This copy is for personal use only - distribution prohibited.

Transkrypt

1 Wstęp Prenatalna diagnostyka cytogenetyczna chorób genetycznych. Klasyczne metody i zasady oceny kariotypu Ewa Bocian Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka Streszczenie: Diagnostyka cytogenetyczna dotyczy tych chorób genetycznych, które uwarunkowane są aberracjami chromosomowymi i polega na określeniu kariotypu. Prenatalnej oceny kariotypu dokonuje się w przypadku zwiększonego, w stosunku do populacyjnego, ryzyka urodzenia dziecka z aberracją chromosomową. Specyfika prenatalnych badań cytogenetycznych polega na ograniczonych możliwościach uzyskania materiału do badań, oraz na rodzaju materiału zawierające komórki płodu. Bardzo ważny jest także element czasu, w którym badanie powinno być wykonane, jak też konieczność jak najszybszego uzyskania wyniku diagnostycznego. Te elementy specyfiki badań prenatalnych mają istotny wpływ na samą metodykę jak i procedurę diagnostyczną. Ponieważ wynik oceny kariotypu decyduje niekiedy o dalszych losach ciąży konieczne jest, tak z klinicznego jak i prawnego względu, zapewnienie odpowiednio wysokiego standardu tych badań. W opracowaniu przedstawiono metody i zasady procedury diagnostycznej w badaniach komórek płynu owodniowego, kosmówki oraz krwi pępowinowej. Uwzględniono metodykę hodowli tych komórek, zasady analizy kariotypu oraz opisu wyniku badania. Omówiono najczęściej występujące problemy diagnostyczne ze szczególnym uwzględnieniem mozaikowości chromosomowej a także zasady interpretacji cytologicznej i klinicznej wyniku badania. Podano stosowane standardy jakości prenatalnych badań cytologicznych. Słowa kluczowe: ocena kariotypu płodu kosmówka płyn owodniowy interpretacja wyniku standardy jakości Adres do korespondencji: Doc. dr hab. Ewa Bocian, Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka, ul. Kasprzaka 17A, Warszawa Historia rozwoju prenatalnych badań cytogenetycznych sięga połowy lat 50. gdy po raz pierwszy określona została płeć płodu w komórkach z płynu owodniowego [1]. Jednak rozwój metod badawczych umożliwiających analizę cytogenetyczną komórek płodu datuje się dopiero od 1966 roku, kiedy to Steel i Breg stwierdzili obecność w płynie owodniowym żywych, dających się namnażać in vitro, komórek płodu [2]. Opracowanie technik hodowli oraz analizy biochemicznej i chromosomowej tych komórek umożliwiło diagnostykę prenatalną aberracji chromosomowych oraz niektórych chorób monogenowych (metabolicznych) początkowo w II a z końcem lat 80. także w I trymestrze ciąży [3 5]. Próby biopsji kosmówki (CVS, ang. chorionic villus sampling) oraz cytogenetycznej analizy tej tkanki jako potencjalnej metody diagnostyki aberracji chromosomowych w I trymestrze ciąży rozpoczęto już w 1968 roku jednak szersze wykorzystanie tej metody do analizy kariotypu płodu przypada dopiero na drugą połowę lat 80 [6 9]. Przełomowe znaczenie dla wykorzystania tej metody diagnostycznej miało opracowanie w 1983 roku przez badaczy włoskich metody oce- ny kariotypu bezpośrednio z pobranego materiału [10]. W 12 lat później zarejestrowano już wykonanie ponad badań z zastosowaniem tej metody diagnostycznej [11]. Dokonujące się równocześnie z postępem w zakresie technik ultrasonograficznych oraz metod pozyskiwania do badań tkanek płodu, doskonalenie metod hodowli oraz analizy chromosomowej tych komórek umożliwiło znaczne zwiększenie czułości i skuteczności badań prenatalnych. Również, co w tego typu badaniach bardzo istotne, skróceniu uległ czas potrzebny do uzyskania wyniku diagnostycznego. Prenatalnej oceny kariotypu dokonuje się w przypadku zwiększonego, w stosunku do populacyjnego, ryzyka urodzenia dziecka z aberracją chromosomową. Schemat procedury diagnostycznej, zasady i poszczególne etapy badania, tzn. konieczność uzyskania dzielących się komórek, w których można analizować chromosomy, sporządzanie preparatów chromosomowych, specyficzne metody ich barwienia są takie same dla przed- i pourodzeniowego badania kariotypu. Omówienie tych metod znaleźć można w wielu podręcznikach i opracowaniach zawierających elementy cytogenety- 1

