Urokinazowy aktywator plazminogenu w chorobach nowotworowych rola, znaczenie diagnostyczne i aspekty terapii antynowotworowej

Transkrypt

1 PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 4, str JOANNA KOŁODZIEJCZYK, BEATA TALAR, BEATA OLAS, BARBARA WACHOWICZ Urokinazowy aktywator plazminogenu w chorobach nowotworowych rola, znaczenie diagnostyczne i aspekty terapii antynowotworowej Urokinase-type plasminogen activator in cancer progression role, potential applications in diagnostics and anticancer therapy Katedra Biochemii Ogólnej, Uniwersytet Łódzki Kierownik: Prof. dr hab. Barbara Wachowicz STRESZCZENIE Działanie układu fibrynolitycznego wewnątrz naczynia krwionośnego stanowi element hemostazy odpowiedzialny za usuwanie zbędnej fibryny i utrzymanie płynności krwi. Natomiast pozanaczyniowa aktywność białek fibrynolizy jest zaangaŝowana w migrację komórek i przebudowę tkanek, związaną zarówno z procesami fizjologicznymi, jak i patologicznymi. Rosnąca liczba danych potwierdza istotną rolę białek fibrynolizy w progresji i przerzutowaniu nowotworów. Szczególną uwagę zwraca się na urokinazowy aktywator plazminogenu, ze względu na róŝnorodność funkcji urokinazy i jej receptora. Udział układu fibrynolitycznego w progresji nowotworów moŝe mieć charakter bezpośredni, wynikający ze zdolności proteolitycznych plazminy, bądź teŝ pośredni, będący wynikiem innych właściwości biologicznych urokinazy, takich jak aktywność mitogenna, prozapalna, czy udział w szlakach przekazywania sygnału. Prezentowana praca stanowi przegląd głównych aspektów udziału urokinazowego aktywatora plazminogenu w przebiegu chorób nowotworowych i jego potencjalne uŝycie jako celu w terapii przeciwnowotworowej. SŁOWA KLUCZOWE: Plazminogen Urokinaza Nowotwory Metastaza SUMMARY Intravascular activity of the fibrinolytic system constitutes a part of the haemostasis responsible for the degradation of fibrin deposits. The extravascular proteolytic action of fibrinolytic enzymes in involved in various physiological and pathological processes that require tissue remodeling and cell migration. A growing number of data confirm an important role of the fibrinolytic system in tumor progression and metastasis, particularly due to multifunctional activity of urokinase-type plasminogen activator and its receptor. Tumor invasion and metastasis require cleaving of cell-cell and cell-extracelular matrix interactions, as well as the degradation of extracellular matrix components. Fibrinolytic system may participate directly in tumor progression by plasmin urokinase-induced plasmin activity, or indirectly due to other biological functions of urokinase, including its mitogenic, signal transduction molecule and proinflammatory properties. The presented article is a short review on the role of urokinase-type plasminogen activator in cancer progression, metastasis and anticancer therapy. KEY WORDS: Plasminogen Urokinase Cancer Metastasis WPROWADZENIE Działanie układu fibrynolitycznego wewnątrz naczynia krwionośnego stanowi fizjologiczną przeciwwagę dla procesu krzepnięcia krwi i mechanizm kontrolujący ilość powstającego włóknika (fibryny). Aktywność białek układu fibrynolizy obejmuje równieŝ liczne procesy związane z proteolizą pozanaczyniową, związaną zarówno ze zmianami fizjologicznymi, jak i patologicznymi. Składniki układu fibrynolitycznego uczestniczą m.in. w migracji komórek, przebudowie tkanek, angiogenezie, owulacji, gojeniu się ran oraz w róŝnorodnych procesach patologicznych, takich jak: choroby nowotworowe, czy infekcje. Istotnym etapem w procesach proteolizy pozanaczyniowej zachodzącej z udziałem plazminy, jest aktywacja plazminogenu przez urokinazowy aktywator plazminogenu (upa, ang. urokinase-type

