i zagęszczonymi próbkami pobranymi z układu oddechowego od ludzi, włączając odkrztuszoną i indukowaną plwocinę, popłuczyny oskrzelowe i BAL, które zostały upłynnione, odkażone i zagęszczone przy użyciu metod wykorzystujących NALC-NaOH 25, NaOH 25 lub SDS-NaOH 26,27. Nie pipetować za pomocą ust. Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Przy obchodzeniu się z próbkami i odczynnikami z zestawów stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyć ręce po pracy z próbkami i odczynnikami testowymi. Unikać skażenia odczynników bakteriami podczas pobierania porcji z butelek z odczynnikami. Zaleca się stosowanie jałowych, jednorazowych pipet oraz końcówek pipet. Nie łączyć odczynników z różnych serii ani z różnych butelek z tej samej serii. Wyrzucić wszystkie nieużyte odczynniki, postępując zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. Nie używać zestawu po upływie daty ważności. Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (Material Safety Data Sheets MSDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. Praca w laboratorium musi przebiegać w sposób jednokierunkowy należy ją rozpocząć w obszarze przedamplifikacyjnym i przemieszczać się jednokierunkowo w stronę obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności poprzedzające 8/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

9 Mycobacterium tuberculosis Test proces amplifikacji muszą zaczynać się od przygotowania odczynników, a następnie przygotowania próbki. Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone wyłącznie do określonej czynności poprzedzającej proces amplifikacji; nie wolno używać ich do innych czynności ani przemieszczać między obszarami. W każdym obszarze konieczne jest używanie rękawiczek, które należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenie i materiały zastosowane do przygotowania odczynnika nie mogą być używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem próbki lub pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA lub innych źródeł docelowego DNA. Materiały i urządzenia używane w czynnościach po amplifikacji muszą pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym. Z próbkami należy obchodzić się tak jak z materiałem zakaźnym, stosując laboratoryjne procedury bezpieczeństwa, takie jak określone w dokumentach Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 32 oraz w CLSI Document M29-A3 33. Dokładnie wyczyścić i zdezynfekować odpowiednim roztworem dezynfekującym wszystkie powierzchnie pracy. Odczynniki RW, RL, RN, MYCO MMX, AmpErase LD enzyme, MYCO IC, MTB (+) C, MYCO ( ) C i MT PS1 zawierają azydek sodu. Azydek sodu może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu azydków. Podczas obchodzenia się z odczynnikami RW, RL, RN, MYCO MMX, MT4, DN4, CN4, SB3, SB i substratem roboczym (zmieszane odczynniki SB3 i SB) należy mieć na sobie ochronę oczu, fartuch laboratoryjny i jednorazowe rękawiczki. Unikać kontaktu wymienionych materiałów ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, natychmiast spłukać dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń. W razie rozlania wspomnianych odczynników należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je wodą. Należy unikać kontaktu SB i substratu roboczego ze skórą i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu ze skórą, natychmiast spłukać dużą ilością wody. Dimetyloformamid zawarty w SB i substracie roboczym może działać szkodliwe na płód w łonie matki; opisywano ponadto działania toksyczne po doustnym przyjęciu dużych dawek. Należy unikać kontaktu ze skórą, wdychania oparów oraz spożycia. Jeżeli dojdzie do kontaktu ze skórą, dokładnie spłukać za pomocą mydła i wody oraz natychmiast zwrócić się o pomoc medyczną. Do przygotowania próbek i kontroli należy bezwzględnie używać probówek zakręcanych, aby uniknąć rozpryśnięcia próbki i możliwości krzyżowego skażenia próbek. Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym. Wymagania dotyczące przechowywania i użytkowania Nie zamrażać odczynników. RW, RL i RN należy przechowywać w temperaturze 2 25 C. Jeżeli nie zostały otwarte, odczynniki te są trwałe do upływu wymienionej daty ważności. Odczynniki MYCO MMX, MYCO IC i AmpErase LD enzyme należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Jeżeli nie zostały otwarte, odczynniki te są trwałe do upływu wymienionej daty ważności. Po otwarciu odczynnik roboczy Master Mix (przygotowany przez dodanie enzymu AmpErase LD enzyme i odczynnika MYCO IC do MYCO MMX) musi być przechowywany w temperaturze 2 8 C i jest trwały przez 4 tygodnie. 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 9/30