2 Tabela 1. Wskazania do prenatalnej oceny kariotypu. ki klinicznej [12 15]. Tutaj przedstawione zostaną tylko te aspekty badań, które dotyczą specyfiki prenatalnej oceny kariotypu. Wiąże się ona przede wszystkim z ograniczonymi możliwościami uzyskania materiału do badań oraz z rodzajem materiału zawierającego komórki płodu. Bardzo ważny jest także element czasu, zarówno okresu ciąży, w którym badanie powinno być wykonane jak też konieczności jak najszybszego uzyskania wyniku diagnostycznego. Te elementy specyfiki badań prenatalnych nie pozostają bez wpływu na samą metodykę i procedurę diagnostyczną. Wskazania do prenatalnej oceny kariotypu Znaczna większość inwazyjnych badań prenatalnych (80%) wykonywana jest ze względu na zaawansowany wiek matki i związane z nim, zwiększone w stosunku do populacyjnego, ryzyko aneuploidii chromosomowej. Należy jednak pamiętać, że 80% dzieci z aberracjami chromosomowymi rodzą kobiety młode. Ryzyko wystąpienia aberracji u płodu związane 2 Większe od populacyjnego ryzyko urodzenia dziecka z aberracją chromosomową Wiek matki 35 lat Aneuploidia u dziecka z poprzedniej ciąży Jedno z rodziców jest nosicielem zrównoważonej aberracji chromosomowej Wady stwierdzane u płodu w badaniu USG Nieprawidłowe wyniki badań przesiewowych w surowicy matki Zwiększone ryzyko wystąpienia choroby sprzężonej z chromosomem X (określenie płci płodu gdy nie jest możliwa diagnostyka molekularna choroby) Tabela 2. Ryzyko niezrównoważonej aberracji chromosomowej u potomstwa nosicieli zrównoważonej aberracji strukturalnej [16 18]. Translokacja 13;14 Translokacji wzajemnej w przypadku rozpoznania translokacji poprzez: poronienie samoistne dziecko chore z aberracją lub martwo urodzone ~1,5 5% ~20 20% Insercji 50% Inwersji chromosomowej u matki 4% u ojca 8% Tabela 3. Ryzyko niezrównoważonej aberracji chromosomowej u potomstwa nosicieli translokacji Robertsonowskich [16 18]. 14;21 21;22 21;21 Nosiciel Którekolwiek z rodziców Ojciec Matka Ojciec Matka Którekolwiek z rodziców Ryzyko niezrównoważonego kariotypu,% z wiekiem matki dotyczy przede wszystkim trisomii chromosomów 13, 18 i 21 oraz trisomii XXY a także aberracji strukturalnych chromosomów. Nie obejmuje natomiast monosomii chromosomu X oraz poliploidii. Zwiększone ryzyko urodzenia dziecka z aberracją istnieje także wtedy, gdy wystąpiła już aneuploidia u dziecka z poprzedniej ciąży lub jedno z rodziców jest nosicielem zrównoważonej aberracji chromosomowej (Tabeli 1). W tym ostatnim przypadku ryzyko wystąpienia aberracji u płodu zależy od wielu czynników, między innymi od rodzaju i wielkości aberracji, uczestniczących w niej chromosomów a także od płci nosiciela aberracji (Tabela 2 i 3). Wyczerpujące omówienie tego zagadnienia znaleźć można w podręczniku Gardnera i Sutherlanda [19]. Metody badań Schemat badania cytogenetycznego Badanie cytogenetyczne polega na analizie chromosomów w dzielących się mitotycznie komórkach. Procedura badania (jego podstawowe etapy) jest w zasadzie niezależna od rodzaju badanych komórek i przebiega według następującego schematu: Namnożenie komórek w hodowli in vitro w celu uzyskania komórek mitotycznych. Nagromadzenie komórek w stadium metafazy (inkubacja z trucizną mitotyczną kolcemidem). Zakończenie hodowli i sporządzenie preparatów chromosomowych: poddanie komórek szokowi hipotonicznemu (zazwyczaj przy pomocy 0,075 M roztworu KCl), utrwalenie komórek (zazwyczaj mieszaniną lodowatego kwasu octowego i metanolu w proporcjach objętościowych 1:3), sporządzenie preparatów chromosomów poprzez naniesienie zawiesiny komórek na szkiełko podstawowe. Wybarwienie chromosomów metodą prążkową (np. GTG).