2 620 J. KOŁODZIEJCZYK i wsp. plasminogen activator), połączony ze swoistym receptorem na powierzchni komórki migrującej (upar, ang. urokinase-type plasminogen activator) [1]. Zarówno fizjologiczna, jak i patologiczna rola białek układu fibrynolitycznego jest zaleŝna od degradacji białek błony podstawnej i macierzy zewnątrzkomórkowej, niszczenia połączeń międzykomórkowych oraz połączeń typu komórka macierz. W 1983 roku, Ossowski i Reich jako pierwsi opublikowali wyniki doświadczeń, w których zaobserwowali, Ŝe zastosowanie przeciwciał anty-upa blokuje inwazyjność komórek guza [2]. Wyniki te zapoczątkowały wzrost zainteresowania rolą układu fibrynolitycznego we wzroście rozwijającego się guza i progresji zmian nowotworowych. Dlatego teŝ, zwraca się coraz większą uwagę na znaczenie aktywacji plazminogenu zaleŝnej od upa, rośnie takŝe zainteresowanie badaniami mającymi na celu dokładniejsze poznanie biochemicznych mechanizmów fizjologicznego i patofizjologicznego działania tego aktywatora fibrynolizy. Fizjologia układu fibrynolitycznego Fibrynoliza stanowi fizjologiczny mechanizm kontrolujący i limitujący procesy krzepnięcia krwi oraz ilość powstającego włóknika. Głównym białkiem fibrynolizy jest plazminogen, proenzym ulegający przekształceniu do aktywnej enzymatycznie plazminy. Udział białek układu fibrynolitycznego w licznych procesach fizjologicznych i progresji zmian chorobowych, wynika z róŝnorodności funkcji biologicznych zarówno plazminy, jak i jej aktywatorów, zwłaszcza urokinazy. Plazmina wykazuje szeroki zakres działania proteolitycznego, do jej substratów poza fibrynogenem i fibryną naleŝą róŝne białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM, ang. extracellular matrix), a takŝe białkowe składniki błony podstawnej, m.in.: lamina, fibronektyna, witronektyna, trombospondyna oraz proteoglikany. Substratami dla plazminy mogą być takŝe niektóre czynniki wzrostu, m.in. zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bfgf, ang. basic fibroblast growth factor), transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β, ang. transforming growth factor type β) [3]. Ponadto, enzym ten aktywuje liczne proenzymy, takie jak proupa, pro-tpa, plazminogen (autoaktywacja) oraz zymogeny metaloproteinaz, w tym: prommp-1, prommp-3, prommp-10, prommp-13 [4]. Wewnątrznaczyniowa aktywacja fibrynolizy, niezbędna do usuwania złogów fibryny odbywa się głównie przy udziale tkankowego aktywatora plazminogenu (tpa, ang. tissue-type plasminogen activator) i zachodzi na powierzchni włóknika. Urokinazowy aktywator plazminogenu (upa, zwany takŝe urokinazą) zaangaŝowany jest w proteolizę pozanaczyniową. upa wykazuje wzmoŝoną aktywność proteolityczną po związaniu ze swoistym receptorem (upar), znajdującym się na powierzchni komórek. Proces aktywacji plazminogenu podlega kontroli przez inhibitory aktywatorów plazminogenu, głównie PAI-1 (ang. plasminogen activator inhibitor type 1), a takŝe PAI-2 (plasminogen activator inhibitor type 2), pojawiający się u kobiet w ciąŝy. Natomiast juŝ powstała plazmina jest przewaŝnie hamowana przez α 2 -antyplazminę i α 2 -makroglobulinę [5, 6] (Rycina 1). Urokinazowy aktywator plazminogenu Urokinazowy aktywator plazminogenu (Rycina 2) syntetyzowany jest w formie nieaktywnego zymogenu (pro-upa) w postaci jednołańcuchowej (sc-upa, ang. single chain urokinase plasminogen activator), która posiada słabą aktywność proteolityczną (ok. 200 razy słabszą niŝ aktywność formy dwułańcuchowej: tc-upa, ang. two chains urokinase plasminogen activator). Aktywność sc-upa jest jednak niezbędna do generowania niewielkich ilości plazminy, która hydrolizuje cząsteczkę sc-upa tworząc w pełni aktywną formę upa, czyli tc-upa. Plazmina nie jest jedyną proteazą zdolną do aktywacji upa, właściwość taką posiadają takŝe kalikreina, katepsyna B oraz osoczowy czynnik krzepnięcia krwi XIIa. W warunkach fizjologicznych upa jest syntetyzowany głównie przez komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich, komórki nabłonkowe, fibroblasty, monocyty/makrofagi, a jego stęŝenie w osoczu krwi utrzymuje się na podobnym poziomie w trakcie cyklu dobowego. Do znacznego wzrostu wytwarzania tego białka dochodzi natomiast w chorobach nowotworowych na skutek zwiększonej syntezy upa

3 Urokinazowy aktywator plazminogenu 621 przez komórki nowotworowe. Szczególnie wysoki poziom upa wykazano w złośliwych nowotworach tarczycy, szyjki macicy, jajników, piersi [7, 8]. Ryc. 1. Układ fibrynolityczny: substraty, produkty i jego regulacja [6, zmodyfikowano]. Fig. 1. The fibrinolytic system: substrates, products and regulation [6, modified]. Ryc. 2. Schemat struktury domenowej sc-upa z zaznaczeniem miejsc wraŝliwych na hydrolizę [ zmodyfikowano]; EGF domena podobna do epidermalnego czynnika wzrostu, ATF fragment N-końcowy, K1 domena kringlowa. Fig. 2. Schematic representation of sc-upa structure, with the indicated hydrolysis-sensitive positions [ modified]; EGF epidermal growth factor-like domain, ATF N-terminal fragment, K1 kringle domain.

