Kultury komórkowe i tkankowe prowadzenie, namnażanie i przygotowanie do testowania nowych leków antynowotworowych

Transkrypt

1 Kultury komórkowe i tkankowe prowadzenie, namnażanie i przygotowanie do testowania nowych leków antynowotworowych mgr Małgorzata Semik Politechnika Rzeszowska

2 Historia kultur tkankowych Pierwszą próbę hodowli komórek zwierzęcych podjął Alfred Vulpian. 1856r. - doświadczenia Carla F. W. Ludwiga, który opracował techniki perfuzji narządów po ich usunięciu z ciała. W roku 1895r. Vulpian wyizolował fragmenty ogona kijanki i próbował je hodować w wodzie (komórki przeżyły, ale nie namnażały się). W latach angielski lekarz Sydney Ringer prowadzi doświadczenia nad wpływem składników krwi na pracę mięśnia sercowego zwierząt. Opracowuje skład roztworu soli nieorganicznych ( 0,75% NaCl), udowadnia, że funkcjonowanie izolowanych narządów przez długi okres czasu jest możliwe.

3 Historia kultur tkankowych Rok 1885 roku embriologowi niemieckiemu Wilhelmowi Roux udało się utrzymać w ogrzewanym roztworze soli płytkę nerwową uzyskaną z zarodka kurczaka. Rok 1903 próby hodowli komórek in vitro zostały uwieńczone sukcesem, Francuz Justyn Jolly prowadzi hodowlę jądrzastych krwinek czerwonych żab i salamander, krwinki in vitro ulegały podziałom przez 15 dni. Trzy lata później Charles William Beebe wraz z Jamesem Ewingiem zdołali utrzymać in vitro komórki chłonaakomięsaka pochodzące od psa. Rok 1907 Stany Zjednoczone, Ross G. Harrison uzyskuje in vitro zróżnicowane komórki nerwowe embrionów płazów, technika hodowli w kropli wiszącej. Odkrycia Harrisona udowodniły, że funkcja fizjologiczna komórek może być kontynuowana in vitro.

4 Historia kultur tkankowych Wprowadzenie aseptyki prze chirurga amerykańskiego Alexisa Carella. Pobieranie materiału i zakładanie hodowli oraz jej prowadzenie odbywa się zgodnie z podstawowymi zasadami aseptyki. Przełom w hodowli tkanek, możliwe długie utrzymanie hodowli bez zakażenia. Rok 1911 Burrows i Carrel z powodzeniem utrzymali w hodowli eksplanty pochodzące od dorosłych psów, kogutów, szczurów i świnek morskich, a także tkanki nowotworowe. Wprowadził nowe naczynia hodowlane do hodowli popularnie zwane karelkami. Hodowla fibroblastów zarodka kurczęcia była prowadzona w laboratorium Carella przez 34 lata.

5 Historia kultur tkankowych Rok 1914r. Albertowi H. Ebelingowi udaje się założyć hodowlę komórek nabłonkowych. Rok 1933 Carrel wraz z Georgie Otto Geyem przedstawiają metodę hodowli tkanek w probówkach rotujących tzw. roller tube. Dzięki tym wszystkim osiągnięciom możliwe stało się hodowanie komórek na dużą skalę. Początki hodowli tkanek w Polsce Prof. Zygmunt Grodziński z UJ odbywa staż w laboratorium stworzonym przez Carella, zakłada swoją hodowle fragmentów tkanek zarodka kurczęcia.

6 Historia kultur tkankowych Rok 1916 Pyton Rous po raz pierwszy użył trypsyny w celu oddysocjowania pojedynczych komórek od fragmentów tkanki. Komórki umieszczono w pożywce hodowlanej uzyskując zawiesinę żywych komórek. W latach 50-tych opanowano metod zakładania hodowli pierwotnych komórek ptaków i ssaków. Druga połowa XX wieku konstruowano pierwsze neokanki i neonarządy. Opracowanie nowych pożywek hodowlanych i nowych technik hodowli umożliwiło utrzymanie ex vivo już nie tylko izolowanych komórek ale także tkanek i narządów.