3 Tabela 4. Warunki uzyskiwania i charakterystyka materiału płodowego. Technika pobierania Okres ciąży, tygodnie Uzyskiwany materiał/komórki Optymalna ilość materiału do badań Amniopunkcja 12 14*, Płyn owodniowy/amniocyty ml Biopsja kosmówki 9 12 Kosmówka krzewiasta/komórki cytotrofoblastu i fibroblasty mezodermalne mg Kordocenteza >18 Krew pępowinowa 1 2 ml *tzw. amniopunkcja wczesna Tabela 5. Charakterystyka metod otrzymywania preparatów i analizy chromosomów. Zalety metody Problemy Preparaty uzyskiwane z zawiesiny komórek Dobra jakość techniczna preparatów Długi czas hodowli Możliwość uzyskania dodatkowych preparatów chromosomów Trudna interpretacja mozaikowości chromosomowej Preparaty z hodowli pierwotnych in situ Krótszy czas hodowli Jakość techniczna preparatów Mniej pracochłonna i tańsza Mniej komórek do analizy Łatwiejsza interpretacja mozaikowości chromosomowej Brak możliwości uzyskania dodatkowych preparatów chromosomowych Analiza chromosomów w mikroskopie (przy pow. >1000 ). Sporządzenie dokumentacji obrazu chromosomów (kariogramu). Ustalenie i opisanie wyniku badania. Specyfika badań prenatalnych wiąże się przede wszystkim z rodzajem pozyskiwanego do badania materiału płodowego. Materiał i okres ciąży Oceny kariotypu dokonuje się najczęściej w I lub II trymestrze ciąży w amniocytach znajdujących się w płynie owodniowym lub w komórkach kosmówki (Tabela 4). W szczególnych przypadkach diagnostycznych badana jest krew pępowinowa. Badanie cytogenetyczne może być wykonane zarówno nieco wcześniej jak i w późniejszym niż podany w tabeli okresie ciąży. Wiąże się to jednak z większym ryzykiem dla ciąży lub mniejszą skutecznością badania. Decydujące są też unormowania prawne dotyczące wieku ciąży, w którym może być ona zakończona ze względów medycznych. Badanie komórek płynu owodniowego i kosmówki Komórki płynu owodniowego (amniocyty) stanowią heterogenną populację zawiera jącą komórki owodni, skóry, układu moczowo-płciowego i pokarmowego płodu. Spośród nich tylko nieliczne żywe komórki mają zdolność do wzrostu w hodowli in vitro i umożliwiają uzyskanie odpowiednich do analizy preparatów chromosomowych. Ogólna liczba komórek w płynie owodniowym rośnie pomiędzy 8 i 18 tygodniem jako wykładnicza funkcja wieku ciąży. Jednak liczba żywych komórek wzrasta w tym czasie tylko nieznacznie. W późniejszym okresie ciąży płyn zawiera coraz więcej martwych komórek. Zarówno amniocyty jak i komórki kosmówki rosną przyrośnięte do dna naczynia hodowlanego tworząc kolonie. Z jednej komórki powstaje jedna kolonia. Hodowla tych komórek wymaga stosowania odpowiednich podłóż hodowlanych zawierających czynniki wzrostowe oraz określonych warunków inkubacji (temperatury, wilgotności i stężenia CO 2 ). Konieczne jest także stosowanie specjalnych naczyń hodowlanych, których powierzchnia ułatwia przyklejanie się komórek do ich dna. Z zasady zakładane są co najmniej dwie, a zazwyczaj trzy hodowle. Warunkuje to odpowiednio wysoką skuteczność badań oraz umożliwia uzyskanie wiarygodnego wyniku badania i jego interpretację. Czas trwania hodowli wynosi zazwyczaj 7 14 dni. Rodzaj stosowanego do hodowli naczynia (butelka typu Falcon, szkiełko nakrywkowe w płytce Petriego, szkiełko podstawowe z przyklejoną do niego komorą) i związany z nim sposób prowadzenia hodowli mają istotne znaczenie dla czasu trwania hodowli oraz metody otrzymywania preparatów chromosomowych i ich analizy. Preparaty chromosomowe można otrzymywać i analizować dwiema metodami. W pierwszej są one wykonywane z zawiesiny komórek uzyskanej przez enzymatyczne (zazwyczaj trypsyną) odklejenie ich od dna naczynia hodowlanego. W tej metodzie nie ma możliwości stwierdzenia z których kolonii pochodzą analizowane komórki. W drugiej metodzie chromosomy analizowane są in situ, w pierwotnych hodowlach komórek. We wszystkich zabiegach zmierzających do sporządzenia preparatu operuje się szkiełkiem, na którym znajdują się kolonie komórkowe. Analizowane są chromosomy dzielących się komórek w poszczególnych koloniach co ułatwia interpretację wyniku w przypadku stwierdzenia mozaikowości chromosomowej [20,21]. Wady i zalety tych dwóch metod podano w Tabeli 5. Preparaty chromosomów z komórek kosmówki można uzyskać dwiema metodami, bezpośrednio z pobranej do ba- 3