4 622 J. KOŁODZIEJCZYK i wsp. Wolny oraz przyłączony do receptora upa w zdrowym organizmie bezpośrednio po aktywacji łączy się z PAI-1, tworząc nieaktywny kompleks upa/pai-1/upar, wychwytywany przez receptory LDL dla α 2 -makroglobuliny, co umoŝliwia jego endocytozę. Wewnątrz komórki dochodzi do uwolnienia cząsteczki receptora upar, która jest następnie retranspotrowana na powierzchnię komórki, gdzie moŝe wiązać kolejną urokinazę, a pozostały kompleks upa/pai-1 przenoszony jest do lizosomów, gdzie ulega degradacji (okres półtrwania urokinazy wynosi 5-10 minut). Proces usuwania rozpuszczalnego kompleksu upa/pai-1 jest podobny, jednak zachodzi znacznie wolniej. upa podlega regulacji ze strony PAI-1 odpowiadającego takŝe za hamowanie aktywności tpa, jak równieŝ PAI-2 (u kobiet w ciąŝy) oraz neksyny typu 1 wydzielanej przez fibroblasty i kowalencyjnie wiąŝącej upa [9, 10]. Receptor urokinazowego aktywatora plazminogenu W przebiegu chorób nowotworowych waŝną rolę odgrywa tzw. pierwotna aktywacja układu fibrynolitycznego przez komórki transformowane, w przeciwieństwie do fizjologicznej aktywacji wtórnej, gdzie etap proteolizy poprzedzony jest aktywacją kaskady krzepnięcia krwi. Istotną rolę w zwiększaniu aktywności proteolitycznej urokinazy pełni jej receptor upar (inaczej receptor CD87, ang. cluster of differentiation 87), białko receptorowe pozbawione domeny transbłonowej, zakotwiczone w błonie za pomocą fragmentu glikozylofosfatydyloinozytolowego (GPI). Aktywność urokinazy związanej z receptorem w reakcji proteolizy plazminogenu jest 40-krotnie wyŝsza, niŝ jej aktywność w postaci wolnej. Utworzenie kompleksu upa/upar zabezpiecza urokinazę przed dalszym działaniem plazminy oraz innych proteaz [9]. upar jest glikoproteiną zawierającą w swojej strukturze 3 domeny o róŝnej funkcji biologicznej: domena D1 odpowiada za związanie fragmentu N-końcowego urokinazy (ATF, ang. aminoterminal fragment), natomiast domeny D2 i D3 odpowiedzialne są za interakcję upar/witronektyna. Aktywność fizjologiczną wykazuje równieŝ wraŝliwy na proteolizę krótki łańcuch aminokwasowy łączący domeny D1 i D2, posiadający właściwości podobne do chemokin [11]. Ekspresja upar zachodzi w komórkach macierzystych szpiku, w monocytach, eozynofilach, neutrofilach, komórkach tucznych, dendrytach, zaktywowanych limfocytach T, komórkach NK, fibroblastach, keratynocytach, komórkach mięśni gładkich, hepatocytach, trofoblastach. Znaczną nadekspresję upar/cd87 stwierdzono takŝe w komórkach nowotworów złośliwych: raka piersi, jajników, endometrium, nerek, wątroby, Ŝołądka, okręŝnicy, kości i płuc [12]. Jednocześnie zaobserwowano, Ŝe stopień jego ekspresji w komórkach nowotworowych zaleŝy od stopnia zaawansowania choroby, np. w komórkach nowotworu łagodnego piersi nie obserwuje się istotnego wzrostu ekspresji upar/cd87, podczas gdy w formie złośliwej nowotworu piersi obserwuje się znaczną nadekspresję tego receptora [10, 13]. Jak wskazują najnowsze doniesienia (2011) [14], zarówno upa, jak i upar uczestniczą w procesach zapalnych związanych z rozwojem i progresją zmian nowotworowych. W otoczeniu tkanki guza obserwuje się znaczne zwiększenie liczby komórek prozapalnych, takich jak monocyty i makrofagi. Badania Zhang i wsp. [14] pokazały, Ŝe istotną rolę w chemotaksji tych komórek pełni upa i jego receptor, chociaŝ jej dokładne mechanizmy nie są nadal poznane. Za prozapalne właściwości urokinazy odpowiada występująca w jego strukturze pojedyncza domena kringlowa. Urokinaza stymuluje neutrofile do wzmoŝonej aktywacji, wytwarzania wolnych rodników oraz migracji. Ponadto bezpośrednio i pośrednio, poprzez aktywację plazminogenu, uczestniczy w uwalnianiu i aktywacji mediatorów reakcji zapalnych, m.in. interleukiny 1 i 6 (IL-1, IL-6), TGF-β oraz aktywacji metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej, co prowadzi do lokalnego nasilenia procesu zapalnego. Aktywność proteolityczna upa moŝe równieŝ prowadzić do miejscowego uwolnienia supar, który rekrutuje i aktywuje komórki odpowiedzi zapalnej: monocyty, neutrofile i limfocyty T [15]. Udział upa w progresji zmian nowotworowych Metastaza, czyli przerzutowanie komórek nowotworowych obejmuje wiele etapów, a wśród nich: zmianę fenotypową komórki (przejście epitelialno-mazenchymalne komórki nowotworowej), degrada-