7 W jakim celu hodować komórki i tkanki? Dzięki hodowlom tkankowym i komórkowym można: w laboratoriach przeprowadzać badania pierwotne, np. w celu sprawdzenia wpływu nowych związków chemicznych (potencjalnych leków, np. nowotworowych) na komórki. w przemyśle biotechnologicznym produkować substancje stosowane jako leki w medycynie, np.: przeciwciała, białka enzymatyczne, skomplikowane związki organiczne (których synteza chemiczna byłaby droższa) wektory wirusowe do terapii genowej

8 HODOWLA KOMÓREK I TKANEK Hodowla tkankowa = kultura tkankowa (ang. tissue culture) Hodowla komórkowa = kultura komórkowa (ang. cell culture) Hodowla komórek ssaczych Hodowla komórek bakteryjnych Hodowla komórek/ tkanek roślinnych

9 HODOWLA KOMÓREK I TKANEK Hodowla komórek ludzkich fibroblastów pobranych z biopsji skóry Hodowla komórek nerwowych Hodowla nerki

10 HODOWLA KOMÓREK I TKANEK Inkubacja hodowla do 24 godzin. Hodowla metoda pozwalająca na utrzymanie poza organizmem czyli in vitro żywych komórek, fragmentów tkanek lub narządów ponad 24 godziny.

11 HODOWLA KOMÓREK I TKANEK Hodowla komórek jest modelem in vitro próbującym odzwierciedlać system komórek in vivo. Umożliwia utrzymanie żywych komórek poza organizmem. Hodowla tkanek jest modelem in vitro naśladującym tkanki i narządy in vivo. Umożliwia konstruowanie modeli tkankowych i narządowych z zachowaniem specyficznego układu przestrzennego i interakcji różnych typów komórek w tkance lub narządzie

12 TYPY HODOWLI Podział ze względu na pochodzenie komórek i ich czas życia: hodowle pierwotne (pierwszorzędowe) hodowle komórek wyizolowanych bezpośrednio z organizmu. hodowle wtórne (drugorzędowe) hodowla powstała z hodowli pierwotnej po wielokrotnym pasażowaniu.

13 HODOWLE PIERWOTNE HODOWLE PIERWOTNE zakładane są z pojedynczych komórek świeżo wyizolowanych z organizmu. komórki bezpośrednio izolowane z organizmu np. komórki krwi, lub uzyskane mechanicznie drobne fragmenty - eksplantaty zawiesiny komórkowe, uzyskane po działaniu enzymów na pobrany fragment tkanki. komórki proliferują i tworzą skupiska (kolonie) w zawiesinie lub jednolitą warstwę na podłożu. w wyniku proliferacji powstaje hodowla konfulentna HODOWLA KONFULENTNA (ang. confluent monolayer) komórki zajmują 100% dostępnej powierzchni wzrostu

14 Rozrost komórek z eksplantatu czerniaka ludzkiego Miejsce po eksplantacie 3 dni po eksplantacji 7 dni po eksplantacji

15 HODOWLE WTÓRNE HODOWLE WTÓRNE subkultura komórek powstała z hodowli pierwotnej po wielokrotnym pasażowaniu.

16 TYPY HODOWLI TKANEK Podział ze względu na typ hodowli: hodowle w zawiesinie hodowle przylegające hodowle na mikronośnikach hodowle przestrzenne

17 HODOWLE W ZAWIESINIE HODOWLE W ZAWIESINIE - to hodowle rozproszonych komórek. Komórki żeby proliferować nie muszą mieć kontaktu z podłożem. Najczęściej prowadzi się je w butelkach hodowlanych, specjalnych naczyniach z wbudowanym mieszadełkiem, a na skalę przemysłową w bioreaktorach. Najczęściej tak hoduje się komórki nowotworowe lub linie komórkowe nowotworowe.

18 HODOWLE NA MIKRONOŚNIKACH HODOWLI NA MIKRONOŚNIKACH o zwiększonej powierzchni wzrostu. metoda hodowli Wetzel wprowadza do zawiesiny komórek kulki dekstranu (Sephadex A50), Mikronośniki dekstranowe kuleczki typu CYTODEX (powlekane kolagenem) lub biosfery polistyrenowe, żelowe, kolagenowe, celulozowe, Mikronośniki żelowe GELASFERY (powlekane fibronektyną), Mikronośniki porowate - zwiększenie gęstości hodowli 20-50x Hodowle na mikronośnikach są najlepsze dla linii komórkowych