4 dania tkanki oraz z zastosowaniem hodowli tych komórek [10,22,23]. Sposób hodowli komórek kosmówki oraz czas jej trwania nie różni się zasadniczo od opisanego wcześniej dla komórek płynu owodniowego. Przed założeniem hodowli konieczne jest natomiast odpowiednie przygotowanie badanej próbki kosmówki. Polega ono na oczysz czeniu i oddzieleniu od kosmków fragmentów tkanki matczynej (doczesnej), której komórki rosną w hodowli szybciej niż komórki pochodzenia płodowego. Zabieg ten zapobiega niebezpieczeństwu oznaczenia kariotypu matki zamiast kariotypu płodu. W hodowli namnażane są komórki zrębu mezodermalnego kosmków. Zastosowanie trypsyny i kolagenazy w celu zniszczenia struktury kosmka i uwolnienia z niej tych komórek przyspiesza i ułatwia ich hodowlę. Możliwość uzyskania preparatów chromosomowych bezpośrednio z pobranej do badania kosmówki zapewnia duża aktywność mitotyczna warstwy cytotrofoblastycznej kosmków in vivo. W metodzie bezpośredniej preparaty chromosomowe sporządzane są po 1 3-godzinnej inkubacji kosmków w pożywce z kolcemidem w celu nagromadzenia komórek metafazowych. Niekiedy stosowana jest dłuższa, 24 lub 48-godzinna inkubacja kosmków w medium hodowlanym, umożliwiająca zwiększenie liczby komórek mitotycznych oraz uzyskanie lepszych chromosomów do analizy. Proces inkubacji kończy ekspozycja inkubowanych komórek na kolcemid. Stosując tę metodę badania wynik uzyskiwany jest w ciągu 1 do 3 dni. Nie występuje w niej też niebezpieczeństwo oznaczenia kariotypu matki zamiast kariotypu płodu ponieważ w tkankach matczynych, mogących znajdować się w materiale biopsyjnym, nie ma dzielących się komórek. Stosowanie metody bezpośredniej wiąże się natomiast z ryzykiem stwierdze nia aberracji chromosomowej (zazwyczaj w mozaice z komórkami prawidłowymi stwierdzanej w 1 2% badań) obecnej tylko w kosmówce a nie występującej w komórkach płodu [24]. Zróżnicowanie problemów i ograniczeń diagnostycznych metody bezpośredniej i opartej na hodowli komórek kosmówki decyduje o konieczności równoczesnego stosowania obu tych metod. Należy pamiętać jednak, że wynik badania uzyskany przy zastosowaniu hodowli komórek zrębu mezodermalnego kosmków jest bardziej wiarygodny niż wynik uzyskany metodą bezpośrednią, w komórkach cytotrofoblastu. Decyduje o tym pochodzenie tych komórek z węzła zarodkowego blastocysty, z którego również rozwija się zarodek. W związku z tym jeśli w bezpośredniej metodzie badania stwierdzona zostanie aberracja istnieje bezwzględna konieczność weryfikacji tego wyniku w komórkach z hodowli lub inną metodą. Badanie krwi pępowinowej Ocena kariotypu w krwi pępowinowej dokonywana jest tylko w szczególnych sytuacjach diagnostycznych. Najczęściej w przypadku stwierdzenia w badaniu ultrasonograficznym wad rozwojowych płodu, sugerujących aberrację chromosomową oraz w celu weryfikacji kariotypu uzyskanego z amniocytów lub kosmówki. Przeprowadzenie badania powinno być zawsze poprzedzone testem potwierdzającym pochodzenie płodowe krwi uzyskanej z kordocentezy. Procedura badania nie różni się zasadniczo od stosowanej w rutynowym badaniu limfocytów krwi obwodowej. Hodowla prowadzona jest przez godzin w pożywce zawierającej fitohemaglutyninę stymulującą komórki do podziału in vitro. Możliwa jest także ocena kariotypu bez prowadzenia hodowli, a jedynie po krótkiej (2 3, lub 24 godz.) inkubacji krwi 4 w pożywce z kolcemidem ponieważ krew płodu zawiera spontanicznie dzielące się jądrzaste erytrocyty [25,26]. Mniejsza skuteczność tej metody, często niedostateczna jakość techniczna uzyskiwanych w niej preparatów chromosomowych decyduje o konieczności równoległego prowadzenia standardowych hodowli limfocytów. W wymagających tego sytuacjach diagnostycznych wynik badania uzyskanego metodą bezpośrednią weryfikowany jest w preparatach chromosomowych pochodzących z hodowli limfocytów. Wiarygodność wyniku oceny kariotypu w komórkach krwi płodu jest wyższa od uzyskiwanej w badaniach amniocytów i komórek trofoblastu. Należy jednak pamiętać, że stwierdzenie prawidłowego kariotypu w komórkach krwi nie wyklucza całkowicie obecności tkankowo-specyficznej mozaikowości. Dotyczy to szczególnie aberracji niektórych chromosomów [np. i(12p), 16 czy 20]. W ocenie skuteczności i wiarygodności metody analizy kariotypu w krwi pępowinowej należy także uwzględnić i to, że wykonanie badania metodą bezpośrednią umożliwia w niektórych przypadkach rozpoznanie tkankowo-specyficznej mozaikowości nie wykrywanej w badaniu komórek stymulowanych do podziału w hodowli in vitro [27]. Sugeruje się więc, że jest ona bardziej wiarygodną metodą oceny kariotypu niż metoda standardowa. Zasady analizy kariotypu w badaniach prenatalnych Uzyskanie wiarygodnego wyniku badania cytogenetycznego zapewnia zachowanie w badaniu ściśle określonej procedury diagnostycznej obejmującej również określone zasady analizy chromosomowej (Tabela 6) [28,29]. Każda wątpliwość diagnostyczna musi zostać w miarę możliwości wyjaśniona. W zależności od istoty problemu i wieku ciąży poprzez analizę dodatkowych komórek (zazwyczaj muszą pochodzić one z innych, niż analizowane pierwotnie, naczyń hodowlanych) lub przez zastosowanie różnych dodatkowych technik