5 Urokinazowy aktywator plazminogenu 623 cję lub przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej, inwazję miejscową (przerzuty miejscowe) i regionalną (przerzuty regionalne), angiogenezę, intrawazację, transport komórek w krwiobiegu, ekstrawazację i ostatecznie tworzenie przerzutów odległych [16]. Dostępne informacje potwierdzają udział elementów urokinazowej aktywacji plazminogenu (upa, upar, PAI-1, plazminogen) we wszystkich etapach rozwoju nowotworów. Tak znaczący udział urokinazy w tworzeniu i progresji guza wynika zarówno z jej aktywności proteolitycznej wobec plazminogenu, jak i z innych właściwości, niezwiązanych z aktywacją plazminogenu, a z adhezją komórek, apoptozą oraz chemotaksją [17]. Ukierunkowany charakter migracji komórki nowotworowej przerzutującej związany jest z nagromadzeniem urokinazy i jej receptora na wiodącym końcu komórki (tzw. zaleŝna od upa migracja komórek, ang. upa dependent cell migration), w miejscu kontaktu komórki z macierzą międzykomórkową, na szczycie filopodiów i lamellipodiów [16]. Zwiększone stęŝenie upar oraz upa występuje w obszarze komórek znajdujących się na peryferiach guza, w porównaniu do ich stęŝenia w obszarze centralnym [16, 18]. Taka lokalizacja kompleksu upa/upar zapewnia upa udział w regulacji interakcji typu komórka macierz zewnątrzkomórkowa. W wyniku nasilonej aktywacji plazminogenu, powstała plazmina bezpośrednio degraduje białka błony podstawnej i macierzy zewnątrzkomórkowej m.in. laminę, fibronektynę, liczne proteoglikany oraz pośrednio kolagen, stromielizynę, elastynę i inne, poprzez aktywację metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej (MMPs, ang. matrix metaloproteinases). Efektem tego procesu, obok usunięcia przeszkody strukturalnej, jest uwolnienie związanych z macierzą czynników proangiogennych, takich jak: zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów, TGF-β, czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF, ang. vascular endothelial growth factor) oraz insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF, ang. insulin-like growth factor), stymulujących ekspresję składników urokinazowego układu aktywacji plazminogenu [15, 18, 19]. Pronowotworowe właściwości upa niezwiązane z aktywacją plazminogenu upa wykazuje właściwości proteolityczne takŝe wobec własnego receptora upar. Urokinaza po przyłączeniu do zakotwiczonego w błonie komórkowej receptora moŝe hydrolizować połączenie pomiędzy domeną D1, a połączonymi ze sobą domenami D2 i D3, prowadząc do uwolnienia rozpuszczalnego receptora upa (supar, ang. soluble urokinase plasminogen activator receptor) składającego się z domen D2 i D3 oraz pentapeptydu (SRSRY) o cechach chemotaktycznych (łącznika domen D1 a D2) i właściwościach pro-migracyjnych. StęŜenie rozpuszczalnej formy receptora stanowi jeden z markerów procesów zapalnych i wielu nowotworów [20]. Epitop receptora upar posiada równieŝ właściwości chemokiny, a jego ekspozycja moŝe zachodzić takŝe bez proteolizy receptora i uwolnienia su-par, jedynie na skutek zmian konformacyjnych wywołanych przez związanie upa bądź fragmentu ATF z domeną D1. Takie zmiany w strukturze u-par umoŝliwiają związanie witronektyny (Vn, ang. vitronectin,) lub integryn α V β 3 (w diagnostyce marker unaczynienia tkanek) do