cobas TaqScreen DPX Test DPX

Transkrypt

1 cobas TaqScreen DPX Test for use on the cobas s 201 system DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. cobas TaqScreen DPX Test DPX 96 Tests P/N: cobas TaqScreen DPX Control Kit DPX CTL 12 Sets P/N: cobas TaqScreen Wash Reagent TS WR 5.1 L P/N: ZASTOSOWANIE Test cobas TaqScreen DPX do stosowania z systemem cobas s 201 jest testem in vitro opartym na amplifikacji kwasu nukleinowego służącym do bezpośredniego ilościowego oznaczania DNA genotypów 1, 2 i 3 parwowirusa B19 (B19V) i bezpośredniego wykrywania jakościowego RNA genotypów I, II i III wirusa zapalenia wątroby typu A (HAV) w ludzkim osoczu. Test cobas TaqScreen DPX jest przeznaczony do użycia jako test wewnątrzprocesowy w celu oznaczania ilościowego wyłącznie DNA parwowirusa B19 lub jednoczesnego oznaczania ilościowego DNA parwowirusa B19 i wykrywania RNA wirusa zapalenia wątroby typu A w osoczu ludzkim przeznaczonym do dalszej obróbki. Można używać osocze z krwi pełnej (odzyskane) lub zebrane przez aferezę (osocze wyjściowe). Można testować próbki od wszystkich dawców lub pul produkcyjnych w formie pojedynczych próbek lub pul złożonych z równych objętości poszczególnych próbek. Ten test nie jest przeznaczony do stosowania z próbkami krwi pępowinowej. Ten test nie jest przeznaczony do stosowania jako narzędzie diagnostyczne. PODSUMOWANIE ORAZ OPIS TESTU W teście cobas TaqScreen DPX zastosowano kilka barwników, co umożliwia jednoczesne wykrywanie docelowych kwasów nukleinowych bez konieczności stosowania testów identyfikacyjnych. Na podstawie zainstalowanego pliku definicji testu (Test Definition File, TDF) test cobas TaqScreen DPX przedstawia wyniki analizy ilościowej B19V i jakościowej HAV lub wyłącznie wynik analizy ilościowej B19V. Ludzki parwowirus B19 (B19V) należący do rodzaju Erythrovirus z rodziny Parvoviridae 1 jest małym wirusem pozbawionym otoczki, zawierającym pojedynczą nić DNA. Wśród ludzkich erytrowirusów wyróżnia się trzy genotypy: genotyp 1 (szczepy B19V), genotyp 2 (szczepy A6) i genotyp 3 (szczepy V9/D91.1) 1. Wirus B19V występuje na całym świecie. Badania serologiczne wykazały, że u co najmniej 50% osób dorosłych występują we krwi przeciwciała IgG przeciwko wirusowi B19V wskazujące na przebyte zakażenie 2, 3. Zakażenie wirusowe wiąże się z objawami klinicznymi, których manifestacja i nasilenie zależą od stanu immunologicznego i hematologicznego pacjenta 4. W przypadku osób immunokompetentnych zakażenie przebiega bezobjawowo lub objawy są łagodne, obejmujące rumień zakaźny (choroba piąta) u dzieci i artropatię u dorosłych. Wirus B19V może jednak powodować również poważne schorzenia, takie jak przejściowa niedokrwistość aplastyczna u osób z zaburzeniami hematologicznymi i obrzęk uogólniony płodu, niedokrwistość wrodzoną oraz obumarcie płodu u ciężarnych 4. Występowanie wirusa B19V w krwi i osoczu dawców może wahać się od 0,003% do 0,6% w zależności od tego, czy pobrano krew w sezonie epidemicznym czy poza nim 5, 6. Wirus B19V przenosi się zwykle drogą kropelkową, możliwe jest jednak przeniesienie go przez produkty osoczopochodne, co jest związane z wielkością pul osocza, częstością występowania ostrych, niewidocznych klinicznie zakażeń wirusem B19V, wysokim poziomem wirusa we krwi zakażonych dawców (do IU/ml) i opornością wirusa B19V na większość standardowych procedur inaktywacji/usuwania, takich jak metoda rozpuszczalnik/detergent (S/D) lub pasteryzacja 7. Istnieją doniesienia o obecności DNA wirusa B19V w pulach osocza i produktach osoczopochodnych 8 10 i liczne doniesienia o przenoszeniu wirusa B19V przez podanie produktów osoczopochodnych, zwłaszcza czynników krzepnięcia 7, Część Informacje dotyczące wersji dokumentu znajduje się na końcu niniejszego dokumentu. 1

2 Wirus zapalenia wątroby typu A (HAV) należący do grupy hepatowirusów z rodziny Picornaviridae 14 jest małym, pozbawionym otoczki wirusem RNA. HAV występuje na całym świecie, jest przenoszony drogą fekalno-oralną, głównie w przypadku bliskiego, osobistego kontaktu. Epidemie występują często w krajach rozwijających się, gdzie zakażenia występują głównie u osób we wczesnym okresie życia, co skutkuje wysokim odsetkiem osób z przeciwciałami przeciwko HAV w populacji 15. Z kolei w krajach uprzemysłowionych spadek zapadalności spowodował, że zakażenia występują głównie u osób dorosłych 16. Zakażenia HAV u ludzi mogą mieć różny przebieg, od bezobjawowych, głównie u małych dzieci, do zapalenia wątroby o gwałtownym przebiegu, i w niektórych przypadkach prowadzą do zgonu. W północnej Europie oraz w Japonii, Kanadzie i USA częstość występowania w ogólnej populacji jest niewielka (ok. 0,01%), a zachorowania występują głównie w grupach podwyższonego ryzyka, na przykład u osób podróżujących do regionów endemicznego występowania wirusa 17. Wyróżniono kilka genotypów HAV (I VI), przy czym u ludzi występują genotypy I, II i III 18,19. Zakaźny HAV może być wykryty we krwi w okresie okienka serologicznego 20, jednak ryzyko przeniesienia HAV jest niewielkie podczas transfuzji. Podobnie jak w przypadku wirusa B19V, trudno jest inaktywować HAV metodą S/D lub przez pasteryzację. Istnieją też doniesienia o przeniesieniu HAV w produktach osoczopochodnych, głównie w czynnikach krzepnięcia Skażenie pul osocza wirusami B19V i HAV można wykryć testami wykorzystującymi kwasy nukleinowe. W związku z tym na początku XXI wieku niektórzy producenci osocza zainicjowali badania z wykorzystaniem kwasów nukleinowych (Nucleic Acid Testing, NAT) do wykrywania DNA wirusa B19V i RNA HAV w osoczu przeznaczonym do dalszej obróbki. Miały one na celu ograniczenie zawartości wirusa B19V w pulach osocza i wyeliminowanie próbek osocza zakażonych HAV. Takie badania są nazywane badaniami wewnątrzprocesowymi. Ze względu na doniesienia o obecności przeciwciał IgG przeciwko wirusowi B19V w pulach osocza i przenoszeniu wirusa B19V przez produkty zawierające > 10 4 IU/ml DNA B19V 7 zaproponowano przyjęcie ograniczenia zawartości DNA B19V w puli osocza do dalszej obróbki do < 10 4 IU/ml jako wymóg prawny amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) i Unii Europejskiej wobec osocza przeznaczonego do produkcji przeciwciał przeciwko antygenowi D i osocza poddanego obróbce mającej na celu inaktywację wirusów 24, 25, 26. Nie określono obecnie wymogów prawnych dotyczących testów na obecność HAV w pulach osocza. Jednak zgodnie z wymogami prawnymi obowiązującymi na obszarze Unii Europejskiej testy NAT HAV pul osocza wykonywane w ramach badań wewnątrzprocesowych powinny umożliwiać wykrywanie kontroli zawierających 100 IU/ml RNA HAV 26. Test cobas TaqScreen DPX jest testem podwójnym, umożliwiającym jednoczesne wykrywanie wirusów B19V i HAV w próbkach ludzkiego osocza od pojedynczych dawców lub w pulach osocza. Stosowanie technologii wielu barwników umożliwia identyfikację każdego z docelowych wirusów bez konieczności stosowania dalszych testów identyfikacyjnych. Ponadto test umożliwia oznaczenie ilościowe (w IU/ml) wirusa B19V z zastosowaniem standardu Quantitation Standard (QS), opartego bezpośrednio na międzynarodowym standardzie WHO dla wirusa B19V 27. Standard QS wraz z kontrolą wewnętrzną (internal control, IC) (dla docelowego HAV) ulega ekstrakcji i amplifikacji jednocześnie z każdą próbką. Test cobas TaqScreen DPX wykorzystuje ogólną technikę przygotowywania kwasów nukleinowych w urządzeniu COBAS AmpliPrep. DNA wirusa B19V i RNA wirusa HAV wraz z QS i IC są amplifikowane i wykrywane w pojedynczej próbówce przy użyciu zautomatyzowanej techniki PCR w czasie rzeczywistym w analizatorze COBAS TaqMan. Identyfikacja docelowych wirusów, QS i IC jest możliwa dzięki zastosowaniu sond wyznakowanych fluorescencyjnie i wykrywanych w osobnych kanałach analizatora COBAS TaqMan. W teście stosowany jest enzym AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) umożliwiający redukcję potencjalnego zanieczyszczenia produktami amplifikacji przeprowadzonej uprzednio (amplikonem). ZASADY PROCEDURY Test cobas TaqScreen DPX do stosowania z systemem cobas s 201 jest oparty na 4 głównych procesach: 1. Zautomatyzowane pulowanie próbek i pipetowanie kontroli przy użyciu urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD (opcjonalnie) 2. Zautomatyzowane przygotowywanie próbek przy użyciu urządzenia COBAS AmpliPrep 3. Zautomatyzowana amplifikacja kwasu nukleinowego oraz zautomatyzowana detekcja w czasie rzeczywistym produktów reakcji PCR przy użyciu analizatora COBAS TaqMan 4. Zautomatyzowane zarządzanie danymi przy użyciu oprogramowania do pulowania i zarządzania danymi (PDM) 2