10 Dostarczane materiały MTB (+) C i MYCO ( ) C należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Odczynniki te są trwałe do upływu podanej daty ważności. Przechowywać MT PS1 i MT4 w temperaturze 2 8 C. Odczynniki te są trwałe do upływu podanej daty ważności. Po zmieszaniu MT PS1 i MT4 odczynnik roboczy jest trwały przez 30 dni w temperaturze 2 8 C. Odczynnik roboczy może być używany maksymalnie przez sześć cykli pracy urządzenia (12 godzin na cykl) i pomiędzy cyklami pracy urządzenia musi być przechowywany w temperaturze 2 8 C. DN4 należy przechowywać w temperaturze 2 25 C. DN4 jest trwały do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu DN4 jest trwały przez 30 dni w temperaturze 2 8 C lub do upływu daty ważności (zależnie od tego, który termin jest wcześniejszy). DN4 można stosować w ciągu maksymalnie sześciu cykli pracy urządzenia (12 godzin na cykl), a między poszczególnymi cyklami należy go przechowywać w temperaturze 2 8 C. CN4 należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. CN4 jest trwały do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu CN4 jest trwały przez 30 dni w temperaturze 2 8 C lub do upływu daty ważności (zależnie od tego, który termin jest wcześniejszy). CN4 można stosować w ciągu maksymalnie sześciu cykli pracy urządzenia (12 godzin na cykl), a między poszczególnymi cyklami należy go przechowywać w temperaturze 2 8 C. SB3 i SB należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Jeżeli nie zostały otwarte, odczynniki te są trwałe do upływu podanej daty ważności. Substrat roboczy musi być przygotowywany codziennie przez zmieszanie SB3 z SB. Substrat roboczy w analizatorze COBAS AMPLICOR jest trwały przez 16 godzin. SB3, SB ani substratu roboczego nie należy poddawać działaniu metali, środków utleniających lub bezpośredniego światła. WB należy przechowywać w temperaturze 2 30 C. WB jest trwały do upływu podanej daty ważności. Zbadać WB oraz, jeżeli jest to konieczne, ogrzać w C w celu ponownego rozpuszczenia ewentualnego osadu. Roboczy bufor płuczący (1X), przygotowany przez rozcieńczenie WB wodą destylowaną lub dejonizowaną, powinien być przechowywany w pojemniku na bufor płuczący analizatora COBAS AMPLICOR w temperaturze 2 25 C; bufor jest trwały przez 2 tygodnie od daty przygotowania. Pomiędzy przebiegami pracy urządzenia częściowo zużyte odczynniki służące do detekcji należy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Przed wprowadzeniem do analizatora COBAS AMPLICOR odczynników z otwartych opakowań lub odczynników roboczych należy sprawdzić ich datę ważności. AMPLICOR Respiratory RSP PREP P/N: Specimen Preparation Kit ART: AMPLICOR zestaw do przygotowywania US: próbek z dróg oddechowych RW (roztwór do przemywania próbek z dróg oddechowych) RL (odczynnik lizujący do próbek z dróg oddechowych) RN (odczynnik neutralizujący do próbek z dróg oddechowych) 10/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

11 Mycobacterium tuberculosis Test AMPLICOR M. tuberculosis MYCO CTL P/N: Positive Control Kit ART: AMPLICOR M. tuberculosis zestaw kontroli dodatniej US: MTB (+) C [kontrola (+) M. tuberculosis] AMPLICOR Mycobacterium MYCO AMP P/N: Amplification Kit ART: AMPLICOR Mycobacterium zestaw do amplifikacji US: MYCO MMX (odczynnik Mycobacterium Master Mix) AmpErase LD enzyme (uracylo-n-glikozylaza z niską zawartością DNA) MYCO IC (kontrola wewnętrzna Mycobacterium) MYCO ( ) C [kontrola ( ) Mycobacterium] COBAS AMPLICOR MTB DK P/N: M. tuberculosis Detection Kit ART: COBAS AMPLICOR zestaw do detekcji M. tuberculosis US: MT PS1 (zawiesina 1 sondy MTB) MT4 (zawiesina 2 sondy MTB) COBAS AMPLICOR DK P/N: Detection Reagents Kit ART: COBAS AMPLICOR zestaw odczynników do detekcji US: DN4 (roztwór denaturujący) CN4 (koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) SB3 (substrat A) SB (substrat B) COBAS AMPLICOR CN4 P/N: Conjugate Detection Reagent ART: COBAS AMPLICOR odczynnik do detekcji koniugatu US: CN4 (koniugat awidyny i peroksydazy chrzanowej) COBAS AMPLICOR WB P/N: Wash Buffer ART: COBAS AMPLICOR bufor płuczący US: WB 10X-koncentrat płuczący 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 11/30