domeny D2 i D3 [3, 13]. Witronektyna jest białkiem wchodzącym w skład macierzy zewnatrzkomórkowej, wiąŝącym się z komórkami poprzez receptor upar (w obecności upa oddziaływanie Vn/uPAR jest silniejsze) lub przez integryny. Oddziaływanie upa/upar/vn moŝe prowadzić do przebudowy cytoszkieletu komórki. Proces ten, regulowany jest przez PAI-1, który współzawodniczy z upar o miejsce wiązania w cząsteczce witronektyny (domena SMB, ang. somatomedin B domain). PAI-1 moduluje interakcję Vn/uPAR, upar/integryny oraz Vn/integryny [18]. Nie moŝna jednak stwierdzić, Ŝe PAI-1 hamuje proces przerzutowania poprzez hamowanie działania urokinazy, inhibitor ten uczestniczy w regulacji aktywności proteolitycznej, niezbędnej do rozrostu guza i tworzenia ognisk wtórnych. Liczne doniesienia sugerują, Ŝe wzrost stęŝenia PAI-1 u chorych na raka koreluje z nasileniem procesu chorobowego [10, 13, 22]. Zmiany konformacyjne zachodzące w cząsteczce upar po przyłączeniu urokinazowego aktywatora plazminogenu, a następnie witronektyny, powodują równieŝ przekazywanie (transdukcję) sygnału do jądra komórkowego, gdzie uruchamiane zostają szlaki z udziałem kinaz białkowych m.in.: FAK (ang. focal adhesion kinase), MAPK (ang. mitogen-activated protein kinase, dawniej zwana ERK, ang. extracellular signal-regulated kinases). Szlaki przekazywania sygnału z udziałem tych kinaz zaangaŝowane

6 624 J. KOŁODZIEJCZYK i wsp. są w regulację: proliferacji komórek, oddziaływań typu komórka-ecm, komórka-komórka, adhezji, migracji komórek, ekspresji genów Bcl-2 (białka Bcl-2 regulują podziały komórkowe oraz hamują apoptozę), a takŝe regulacji ekspresji samego upar poprzez oddziaływanie białek Bcl-2 z czynnikiem transkrypcyjnym Sp-1 [23] (Rycina 3). PoniewaŜ upar nie posiada domen transbłonowych, w przekazywaniu sygnału do komórki niezbędne są inne białka - białka błonowe, jak np. integryny, receptory chemokin, czy receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR, ang. epidermal growth factor receptor). Integryny odpowiadają za przekazywanie informacji do komórki o właściwościach fizycznych i biochemicznych ECM, stąd teŝ mogą regulować przebudowę ECM i pośrednio wpływać na procesy nowotworzenia [15, 21]. Dostępne dane sugerują równieŝ, Ŝe upar moŝe stanowić niezaleŝny czynnik promujący metastazę. Badania Jo i wsp. [24] wykazały, Ŝe receptor ten stymuluje tworzenie przerzutów, niezaleŝne od związania urokinazy. Ryc. 3. Udział u-pa w progresji zmian nowotworowych [7, zmodyfikowano]. Fig. 3. The role of upa in cancer progression [7, modified]. Urokinaza prognostycznym markerem nowotworowym Znaczące zwiększenie ekspresji upa i upar obserwuje się w wielu nowotworach złośliwych, a dostępne informacje wskazują równieŝ na róŝnice pomiędzy stopniem zaawansowania nowotworu, a poziomem ekspresji upa i upar. Stwierdzono znacznie wyŝszy poziom opisywanych białek w przerzutach, niŝ w ogniskach pierwotnych nowotworów [25]. UwaŜa się ponadto, Ŝe takŝe zwiększone stęŝenie rozpuszczalnej formy receptora upar moŝe stanowić obiecujący biomarker zmian nowotworowych i towarzyszącego im procesu zapalnego [26]. Badania kliniczne wykazały silny wzrost poziomu upa oraz kompleksu upa-pai-1 u pacjentów w zaawansowanym stadium choroby nowotworowej w porównaniu z osobami zdrowymi, ustalono teŝ istnienie korelacji pomiędzy nasileniem ekspresji urokinazy, a niepomyślnym rokowaniem dla pacjenta. StęŜenie upa i/lub upar/pai-1 moŝe być jednym z markerów prognozowania w złośliwych nowotworach przełyku, Ŝołądka, jelita grubego [27]. W 1988 r. Duffy i wsp. [28] wykazali korelację pomiędzy wysokim stęŝeniem urokinazowego aktywatora plazminogenu u pacjentek z rakiem piersi, a szybkością progresji zmian nowotworowych oraz brakiem