19 HODOWLE PRZESTRZENNE HODOWLE PRZESTRZENNE hodowle w których odtworzono wzajemne przestrzenne kontakty między komórkami. Modele naśladujące tkanki Do hodowli przestrzennych zaliczamy: 1. hodowle narządowe 2. agregaty i sferoidy (modele 3D) 3. hodowle organotypowe 4. hodowle na sztucznych naczyniach włosowatych 5. modele tkankowe i narządowe

20 HODOWLE NARZĄDOWE HODOWLE NARZĄDOWE to hodowle modeli najbardziej zbliżone do stanu tkanki lub narządu in vivo. pierwsze hodowle narządowe wprowadziła Fell hodowle całych organów lub ich fragmentów, struktura narządu nie zostaje naruszona, a zróżnicowanie tkanek nie ulega zmianie najbardziej odpowiednie do tego typu hodowli są narządy płaskie np. gruczoł mlekowy myszy, przepona lub tkanki zarodkowe ssaków, tego typu hodowle pomagają poznać mechanizm interakcji pomiędzy tkankami i komórkami w danym narządzie, pomagają w konstruowaniu modeli tkanek i narządów in vitro.

21 AGREGATY AGREGATY to pierwsze modele przestrzenne 3D. mogą być zbudowane z jednego lub kilku typów komórek, zawierają macierz zewnątrzkomórkową i połączenia międzykomórkowe optymalna średnica agregatu wynosi µm, funkcjonalnie przypomina on tkankę model ten jest wysoce użyteczny w prowadzeniu hodowli komórek wysoce zróżnicowanych, przejawiających krótki okres aktywności, stosuje się je do oceny stopnia inwazyjności komórek wyizolowanych z guzów nowotworowych. to doskonały model do badań wpływu czynników odżywczych na wzrost, metabolizm, zdolności proliferacyjne, czy żywotność komórek nowotworowych. a także do badań apoptozy i inwazyjności nowotworów agregaty komórek mózgu są stosowane do badań nad chorobami Alzheimera, Parkinsona.

22 SFEROIDY SFEROIDY - powstają z agregatów, które w czasie hodowli przekroczyły krytyczną średnicę agregatu rosnące w systemie 3D sferoidy zachują się jak guzy nowotworowe, mikroobszary nowotworowe lub ogniska przerzutów, wykazano wiele podobieństw pomiędzy tkanką nowotworową in vivo, a sferoidom powstającym in vitro

23 SFEROIDY wielokomórkowe sferoidy utworzone z komórek mięsaka do badań proliferacji i różnicowania komórek nowotworowych, sferoidy wyprowadzone z materiału bipsyjnego, służą do testowania leków przeciwnowotworowych, sferoidy wyprowadzone z linii komórkowych ustalonych - bardzo dobry modele służący do poznania mechanizmów kontrolujących przenikanie leków, ich wiązanie i działanie, hodowle sferoidów wątroby, trzustki, chrząstki.

24 TYPY HODOWLI

25 KOKULTURY ORGANOTYPOWE KOKULTURY ORGANOTYPOWE hodowla 2 lub większej liczby typów komórek w systemie przestrzennym to modele komórkowe wykazujące jak najwięcej cech narządu z którego zostały wyprowadzone kokultura organotypowa endometrium, komórki stworzonego modelu rosną, proliferują, wydzielają różne białka, kokultura organotypowa skóry, z komórek autologicznych pacjenta uzyskuje się znaczne fragmenty skóry w stosunkowo krótkim czasie, 2-3 tygodnie, stosowany przy rozległych oparzeniach,

26

27 ZALETY HODOWLI TKANEK 1. Kontrolę środowiska, wszystkie parametry można ustalić i zmierzyć, 2. Możliwość badania funkcji różnych typów komórek budujących tkanki i narządy. 3. Możliwość badania interakcji pomiędzy komórkami wchodzącymi w skład tkanek i narządów. 4. Powtarzalność wyników hodowli 5. Koszt prowadzenia badań in vitro jest znacznie niższy niż koszt badań na zwierzętach.