3 Zautomatyzowane pulowanie próbek i pipetowanie przy użyciu urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Urządzenie pipetujące Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD pozwala na automatyzację pipetowania próbek od pojedynczych dawców, pulowanie próbek uzyskanych od wielu dawców oraz pipetowanie odczynników kontrolnych testu. System cobas s 201 umożliwia rozstrzygnięcie reaktywnych pul osocza do uzyskania wyników dla poszczególnych próbek. System cobas s 201 służy do przetwarzania próbek w partiach. Partię definiuje się jako zbiór próbek i kontroli, które są pipetowane, ekstrahowane, amplifikowane i wykrywane łącznie. Po zakończeniu pipetowania partii w urządzeniu pipetującym Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD cały statyw na próbki jest przenoszony do urządzenia COBAS AmpliPrep w celu przeprowadzenia następnego etapu. Zautomatyzowane przygotowywanie próbek przy użyciu urządzenia COBAS AmpliPrep Cząsteczki kwasów nukleinowych z próbek i dodanej kontroli wewnętrznej (internal control, IC) Armored HAV RNA oraz cząsteczki standardu QS DNA wirusa B19V w osłonce faga lambda (które służą jako kontrola procesów przygotowywania próbek i amplifikacji / detekcji / oznaczenia ilościowego) są przetwarzane jednocześnie. Test cobas TaqScreen DPX zawiera odczynniki do pięciu kolejnych etapów przeprowadzanych w urządzeniu COBAS AmpliPrep. Roztwór proteinazy trawi białka, co ułatwia lizę, pozwala na inaktywację nukleaz i ułatwia uwalnianie RNA i DNA z cząsteczek wirusa. Dodanie odczynnika lizującego do próbki powoduje przez denaturację białek lizę wirusa i inaktywację nukleaz. RNA i DNA są uwalniane i jednocześnie chronione przed nukleazami. Uwolnione kwasy nukleinowe łączą się z silikonową powierzchnią dodanych szklanych cząstek magnetycznych. Jest to spowodowane głównie sumarycznym dodatnim ładunkiem na powierzchni szklanej cząstki i sumarycznym ujemnym ładunkiem kwasów nukleinowych wynikającym ze stężenia soli chaotropowej i siły jonowej odczynnika lizującego. Odczynnik płuczący pozwala na usunięcie niezwiązanych substancji i zanieczyszczeń, takich jak zdenaturowane białka, fragmenty komórek i potencjalne inhibitory reakcji PCR (takie jak hemoglobina itp.), oraz zmniejszenie stężenia soli. Oczyszczone kwasy nukleinowe są odłączane do szklanych cząstek magnetycznych w podwyższonej temperaturze za pomocą buforu do elucji. Zautomatyzowana amplifikacja i detekcja kwasu nukleinowego przy użyciu analizatora COBAS TaqMan Po wyizolowaniu oczyszczonych kwasów nukleinowych z ludzkiego osocza podczas zautomatyzowanego przygotowania próbek, do amplifikacji i detekcji RNA HAV i RNA IC oraz amplifikacji i oznaczenia ilościowego DNA B19V i DNA QS używa się odczynnika cobas TaqScreen DPX Master Mix (MMX). Po zaktywowaniu przez dodanie octanu manganu odczynnik cobas TaqScreen DPX Master Mix umożliwia odwrotną transkrypcję (dla docelowych RNA), a następnie amplifikację PCR wysoce konserwatywnych regionów RNA HAV, RNA IC, DNA wirusa B19V i DNA QS przy użyciu specyficznych starterów. Amplikony są wykrywane przez hybrydyzację ze swoistymi sondami oligonukleotydowymi. Amplifikacja, hybrydyzacja i detekcja zachodzą jednocześnie. Odwrotna transkrypcja oraz amplifikacja PCR Reakcje odwrotnej transkrypcji i amplifikacji przeprowadza się przy użyciu termostabilnego rekombinowanego enzymu, polimerazy DNA Z05. W obecności jonów manganowych (Mn2+) polimeraza DNA Z05 uzyskuje aktywność odwrotnej transkryptazy i polimerazy DNA. Dzięki temu możliwy jest przebieg reakcji odwrotnej transkrypcji i amplifikacji PCR w tej samej mieszaninie reakcyjnej. Podczas amplifikacji PCR wysoka temperatura w kolejnych etapach reakcji umożliwia denaturację amplikonu docelowego i IC/QS do jednoniciowego DNA. Polimeraza DNA Z05 powoduje wydłużenie przyłączonych starterów wzdłuż docelowych matryc celem wytworzenia dwuniciowego DNA (amplikonu). Ten proces powtarza się cyklicznie, a po każdym cyklu podwajana jest ilość amplikonu. Amplifikacja zachodzi jedynie w obszarze docelowego genomu między starterami; całość genomu nie ulega amplifikacji. Zapobieganie zanieczyszczeniu produktami poprzedniej reakcji Zanieczyszczeniu produktami poprzedniej reakcji zapobiega się, stosując enzym AmpErase (uracylo-n-glikozylaza) oraz trójfosforan dezoksyurydyny (dutp). Dezoksyurydyna nie występuje w naturalnym DNA, ale jest zawsze obecna w amplikonie z uwagi na zastosowanie w odczynniku Master Mix mieszaniny trójfosforanu dezoksyurydyny / trójfosforanu tymidyny jako jednego z dntp; dlatego wyłącznie amplikon zawiera dezoksyurydynę. Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje rozkład nici DNA zawierającego dezoksyurydynę 28 przez otwarcie pierścienia dezoksyrybozy w pozycji C1, przez co DNA nie może ulegać amplifikacji. DNA zawierający dezoksytymidynę lub RNA zawierający rybourydynę 29,30 nie jest rozpoznawany przez enzym. Podczas początkowej fazy odwrotnej transkrypcji enzym AmpErase katalizuje cięcie produktów poprzedniej reakcji w miejscu reszt dezoksyurydyny. Enzym AmpErase jest inaktywowany na długo po poddaniu działaniu temperatury powyżej 55 C, dlatego nie niszczy docelowego amplikonu utworzonego w wyniku przeprowadzanej aktualnie reakcji PCR. 3