7 Urokinazowy aktywator plazminogenu 625 skuteczności terapii antynowotworowej. Obecnie, u chorych na raka piersi urokinaza jest uznanym markerem nowotworowym, istotnym w ocenie prawdopodobieństwa tworzenia przerzutów u pacjentów z nowotworem bez przerzutów do węzłów chłonnych, bądź prawdopodobieństwa nawrotu choroby u pacjentów będących w remisji. W tym typie nowotworu upa jest jednym z najwaŝniejszych markerów prognostycznych, niezaleŝnym od tradycyjnych wskaźników, takich jak: wielkość guza, stan węzłów chłonnych, czy status receptorów hormonów steroidowych [3]. Mimori i wsp. [29] wykazali, Ŝe wzrost ekspresji genu upar w komórkach szpiku kostnego osób chorych na raka piersi jest skorelowany ze zwiększeniem ryzyka i metastazy po leczeniu chirurgicznym. Ponadto, dostępne informacje wskazują, Ŝe podwyŝszony poziom upa jest skorelowany ze skłonnościami do wystąpienia przerzutów, a tym samym z rokowaniami nie tylko w przypadku nowotworów piersi, ale wielu róŝnych rodzajów nowotworów złośliwych, m.in. w nowotworach tarczycy, raka szyjki macicy, jajników, pęcherza moczowego i mózgu [30]. upa i upar jako cele terapii antynowotworowej W opracowywaniu potencjalnych leków przeciwnowotworowych, bierze się pod uwagę głównie działanie na trzech newralgicznych poziomach patofizjologicznej aktywności upa i upar: 1) redukcję ekspresji upa i upar, 2) hamowanie interakcji upa-upar, 3) bezpośrednią inhibicję aktywności urokinazy. Obecnie, najbardziej zaawansowane badania dotyczą potencjalnych niskocząsteczkowych inhibitorów hamujących aktywność proteolityczną urokinazy [31]. Początkowo, badania prowadzone na hodowlach komórkowych obejmowały inhibitory proteaz serynowych pochodzenia naturalnego i syntetyczne, takie jak: kwas traneksamowy, aprotynina, leupeptyna i amiliryd. Jednak związki te, mimo Ŝe hamowały proces metastazy guza, nie wykazywały specyficzności wobec upa. Pierwsze badania nad specyficznymi inhibitorami urokinazy doprowadziły do zsyntetyzowania związków opartych na strukturze fenyloguanidyny. 4-trifluorometylenofenyloguanidyna oraz 4-chlorofenyloguanidyna najsilniej hamowały upa i nie wykazywały specyficzności wobec innych proteaz serynowych, m.in. wobec trombiny oraz plazminy w osoczu [32]. Jako pierwsze w fazę badań klinicznych weszły syntetyczne inhibitory proteaz serynowych naleŝące do pochodnych 3-amidynofenyloalniny o nazwie WX-UK1 (Wilex AG, Niemcy). Badania przedkliniczne wykazały, Ŝe WX-UK1 hamuje proces metastazy i rozrost guza pierwotnego, poprzez inhibicję aktywności urokinazowego aktywatora plazminogenu. W I fazie badań klinicznych nie wykazano negatywnego wpływu WX-UK1 na układ krwionośny (zdrowi ochotnicy). Związki te badane są w kombinacji z chemioterapeutykami w przypadku leczenia guzów litych [33]. Do związków hamujących aktywność upa naleŝą takŝe naturalne inhibitory pochodzenia endo- (PAI-1, PAI-2) i egzogennego. Endogenne inhibitory upa (PAI-1, PAI-2) są białkami wielofunkcyjnymi, poza hamowaniem proteolizy w wyniku bezpośredniego oddziaływania z upa (takŝe t-pa), posiadają inne funkcje, których efekt nie jest do końca poznany. Ponadto, prowadzone są badania potwierdzające właściwości prometastatyczne PAI-1 [34]. W przypadku guzów złośliwych obserwuje się wzrost stęŝenia PAI-1 w przestrzeni okołoguzowej. Natomiast wzrost stęŝenia PAI-2 moŝe prowadzić to zahamowania metastazy guza w wyniku zablokowania interakcji upa/upar z PAI-1 [35]. Odmienna rola PAI-1 i PAI-2 w progresji zmian nowotworowych związana jest z faktem, Ŝe PAI-1 oprócz tego, Ŝe bierze udział w hamowaniu przekształcenia plazminogenu w aktywny enzym, wykazuje takŝe powinowactwo do witronektyny, przez co zaangaŝowany jest w regulację migracji i adhezji komórek nowotworowych, natomiast PAI-2 nie posiada takich właściwości [18]. Spadek aktywności upa moŝe nastąpić takŝe w wyniku hamowania