28 WADY HODOWLI TKANEK 1. Ścisła aseptyka, 2. Masowa produkcja komórek w biotechnologii jest bardzo kosztowna (wyhodowanie 100g tkanki to już hodowla na skalę przemysłową), 3. Wiele hodowli jest niestabilnych, wyniki wahają się z dnia na dzień, dotyczy to zwłaszcza ciągłych ludzkich linii komórkowych, 4. Długotrwałe hodowle są trudne do utrzymania, utrata fenotypu komórek. 5. Badania żmudne, czasochłonne ale niewątpliwie bardzo korzystne.

29 LINIE KOMÓRKOWE LINIA KOMÓRKOWA - powstaje z hodowli pierwotnej po pierwszym pasażu. Wyróżniamy dwa typy linii komórkowych: SZCZEPY KOMÓRKOWE - linia o określonej długości życia (najczęściej wywodzi się z linii komórek diploidalnych, po kilku pasażach zamiera) ustalona, nieśmiertelna, dzieląca się w nieskończoność (powstaje albo w wyniku unieśmiertelnienia komórek na skutek transfekcji lub transformacji spontanicznej). CIĄGŁA LINIA KOMÓRKOWA - Mogą to być również linie komórek nowotworowych.

30 LINIE KOMÓRKOWE

31 LABORATORIUM Funkcjonalna pracownia: 1. Boks wydzielona przestrzeń jałowa. 2. Przestrzeń czysta przeznaczona do przygotowywania roztworów. 3. Przestrzeń brudna zmywalnia. 4. Części cytologiczno-biochemicznej przeznaczonej do wykonywania manipulacji na prowadzonych hodowlach

32 LABORATORIUM Wyposażenie pracowni: 1. Komora laminarna komora z przepływem sterylnego powietrza 2. Inkubator CO 2 3. Mikroskop świetlny (odwrócony i kontrastofo-fazowy) 4. Lodówki, zamrażarki (niskiego mrożenia) naczynie Dowera 5. Wirówki, suszarki, sterylizatory 6. Liczniki komórek 7. Inny sprzęt laboratoryjny (drobny sprzęt do prowadzenie hodowli)

33 WARUNKI HODOWLI 1. Rodzaj powierzchni na której rosną komórki 2. Pożywka (medium) 3. Skład fazy gazowej nad pożywką dostęp CO 2 (zwykle 5-7,5%, co umożliwia utrzymanie odpowiedniego ph) ph 7,2 7,5 dostęp tlenu (zwykle 1-9%, naczynia hodowlane posiadają odpowiednie filtry) wysoka wilgotność powietrza 4. Temperatura hodowli ( zwykle 37 C)

34 WARUNKI HODOWLI Do hodowli komórkowych (tkankowych) używa się przede wszystkim sterylnych, szklanych lub plastikowych (obecnie najczęściej) naczyń płaskodennych. butelki hodowlane, płytki (szalki) Petriego, płytki do hodowli, Mikronośniki Powierzchnie powlekane

35 WARUNKI HODOWLI Naturalne Pożywka czyli medium surowica limfa osocze krwi alfa-, beta- i gammaglobulinowe frakcje surowicy bydlęcej Syntetyczne o znanym składzie.

36 PODŁOŻA HODOWLANE H. Eagle i R.C. Parker twórcy pierwszej pożywki o określonym składzie chemicznym (EMEM Eagle minimum essential medium). Standardowe składniki pożywek: Źródło energii węglowodany (najczęściej glukoza, fruktoza i galaktoza), Aminokwasy, białka i peptydy Kwasy tłuszczowe, lipidy i cholesterol Witaminy zwłaszcza grupy B Hormony i czynniki wzrostu Mikroelementy Zn, Cu, Sn, Fe Antybiotyki penicylina, streptomycyna Surowica bydlęca (FBS), cielęca (PBS)

37 PODŁOŻA HODOWLANE Najczęściej używane rodzaje pożywek podstawowych (4 rodzaje): 1. EMEM oraz ich modyfikacje 2. pożywki opracowane przez RPMI w różnych odmianach 3. pożywki z surowicą (pożywka Fishera, Trowella, Williamsa) 4. pożywki podstawowe bez surowicy (TCM 199, MCDB, NCTC)

38 ZAKŁADANIE HODOWLI Praca z kulturami komórkowymi (tkankowymi) dzieli się na kilka etapów: Izolacja komórek Utrzymanie linii komórkowej Wykorzystanie namnożonych komórek