barwienia chromosomów (również metodami cytogenetyki molekularnej), albo poprzez weryfikację kariotypu w powtórnym badaniu (zazwyczaj w innej tkance). Jeśli problem powstał w badaniu komórek kosmówki to weryfikacji kariotypu można dokonać w amniocytach, gdy zaś wątpliwości dotyczą kariotypu amniocytów powtórne badanie wykonywane jest zazwyczaj w krwi pępowinowej. Wynik badania i jego interpretacja Specyfika badań prenatalnych, od wyników których zależą niekiedy dalsze losy ciąży, decyduje o bezwzględnej konieczności prawidłowej interpretacji, tak cytogenetycznej jak i klinicznej, wyniku diagnostycznego. Zazwyczaj nie jest ona trudna w przypadku stwierdzenia w badaniu niezrównoważonej aberracji strukturalnej, aberracji liczbowej lub zrównoważonej aberracji chromosomowej odziedziczonej po jednym z rodziców. Problemy interpretacyjne sprawiają najczęściej te wyniki badań, w których stwierdzana jest zrównoważona aberracja strukturalna powstała de novo, obecność chromosomów markerowych lub mozaikowość chromosomowa. Rzadziej, problemy interpretacyjne dotyczą wzrostu w hodowli komórek pochodzenia matczynego. Zrównoważona aberracja powstała de novo Interpretacja kariotypu płodu, w którym rozpoznana została aberracja strukturalna nie występująca w rodzinie jest trud-

5 Tabela 6. Zasady prenatalnej analizy kariotypu. Analiza komórek pochodzących z co najmniej 2 hodowli Ustalenie liczby chromosomów w co najmniej komórkach lub w komórkach pochodzących z co najmniej 15 kolonii Dokonanie analizy obrazu prążkowego poszczególnych chromosomów w 3 5 komórkach. Rozdzielczość prążkowa powinna być adekwatna do wskazania decydującego o wykonaniu badania. Sporządzenie 1 lub 2 kariogramów a w przypadku mozaikowości jednego kariogramu dla każdej linii komórkowej W przypadku stwierdzenia aberracji strukturalnej konieczność określenia jej pochodzenia (określenia kariotypu rodziców) W przypadku stwierdzenia mozaikowości chromosomowej konieczność różnicowania pomiędzy mozaikowością prawdziwą i pseudomozaikowością Stwierdzenie klonalnej aberracji występującej w komórkach pochodzących z co najmniej 2 naczyń hodowlanych upoważnia do określenia kariotypu jako mozaikowego na. Nie ma bowiem w takim przypadku pewności czy aberracja jest rzeczywiście w pełni zrównoważona. Dane kliniczne wskazują, że ryzyko nieprawidłowego fenotypu wynosi w takich przypadkach około 7% [30]. Chromosomy markerowe Małe, dodatkowe chromosomy markerowe (mar) stwierdzane są prenatalnie w ok. 0,15% badań, w tym powstałe de novo w 0,04 0,09% badań [30,31]. Obecnie dzięki technice fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), można stosunkowo łatwo ustalić od którego z chromosomów pochodzi chromosom mar. Mimo to ocena skutków klinicznych obecności takich chromosomów jest w wielu przypadkach trudna lub niemożliwa. Przyjmuje się, że ryzyko nieprawidłowego fenotypu dziecka jest małe w przypadku rodzinnego występowania chromosomu markerowego, natomiast dla chromosomów mar powstałych de novo (za wyjątkiem mar pochodzących z chromosomu 15), ryzyko to oceniane jest zależnie od rodzaju tego chromosomu na 7 28% [32]. Nie dotyczy to poznanych już dobrze zespołów związanych z takimi chromosomami mar jak invdup(15)(q11.2), i(12p), i(18p) oraz idic(22), dla których ryzyko to wynosi 100%. Mozaikowa forma występowania, małe rozmiary chromosomu mar oraz pochodzenie z niektórych chromosomów akrocentrycznych wiążą się z mniejszym ryzykiem nieprawidłowego fenotypu aniżeli w przypadku innych chromosomów markerowych. Mozaikowość i pseudomozaikowość Do trudnych pod względem interpretacji cytogenetycznej i klinicznej wyników pre natalnej analizy chromosomowej należą te badania, w których stwierdzana jest mozaikowość (np. trisomia współistniejąca z komórkami prawidłowymi). W takiej sytuacji konieczne jest zawsze rozstrzygnięcie czy jest to mozaikowość prawdziwa (występująca u płodu) czy też pseudomozaikowość. Mozaikowość prawdziwa definiowana jest jako obecność nieprawidłowych komórek w co najmniej dwóch koloniach znajdujących się w co najmniej dwóch naczyniach hodowlanych jeśli badanie wykonywane jest metodą in situ. W przypadku natomiast analizy preparatów sporządzanych z zawiesiny komórek jeśli nieprawidłowe komórki pochodzą z dwóch naczyń hodowlanych. Mozaikowatość prawdziwa stwierdzana jest w 0,25% badań. Pseudomozaikowość definiowana jest jako obecność nieprawidłowych komórek tylko w jednym z kilku naczyń hodowlanych. Może polegać na występowaniu jednej lub wielu nieprawidłowych komórek, stwierdzanym odpowiednio w 2,5 7% lub 0,6 1,1% badań [33 35]. Pseudomozaikowość powstaje zazwyczaj podczas hodowli in vitro. Może być też wynikiem obecności w hodowli nieprawidłowych komórek pochodzących z