oddziaływania upa z upar. W tym przypadku wykorzystuje się liniowe bądź cykliczne peptydy, których struktura oparta jest na domenie EGF (ang. epidermal factor-like domain) znajdującej się w strukturze upa. Badania in vitro potwierdziły, Ŝe takie peptydy konkurują z upa o miejsce wiązania na receptorze upar [36]. Ponadto, moŝliwe jest wykorzystanie innych metod, których ostatecznym efektem jest zahamowanie prometastatycznych właściwości upa, poprzez m.in. hamowanie: syntezy elementów urokinazowej aktywacji plazminogenu, aktywności plazminy, lub interakcji upa -

8 626 J. KOŁODZIEJCZYK i wsp. upar - integryny [22]. W 1994 r. po raz pierwszy dokonano oceny moŝliwości zahamowania inwazyjności ludzkich komórek nowotworu złośliwego skóry (carcinoma spinocellulare) dzięki zastosowaniu strategii antygenowej regulacji ekspresji genów upar. Komórki nowotworu skóry, w których następowała ekspresja antysensowego upar charakteryzowały się osłabioną zdolnością do inwazji i metastazy w stosunku do komórek kontrolnych, gdzie nie wprowadzono wektora [12]. W przypadku badań nad antygenową regulacją upar in vivo wyróŝnia się metody oparte na oddziaływaniu komplementarnych do upar mrna: antysensownych oligonukleotydów (DNA i RNA), rybozymów, deoksyrybozymów oraz małego interferencyjnego RNA sirna. Innym przykładem badań nad zastosowania terapii genowej w hamowaniu aktywności upar, jest wykorzystanie wektorów adenowirusowych lub retrowirusowych z wprowadzoną sekwencją nukleotydową kodującą fragment ATF upa. Zastosowanie takich wektorów prowadzi do nadekspresji ATF, syntetyzowane białko pozbawione jest właściwości enzymatycznych, a jednocześnie konkuruje z upa o miejsce wiązania w receptorze upar. Jak dotąd, badania z wykorzystaniem tego mechanizmu hamowania aktywności układu upa/upar prowadzone były na myszach i wykazały spowolnienie wzrostu i metastazy guza na skutek zahamowania angiogenezy [21]. PIŚMIENNICTWO 1. Rijken D.C. Overview of the fibrinolytic system. Thrombosis: fundamental & clinical aspects. Red. Arnout J, de Gaetano G, Hoylaerts M, Peerlinck K, van Geet C., Verhaeghe R. Thrombosis: fundamental & clinical aspects. Leuven University Press, Leuven 2003; Ossowski L, Reich E. Antibodies to plasminogen activator inhibit human tumor metastasis. Cell 1983; 35: Duffy M. Plasminogen activator system: role in malignancy. Curr Pharmac Des 2004; 10: Lijnen H.R. Molecular interactions between the plasminogen/plasmin and matrix metalloproteinase systems. Fibrinolysis Proteol 2000; 14: Dobrovolsky A.B, Titaeva E.V. The fibrynolysis system: regulation of activity and physiologic functions of its amin components. Biochemistry (Moscow) 2002; 67: Collen D. Ham-Wasserman lecture: Role of the plasminogen system in fibrin-homeostasis and tissue remodeling hematology. Am Soc Hematol Educ Program 2001; Crippa M. P. Urokinase-type plasminogen activator. Int J Biochem Cell Biol 2007; 39: Bansal V., Roychoudhury P. Production and purification of urokinase: a comprehensive review. Prot Expr Purif 2006; 45: Stepanova VV, Tkachuk VA. Urokinase as a multidomain protein and polyfunctional cell regulator. Biochemistry 2002; 67: Blasi F, Sidenius N. The urokinase receptor: focused cell surface proteolysis, cell adhesion and signaling. FEBS Lett 2010; 584: Sidenius N, Blasi F. The urokinase plasminogen activator system in cancer: recent advances and implication for prognosis and therapy. Cancer Metastasis Rev 2003; 22: Pillay V, Dass C, Choong P. The urokinase plasminogen activator receptor as a gene therapy target for cancer. Trends Biotech. 