39 IZOLACJA KOMÓREK Izolacja komórek oddzielenie komórek od macierzy zewnątrzkomórkowej, która spaja komórki w tkance. Tkanki kroi się na małe kawałki, które następnie zanurza się w pożywce. Tkanki frakcjonuje się na poszczególne komórki: rozdrobnienie mechaniczne tkanki (homogenizator) trawienie enzymami proteolitycznymi (np. trypsyną, kolagenaza) traktowanie EDTA wiąże jony wapnia potrzebne do kontaktu komórkakomórka

40 IZOLACJA KOMÓREK Izolacja frakcji subkomórkowych rozbicie komórek szok osmotyczny, ultradźwięki, niejonowe detergenty, tarcie mechaniczne (przecierając komórki przez gęste sita, lub ucierając w homogenizatorach)

41 IZOLACJA KOMÓREK Wirowanie różnicowe - metoda wirowania przy określonych prędkościach: pozwala na rozdzielenie większych i cięższych komórek od mniejszych i lżejszych, można rozdzielić także frakcje subkomórkowe

42 IZOLACJA KOMÓREK Metoda wirowania w gradiencie gęstości: pozwala na bardziej precyzyjne rozdzielenie odpowiednich frakcji gradient może być skokowy lub ciągły gradienty gęstości przygotowuje się z takich substancji jaki: sacharoza, glikol, chlorek cezu w gradiencie gęstości komórki bądź frakcje subkomórkowe wędrują do rejonów o gęstości, która jest równa ich własnej, tworząc pasma oczyszczonych frakcji

43 IZOLACJA KOMÓREK Separacja komórek z wykorzystaniem cytofluorometru przepływowego - FACS: Metoda wykorzystuje specjalne przeciwciała połączone z odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym, które łączą się ze specyficznym typem komórek. Wyznakowane komórki można oddzielić od niewyznakowanych w cytofluorometrze przepływowym.

44 OCENA WZROSTU KOMÓREK W HODOWLI Wzrost komórek w prowadzonych hodowlach określa się na podstawie tzw. krzywych wzrostu.

45 FAZY WZROSTU KOMÓREK FAZA LAG bezpośrednio po wysianiu komórek. Czas ten jest okresem adaptacji komórek. W tym czasie komórki przyczepiają się do podłoża i rozpłaszczają na dnie naczynia. Ilość komórek w tej fazie na ogół nie zmienia się, ale czasem zdarza się, że może ona maleć na skutek obumierania uszkodzonych komórek, które nie przyczepione do podłoża obumierają. Komórki w tym okresie wchodzą w fazę G1. Dla różnych komórek faz lag ma różną długość.

46 FAZY WZROSTU KOMÓREK FAZA LOG faza logarytmicznego wzrostu. Okres intensywnego wzrostu liczby komórek. Komórki dzielą się w tym czasie bardzo intensywnie. Faza ta kończy się między pierwszym a drugim podwojeniem populacji komórek, osiągnięciem stanu konfluencji. Charakterystycznymi cechami komórek w tej fazie wzrostu jest ich duża żywotność i wysokie tempo metabolizmu. Długość tej fazy zależy od gęstości wyjściowej hodowli.

47 FAZY WZROSTU KOMÓREK FAZA PLATAU faza stacjonarna. Czas, w którym komórki osiągają konfluencję i ustają ich podziały, Dochodzi do zahamowania kontaktowego wzrostu.. Pewna ilość komórek umiera, sporadycznie obserwuje się podziały komórkowe. Nie zmienia się liczba komórek w hodowli (taka sama ilość komórek proliferuje jak i obumiera). Hodowla taka charakteryzuje się szybkim wykorzystaniem medium. Komórki po osiągnięciu stanu konfluencji należy przepasażować. FAZA UTRATY KOMÓREK stopniowe obumieranie komórek spowodowane brakiem składników odżywczych, obniżeniem ph i gromadzeniem się toksycznych produktów metabolizmu komórkowego

48 HODOWLE KRÓTKOTERMINOWE 1. krótkoterminowych hodowle tkankowe prowadzi się przez kilka dni 2. najczęsciej jest to hodowla w zawiesinie (komórki nie rosną w warstwie) 3. podczas hodowli nie dokonuje się wcale wymiany podłoża hodowlanego (pożywka jest wystarczająca dla całej hodowli), ani nie pasażuje się hodowli 4. inkubacja w temp. 37 C w inkubatorze w atmosferze ochronnej z 5 % CO 2. Przykłady: - hodowla krótkoterminowa krwi żylnej na kariotyp (trwa 72 godziny) - hodowla w celu ustalenia nabytych aberracji chromosomowych (trwa 48 godzin) - hodowla krwi pępowinowej (trwa godzin)