błon płodowych i trofoblastu. Wzrost w hodowli komórek matki może być przyczyną mozaikowości typu 46,XX/46XY. Stwierdzana jest ona w około 0,2 0,7% badań komórek płynu owodniowego i w 2 4% badań kosmówki [36 39]. Ze względu na to, że fakt ten może być stwierdzony jedynie w tych przypadkach, w których płód jest płci męskiej przypuszcza się, że rzeczywista częstość wzrostu w hodowli komórek matki jest dwukrotnie większa. Właściwa interpretacja wyniku badania w przypadku stwierdzenia mozaikowości jest możliwa jedynie po przeprowadzeniu analizy chromosomów komórek pochodzących z co najmniej dwóch naczyń hodowlanych. Sposób interpretacji wyniku zależy od stosowanej metody hodowli i sporządzania preparatów chromosomów. Uwzględniać on musi także i to jakiego chromosomu mozaikowość dotyczy. Od tego też zależy dalszy tok postępowania diagnostycznego [40]. Jeśli stwierdzona zostanie mozaikowa trisomia chromosomów 8, 9, 21, 13, 18, lub X i Y opisywana u żywo urodzonych dzieci, to prawdopodobieństwo, że jest to mozaikowość prawdziwa jest większe niż dla trisomii innych chromosomów. W takich przypadkach należy analizować większą liczbę kolonii lub komórek z kilku naczyń hodowlanych aniżeli wtedy, gdy stwierdzona została inna aberracja. Nie zawsze jednak możliwe jest jednoznaczne rozróżnienie mozaikowości od pseudomozaikowości. Wiele problemów sprawia także kliniczna interpretacja kariotypu mozaikowego [41]. Wynikają one z dużej różnorodności i zmienności indywidualnej fenotypu związanego z określonym rodzajem mozaikowości. Tylko w ¼ przypadków rozpoznanej prenatalnie mozaikowości prawdziwej stwierdzany jest nieprawidłowy fenotyp po urodzeniu. Szczególny problem interpretacyjny dotyczy mozaikowej trisomii chromosomu 12 i 20 [41 43]. Dzieci lub płody urodzone z tych ciąż są zazwyczaj prawidłowe jednak opisywane są także przypadki obecności wad rozwojowych. Szczególnie złożony jest problem interpretacji mozaikowości stwierdzanej w badaniach z zastosowaniem biopsji kosmówki [44]. W około 1 2% tych badań stwierdzana jest niezgodność pomiędzy kariotypem uzyskanym metodą bezpośrednią (metoda I) lub z zastosowaniem hodowli komórek (metoda II), a kariotypem płodu [24]. Połowę tych przypadków stanowią badania, w których metodą bezpośrednią uzyskano nieprawidłowy mozaikowy kariotyp podczas gdy kariotyp oznaczony metodą II i kariotyp płodu był prawidłowy [45]. Sytuację odwrotną, tzn. nieprawidłowy kariotyp oceniony metodą II a prawidłowy, odpowiadający kariotypowi płodu uzyskany me- 5

6 Tabela 7. Minimalne standardy skuteczności i czasu trwania prenatalnych badań cytogenetycznych [48]. todą I stwierdza się w 25% badań. Pozostałą część przypadków niezgodności kariotypu płodu z kariotypem uzyskanym w kosmówce stanowią trzy inne, spośród możliwych, warianty tej niezgodności. Z powyższego wynika, że w badaniach kosmówki istnieje niebezpieczeństwo rozpoznania aberracji, która w rzeczywistości u płodu nie występuje. Sytuacja odwrotna, tzn. obecność aberracji u płodu i brak jej w komórkach kosmówki, chociaż teoretycznie możliwa, w praktyce nie została opisana. Interpretacja kliniczna mozaikowości stwierdzanej tylko w łożysku a nie występującej u płodu uwzględniać powinna mechanizmy jej powstawania. Jednym z nich jest korekta stanu trisomicznego, w wyniku której powstać może disomia jednorodzicielska o zróżnicowanych, zależnie od chromosomu którego dotyczy, skutkach klinicznych [24,44,46]. Problemy związane z mozaikowością chromosomową występującą tylko w łożysku wiążą się ze złożonym procesem formowania łożyska i rozwoju zarodka z zygoty [24,44,45]. Zależnie od tego, w którym podziale komórkowym zygoty powstanie aberracja oraz w zależności od lokalizacji nieprawidłowej komórki w blastocyście, kariotyp kosmówki odpowiada lub nie kariotypowi rozwijającego się zarodka. Jak już wspomniano wcześniej, mozaikowość ograniczona do kosmówki stwierdzana jest rzadziej w badaniach z zastosowaniem hodowli komórek niż metodą bezpośrednią. Wynika to z tego, że typ i pochodzenie analizowanych tymi metodami komórek są różne. Namnażane w hodowli komórki zrębu mezodermalnego wywodzą się z pozaembrionalnej mezodermy. Powstaje ona z węzła zarodkowego, z którego rozwija się także zarodek. Natomiast komórki cytotrofoblastu badane w metodzie bezpośredniej powstają z najwcześniej oddzielającego się od linii zarodkowej trofoblastu. Prawdopodobieństwo powstania aberracji w tych komórkach jest znacznie wyższe niż w komórkach, z których wywodzi się zarodek. Dlatego też w każdym przypadku stwierdzenia mozaikowości chromosomowej w badaniu kosmówki konieczna jest weryfikacja wyniku w komórkach płynu owodniowego lub krwi pępowinowej. Standardy jakości prenatalnych badań cytogenetycznych 