2006; 25: Chorostowska-Wynimko J. Rola inhibitora aktywatora plazminogenu typu 1 w regulacji aktywności angiogennej komórek śródbłonka naczyniowego - implikacje dla regulacji powstawania przerzutów nowotworowych do płuc. Pneum Alerg 2004; 72: Zhang J, Sud S, Mizutani K, Gyetko M.R, Pienta K.J. Activation of urokinase plasminogen activator and its receptor axis is essential for macrophage infiltration in a prostate cancer mouse model. Neoplasia 2011; 13: Mondino A, Blasi F. upa and upar in fibrinolysis, immunity and pathology. Trends Immunol 2004; 8: Popow-Woźniak A, Nowak D, Malicka-Błaszkiewicz M. Sposoby migracji komórek nowotworowych. Post Bioch 2009; 2: Alfano D, Franco P, Vocca I. i wsp. The urokinase plasminogen activator and its receptor. Role in cell growth and apoptosis. Thromb Haemost 2005; 93: Wyrzykowska P, Kasza A. Regulacja ekspresji genu PAI-1. Post Bioch 2009; 55: Joyce J, Pollard J. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer 2009; 9: Langkilde A, Hansen T.W, Ladelund S. i wsp. Increased plasma soluble upar level is a risk marker of respiratory cancer in initially cancer-free individuals. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2011; 20(4): Tang C, Wei Y. The urokinase receptor and integrins in cancer progression. Cell Mol Life Sci 2008; 65: Rakic J.M, Maillard C, Jost M. i wsp. Role of plasminogen activator-plasmin system in tumor angiogenesis. Cell Mol Life Sci 2003; 60:

9 Urokinazowy aktywator plazminogenu Trisciuoglio D, Iervolino A, Candiloro A. i wsp. bcl-2 induction of urokinase plasminogen activator receptor expression in human cancer cells through Sp1 activation. J Biol Chem 2004; 8: Jo M, Takimoto S, Montel V, Gonias S.L. The urokinase receptor promotes cancer metastasis independently of urokinasetype plasminogen activator in mice. Am J Pathol 2009; 175: Schmalfeldt B, Kuhn W, Reuning U. i wsp. Primary tumor and metastasis in ovarian cancer differ in their content of urokinase-type plasminogen activator, its receptor, and inhibitors types 1 and 2. Cancer Res 1995; 55: Eugen-Olsen J, Andersen O, Linneberg A. i wsp. Circulating soluble urokinase plasminogen activator receptor predicts cancer, cardiovascular disease, diabetes and mortality in the general population. J Intern Med. 2010; 268(3): Allgayer H. Translational research on u-par. Eur J Cancer 2010; 46: Duffy M.J, O'Grady P, Devaney D, O'Siorain L, Fennelly J.J, Lijnen H.J. Urokinase-plasminogen activator, a marker for aggressive breast carcinomas. Preliminary report. Cancer 1988; 62(3): Mimori K, Kataoka A, Yamaguchi H. i wsp. Preoperative u-par gene expression in bone marrow indicates the potential power of recurrence in breast cancer cases. Ann Surg Oncol 2009; 16(7): Smith H.W, Marshall C.J. Regulation of cell signalling by upar. Nat Rev Mol Cell Biol 2010; 11: Hildenbrand R, Allgayer H, Marx A, Stroebel P. Modulators of the urokinase-type plasminogen activation system for cancer. Expert Opin Investig Drugs 2010; 19(5): Yang H, Henkin J. Competitive inhibitors of human urokinase. Fibrinolysis 1992; 6(Suppl 1), Ertongur S, Lang S, Mack B, Wosikowski K, Muehlenweg B, Gires O. Inhibition of the invasion capacity of carcinoma cells by WX-UK1, a novel synthetic inhibitor of the urokinase-type plasminogen activator system. Int J Cancer 2004; 20: Lobov S, Ranson M. Molecular competition between plasminogen activator inhibitors type -1 and -2 for urokinase: implications for cellular proteolysis and adhesion in cancer. Cancer Lett 2011; 303: Croucher D, Saunders D, Lobov S, Ranson M. Revisiting the biological roles of PAI2 (SERPINB2) in cancer. Nat Rev Cancer 2008; 8: Markowska A, Bruzgo I, Miltyk W, Midura-Nowaczek K. Tripeptides with C-Terminal arginine as potential inhibitors of urokinase. Int J Pept Res Ther 2011; 17: Praca wpłynęła r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autora: Dr Joanna Kołodziejczyk Katedra Biochemii Ogólnej Uniwersytet Łódzki ul. Pomorska 141/ Łódź Tel joannak@biol.uni.lodz.pl