12 Materiały wymagane, lecz niedostarczane Obszar obróbki przedamplifikacyjnej obszar przygotowania odczynników Pierścień A przeznaczony do analizatora COBAS AMPLICOR z wbudowanymi 12 probówkami A-tube Statyw pierścienia A przeznaczony do analizatora COBAS AMPLICOR Pipeta Eppendorf Multipette ze zbiorniczkiem Combitip o pojemności 1,25 ml (jałowa, pojedynczo pakowana) Pipetory (pojemność 100 µl)* z barierą aerozolową lub z końcówkami z wyrzutnikiem Rękawice jednorazowe bezpudrowe Obszar obróbki przedamplifikacyjnej obszar przygotowania próbki i kontroli Polipropylenowe probówki z zakręcanym korkiem o pojemności 1,5 ml, jałowe, niesilikonizowane, stożkowe (Sarstedt lub odpowiednik)** Statyw na probówki (Sarstedt lub odpowiednik) Sterylne pipety transferowe z precyzyjną końcówką Pipetory (pojemność 50 µl, 100 µl, 400 µl, 500 µl i 1000 µl)* z barierą aerozolową lub końcówkami z wyrzutnikiem Mikrowirówka (maks. RCF x g, min. RCF x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M lub odpowiednik Mieszadło wibracyjne Blok grzejny 60 C ± 2 C Rękawice jednorazowe bezpudrowe Obszar obróbki poamplifikacyjnej obszar amplifikacji/detekcji Analizator COBAS AMPLICOR z drukarką Instrukcja obsługi analizatora COBAS AMPLICOR Opcjonalnie: Oprogramowanie AMPLILINK obejmujące: Stacja danych z oprogramowaniem AMPLILINK, wyposażona w drukarkę Instrukcja obsługi programu AMPLILINK, wersja 2.4, do analizatora COBAS AMPLICOR (do użytku z programem AMPLILINK, v2.41) lub podręcznik obsługi programu AMPLILINK, wersja 3.2, do użytku z narzędziem COBAS AmpliPrep oraz analizatorami COBAS TaqMan, COBAS TaqMan 48 i COBAS AMPLICOR (do użytku z programem AMPLILINK, v3.2) Instrukcja metodyczna do testu COBAS AMPLICOR MTB Stojak na naczynka D Woda destylowana lub dejonizowana Pipety serologiczne o pojemności 5 ml Cylinder miarowy (o pojemności co najmniej 1 litra) Mieszadło wibracyjne Rękawice jednorazowe bezpudrowe * Dokładność pipetorów musi mieścić się w zakresie 3% podanej objętości. Tam, gdzie jest to wskazane, konieczne jest stosowanie końcówek z barierą aerozolową lub wyrzutnikiem, aby zapobiec krzyżowemu skażeniu próbki i amplikonu. ** Do przygotowywania próbek oraz kontroli należy stosować probówki z zakręcanym korkiem, aby zapobiegać rozlaniu i potencjalnemu skażeniu krzyżowemu próbek i kontroli. Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym. 12/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

13 Mycobacterium tuberculosis Test Pobieranie, transport i przechowywanie próbek Uwaga Pobieranie próbek Transport próbek Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z materiałem potencjalnie zakaźnym. Jedyne akceptowalne próbki z dróg oddechowych to: (a) odkrztuszona i indukowana plwocina; (b) popłuczyny oskrzelowe; oraz (c) BAL pobrane do sterylnych, plastikowych pojemników. Próbki te muszą być płynne, odkażone i zagęszczone przy użyciu metod wykorzystujących NALC-NaOH 25, NaOH 25 lub SDS-NaOH 26,27. Odkażone próbki muszą być przewiezione do laboratorium w temperaturze 2 25 C pod warunkiem, że dotrą tam w ciągu 24 godzin od chwili pobrania. Jeżeli próbki nie dotrą do laboratorium w ciągu 24 godzin od chwili pobrania, będą musiały być przechowywane w temperaturze 70 C i transportowane na suchym lodzie. Próbki należy przesyłać zgodnie z wszystkimi przepisami krajowymi, wojewódzkimi i lokalnymi dotyczącymi transportu czynników etiologicznych 34. Przechowywanie próbek Odkażone próbki można przechowywać w temperaturze 70 C do 8 miesięcy. Przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze 70 C do 6 miesięcy lub do 4 dni w temperaturze 2 8 C. Instrukcja użytkowania Uwaga Uwaga Uwaga Uwaga Przygotowanie odczynników Aby uzyskać szczegółowe instrukcje użytkowania, informacje dotyczące drukowania wyników oraz interpretowania oznaczeń kodowych i komentarzy, należy sięgnąć do (1) instrukcji obsługi analizatora COBAS AMPLICOR, a (2) w razie korzystania z programu AMPLILINK, v2.41 należy zapoznać się z instrukcją obsługi programu AMPLILINK, wersja 2.4, do analizatora COBAS AMPLICOR, lub w przypadku korzystania z programu AMPLILINK, v3.2, należy zapoznać się z podręcznikiem obsługi programu AMPLILINK, wersja 3.2, do narzędzia COBAS AmpliPrep, analizatorów: COBAS TaqMan, COBAS TaqMan 48 i COBAS AMPLICOR. Jeśli obróbka próbki, amplifikacja i detekcja wykonywane są w jednym dniu roboczym, wykonać procedurę, jak opisano poniżej. Jeśli przygotowanie próbki wykonywane jest w dniu innym niż amplifikacja i detekcja, należy wykonać przygotowanie odczynników w tym samym dniu co amplifikację i detekcję. Wszystkie odczynniki muszą mieć temperaturę otoczenia przed użyciem. Tam, gdzie jest to wskazane, należy używać pipetorów z końcówkami z barierą aerozolową lub dodatnim wypieraniem. Należy dołożyć wszelkich starań, aby zapewnić selektywną amplifikację. Do przygotowania próbek oraz kontroli należy używać probówek z zakręcanym korkiem, aby zapobiegać rozlaniu i możliwości skażenia krzyżowego próbek. Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym. Wykonywane w: Obszar obróbki przedamplifikacyjnej obszar przygotowania odczynników 1. Ustalić odpowiednią liczbę pierścieni A potrzebnych do oznaczenia próbek pacjentów i kontrolnych. Przy każdej przeprowadzanej reakcji PCR należy uwzględnić jedną kontrolę (+) M. tuberculosis oraz jedną kontrolę ( ) Mycobacterium (patrz rozdział Kontrola jakości ). Umieścić pierścień A w odpowiednim statywie. 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 13/30

14 Uwaga Nawet jeżeli nie będzie się przeprowadzać detekcji MYCO IC, należy dodać MYCO IC do odczynnika Master Mix. 2. Wymieszać probówkę z MYCO IC na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund. Przygotować roboczy odczynnik Master Mix, dodając 100 µl MYCO IC i 100 µl enzymu AmpErase LD enzyme do jednej fiolki MYCO MMX (mieszanina wystarcza do przeprowadzenia 32 amplifikacji). Nie jest konieczne odmierzanie objętości odczynnika Master Mix. Dodać 100 µl MYCO IC i 100 µl enzymu AmpErase LD enzyme do pełnej fiolki z MYCO MMX. Zamknąć ponownie probówkę i dokładnie wymieszać zawartość, odwracając razy. Nie mieszać roboczego odczynnika Master Mix na mieszadle wibracyjnym. Zanotować datę przygotowania odczynnika na fiolce. Wyrzucić puste fiolki po MYCO IC i enzymie AmpErase LD enzyme. Odczynnik roboczy Master Mix jest trwały przez 4 tygodnie w temperaturze 2 8 C. 3. Dodać 50 µl odczynnika roboczego Master Mix do każdej z probówek A-tube, używając pipetora powtarzalnego ze zbiorniczkiem Combitip o objętości 1,25 ml lub pipetora wyposażonego w barierę aerozolową lub końcówkę z wyrzutnikiem. W tym czasie nie należy zamykać korków probówek A-tube. 4. Umieścić pierścień A zawierający odczynnik roboczy Master Mix w plastikowej torebce przeznaczonej do wielokrotnego zamykania i zamknąć szczelnie torebkę. Przenieść pierścienie A do obszaru przedamplifikacyjnego obszaru przygotowania próbki i kontroli. Pierścienie A zawierające odczynnik roboczy Master Mix należy przechowywać w temperaturze 2 8 C w obszarze przed amplifikacją przygotowania próbek badanych i kontrolnych, do czasu zakończenia przygotowywania próbek badanych i kontrolnych. Odczynnik roboczy Master Mix jest trwały przez 24 godziny w temperaturze 2 8 C w probówkach A-tube umieszczonych w szczelnie zamkniętej torebce z tworzywa. Przygotowanie próbki i kontroli Uwaga Przeprowadzane w: Obszar obróbki przedamplifikacyjnej obszar przygotowania próbki i kontroli Aby wykonać amplifikację przygotowanych próbek i kontroli należy najpierw wykonać kroki opisane w części Przygotowanie odczynników. Rozmrozić przygotowane próbki i próbki kontrolne w temperaturze pokojowej i przejść do etapu 10 z rozdziału Przygotowanie próbki i kontroli. 1. Na każdą próbkę oznaczyć jedną polipropylenową probówkę o pojemności 1,5 ml z zakręcanym korkiem oraz próbkę kontrolną. Nie należy stosować probówek z korkiem zatrzaskowym. Oznaczyć każdą probówkę do przygotowania próbek numerem identyfikacyjnym próbki. 2. Dodać 500 µl RW do każdej probówki z próbką badaną. 3. Dodać 100 µl płynnej, odkażonej i zagęszczonej próbki z dróg oddechowych do probówki zawierającej RW. Zamknąć ponownie probówkę i mieszać przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym. 4. Odwirować przy prędkości x g przez 10 minut. 5. Zaaspirować supernatant przy użyciu pipety transferowej z cienką końcówką i dodać 100 µl RL do peletki, używając do każdej próbki nowej końcówki do pipet z osłoną aerozolową. Mieszać przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym do czasu uzyskania zawiesiny z peletki. 6. Przygotować kontrole robocze w następujący sposób: 14/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

15 Mycobacterium tuberculosis Test Uwaga Konieczne jest przygotowanie świeżych kontroli roboczych każdego dnia, w którym wykonywany jest test, a następnie należy je wyrzucić na koniec dnia. a. Wymieszać probówkę z MYCO ( ) C przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym. Przenieść 100 µl MYCO ( ) C do polipropylenowej probówki z zakrętką o pojemności 1,5 ml, używając pipetora z końcówką z barierą aerozolową. Dodać 400 µl RL. Mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund. Przygotowana próbka jest kontrolą roboczą ( ) Mycobacterium. b. Mieszać probówkę z MTB (+) C przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym. Przenieść 100 µl MTB (+) C do polipropylenowej probówki z zakrętką o pojemności 1,5 ml, używając pipetora z końcówką z barierą aerozolową. Dodać 400 µl RL. Mieszać na mieszadle wibracyjnym przez 5 sekund. Przygotowana próbka jest kontrolą roboczą (+) M. tuberculosis. c. Przenieść 100 µl każdej z kontroli roboczych do polipropylenowej probówki o pojemności 1,5 ml z zakrętką i poddać obróbce równolegle z próbkami klinicznymi. 7. Inkubować próbki i kontrole w suchym bloku grzejnym w temperaturze 60 C ± 2 C przez 45 minut. 8. Wyjąć probówki z bloku grzejnego i odwirować pulsacyjnie przez 5 sekund, aby usunąć kondensat z zakrętki. 9. Przy użyciu pipetora z końcówką do pipet z osłoną aerozolową dodać 100 µl RN do każdej probówki z próbką i próbką kontrolną. Mieszać przez 5 sekund na mieszadle wibracyjnym przy połowie prędkości maksymalnej. Należy użyć nowej końcówki z osłoną aerozolową dla każdej próbki i kontroli. 10. Używając pipetora(-ów) z końcówką(-ami) z osłoną aerozolową, przenieść 50 µl każdej przygotowanej próbki chorego, kontroli roboczej (+) M. tuberculosis i kontroli roboczej ( ) Mycobacterium do odpowiednich probówek A-tube z odczynnikiem roboczym Master Mix. Zachować ostrożność, aby uniknąć przeniesienia materiału, który mógł nie zostać ponownie zawieszony. Zamknąć probówki zakrętkami. Odnotować pozycję próbki (próbek) od chorych i próbki kontrolnej na mapie pierścienia A. 11. Przenieść przygotowane próbki (próbki od pacjentów i próbki kontrolne) w pierścieniach A do obszaru amplifikacji/detekcji. Przygotowane próbki można przechowywać w temperaturze 2 8 C do 8 godzin. Amplifikacja i detekcja Przeprowadzane w: Obszar obróbki poamplifikacyjnej obszar amplifikacji/detekcji Należy wykonać następujące codzienne czynności serwisowe: Przecierać stanowisko startowe przy użyciu wilgotnej szmatki pozbawionej kłaczków, a następnie osuszyć je. Wytrzeć końcówkę statywu na naczynka D wilgotną ściereczką niezostawiającą włókien, a następnie wysuszyć. Sprawdzić pojemnik buforu płuczącego i napełnić go w razie potrzeby. Przygotować roboczy bufor płuczący (1X) w sposób podany poniżej. Zbadać WB oraz, jeżeli jest to konieczne, ogrzać w C w celu ponownego rozpuszczenia ewentualnego osadu. Przygotować roboczy roztwór płuczący, dodając 1 objętość WB do 9 objętości wody destylowanej lub dejonizowanej. Dobrze wymieszać. Należy dbać o to, żeby w zbiornik buforu płuczącego przez cały czas zawierał co najmniej 3 4 litry buforu płuczącego (1X). 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 15/30

16 Opróżnić pojemnik na resztki. Uruchomić analizator COBAS AMPLICOR. Podczas uruchamiania systemu sprawdzić strzykawki i przewody. Podczas uruchamiania sprawdzić końcówkę transferową. Przed każdym przebiegiem oznaczeń: Sprawdzić pojemnik na resztki i opróżnić, jeśli to konieczne. Sprawdzić pojemnik buforu płuczącego i dodać bufor, jeśli to konieczne. Usunąć zużyte statywy na naczynka D. Uruchomić analizator COBAS AMPLICOR. Uruchamianie i obsługa systemu analizatora COBAS AMPLICOR 1. Sprawdzić ilości odczynników wewnątrz analizatora COBAS AMPLICOR. Przygotować wystarczającą liczbę kaset z odczynnikami do wykonania analizy wprowadzonych próbek. 2. Dokładnie wymieszać MT PS1 na mieszadle wibracyjnym. Dodać 2,5 ml MT PS1 do kasety z MT4. Umieścić kasetę w statywie dla odczynników specyficznych dla określonego testu. Usunąć zużytą fiolkę MT PS1. Zanotować datę przygotowania odczynnika na kasecie MT4. Uwaga Jeżeli nie będzie wykonywana detekcja kontroli wewnętrznej, przejść do etapu 4. W przeciwnym razie kontynuować etap Dokładnie wymieszać IC PS1 na mieszadle wibracyjnym. Dodać 2,5 ml IC PS1 do kasety z IC4. Umieścić kasetę w statywie dla odczynników specyficznych dla określonego testu. Usunąć zużytą fiolkę IC PS1. Zanotować datę przygotowania odczynnika na kasecie IC4. 4. Przygotować roztwór substratu roboczego, odpipetowując 5 ml SB do jednej kasety z SB3. Aby wymieszać roztwór, kilkakrotnie nabrać i usunąć płyn z pipety. Wyrzucić zużytą fiolkę SB. Odnotować datę przygotowania na kasecie z SB3. 5. Umieścić substrat roboczy w kasecie z SB3 w statywie dla roztworów podstawowych. 6. Umieścić kasety z DN4 i CN4 w statywie dla roztworów podstawowych. Na każdej kasecie odnotować datę jej otwarcia. 7. Oznaczyć ramki na odczynniki jako zwykłe lub określone dla danego testu, używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK. 8. Skonfigurować ramki na odczynniki przez wprowadzenie pozycji odczynników i numerów serii do analizatora COBAS AMPLICOR, używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK. 9. Załadować statyw na odczynniki do analizatora COBAS AMPLICOR, używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK. Upewnić się, że każda kaseta z odczynnikami znajduje się w przypisanym jej miejscu i jest mocno zamocowana w statywie. 10. Umieścić statyw na naczynka D na platformie przeznaczonej dla naczynek D. Dla każdej reakcji detekcji wymagana jest jedno naczynko D, a dla każdej kasety z substratem roboczym wymagane są dwa naczynka D, aby umożliwić wyzerowanie analizatora COBAS AMPLICOR. 16/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

17 Mycobacterium tuberculosis Test 11. Umieścić pierścienie A w segmentach termocyklera analizatora COBAS AMPLICOR. 12. Załadować pierścienie A do analizatora COBAS AMPLICOR, używając klawiatury, czytnika kodów kreskowych lub oprogramowania AMPLILINK. 13. Utworzyć listę roboczą pierścienia A. 14. Szczelnie zamknąć pokrywę segmentu(-ów) termocyklera. 15. Uruchomić analizator COBAS AMPLICOR. 16. Zaczekać, aż analizator COBAS AMPLICOR wyświetli komunikat o pomyślnym sprawdzeniu systemu w czasie uruchamiania. Uwaga Analizator COBAS AMPLICOR umożliwia wykonanie 6 oddzielnych oznaczeń zawartości każdej probówki A-tube. Analizator oblicza wymaganą ilość każdego odczynnika do detekcji, a przeprowadzone sprawdzanie obciążenia na początku każdego przebiegu testu pozwala określić, czy dostępna jest wystarczająca ilość odczynników koniecznych do testów. Kontrola jakości 17. Analizator COBAS AMPLICOR automatycznie wykonuje amplifikację i detekcję. Wyniki wyrażone są w postaci wartości absorbancji przy długości fali 660 nm oraz jako wynik dodatni lub ujemny. Z każdą serią próbek musi zostać przygotowana co najmniej jedna kontrola (+) M. tuberculosis oraz jedna kontrola ( ) Mycobacterium. Jak w przypadku każdej nowej procedury laboratoryjnej, nowi operatorzy do czasu uzyskania przez nich wysokiej biegłości w prawidłowym wykonywaniu procedury oznaczenia powinni rozważyć użycie dodatkowych dodatnich i ujemnych prób kontrolnych podczas każdego oznaczenia. Nie ma wymagań dotyczących położenia kontroli w pierścieniu A. Aby upewnić się o prawidłowym przebiegu cyklu, należy sprawdzić sygnały i komentarze na właściwym dla niego wydruku. Kontrola ujemna Kontrola dodatnia Absorbancja kontroli ( ) Mycobacterium powinna być mniejsza od 0,25 przy długości fali 660 nm. Jeżeli absorbancja kontroli ( ) Mycobacterium jest równa lub wyższa niż 0,25, cały przebieg oznaczeń jest nieprawidłowy. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbek, amplifikacja i detekcja). Jeśli absorbancja kontroli ( ) Mycobacterium jest znacząco większa niż 0,25, w celu otrzymania pomocy technicznej należy skontaktować się z miejscowym biurem Roche. Absorbancja kontroli (+) M. tuberculosis przy długości fali 660 nm powinna być równa lub wyższa niż 2,0. Jeżeli absorbancja kontroli (+) M. tuberculosis wynosi poniżej 2,0, cały cykl jest nieprawidłowy. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie próbek, amplifikacja i detekcja). Jeżeli absorbancja kontroli (+) M. tuberculosis wynosi systematycznie poniżej 2,0, należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielstwem firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej. Kontrola Aby zbadać efektywność przygotowywania próbek (zalecane raz w miesiącu), przygotowywania próbek 10 4 studzienek z M. tuberculosis należy przygotować w sposób opisany w rozdziale Przygotowanie próbki i kontroli, a następnie zbadać je tak samo jak próbki kliniczne. Jeżeli próbka została właściwie przygotowana przy użyciu testu COBAS AMPLICOR MTB, powinno się uzyskać wartość absorbancji większą lub równą 0,35 przy długości fali 660 nm. 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 17/30

18 Wyniki Interpretacja wyników Bez użycia detekcji kontroli wewnętrznej 1. Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, należy sprawdzić sygnały (FLG, flags) i komentarze umieszczone na wydruku dla danego cyklu. Jeżeli cykl jest nieprawidłowy, należy powtórzyć go w całości (przygotowanie próbek, amplifikacja i detekcja). 2. W przypadku prawidłowego cyklu wyniki próbek interpretuje się w następujący sposób: A 660 Komentarz Interpretacja < 0.35 NEGATIVE Nie wykryto DNA MTB. Próbka przypuszczalnie nie zawiera M. tuberculosis. Wynik ujemny nie wyklucza obecności zakażenia MTB, gdyż wyniki zależne są od odpowiedniego pobrania próbki, nieobecności inhibitorów oraz obecności wystarczającej ilości DNA do detekcji POSITIVE Wykryto DNA MTB. Wynik dodatni badania próbki na obecność M. tuberculosis. Interpretacja wyników Przy użyciu detekcji kontroli wewnętrznej 1. Aby upewnić się o poprawnym przebiegu cyklu, należy sprawdzić sygnały (FLG, flags) i komentarze umieszczone na wydruku dla danego cyklu. Jeżeli cykl jest nieprawidłowy, należy powtórzyć go w całości (przygotowanie próbek, amplifikacja i detekcja). 2. W przypadku prawidłowego cyklu wyniki próbek interpretuje się w następujący sposób: Wynik próbki MTB Wynik próbki IC Interpretacja A 660 Komentarz A 660 Komentarz < 0.35 NEGATIVE 0.35 POSITIVE Nie wykryto DNA MTB. Próbka przypuszczalnie nie zawiera M. tuberculosis. Wynik ujemny nie wyklucza obecności zakażenia MTB, gdyż wyniki zależne są od odpowiedniego pobrania próbki, nieobecności inhibitorów oraz obecności wystarczającej ilości DNA do detekcji. < 0.35 NEGATIVE < 0.35 NEGATIVE Wynik ujemny nieważny. Przygotować następną porcję wyjściowej próbki. Jeżeli wyjściowa próbka nie jest dostępna, należy pobrać nową POSITIVE DOWOLNY DOWOLNY Wykryto DNA MTB. Wynik dodatni badania próbki na obecność MTB. 18/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

19 Mycobacterium tuberculosis Test Środki ostrożności dotyczące procedury Ograniczenia metody Praca w laboratorium musi przebiegać w sposób jednokierunkowy należy ją rozpocząć w obszarze przedamplifikacyjnym i przemieszczać się jednokierunkowo w stronę obszaru poamplifikacyjnego (amplifikacji/detekcji). Czynności poprzedzające proces amplifikacji muszą zaczynać się od przygotowania odczynników, a następnie przygotowania próbki. Materiały i wyposażenie muszą być przeznaczone wyłącznie do określonej czynności przed procesem amplifikacji i nie wolno używać ich do innych czynności ani przemieszczać między obszarami. W każdym obszarze konieczne jest używanie rękawiczek, które należy zmienić przed opuszczeniem danego obszaru. Wyposażenie i materiały zastosowane do przygotowania odczynnika nie mogą być używane podczas czynności związanych z przygotowywaniem próbki lub pipetowaniem albo obróbką zamplifikowanego DNA lub innych źródeł docelowego DNA. Materiały i urządzenia używane w czynnościach po amplifikacji muszą pozostawać zawsze w obszarze poamplifikacyjnym. Jak w przypadku każdej procedury testowej, dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej. Z uwagi na wysoką czułość analityczną niniejszego testu należy zachować wyjątkową ostrożność, aby zapewnić czystość zestawów odczynników oraz mieszanin do amplifikacji. Należy ściśle monitorować czystość wszystkich odczynników. Należy usunąć wszystkie podejrzane odczynniki. Niniejszy test został zwalidowany dla płynnych, odkażonych i zagęszczonych próbek pobranych z układu oddechowego ludzi, włączając odkrztuszoną i indukowaną plwocinę, popłuczyny oskrzelowe i BAL. Próbki te zostały upłynnione, odkażone i zagęszczone przy użyciu metod wykorzystujących NALC-NaOH 25, NaOH 25 lub SDS-NaOH 26,27. Badanie innych rodzajów próbek może dawać wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie. Uzyskanie wiarygodnych wyników zależy od właściwego pobrania próbki, transportu, przechowywania oraz procedur obróbki. Detekcja drobnoustrojów kompleksu M. tuberculosis zależna jest od liczby bakterii obecnych w próbce i mogą na nią mieć wpływ metody pobrania próbki, czynniki zależne od pacjenta (np. wiek, obecność objawów) i/lub stadium zakażenia. Wyniki fałszywie ujemne mogą się pojawiać na skutek hamowania polimerazy. Do testu COBAS AMPLICOR MTB dodano kontrolę wewnętrzną Mycobacterium, aby umożliwić identyfikację poddanych obróbce próbek zawierających substancje, które mogą zakłócać amplifikację PCR. Dodanie enzymu AmpErase LD do odczynnika Master Mix zmniejsza ryzyko skażenia amplikonu. Jednak kontaminacji z dodatnich kontroli MTB i materiałów klinicznych można uniknąć tylko przez dobre praktyki laboratoryjne i dokładne realizowanie procedur wyszczególnionych w niniejszym podręczniku metod. Jak w przypadku każdego testu diagnostycznego, wyniki testu COBAS AMPLICOR MTB należy interpretować z uwzględnieniem wszystkich dostępnych wyników badania klinicznego i badań laboratoryjnych. Produktu tego powinny używać wyłącznie osoby wykwalifikowane w technikach PCR. Niniejszego produktu można używać wyłącznie w analizatorze COBAS AMPLICOR. 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 19/30

20 Charakterystyka skuteczności Swoistość analityczna: Swoistość analityczną testu COBAS AMPLICOR MTB oceniono na podstawie testów przeprowadzonych przy użyciu następujących bakterii i wirusów, z których wiele stanowi prawidłową florę lub często spotykane patogeny dróg oddechowych. Wszystkie izolaty bakterii przebadano przy użyciu 10 6 komórek/ml lub 10 5 kopii kwasu nukleinowego/pcr. Izolaty wirusów zbadano, używając wymienionych poniżej poziomów PFU/ml. Żaden z badanych izolatów nie wykazał dodatniego odczynu w teście COBAS AMPLICOR MTB. Gatunki Mycobacterium Mycobacterium asiaticum Mycobacterium aurum Mycobacterium avium Mycobacterium chitae Mycobacterium cookii Mycobacterium fallax Mycobacterium flavescens Mycobacterium fortuitum Mycobacterium gastri Mycobacterium gordonae Mycobacterium intracellulare Mycobacterium kansasii Mycobacterium komassense Mycobacterium malmoense Mycobacterium marinum Mycobacterium neoaurum Mycobacterium nonchromogenicum Mycobacterium phlei Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium senegalens Mycobacterium simiae Mycobacterium smegmatis Mycobacterium sphagni Mycobacterium szulgai Mycobacterium terrae Mycobacterium thermoresistibile Mycobacterium triviale Mycobacterium xenopi 20/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

21 Mycobacterium tuberculosis Test Gatunki inne niż Mycobacterium Acinetobacter calcoaceticus Histoplasma capsulatum Actinomadura madurae Klebsiella pneumoniae Actinomyces pyogenes Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae Actinoplanes italicus Lactobacillus casei Aeromonas hydrophila Legionella micdadei Arcanobacterium haemolyticum Legionella pneumophila Arthrobacter oxydans Microbacterium lactamicum Bacillus subtilis Neisseria gonorrhoeae Bacteroides fragilis Neisseria lactamica Blastomyces dermatitidis Neisseria meningitidis Bordetella parapertussis Nocardia asteroides Bordetella pertussis Nocardia brasiliensis Branhamella (Moraxella) catarrhalis Nocardia farcinica Brevibacterium linens Nocardia nova Campylobacter jejuni Nocardia otitidiscaviarum Candida albicans Nocardia transvalensis Chromobacterium violaceum Oerskovia turbata Citrobacter freundii Peptococcus niger Clostridium perfringens Peptostreptococcus anaerobius Coccidioides immitis Peptostreptococcus magnus Corynebacterium aquaticum Porphyromonas asaccharolytica Corynebacterium diphtheriae Porphyromonas gingivalis Corynebacterium flavescens Prevotella melaninogenica Corynebacterium glutamicum Propionibacterium acnes Corynebacterium jeikeium Pseudomonas aeruginosa Corynebacterium minutissimum Rhodococcus aichiensis Corynebacterium pseudodiphtheriticum Rhodococcus bronchialis Corynebacterium pseudotuberculosis Rhodococcus chubuensis Corynebacterium renale Rhodococcus equi Corynebacterium striatum Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis Corynebacterium xerosis Serratia marcescens Cryptococcus neoformans Staphylococcus aureus Deinococcus radiodurans Staphylococcus epidermidis Dermatophilus congolensis Streptococcus agalactiae Eikenella corrodens Streptococcus gordonii Enterobacter cloacae Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis Streptococcus pyogenes Enterococcus faecium Streptomyces griseus Escherichia coli Veillonella atypica Fusobacterium nucleatum Veillonella parvula Gordona sputi Vibrio parahaemolyticus Haemophilus influenzae Xanthomonas maltophilia Haemophilus parainfluenzae Yersinia enterocolitica 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 21/30