6 Materiał badany Skuteczność,% Czas badania, dni Płyn owodniowy i kosmówka Krew pępowinowa wymogi dotyczące jakości dla czasu badań są spełnione jeśli 80% badań mieści się w zakresie minimalnego standardu Piśmiennictwo: 1. Fuchs F, Riis P: Antenatal sex determination. Nature, 1956; 177: Steele MW, Breg WR: Chromosome analysis of human amniotic-fluid cells. Lancet, 1966; i: Jacobson CB, Barter RG: Intrauterine diagnosis and management of genetic defects. Am J Obstet Gynecol, 1967; 99: Nadler HL, Gerbie AB: Role of amniocentesis in the intrauterine detection of genetic disorders. N Engl J Med, 1968; 282: Specyfika prenatalnych badań cytogenetycznych polega między innymi na ograniczonych możliwościach weryfikacji wyników tych badań oraz konieczności uzyskania wyniku diagnostycznego w jak najkrótszym czasie. Niekiedy wynik oceny kariotypu decyduje o dalszych losach ciąży. Konieczne jest zatem, tak z klinicznego jak i prawnego względu, zapewnienie odpowiednio wysokiego standardu tych badań [29,47]. Dotyczy to nie tylko procedury i metodyki badania, oraz sposobu przedstawiania i interpretacji wyniku, ale także okresu ciąży, w którym badanie jest wykonywane i jakości uzyskanego materiału do badania. Szczególnie ważna jest dbałość o to aby stosowane metody hodowli komórek płodu zapewniały wysoką skuteczność badań, optymalny do analizy indeks mitotyczny i morfologię chromosomów oraz jak najkrótszy czas badania. Sposób prowadzenia hodowli powinien zapewniać możliwość odpowiedniej interpretacji wyniku w przypadku wątpliwości diagnostycznych. Minimalne, możliwe do zaakceptowania standardy dotyczące skuteczności i czasu badań przedstawiono w Tabeli 7. We wszystkich przypadkach rozpoznanej w badaniu prenatalnym aberracji niezrównoważonej, mozaikowości lub nie w pełni scharakteryzowanej aberracji konieczna jest weryfikacja wyniku po urodzeniu dziecka. Każdy nieprawidłowy wynik badania cytogenetycznego, który zadecydował o zakończeniu ciąży musi zostać zweryfikowany badaniem komórek płodu. Jeśli aberracja miała charakter mozaikowy, weryfikacja dokonana powinna być w kilku tkankach. Na zakończenie należy zwrócić uwagę na jeszcze jeden istotny problem. Prenatalne badania cytogenetyczne wykonywane są najczęściej z powodu zwiększonego ryzyka aneuploidii lub wystąpienia u dziecka aberracji rodzicielskiej. Skuteczność identyfikacji tych nieprawidłowości jest rzędu 99,9%. Nie można jednak oczekiwać, że w badaniu rutynowym rozpoznana zostanie bardzo mała, czasami submikroskopowa aberracja, do identyfikacji, której konieczne jest zastosowanie specjalistycznych metod analizy chromosomowej (np. zwiększonej rozdzielczości prążkowej czy techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ FISH). Metody te nie mogą być stosowane we wszystkich badaniach. Tak więc wynik badania prenatalnego, podobnie jak każdego innego badania diagnostycznego, daje zazwyczaj odpowiedź tylko na zadane w skierowaniu pytanie, a sformułowane w procesie porady genetycznej. 5. Wilson RD: Early amniocentesis: a clinical review. Pren Diagn, 1995; 15: Mohr J: Foetal genetic diagnosis: development of techniques for early sampling of foetal cells. Acta Pathol Microbiol Scand, 1968; 73: Simoni G, Gimelli G, Cuoco C i wsp: First trimester fetal karyotyping: one thousand dia gnoses. Hum Genet, 1986; 72: 203 9

7 Sachs ES, Jahoda MGJ, Kleijer WJ i wsp: Impact of first-trimester chromosome, DNA, and metabolic studies on pregnancies at high genetic risk: Experience with 1,000 cases. Am J Med Genet, 1988; 29: Rhoads GG, Jackson LG, Schlesselman SE i wsp: The safety and efficacy of chorionic villus sampling for early prenatal diagnosis of cytogenetic abnormalities. N Engl J Med, 1989; 320: Simoni G, Brambati B, Danesino C i wsp: Efficient direct chromosome analysis and enzyme determinations from chorionic villi sampling in first trimester of pregnancy. Hum Genet, 1983; 63: Kuliev A, Jackson L, Froster U i wsp: Chorionic Villus sampling safety. Report of World Health Organization/EURO meeting in association with the Seventh International Confe rence on Early Prenatal Diagnosis of Genetic Disorders. Am J Obstet Gynecol, 1996; 174: Wegner RD: Diagnostic Cytogenetics. Springer-Verlag, Gersen LG, Keagle MB (Eds): The principles of Clinical Cytogenetics, Humana Press, Czepulkowski B: Analyzing Chromosomes BIOS Scientific Publishers Ltd, Mittelman F: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (1995), KARGER and Cytogenet Cell Genet, Daniel A, Hook EB, Wulf G: Risk of unbalanced progeny at amniocentesis to carriers of chromosome rearrangements: data from United States and Canadian laboratories. Am J Med Genet, 1989; 33: Boue A, Gallano P: A collaborative study of the segregation of