4 Wykrywanie produktów reakcji PCR 31,32 Odczynnik cobas TaqScreen DPX MMX zawiera sondy wykrywające swoiste dla kwasów nukleinowych HAV, IC, B19V i QS. Każda sonda wykrywająca jest wyznakowana: 1) jednym z czterech barwników fluorescencyjnych, który działa jako barwnik reporterowy, i 2) drugim barwnikiem, który spełnia rolę wygaszacza. Każdej sekwencji docelowej przypisany jest określony barwnik reporterowy, a fluorescencję, której jest źródłem, mierzy się przy określonej długości fali. We wszystkich sondach używa się barwnika wygaszacza tego samego typu. W tym systemie można wykrywać wszystkie amplifikowane kwasy nukleinowe przy różnych długościach fal. Zanim rozpocznie się amplifikacja PCR, sondy są nienaruszone, a fluorescencja reportera jest wytłumiona bliskością wygaszacza, na zasadzie efektu przenoszenia energii Förstera. Podczas amplifikacji PCR sondy hybrydyzują z docelowymi jednoniciowymi sekwencjami DNA i są rozszczepiane przez 5'- i 3'-nukleazową aktywność polimerazy DNA Z05 w tym samym czasie, kiedy zachodzi amplifikacja. Kiedy barwnik reporterowy i wygaszacz zostaną rozdzielone przez to rozszczepienie, ujawnia się aktywność fluorescencyjna barwnika reporterowego. Z każdym cyklem PCR generowana jest zwiększająca się liczba rozszczepionych sond i jednocześnie wzrasta sumaryczny sygnał barwnika reporterowego. Detekcji produktów PCR w czasie rzeczywistym towarzyszy niezależny pomiar fluorescencji poszczególnych uwolnionych barwników reporterowych, reprezentujących docelowe wirusy, IC i QS. Zautomatyzowane zarządzanie danymi przy użyciu programu PDM Oprogramowanie Roche PDM pozwala użytkownikowi przeglądać i raportować wyniki. Oprogramowanie Roche PDM interpretuje wyniki testu cobas TaqScreen DPX jako niereaktywne, reaktywne lub nieważne dla docelowego HAV bądź < wartości odcięcia, wartości odcięcia lub nieważne dla docelowego wirusa B19V. Oprogramowanie Roche PDM pozwala użytkownikowi nie tylko odbierać i analizować wyniki PCR, ale także drukować raporty, odszukiwać wyniki, akceptować wyniki dawców i (opcjonalnie) przesyłać dane do LIS. MATERIAŁY DOSTARCZONE PRZEZ ROCHE Do wykrywania RNA HAV oraz oznaczania ilościowego DNA wirusa B19V w próbkach osocza są wymagane i dostarczane trzy zestawy: 1) cobas TaqScreen DPX Test, 2) zestaw kontrolny cobas TaqScreen DPX Control Kit i 3) cobas TaqScreen Wash Reagent. Karty charakterystyki (ang. Safety Data Sheet, SDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. cobas TaqScreen DPX Test (P/N: ) DPX 96 testów DPX CS1 (kaseta zawierająca szklane cząstki magnetyczne do oznaczeń DPX) DPX CS2 (kaseta z odczynnikiem lizującym do oznaczeń DPX) DPX CS3 (kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń DPX) DPX CS4 (kaseta z odczynnikami swoistymi dla testu do oznaczeń DPX) cobas TaqScreen DPX Control Kit Zestaw kontrolny cobas TaqScreen DPX (P/N: ) DPX CTL 12 zestawów DPX D(+)C (kontrola podwójna: dodatnia HAV i nisko dodatnia wirusa B19V) DPX H(+)C (kontrola wirusa B19V wysoko dodatnia) DPX ( ) C (kontrola ujemna cobas TaqScreen DPX) 4

5 cobas TaqScreen Wash Reagent Odczynnik płuczący cobas TaqScreen (P/N: ) TS WR (odczynnik płuczący cobas TaqScreen) TS WR 5,1 l INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ SPRZEDAWANE OSOBNO (DO NABYCIA W FIRMIE ROCHE) Ten test jest przeznaczony do użytku z systemem cobas s 201. System cobas s 201 musi być zainstalowany i używany przy pełnej konfiguracji systemu. Pojedynczych elementów systemu cobas s 201 nie można używać jako samodzielnych urządzeń, nie można też zastępować innych elementów. System cobas s 201 wykorzystuje elementy wymienione poniżej. Przyrządy i oprogramowanie dla systemu cobas s 201 Urządzenie pipetujące Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD (opcjonalnie), stacja robocza i oprogramowanie Pooling Manager Urządzenie COBAS AmpliPrep Analizator COBAS TaqMan Stacja danych z oprogramowaniem AMPLILINK Serwer Roche PDM Data Manager, stacja robocza i oprogramowanie Data Manager Plik definicji testu DPX dla testu cobas TaqScreen DPX Plik definicji testu do parwowirusa B19 (B19V) dla testu cobas TaqScreen DPX Podręcznik użytkownika systemu cobas s 201 w konfiguracji D Statywy i materiały jednorazowe Statywy na próbki COBAS AmpliPrep (SK24) (P/N: ) Statywy na jednostki SPU COBAS AmpliPrep (P/N: ) Statywy na odczynniki COBAS AmpliPrep (P/N: ) Jednostki przetwarzania próbki (SPU): (P/N: ) Probówki wejściowe na próbki (probówki S) z klipsami z kodem kreskowym (P/N: ) Statywy z końcówkami K (P/N: ) Opakowanie zawierające probówki K, 12 x 96 (P/N: ) Nośnik K COBAS TaqMan (P/N: ) Końcówki CO-RE o dużej pojemności (1000 µl) z filtrem (P/N: ) Płytki głębokodołkowe, oznaczone etykietami z kodami kreskowymi (P/N: ) Maty zamykające płytki głębokodołkowe (P/N: ) Nośnik na próbki na 24 probówki testowe (P/N: ) Nośnik na próbki na 32 probówki testowe (P/N: ) Nośnik do końcówek (P/N: ) Nośnik do płytek głębokodołkowych (P/N: ) Nośnik na statywy SK24 (P/N: ) Zestaw aerozolu dezynfekującego Hamilton (P/N: ) Zestaw detergentu Hamilton MICROLAB (P/N: ) Rękawice jednorazowe bezpudrowe 5

6 ODCZYNNIKI cobas TaqScreen DPX Test (P/N: ) DPX CS1 MGP (szklane cząstki magnetyczne) Szklane cząstki magnetyczne 93% izopropanolu DPX CS2 LYS (odczynnik lizujący) Cytrynian sodu dwuwodny 42,5% tiocyjanianu guanidyny < 14% polidokanolu 0,9% ditiotreitolu DPX CS3 Pase (roztwór proteinazy) Bufor TRIS < 0,05% EDTA Chlorek wapnia Octan wapnia 7,8% proteinazy Glicerol EB (bufor do elucji) Bufor TRIS 0,2% metylparabenu środek konserwujący DPX CS4 DPX MMX-R1 (odczynnik 1 DPX Master Mix) Octan potasu Octan manganu Glicerol 14,4% dimetylosulfotlenku 0,08% azydku sodu Kwas octowy DPX 96 testów 2 x 48 testów 2 x 7,0 ml 2 x 48 testów 2 x 78 ml 2 x 48 testów 2 x 3,8 ml 2 x 7,0 ml 2 x 48 testów 2 x 3,0 ml DPX MMX-R2 (odczynnik 2 DPX Master Mix) Bufor Tricine Octan potasu Wodorotlenek potasu 4,1% dimetylosulfotlenku Glicerol Tween 20 < 0,09% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,01% preparatu starterów sensownych i antysensownych wirusów B19V i HAV < 0,01% roztworu znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym sond wirusów B19V i HAV < 0,01% roztworu znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym sond QS wirusa B19V i IC wirusa HAV < 0,01% aptameru oligonukleotydowego < 0,01% polimerazy DNA Z05 (bakteryjnej) < 0,01% enzymu AmpErase [uracylo-n-glikozylaza] (bakteryjnego) 0,08% azydku sodu 2 x 2,5 ml 6

7 DPX IC/QS (standard ilościowy i kontrola wewnętrzna DPX) Bufor TRIS 0,002% poli-ra RNA (syntetycznego) EDTA 0,05% azydku sodu < 0,001% niezakaźnego syntetycznego RNA IC opłaszczonego białkiem kapsydowym bakteriofaga MS2 < 0,001% niezakaźnego syntetycznego DNA QS B19V opłaszczonego białkiem kapsydowym bakteriofaga Lambda 2 x 13 ml cobas TaqScreen DPX Control Kit Zestaw kontrolny cobas TaqScreen DPX (P/N: ) DPX CTL 12 zestawów DPX D(+)C 12 x 1,6 ml (podwójna kontrola dodatnia DPX) < 0,001% niezakaźnego syntetycznego RNA HAV opłaszczonego białkiem kapsydowym bakteriofaga MS2 < 0,001% niezakaźnego syntetycznego DNA wirusa B19V opłaszczonego białkiem kapsydowym bakteriofaga Lambda Osocze ludzkie ujemne, niereaktywne w testach licencjonowanych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) w zakresie przeciwciał IgG i IgM Ab przeciwko wirusowi B19V, HBsAg, antygenowi rdzeniowemu HBV Ab, HCV Ab i HIV-1/2 Ab oraz RNA HIV-1. Niereaktywne dla RNA HAV metodami NAT i dla DNA wirusa B19V 5 IU/ml metodą PCR. 0,1% substancji konserwującej ProClin 300 DPX H(+)C 12 x 1,6 ml (kontrola silnie dodatnia DPX) < 0,001% niezakaźnego syntetycznego DNA wirusa B19V opłaszczonego białkiem kapsydowym bakteriofaga Lambda Osocze ludzkie ujemne, niereaktywne w testach licencjonowanych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (Food and Drug Administration, FDA) w zakresie przeciwciał IgG i IgM Ab przeciwko wirusowi B19V, HBsAg, antygenowi rdzeniowemu HBV Ab, HCV Ab i HIV-1/2 Ab oraz RNA HIV-1. Niereaktywne dla RNA HAV metodami NAT i dla DNA wirusa B19V 5 IU/ml metodą PCR. 0,1% substancji konserwującej ProClin 300 DPX ( ) C (kontrola ujemna cobas TaqScreen DPX) Bufor fosforanu sodu EDTA 0,002% poli-ra RNA (syntetycznego) Barwnik amarantowy 0,1% substancji konserwującej ProClin 300 cobas TaqScreen Wash Reagent Odczynnik płuczący cobas TaqScreen (P/N: ) TS WR (odczynnik płuczący cobas TaqScreen) Cytrynian sodu dwuwodny 0,1% metylparabenu środek konserwujący TS WR 12 x 1,6 ml 5,1 l WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA A. Przez temperaturę pokojową rozumie się temperaturę od 15 C do 30 C. B. Nie zamrażać odczynników ani kontroli. 7

8 C. Odczynniki DPX CS1, DPX CS2, DPX CS3 i DPX CS4 należy przechowywać w temperaturze od 2 C do 8 C. Nieużywane odczynniki są stabilne aż do upływu podanej daty ważności. D. Po pierwszym użyciu odczynniki zachowują stabilność przez 30 dni w temperaturze od 2 C do 8 C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej. E. Odczynników można używać w nie więcej niż 6 cyklach pracy urządzenia i w sumie przez maksymalnie 48 godzin pracy urządzenia COBAS AmpliPrep. Między kolejnymi cyklami pracy odczynniki należy przechowywać w temperaturze od 2 C do 8 C. Oprogramowanie AMPLILINK monitoruje łączną liczbę godzin pracy kaset z odczynnikami w urządzeniu COBAS AmpliPrep i uniemożliwia wykorzystanie kaset po osiągnięciu w sumie 48 godzin. F. Oprogramowanie AMPLILINK nie monitoruje liczby cykli pracy urządzenia ze stosowanymi kasetami. Za usunięcie kaset z odczynnikami po wykonaniu 6 cykli pracy urządzenia odpowiedzialny jest użytkownik. G. Odczynniki DPX D(+)C, DPX H(+)C i DPX ( ) C należy przechowywać w temperaturze od 2 C do 8 C. Kontrole są stabilne aż do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu opakowania niewykorzystane do badania odczynniki należy wyrzucić. H. Odczynnik TS WR należy przechowywać w temperaturze od 15 C do 30 C. Nieotwarty odczynnik TS WR pozostaje stabilny aż do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu odczynnik zachowuje stabilność przez 30 dni w temperaturze od 15 C do 30 C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO. A. Próbki mogą być zakaźne. Podczas wykonywania badania należy przestrzegać ogólnych środków ostrożności 33,34. Procedurę tę powinien wykonywać tylko personel biegły w używaniu testu cobas TaqScreen DPX i przeszkolony w postępowaniu z materiałem zakaźnym. Należy dokładnie oczyścić i odkazić wszystkie laboratoryjne powierzchnie robocze świeżo przygotowanym roztworem podchlorynu sodu 0,5% w wodzie dejonizowanej lub destylowanej (10-procentowy roztwór wybielacza rozcieńczony wodą). Następnie należy przetrzeć powierzchnię etanolem 70%. B. UWAGA: Odczynniki DPX D(+)C i DPX H(+)C zawierają ludzkie osocze otrzymane z krwi ludzkiej. Testy wykazały, że zastosowane osocze jest niereaktywne w zakresie przeciwciał IgG i IgM przeciwko wirusowi B19V, HBsAg, antygenowi rdzeniowemu HBV Ab, HCV Ab, HIV-1/2 Ab oraz niereaktywne względem RNA HIV-1 w badaniach metodami NAT. Osocze przebadano również z zastosowaniem testu cobas TaqScreen DPX i wykazano, że jest niereaktywne w kierunku RNA HAV i zawiera 5 IU/ml DNA wirusa B19V. Żadna ze znanych metod badania nie może zaoferować całkowitej pewności, że produkty otrzymane z ludzkiej krwi nie będą przenosić czynników zakaźnych. Wszystkie materiały pochodzące z krwi ludzkiej należy uważać za potencjalnie zakaźne i postępować z nimi z zastosowaniem ogólnych środków ostrożności. W przypadku wylania materiału należy natychmiast zdezynfekować świeżo przygotowanym roztworem podchlorynu sodu 0,5% (rozcieńczony wybielacz) lub postępować zgodnie z procedurami przyjętymi w danej instytucji. C. Należy stosować rutynowe laboratoryjne środki ostrożności. Nie należy pipetować za pomocą ust. Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych. Podczas pracy z próbkami i odczynnikami zestawu należy stosować ochronne rękawice jednorazowe, fartuchy laboratoryjne oraz osłonę oczu. Po zakończeniu pracy z próbkami i odczynnikami testowymi należy dokładnie umyć ręce. D. Odczynniki DPX MMX-R1, DPX MMX-R2 i DPX IC/QS zawierają jako środek konserwujący azydek sodu. Jeśli roztwory zawierające azydki są usuwane do kanalizacji, należy je rozcieńczyć i spłukać dużą ilością bieżącej wody. Te środki ostrożności są zalecane w celu uniknięcia odkładania się złogów w metalowych rurach, co może spowodować zagrożenie wybuchem. E. Wykazano, że heparyna hamuje reakcję PCR. Do tej procedury nie należy stosować osocza heparynizowanego. F. Zaleca się używanie jałowych jednorazowych pipet oraz końcówek pipet wolnych od nukleazy. Jeżeli w trakcie obsługi i przetwarzania próbek nie jest możliwa odpowiednia kontrola kontaminacji między próbkami, może dojść do wystąpienia wyników fałszywie dodatnich. G. Aby uzyskać optymalną skuteczność testu, należy stosować tylko dostarczone lub wymienione potrzebne materiały jednorazowego użytku. 8

9 H. Aby uniknąć krzyżowego zanieczyszczenia próbek lub kontroli, z wszystkimi materiałami zawierającymi próbki lub kontrole należy postępować zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej. I. Przed użyciem należy ocenić wzrokowo każdą kasetę z odczynnikami, probówkę z kontrolą i odczynnik płuczący, aby się upewnić, że nie ma choćby najmniejszego wycieku. W razie wystąpienia wycieku nie wolno używać tego materiału do badania. J. Należy usuwać wszystkie materiały, które przypadkowo weszły w kontakt z próbkami i odczynnikami, zgodnie z przepisami krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi. K. Nie należy używać zestawu testowego cobas TaqScreen DPX, zestawu kontrolnego cobas TaqScreen DPX ani odczynnika płuczącego cobas TaqScreen po upływie daty ważności. Nie wolno zamieniać, mieszać ani łączyć odczynników z różnych zestawów ani z różnych serii. Nie należy umieszczać jednocześnie różnych serii odczynników w urządzeniu COBAS AmpliPrep. L. Karty charakterystyki (ang. Safety Data Sheet, SDS) są dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche. M. Należy unikać kontaktu odczynników ze skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, należy natychmiast spłukać dużą ilością wody; w przeciwnym razie mogą powstać oparzenia. Jeżeli dojdzie do rozlania wymienionych odczynników, przed wytarciem należy rozcieńczyć je wodą. N. Nie wolno dopuścić do kontaktu odczynnika LYS zawierającego tiocyjanian guanidyny z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Połączenie to może skutkować wytworzeniem silnie trującego gazu. O. Należy ściśle przestrzegać podanych procedur i wytycznych w celu zapewnienia prawidłowego wykonania testu. Wszelkie odchylenia od procedur i wytycznych mogą mieć wpływ na optymalną skuteczność testu. P. Należy unikać użycia nadmiernie zhemolizowanych próbek. Q. Zanieczyszczenie próbek osocza krwinkami czerwonymi (> 5%) może spowodować zahamowanie reakcji prowadzonych w teście cobas TaqScreen DPX. R. W żadnej fazie testu nie należy używać składników z uszkodzonymi etykietami z kodem kreskowym. PRZYGOTOWANIE KONTROLI I ODCZYNNIKÓW A. Wyjąć odczynniki z zestawów cobas TaqScreen DPX Control Kit i cobas TaqScreen DPX Test z lodówki co najmniej 30 minut przed użyciem. POBIERANIE, PRZECHOWYWANIE I PULOWANIE PRÓBEK Uwaga: Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się jak z czynnikami zakaźnymi. Próbki A. Z testem cobas TaqScreen DPX można używać próbek osocza pobranych do próbówek z antykoagulantem EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A i 4-procentowym roztworem cytrynianu sodu. Należy postępować zgodnie z instrukcjami obchodzenia się z próbkami i ich odwirowywania umieszczonymi przez producenta na próbówce/worku do pobierania próbek. Podwyższona temperatura ma wpływ na stabilność próbek. B. Krew pobrana do próbówek z antykoagulantami EDTA, CPD, CPDA-1, CP2D, ACD-A i 4-procentowym roztworem cytrynianu sodu może być przechowywana w następujących warunkach: Próbki można przechowywać przez maksymalnie 72 godziny w temperaturze 2 30 C i maksymalnie przez 48 godzin w temperaturze 2 8 C. Próbki osocza po oddzieleniu komórek można przechowywać w temperaturze 2 8 C do 9 dni. 9

10 Rysunek 1 30 Stabilność preparatu krwi pełnej Temperatura ( C) Krew pełna (2 C 30 C) Krew pełna (2 C 8 C) Osocze (2 C 8 C) Liczba dni C. Krew pobraną do probówek Vacutainer PPT firmy Becton Dickinson można przed oddzieleniem osocza przechowywać do 72 godzin w temperaturze 2 30 C. Osocze oddzielone za pomocą żelu w próbówkach PPT można przechowywać w temperaturze 2 8 C przez dodatkowe jedenaście dni 37. D. Osocze oddzielone od komórek może być przechowywane w poniższych warunkach: Osocze można przechowywać przez maksymalnie 10 dni w temperaturze 2 30 C i przez maksymalnie 46 dni w temperaturze 2 8 C. Osocze można przechowywać przez maksymalnie 12 miesięcy w temperaturze < 18 C i przez maksymalnie 15 dni w temperaturze 2 8 C. Nie obserwowano ujemnego wpływu na skuteczność testu, gdy próbki osocza poddawano 3 cyklom zamrażania i rozmrażania. E. Następujące wskazówki dotyczące objętości osocza oparte są na pipetowaniu ze szklanych lub plastikowych probówek 13 x 100 mm zawierających materiał od dawców w urządzeniu pipetującym Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Wymienione objętości dotyczą osocza powyżej upakowanych czerwonych krwinek i są używane podczas pracy z testem cobas TaqScreen DPX. Tabela 1 Informacje o objętościach przy stosowaniu urządzenia do pipetowania Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Typ puli Minimalna objętość osocza Pula główna* 3 ml Pula powtórzona 1,5 ml Pula do rozdziału 2 ml * Uwzględnia tworzenie płytki głębokodołkowej (płytka archiwizacyjna) F. Nie zamrażać krwi pełnej 37. G. Osocze w zakrytych płytkach z głębokimi dołkami można przechowywać w temperaturze 2 30 C do 3 dni, w temperaturze < 18 C do 150 dni i w temperaturze 2 8 C do 30 dni. H. Próbki należy wyjąć z lodówki co najmniej 30 minut przed użyciem. I. Inne warunki pobierania i przechowywania musi zweryfikować użytkownik. Jeśli próbki mają być przesyłane, należy je opakować i oznakować zgodnie z odpowiednimi federalnymi i międzynarodowymi przepisami dotyczącymi transportu próbek i czynników etiologicznych

11 PULOWANIE I PIPETOWANIE PRÓBEK A. System cobas s 201 wykorzystuje wszystkie możliwości pipetowania i pulowania urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Za pomocą urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD przeprowadza się skanowanie kodów kreskowych i pulowanie próbek celem wytworzenia puli. B. System cobas s 201 może być zainstalowany bez urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD, wymagając ręcznego wprowadzania identyfikatorów kodów kreskowych. Instrukcje można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas s 201. C. Jeśli w teście cobas TaqScreen DPX pule wykażą reaktywność wobec HAV lub będą mieć wynik wartości odcięcia dla wirusa B19V, urządzenie pipetujące Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD zostanie użyte do pipetowania pojedynczych próbek z płytki głębokodołkowej lub z oryginalnych probówek z próbkami do dalszych testów. UWAGI PROCEDURALNE A. Wyposażenie 1. Należy przygotować system cobas s 201 do użytku zgodnie z instrukcjami w Podręczniku użytkownika systemu cobas s Aby zapewnić prawidłowe działanie urządzenia, należy wykonywać zalecane czynności konserwacyjne. B. Odczynniki 1. Wyjąć odczynniki z zestawów cobas TaqScreen DPX Control Kit i cobas TaqScreen DPX Test z lodówki co najmniej 30 minut przed użyciem. Odczynnik płuczący cobas TaqScreen Wash Reagent musi przed użyciem uzyskać temperaturę pokojową. Informacje na temat warunków przechowywania można znaleźć w rozdziale Wymagania dotyczące przechowywania i użytkowania. 2. Każdy zestaw cobas TaqScreen DPX Test zawiera ilość materiału wystarczającą do wykonania łącznie 96 testów, które zaleca się przeprowadzać w partiach składających się z maksymalnie 24 testów na statyw SK24. Z każdą partią testową lub każdym statywem SK24 należy przetworzyć po jednym powtórzeniu kontroli ujemnej i dodatniej. W teście cobas TaqScreen DPX próbki i kontrole są poddawane tym samym procesom. 3. Wszystkie odczynniki kontrolne służą do jednorazowego użytku. 4. System pozwoli zapobiec użyciu odczynników z różnych serii, odczynników, w przypadku których została przekroczona dozwolona liczba godzin w urządzeniu, odczynników, których data ważności upłynęła, lub pomieszanych kaset z zestawu czterech kaset poprzednio używanych w systemie. Nie należy umieszczać jednocześnie różnych serii odczynników w urządzeniu COBAS AmpliPrep. C. Przetwarzanie próbek 1. Podczas pracy z próbkami i odczynnikami kontrolnymi należy unikać skażenia rękawiczek. 2. Należy uważać, aby nie doszło do skażenia próbek i kontroli ujemnych dodatnimi odczynnikami kontrolnymi. 11

12 INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA W systemie cobas s 201 przeprowadza się cztery główne procesy: pipetowanie próbek i kontroli w urządzeniu pipetującym Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD, przygotowywanie próbek w urządzeniu COBAS AmpliPrep z użyciem zestawu cobas TaqScreen DPX Test, amplifikację/ detekcję w analizatorze COBAS TaqMan i zarządzanie danymi. Każdy zestaw cobas TaqScreen DPX Test zawiera osiem kaset: dwie kasety DPX CS1 ze szklanymi cząstkami magnetycznymi, dwie kasety DPX CS2 z odczynnikiem lizującym, dwie kasety DPX CS3 z proteazą i buforem do elucji oraz dwie kasety DPX CS4 z kontrolą wewnętrzną oraz odczynnikiem 1 i 2 MMX. Ten zestaw jest używany łącznie z zestawem cobas TaqScreen DPX Control Kit i odczynnikiem płuczącym cobas TaqScreen Wash Reagent. Uwaga: Nie należy otwierać kaset. Uwaga: Nie należy łączyć odczynników z różnych serii ani z różnych butelek z tej samej serii. Uwaga: Nie należy umieszczać jednocześnie kaset z różnych serii w urządzeniu COBAS AmpliPrep. Uwaga: Nie oddzielać probówek kontrolnych od adapterów (plastikowy uchwyt probówek kontrolnych). Uwaga: Oprogramowanie PDM kontroluje badane partie i wymusza przeprowadzenie przebiegu partii na pojedynczym urządzeniu COBAS AmpliPrep i analizatorze COBAS TaqMan podłączonym do tej samej stacji roboczej AMPLILINK. Uwaga: Nie dzielić partii pomiędzy różne urządzenia COBAS AmpliPrep i analizatory COBAS TaqMan. Należy wykonywać wszystkie wymagane czynności zgodnie z opisem podanym w Podręczniku użytkownika systemu cobas s 201. Dokładne instrukcje dotyczące użytkowania można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas s 201. A. Pipetowanie próbek i kontroli przy użyciu urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD Uwaga: Podczas przygotowywania próbek i kontroli należy unikać skażenia rękawic. Uwaga: Wymieszać kontrole w sposób opisany poniżej, odwracając je trzykrotnie i unikając powstania pęcherzyków powietrza. Każdorazowe odwrócenie określa się jako odwrócenie kontroli w pionie o 180, a następnie powrót do pozycji wyjściowej. Podczas odwracania kontroli należy ją utrzymywać przez co najmniej 2 sekundy w każdym ustawieniu (tzn. po odwróceniu w pionie o 180 należy pozostawić kontrolę w tej pozycji przez co najmniej 2 sekundy. Następnie należy ponownie odwrócić kontrolę o 180 w pionie i również pozostawić ją w tej pozycji przez co najmniej 2 sekundy). Uwaga: Wirusy docelowe w kontrolach, próbkach pojedynczych i w pulach są stabilne na systemie (do 30 C) przynajmniej przez 18 godzin przed umieszczeniem w urządzeniu COBAS AmpliPrep. 1. Należy wykonać procedury startowe w urządzeniu pipetującym Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD, a następnie uruchomić zgodnie z instrukcjami na ekranie program Roche PDM Pooling Wizard. 2. Należy uważać, aby nie uszkodzić identyfikacyjnego kodu kreskowego na probówkach na próbki i adapterach probówek z kontrolami. W razie uszkodzenia system nie będzie mógł rozpoznać próbek ani kontroli. 3. Należy odkręcić probówki kontrolne i włożyć próbki, materiały eksploatacyjne i odczynniki kontrolne do urządzenia pipetującego Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD. Po włożeniu próbek, materiałów eksploatacyjnych i odczynników kontrolnych urządzenie przenosi odczynniki kontrolne i próbki do probówek S. 12

13 4. Po zakończeniu pipetowania należy przejrzeć alarmy i wydrukować raport (raporty) pulowania. Należy sprawdzić pule i dołki płytki głębokodołkowej. Należy unieważnić pule i/lub dołki w razie zaobserwowania zabrudzenia czerwonymi krwinkami lub w przypadku różnych objętości. 5. Zamknij ponownie zatyczkami probówki S i przenieś statyw (statywy) SK24 do urządzenia COBAS AmpliPrep w celu wykonania ekstrakcji kwasów nukleinowych. 6. Należy zakryć i przechować płytki głębokodołkowe (jeśli płytki zostały utworzone podczas pipetowania). 7. Należy usunąć i przechować probówki od dawców. Warunki przechowywania zostały opisane w rozdziale Pobieranie, przechowywanie i pulowanie próbek. 8. Należy usunąć i wyrzucić probówki z odczynnikami kontrolnymi. (Probówki z kontrolami służą wyłącznie do jednorazowego użytku). 9. Wszystkie zlecenia testu są tworzone automatycznie i przekazywane do wszystkich stacji danych AMPLILINK w sieci. B. Przygotowywanie i wkładanie odczynników do testu cobas TaqScreen DPX Uwaga: Należy uważać, aby nie uszkodzić etykiet kaset. Czytnik kodów kreskowych w urządzeniu COBAS AmpliPrep służy do automatycznego odczytywania kodu kreskowego na etykiecie każdej z kaset, gdy statywy z odczynnikami są wkładane do urządzenia. 1. Należy wyjąć odczynniki testowe cobas TaqScreen DPX z lodówki co najmniej 30 minut przed ich użyciem. Nie jest wymagane żadne inne przygotowywanie odczynników. 2. Przed rozpoczęciem należy włożyć odpowiednią liczbę kaset, aby dostosować ich liczbę do całkowitej liczby próbek, które będą przetwarzane podczas ciągłej pracy urządzenia COBAS AmpliPrep. Każda kaseta zawiera ilość odczynników wystarczającą do przeprowadzenia 48 testów. Informacje na temat wkładania odczynników do pracy ciągłej można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas s Należy umieścić kasetę DPX CS1 w statywie na odczynniki; należy się upewnić, że kod kreskowy kasety znajduje się w jednej linii z kodem kreskowym statywu, umieszczonym po prawej stronie statywu. Kasety DPX CS1 należy włożyć razem w osobnym statywie na odczynniki, oddzielnie od innych kaset. 4. Należy umieścić statyw z odczynnikami zawierający kasety DPX CS1 w pozycji A, wsuwając go aż do kołka blokującego w urządzeniu COBAS AmpliPrep, następnie zaczekać, aż dioda statywu na odczynniki stanie się zielona, i dopiero wtedy wsunąć statyw we właściwe miejsce w tylnej części urządzenia. Nie należy umieszczać jednocześnie różnych serii odczynników w urządzeniu. 5. Należy umieścić po jednym zestawie kaset DPX CS2, DPX CS3 i DPX CS4 na każdą kasetę DPX CS1 w statywie (statywach) na odczynniki; należy się upewnić, że kody kreskowe kasety znajdują się w jednej linii z kodem kreskowym statywu umieszczonym po prawej stronie statywu. 6. Należy umieścić statyw (statywy) na odczynniki w pozycjach B, C, D lub E, wsuwając je aż do kołka w urządzeniu COBAS AmpliPrep, następnie zaczekać, aż dioda statywu na odczynniki stanie się zielona, i dopiero wtedy wsunąć statyw we właściwe miejsce w tylnej części urządzenia. 7. Diody na pasku stanu urządzenia COBAS AmpliPrep staną się zielone, gdy wszystkie wymagane składniki zestawu zostaną włożone i rozpoznane przez system. C. Ekstrakcja kwasów nukleinowych z pipetowanych próbek i kontroli Uwaga: Przedstawione poniżej czynności należy wykonać na czystej powierzchni stołu. 1. Należy usunąć opakowanie z pakietu jednostek przetwarzania próbek (SPU), pozostawiając nietkniętą taśmę i plastikową pokrywę. 2. Mając uchwyt statywu na SPU skierowany do użytkownika, należy włożyć pakiet jednostek SPU z prawej strony statywu na SPU. 13

14 3. Należy usunąć taśmę i plastikową pokrywę z jednostek SPU znajdujących się w statywie. Należy się upewnić, że wszystkie jednostki SPU są wciśnięte, wyrównane i dokładnie umieszczone w statywie. Uniesione jednostki SPU mogą spowodować uszkodzenie urządzenia. Nie należy naciskać na końcówkę S w SPU. 4. Należy umieścić statywy z SPU w urządzeniu COBAS AmpliPrep statywy na SPU w pozycjach J, K lub L w taki sposób, aby były do końca wsunięte i rozpoznane. Jednocześnie w urządzeniu może znajdować się do 72 jednostek SPU. Należy włożyć wymaganą do testu liczbę jednostek SPU lub w razie potrzeby większą. 5. Należy usunąć opakowanie celofanowe z zapakowanych przez producenta statywów z probówkami K i końcówkami K, uważając przy tym, aby nie przewrócić statywów. Należy się upewnić, że wszystkie są prawidłowo osadzone. 6. Należy umieścić jak najmniejszą wymaganą liczbę statywów z probówkami K i końcówkami K w pozycjach M, N, O lub P urządzenia COBAS AmpliPrep. 7. Statywy SK24 zawierające próbki i kontrole napipetowane w urządzeniu pipetującym Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD należy umieścić w urządzeniu COBAS AmpliPrep w pozycjach F, G lub H. Należy wsunąć statyw aż do zablokowania. Należy sprawdzić status zakładki Sample, aby się upewnić, że wszystkie próbki w każdym statywie zostały rozpoznane. 8. Należy sprawdzić w oprogramowaniu AMPLILINK, czy do wymaganego przygotowania próbek włożone są odpowiednie ilości odczynników i materiałów eksploatacyjnych. 9. Należy nacisnąć przycisk Start w oprogramowaniu AMPLILINK, aby rozpocząć procedurę przygotowania próbek przez urządzenie COBAS AmpliPrep. 10. Wszystkie nieużywane końcówki K i probówki K będą śledzone w urządzeniu COBAS AmpliPrep i będą używane w następnym przebiegu, jeśli nie zostaną rozładowane. D. Amplifikacja i detekcja 1. Przy stosowaniu bez stacji dokującej należy przenieść statyw SK24 zawierający przetworzone próbki i odczynnik Master Mix do analizatora COBAS TaqMan, aby rozpocząć amplifikację i detekcję automatycznie. Oprogramowanie AMPLILINK kontroluje, czy do każdej przetwarzanej próbki dodano odczynnik Master Mix i oznaczy próbkę jako nieważną, jeśli amplifikacja nie rozpocznie się po odstępie czasu określonym w pliku definicji testów (Test Definition File) (120 minut). Dla ułatwienia przebiegu pracy przenieś ramkę SK24 do analizatora COBAS TaqMan w ciągu 1 godziny od zakończenia przygotowania próbek na tej ramce. 2. Po zakończeniu amplifikacji i detekcji w analizatorze COBAS TaqMan analizowane próbki są automatycznie usuwane do pojemnika na odpady. 3. Wyniki są automatycznie akceptowane i przesyłane do oprogramowania PDM. E. Przeglądanie i drukowanie wyników 1. Należy uruchomić stację roboczą Roche PDM. 2. Należy odszukać nieprzeglądane partie w zakładce Review Batches w stacji roboczej Data Manager. 3. Należy przejrzeć alarmy, podświetlając partię, a następnie klikając przycisk Next. 4. Należy przejrzeć wyniki dla kontroli w zakładce Controls Review. Kryteria ważności kontroli można znaleźć w rozdziale Kontrola jakości. 5. Należy przejrzeć wyniki puli w zakładce Alarms Review dla wybranej partii. W razie konieczności użytkownik może ręcznie unieważnić pule niereaktywne dla HAV i z wynikiem < wartości odcięcia dla wirusa B19V. Próbki od dawców z nieważnych pul należy przebadać ponownie. 6. Należy przejrzeć i zwolnić wyniki dawców w zakładce Donor Review dla wybranej partii. 7. Należy wydrukować raporty i w razie potrzeby przesłać je do laboratoryjnego systemu informatycznego (LIS). 14

15 KONTROLA JAKOŚCI 1. W każdej partii należy uwzględnić jedną kontrolę ujemną (DPX ( ) C) i po jednej z dwóch kontroli dodatnich (DPX D(+)C i DPX H(+)C). 2. Status partii. Status partii jest opisany jako Complete, Valid, gdy kontrole partii są ważne. Jeśli którakolwiek z kontroli w partii jest nieważna, cała partia jest nieważna. Unieważnienie wyników na podstawie błędów kontroli jest przeprowadzane automatycznie przez oprogramowanie PDM. a. Kontrola ujemna Ważność kontroli ujemnej jest weryfikowana zgodnie z przeprowadzanym testem. Test DPX (HAV i B19V). Aby kontrola ujemna (DPX ( ) C) była ważna, interpretowany wynik musi być niereaktywny zarówno dla HAV, jak i dla wirusa B19V, a kontrola IC i standard QS muszą być ważne. Jeśli interpretowany wynik dla kontroli ujemnej jest nieważny, cała partia jest nieważna i należy ją powtórzyć. Test tylko na wirusa B19V. Aby kontrola ujemna (DPX ( ) C) była ważna, interpretowany wynik musi być niereaktywny dla wirusa B19V, a odpowiedni standard QS musi być ważny. Jeśli interpretowany wynik dla kontroli ujemnej jest nieważny, cała partia jest nieważna i należy ją powtórzyć. b. Podwójna kontrola dodatnia DPX Ważność podwójnej kontroli dodatniej DPX jest weryfikowana zgodnie z przeprowadzanym testem. Test DPX (HAV i B19V). Aby podwójna kontrola dodatnia (DPX D(+)C) była ważna, interpretowany wynik musi być reaktywny dla HAV, stężenie wirusa B19V musi wynosić od 1,20 x 10 2 do 1,20 x 10 3 IU/ml, a odpowiednia kontrola IC i standard QS muszą być ważne. Jeśli interpretowany wynik dla HAV jest nieważny lub stężenie wirusa B19V jest poza akceptowalnym zakresem, cała partia jest nieważna i należy ją powtórzyć. Test tylko na wirusa B19V. Aby podwójna kontrola dodatnia (DPX D(+)C) była ważna, interpretowany wynik musi wskazywać stężenie wirusa B19V od 1,20 x 10 2 do 1,20 x 10 3 IU/ml, a odpowiedni standard QS musi być ważny. Jeśli interpretowany wynik wskazuje na stężenie wirusa B19V poza akceptowalnym zakresem, cała partia jest nieważna i należy ją powtórzyć. c. Kontrola wysoko dodatnia DPX Aby kontrola wysoko dodatnia DPX (DPX H(+)C) była ważna, stężenie wirusa B19V musi wynosić od 2,40 x 10 5 do 2,40 x 10 6 IU/ml, a odpowiadający jej standard QS musi być ważny. Jeśli stężenie wirusa B19V jest poza akceptowalnym zakresem, cała partia jest nieważna i należy ją powtórzyć. 3. IC dla próbek od dawców a. Aby próbka od dawcy miała ważny niereaktywny ( ) wynik testu dla HAV, odpowiednia kontrola IC musi być ważna; w przeciwnym razie wynik niereaktywny jest nieważny i należy ponownie zbadać próbkę dawcy. b. Ważny wynik dla próbki od dawcy reaktywnej wobec HAV może mieć ważny lub nieważny wynik przeprowadzonej kontroli IC. 4. QS dla próbek od dawców a. Aby próbka od dawcy miała ważny wynik testu dla wirusa B19V, odpowiedni standard QS musi być ważny; w przeciwnym razie wynik jest nieważny i należy ponownie zbadać próbkę dawcy. 15

16 WYNIKI 1. Wyniki próbek są ważne tylko wówczas, gdy zawierająca je partia jest ważna. Kryteria kontroli jakości można znaleźć w rozdziale Kontrola jakości. Dla każdej próbki mierzone są cztery parametry: po jednym dla docelowych wirusów HAV i B19V oraz po jednym dla IC i QS. Test tylko na wirusa B19V. Dla każdej próbki mierzone są dwa parametry: docelowy wirus B19V i QS. 2. Ostateczne wyniki testu mogą być niereaktywne, reaktywne lub nieważne dla docelowego HAV bądź < wartości odcięcia, wartości odcięcia lub nieważne dla docelowego wirusa B19V. 3. Ostateczny status próbki od dawcy w teście cobas TaqScreen DPX jest przedstawiany przez oprogramowanie PDM następująco: Tabela 2 Opis końcowego stanu próbki od dawcy Końcowy status Opis próbki od dawcy Completed Uzyskano ostateczne wyniki dla każdego docelowego wirusa. Accepted Zaakceptowano ukończony test dla próbki od dawcy. Completed Unresolved Termin ważności upłynął, zanim test został zaakceptowany. Accepted Unresolved Zaakceptowano nierozstrzygnięty ukończony test próbki od dawcy. Powtarzanie testu dla danej próbki Probówki z próbkami od dawców z ostatecznym wynikiem nieważnym dla jednego z docelowych wirusów wymagają powtórnego badania, niezależnie od końcowego wyniku dla drugiego z docelowych wirusów. Użytkownik może jednak wybrać opcję Force Unresolve, aby zakończyć pracę z próbką danego dawcy. Zastosowanie funkcji Force Unresolve powoduje przypisanie stanu Accepted Unresolved próbce od dawcy, dla której nie uzyskano ostatecznego wyniku reaktywności wobec HAV lub wartości odcięcia dla wirusa B19V, bądź przypisanie stanu Accepted, jeśli uzyskano wynik reaktywności wobec HAV lub wartości odcięcia dla wirusa B19V. Badanie puli wtórnej Probówki z próbkami od dawców w zawierającej wiele próbek puli z ostatecznym wynikiem nieważnym dla jednego z wirusów docelowych wymagają powtórnego badania, jeśli ostateczny wynik drugiego z docelowych wirusów jest niereaktywny dla HAV lub < wartości odcięcia dla wirusa B19V. Uwaga: Rekursywne wyniki nieprawidłowe można uzyskać z kilku przyczyn, m.in. w przypadku donacji z bardzo wysokimi mianami wirusowymi. Jeżeli nieprawidłowe wyniki rekursywne wystąpią w puli składającej się z więcej niż 1 donacji, należy przejść do rozdzielczości puli, aby wyodrębnić donację składową, która spowodowała uzyskanie takiego wyniku. Testy należy zakończyć po wyodrębnieniu takiej donacji składowej, ponieważ przeprowadzenie dodatkowych testów prawdopodobnie nie spowoduje uzyskania prawidłowego wyniku. Dawca powinien w dalszym ciągu mieć status Complete, Unresolved. W przypadku gdy zebrany materiał obejmujący wiele próbek zostanie oznaczony jako reaktywny wobec HAV lub wartości odcięcia dla wirusa B19V, nastąpi przydzielenie przez system cobas s 201 wszystkim próbkom od dawców, których materiał znalazł się w puli, żądania pulowania do badania puli wtórnej. Próbki od tych dawców są pipetowane za pomocą urządzenia Hamilton MICROLAB STAR/STARlet IVD (zarówno z płytek głębokodołkowych, jak i z pierwotnych probówek zawierających materiał od dawców) do uzyskania mniejszych pul, zawierających próbki mniejszej liczby dawców lub pojedynczego dawcy, a następnie badane ponownie za pomocą testu cobas TaqScreen DPX jako element procesu rozstrzygania, który ma na celu zidentyfikowanie próbek od poszczególnych dawców, reaktywnych wobec HAV lub z wynikiem wartości odcięcia dla wirusa B19V. Dokładne instrukcje na temat przeprowadzania testów rozstrzygających można znaleźć w Podręczniku użytkownika systemu cobas s