49 HODOWLE DŁUGOTERMINOWE 1. długoterminowe hodowle tkankowe prowadzi się w czasie od kilku tygodni do kilku miesięcy, 2. podczas prowadzenia takiej hodowli tkanek, przeprowadza się pełną wymianę podłoża hodowlanego, komórki wielokrotnie się pasażuje, Przykłady: długotrwała hodowla komórek płynu owodniowego (trwa od 2 do 4 tygodni) hodowla materiału z biopsji skóry i mięśni, guzów i innych organów (trwa od 3 do 9 tygodnii).

50 HODOWLA KOMÓREK PŁYNU OWODNIOWEGO 1. Komórki uzyskuje się przy porodzie (amniopunkcja), dostajemy zawiesinę komórek w płynie owodniowym, 2. Określoną objętość płynu owodniowego (ok. 20 ml) wirujemy (1000 obr/min) 3. Supernatant usuwamy, zaś osad komórek jest przenoszony do medium hodowlanego w odpowiednim naczyniu hodowlanym 4. Pojemniki są umieszczone w inkubatorze 5. Hodowle pozostawia się bez manipulacji przez 5-7 dni

51 HODOWLA KOMÓREK PŁYNU OWODNIOWEGO 6. Po tym czasie dokonuje się pierwszej kontroli wzrostu przy użyciu mikroskopu odwróconego, powinny tworzyć się pierwsze kolonie 7. Pierwsza pełna wymiana podłoża hodowlanego 8. Następne fazy hodowli hodowlę monitorować codziennie 9. Między 8 a 12 dniem kultura komórek jest gotowa do badań np. cytogenetycznych 10. Druga równoległa kultura jest następnie pasażowana 11. Tak zyskujemy kolejne kultury do wielokrotnych badań cytogenetycznych

52 UTRZYMANIE HODOWLI Zmiana pożywki w hodowli Częstość zmian pożywki zależy od gęstości komórek w hodowli, tempa ich proliferacji i metabolizmu komórek Po pierwszych objawach niekorzystnych warunków hodowlanych, należy zmienić medium, a jeżeli hodowla jest bardzo zagęszczona przepasażować ją. Wymianę pożywki dokonujemy w sterylnych warunkach. Pasażownie Przeniesienie komórek z dotychczasowego naczynia hodowlanego do nowego. Pasażowaniu poddaje się komórki przed osiągnięciem konfulencji. Na podstawie ilości pasaży można określić wiek komórek.

53 UTRZYMANIE HODOWLI Mrożenie i przechowywanie Rok 1949r. - Christopher Polge przypadkowo odkrywa, że plemniki kurze przeżywają zamrożenie w obecności 5-10% glicerolu. Zawiesza się je w medium zawierającym substancje działającą krioprotekcyjnie chroniącą komórki przed zniszczeniem w czasie zamrażania (DMSO, glicerol) Proces zamrażania przeprowadza się stopniowo, obniżając temperaturę o 1 C na minutę. Po zamrożeniu komórki umieszcza się w ciekłym azocie (-196 C). Transport komórek Komórki zamrożone transportuje się w suchym lodzie, zamrożone pozostają przez 3 dni.

54 Wykorzystanie namnożonych komórek PRZYKŁADOWE ZASTOSOWANIE HODOWLI KOMÓRKOWYCH testowanie toksyczności leków produkcja szczepionek hodowanie tkanek do przeszczepów badanie odpowiedzi immunologicznej badanie interakcji komórka-komórka produkcja rekombinowanych białek produkcja przeciwciał monoklonalnych baza do hodowli wirusów... i wiele innych zastosowań...

55 Linie komórkowe W nazwach mają zakodowane następujące informacje: Pochodzenie komórek, np. NBH = normal human brain Numer linii, jeżeli było wyprowadzonych kilka linii, np. NBH-1, NBH-2 Numer pasażu lub liczbę podwojeń populacji np. NBH 2/2

56 LINIE KOMÓRKOWA Pierwsza stała linia komórkowa HeLa (1951r.) Założona przez George a i Margaretę Gey Wyizolowana z wycinka nowotworu szyjki macicy Henrietty Lacks

57 BANKI LINI KOMÓRKOWYCH 1. Europejska Kolekcja Linii Komórkowych ECACC (ang. The Europen Collection of Cell Cultures), która powstała w roku 1984r. w Wielkiej Brytanii. Obecnie największa z kolekcji zwierzęcych linii komórkowych na świecie. Dysponuje ona 1000 różnych linii komórkowych wyprowadzonych z różnych tkanek, pochodzących od 45 gatunków zwierząt. W liczbie tej miesić się ponad 400 linii komórkowych wyprowadzonych z prawidłowych tkanek ludzkich oraz nowotworów. Kolekcja ta posiada również linie stanowiące modele dla badań wielu chorób ( schizofrenie, raka sutka) 2. Amerykańska Kolekcja Hodowli Komórkowych ATCC

58 Wyprowadzanie linii komórkowych Wyprowadzenie linii komórek mięśni gładkich ściany naczyń. Etapy: Najczęściej wyprowadza się z eksplantatów, lub izoluje się je z warstwy wewnętrznej aorty. Wycina się aortę i umieszcza na szalce Petriego, a następnie tnie na małe kawałeczki Umieszcza się pocięte kawałki w odpowiednio przygotowanej butelce hodowlanej wypełnionej odpowiednim medium. Umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze w temp. 37 C, 5% CO 2 Mięsnie gładki migrują z ekspalntatów w czasie 2-3 tygodni. W czasie prowadzenia hodowli, wymienia się część pożywki i monitorować migrację komórek pod mikroskopem odwróconym Ekspantaty usuwa się a komórki pasażuje 1 pasaż linia komórkowa.

59 OWADZIE LINIE KOMÓRKOWE W badaniach genetycznych, molekularnych i biochemicznych używa się głównie hodowli linii komórkowych owadów. Wszystkie linie są dostępne w ATCC. Najważniejsze linie komórkowe owadów: Linia Sneider2 zwana potocznie komórkami S2 wyprowadzona z komórek embrionów muszki owocowej (Drosophila melenogaster) Linia Sf9, Sf21 wyprowadzone z komórek jajników Spodopera fugiperda,szeroko stosowana w badaniach biochemicznych wymagających wysokiego poziomu produkcji białek Linia High Five nowa wyłącznie komercyjna linia uzyskana z jaj Trichoplusia, zaleta to wysoki poziom sekrecji białek.

60 LUDZKIE LINIE KOMÓRKOWE DU145 (Rak gruczołu krokowego) Klasyczne linie komórek raka prostaty Linia komórek otrzymana z przerzutów do mózgu Linia ta nie jest wrażliwe na hormony MDA-MB-438 (Rak piersi) PC3 (Rak gruczołu krokowego) T47D (Rak piersi) THP-1 (Ostra białaczka szpikowa) Ta linia komórek używana jest do badań i analizy immunohistochemicznych komórek białaczkowych Uzyskana z krwi obwodowej chłopca z ostrą białaczką szpikową

61 LUDZKIE LINIE KOMÓRKOWE Lncap (Rak gruczołu krokowego) Ta linia komórek ludzkich jest bardzo często używane w onkologii Linia komórkowa to wrażliwe komórki ludzkiego raka gruczołowego, uzyskane z przerzutów do węzłów chłonnych od pacjenta w 1977 roku Zawierają w cytoplazmie wysoce specyficzne receptory androgenowe Saos-2 cells (Rak kości) Linia uzyskane z pierwotnego mięsaka w 1973r. Stwierdzono, że hodowla tych komórkek ma kilka funkcji osteoblastów i może być użyteczne jako stabilny model hodowli ludzkich komórek osteoblastów

62 LEKI PRZECIWNOWOTWOROWE Dogodnym źródłem dla pozyskiwania leków przeciwnowotworowych są substancje pochodzenia roślinnego Przykładowe leki przeciwnowotworowe Baccharin Bruceantin Camptothecin Ellipticine Homoharringtonine Maytansine Taxol Tripdiolide Vinblastine Taxol

63 Dziękuję za uwagę