inherited chromosome structural rearrangements in 1356 prenatal diagnoses. Prenat Diagn 1984; 4(Special Issue): Ferguson-Smith MA: Prenatal chromosome anlysis and its impacton the birth incidence of chromosome disorders. Br Med Bull, 1983; 39: Gardner RJM, Sutherland GR: Chromosome abnormalities and genetic counselling. Oxford University Press, Cheung SW, Spitznagel E, Featherstone T, Crane JP: Exclusion of chromosomal mosaicism in amniotic fluid cultures: Efficacy of in situ versus flask technique. Prenat Diagn, 1990; 10: Richkind KE, Risch NJ: Sensitivity of chromosomal mosaicism detected by different tissue culture methods. Prenat Diagn, 1990; 10: Simoni G, Terzoli G, Rossella F: Direct chromosome preparation and cilture using cho rionic villi: An evaluation of the two techniques. Am J Med Genet, 1990; 35: Jakubów K, Bocian E: Diagnostyka prenatalna aberracji chromosomowych w I trymestrze ciąży Metody analizy cytogenetycznej trofoblastu. Gin Pol, 1993; 64: Hahnemann JM, Vejerslev LO: European collaborative research on mosaicism in CVS (EUCROMIC)- fetal and extrafetal cell lineages in 192 gestations with CVS mosaicism involving single autosomal trisomy. Am J Med Genet, 1997; 70: Garnham I, Sutherland GR: Rapid karyotyping of neonates on the basis of data from cord blood. Am J Hum Genet, 1987; 41: Murphy C, Khan T, Karr C, Wolff J: Direct and overnight cultures of cord blood for chromosomal analysis: J Assoc Genet Technol, 2000; 26: Garnham I, Fernandez H, Callen DF i wsp: Discordance between direct and PHA-stimulated chromosome preparations from neonates. Clin Genet, 1994; 45: Knutsen T, Bixenman HA, Lawce H, Martin PK: Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cytogenet Cell Genet, 1990; 44: Bocian E: Diagnostyka cytogenetyczna chorób genetycznych kryteria i zasady procedury diagnostycznej oraz systemu kontroli jakości badań. Diagn Lab, 2001; 37(Supl.1): Warburton D: De novo balanced chromosome rearrangements and extra marker chromosomes identified at prenatal diagnosis: clinical significance and distribution of breakpoints. Am J Hum Genet, 1991; 49: Sachs ES, Van Hemel JO, Den Hollander JC, Jahoda GJ: Marker chromosomes in a series of prenatal diagnoses. Cytogenetic and follow-up studies. Prenat Diagn, 1987; 7: Crolla JA: FISH and molecular studies of autosomal supernumerary marker chromosomes excluding those derived from chromosome 15: Review of the literature. Am J Med Genet, 1998; 75: Worton RG, Stern R: A: Canadian collaborative study of mosaicism in amniotic fluid cells. Prenat Diagn, 1984; 4: Bui T-H, Iselius L, Lindsten J: European collaborative study on prenatal diagnosis: mosaicism, pseudomosaicism and single abnormal cells in amniotic fluid vell cultures. Prenat Diagn, 1984; 4: Hsu LYF: United States survey on chromosome mosaicism and pseudomosaicism in prenatal diagnosis. Prenat Diagn, 1984; 4: Winsor EJT, Tomkins DJ, Kalousek D i wsp: Cytogenetic aspects of the Canadian early and mid- trimester amniotic fluid trial (CEMAT). Prenat Diagn, 1999; 19: Canadian Collaborative CVS Amniocentesis Clinical Trial Group: Multicentre randomi sed clinical trial of chorion villus sampling and amniocentesis. Lancet, 1989; 1: Teshima IE, Kalousek DK, Vrekemans MJJ i wsp: Chromosome mosaicism in CVS and amniocentesis samples. Prenat Diagn, 1992; 12: Ledbetter DH, Zachary JM, Simpson JL i wsp: Cytogenetic results from the U.S. collabo rative study on CVS. Prenat Diagn, 1992; 12: Gardner RJM, Sutherland GR: Chromosome abnormalities detected at prenatal diagnosis. W: Chromosome abnormalities and genetic counselling, 1996, Oxford University Press, 1996; Johnson A, Wapner RJ: Mosaicism: implications for postnatal outcome. Curr Opin Obstet Gynecol, 1997; 10: Brosens J, Overton C, Lavery S.A, Thornton S: Trisomy 12 mosaicism diagnosed by amniocentesis. Acta Obstet Gynecol Scand, 1996; 75: Hsu LYF, Kaffe S, Perlis TE: A revisit of trisomy 20 mosaicism in prenatal diagnosis- an overview of 103 cases. Prenat Diagn, 1991; 11: Kalousek DK, Vekemans M: Confined placental mosaicism. J Med Genet, 1996; 33: Bianchi DW, Wilkins-Haug LE, Enders AC, Hay ED: Origin of extraembrionic mesoderm in experimental animals: relevance to chorionic mosaicism in humans. Am J Med Genet, 1993; 46: Engel E: Uniparental disomy revisited: The first twelve years. Am J Med Genet, 1993; 46: EUCROMIC Quality Assessment Group: Quality guidelines and standards for genetic laboratories/ clinics in prenatal diagnosis on fetal samples obtained by invasive procedures. Eur J Hum Genet, 1997; 5: Waters JJ, Rodgers KS: External quality assurance for clinical cytogenetics in the United Kingdom: Current status and future prospects. J Assoc Genet Technol, 1998; 24: