(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. A23L 1/29 (06.01) A23L 1/308 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 27.. Europejski Biuletyn Patentowy /43 EP B1 (4) Tytuł wynalazku: Zastosowanie polidekstrozy do symulowania funkcjonalnych zalet oligosacharydów mleka ludzkiego u niemowląt karmionych mieszanką (30) Pierwszeństwo: US P US (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 08/08 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 11/07 (73) Uprawniony z patentu: Mead Johnson Nutrition Company, Evansville, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 BRYON W. PETSCHOW, Evansville, US ROBERT J. MCMAHON, Evansville, US GLENN R. GIBSON, Reading, GB ROBERT A. RASTALL, Reading, GB RENIA GEMMELL, Iffley, GB MARIA SAARELA, Espoo, FI ANNA-MARJA AURA, Espoo, FI (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Ewa Wojasińska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 28P27341PL00 EP B1 Opis STAN TECHNIKI (1) Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy stosowania polidekstrozy do symulacji funkcjonalnych właściwości oligosacharydów z ludzkiego mleka u niemowląt. (2) Opis stanu techniki [0002] Mikroflora jelit niemowląt tworzy się szybko w ciągu kilku pierwszych tygodni po urodzeniu. O naturze tej kolonizacji jelitowej decyduje początkowo wczesna ekspozycja na źródła drobnoustrojów w środowisku, jak i zdrowie niemowlęcia. Silny wpływ na jelitową populację bakterii ma to, czy niemowlę jest karmione piersią [ang. breast-fed] czy mieszanką [ang. formula fed]. 1 [0003] U niemowląt karmionych piersią na przykład dominuje Bifidobacterium spp. wśród bakterii jelitowych, a udział Streptococcus spp. i Lactobacillus spp. jest mniejszy. Natomiast mikroflora niemowląt karmionych mieszanką jest bardziej zróżnicowana, zawiera Bifidobacterium spp. i Bacteroides spp. oraz bardziej patogenne gatunki, jak Staphylococcus, Escherichia coli i Clostridia. Rozmaite gatunki Bifidobacterium w kale niemowląt karmionych piersią i mieszanką także się różnią. [0004] Bifidobacteria uważa się ogólnie za korzystne 2 bakterie i wiadomo jest, że zabezpieczają przed kolonizacją przez patogenne bakterie. Następuje to przypuszczalnie przez współzawodniczenie o receptory powierzchniowe komórek, współzawodniczenie o podstawowe składniki pokarmowe,

3 3 wytwarzanie czynników przeciwbakteryjnych i wytwarzanie związków inhibitujących, takich jak krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA), które mogą obniżać ph kału i inhibitować potencjalnie patogenne bakterie. Bifidobacteria wiążą się również z odpornością na infekcje przewodu żołądkowojelitowego (GI ang. gastrointestinal) i infekcje dróg oddechowych oraz ze zwiększoną czynnością immunologiczną u dzieci i niemowląt. Dlatego promowanie środowiska jelitowego, w którym dominują Bifidobacteria, stało się celem w opracowaniu formuł odżywczych dla niemowląt karmionych mieszanką. [000] Ludzkie mleko (HM) zawiera szereg czynników, które mogą przyczyniać się do wzrostu i populacji Bifidobacteria w mikroflorze jelitowej niemowląt. Wśród tych czynników jest 1 złożona mieszanina ponad 130 różnych oligosacharydów osiągających poziom tak wysoki, jak 8-12 g/l w przejściowym i dojrzałym mleku. Kunz, i inni, Oligosaccharides in Human Milk: Structure, Functional, and Metabolic Aspects, Ann. Rev. Nutr. : (00). Te oligosacharydy są odporne na trawienie enzymatyczne w górnym odcinku przewodu żołądkowojelitowego i osiągają okrężnicę w nienaruszonym stanie, gdzie służą jako substraty do fermentacji w okrężnicy. [0006] Sądzi się, że oligosacharydy z ludzkiego mleka wywołują wzrost liczby Bifidobacteria we florze okrężniczej 2 wraz z redukcją liczby bakterii potencjalnie patogennych. Kunz, i inni, Oligosaccharides in Human Milk: Structure, Functional, and Metabolic Aspects, Ann. Rev. Nutr. : (00); Newburg, Do the Binding Properties of Oligosaccharides in Milk Protect Human Infants from

4 4 Gastrointestinal Bacteria?, J. Nutr. 217:S980-S984 (1997). Sposobem, w jaki oligosacharydy HM mogą zwiększyć liczbę Bifidobacteria i zmniejszyć liczbę bakterii potencjalnie patogennych jest działanie jako konkurencyjne receptory i inhibitowanie wiązania patogenów z powierzchnią komórki. Rivero-Urgell, i inni, Oligosaccharides: Application in Infant Food, Early Hum. Dev. 6(S):43-2 (01). [0007] Oprócz zmniejszenia liczby patogennych bakterii i wzmocnienia populacji Bifidobacteria podczas fermentacji oligosacharydów z ludzkiego mleka wytwarzają krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe (SCFA), takie jak kwasy octowy, propionowy i masłowy. Uważa się, że te krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe przyczyniają się do kaloryczności, służą jako główne źródło energii dla nabłonka jelitowego, pobudzają absorpcję sodu i 1 wody w okrężnicy i zwiększają trawienie i absorpcję w jelicie cienkim. Dodatkowo uważa się, że krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe mają wpływ na ogólny stan zdrowotny układu żołądkowo-jelitowego przez modulowanie rozwoju układu żołądkowo-jelitowego i funkcji immunologicznych. [0008] Fermentacja oligosacharydów ludzkiego mleka redukuje również stężenia w kale amoniaku, aminy i fenolu, które uważa się za główne składniki odpowiedzialne za zapach kału. Cummings & Macfarlane, The Control and Consequences of Bacterial Fermentation in the Human Colon, J. Appl. 2 Bacteriol. 70: (1991); Miner & Hazen, Ammonia and Amines: Components of Swine-Building Odor ASAE 12: (1969); Spoelstra, Origin of Objectionable Components in Piggery Wastes and the Possibility of Applying Indicator Components for Studying Odour Development, Agric. Environ.

5 : (1980); O Neill & Phillips, A Review of the Control of Odor Nuisance from Livestock Buildings: Part 3. Properties of the Odorous Substances which have been Identified in Livestock Wastes or in the Air Around them J. Agric. Eng. Res. 3:23-0 (1992). [0009] Na skutek obecności oligosacharydów w ludzkim mleku profil krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych niemowlęcia karmionego piersią jest bardzo różny od profilu niemowlęcia karmionego mieszanką. Na przykład niemowlęta karmione piersią praktycznie nie wytwarzają maślanu, a octan stanowi w przybliżeniu 96% całkowitego wytwarzania krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Lifschitz, i inni, Characterization of Carbohydrate Fermentation in Feces of Formula-Fed and Breast- Fed Infants, Pediatr. Res. 27: (1990); Siigur, i inni, 1 Faecal Short-Chain Fatty Acids in Breast-Fed and Bottle-Fed Infants. Acta. Paediatr. 82:36-38 (1993); Edwards, i inni, Faecal Short-Chain Fatty Acids in Breast-Fed and Formula-Fed Babies, Acta. Paediatr. 72: (1994); Parrett & Edwards, In Vitro Fermentation of Carbohydrates by Breast Fed and Formula Fed Infants, Arch. Dis. Child 76: (1997). Natomiast kiedy niemowlęta są karmione mieszanką mają także octan (74%) jako główny krótkołańcuchowy kwas tłuszczowy w kale oprócz znacznych ilości propionianu (23%) i małych ilości maślanu (3%). Te różnice pomiędzy profilami 2 krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych niemowląt karmionych piersią i niemowląt karmionych mieszanką mogą wpływać na energię, trawienie i ogólne zdrowie niemowląt karmionych mieszanką.

6 6 [00] Ponieważ mleko krowie i dostępne w handlu mieszanki dla niemowląt na bazie mleka krowiego dostarczają tylko śladowe ilości oligosacharydów często stosuje się prebiotyki by uzupełnić dietę niemowląt karmionych mieszanką. Prebiotyki definiuje się jako nietrawione składniki pożywienia, które korzystnie wpływają na gospodarza przez selektywne pobudzanie wzrostu i/lub aktywności jednej lub ograniczonej liczby bakterii w okrężnicy, które mogą poprawić zdrowie gospodarza. Gibson, G.R. & Roberfroid, M.B., Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota-Introducing the Concept of Probiotics, J. Nutr. 12: (199). Pospolite prebiotyki obejmują fruktooligosacharydy glukooligosacharydy, galaktooligosacharydy, izomaltooligosacharydy, ksylooligosacharydy i laktulozę. 1 [0011] Ujawniono wprowadzanie różnych prebiotycznych składników do mieszanek dla niemowląt. Zgłoszenie patentowe St. Zjedn. Ameryki nr na rzecz Bindelsa i innych ujawnia na przykład mieszankę dla niemowląt z większą zawartością białka i przynajmniej jednym prebiotykiem. Prebiotykowym komponentem może być lakto-n-tetraoza, lakto-nfukopentoza, laktuloza (LOS), laktosacharoza, rafinoza, galakto-oligosacharyd (GOS), fruktooligosacharyd (FOS), oligosacharydy pochodne polisacharydów sojowych, oligosacharydy na bazie mannozy, arabinooligosacharydy, 2 ksylooligosacharydy, izomaltooligosacharydy, glukany, oligosacharydy sialilowe i fukooligosacharydy. [0012] Podobnie, zgłoszenie patentowe St. Zjedn. Ameryki nr na rzecz Haschke go ujawnia sposób zwiększenia odpowiedzi immunologicznej obejmujący podawanie przynajmniej

7 7 jednego prebiotyku. Prebiotyk ten może być oligosacharydem wytwarzanym z glukozy, galaktozy, ksylozy, maltozy, sacharozy, laktozy, skrobi, ksylanu, hemicelulozy, inuliny lub ich mieszanin. Prebiotyk może być obecny w płatkach zbożowych dla niemowląt. [0013] Niestety podawanie powyższych prebiotyków niemowlętom karmionym mieszanką ma jednak wiele wad. Chociaż mogą one korzystnie wpływać na populację probiotyków w jelicie, nie wytwarzają one profilu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podobnego do profilu u niemowląt karmionych piersią. Dodatkowo fermentacja wielu z tych prebiotycznych substancji przebiega z bardzo dużą szybkością, co wytwarza często nadmiar gazu, powiększenie obwodu brzucha, wzdęcia i rozwolnienia. Dlatego też wybór substancji prebiotycznych w 1 mieszankach dla niemowląt powinien mieć na celu maksymalizację potencjalnych korzyści i minimalizację takich niepożądanych skutków ubocznych. [0014] Zatem korzystne byłoby podawanie prebiotycznej substancji symulującej funkcjonalne właściwości oligosacharydów ludzkiego mleka u niemowląt, takie jak wzrost populacji i gatunków korzystnych bakterii w jelicie niemowlęcia i wytwarzanie profilu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podobnego do profilu u niemowląt karmionych piersią. Dodatkowo niemowlęta powinny dobrze tolerować 2 prebiotyczną substancję, która nie powinna wytwarzać lub powodować nadmiaru gazu, powiększenia rozmiaru brzucha, wzdęcia lub rozwolnienia.

8 8 STRESZCZENIE WYNALAZKU [001] Niniejszy wynalazek określa się przez załączone zastrzeżenia patentowe. [0016] Pokrótce zatem, niniejszy wynalazek wskazuje po pierwsze nowe zastosowanie polidekstrozy (PDX) w wytwarzaniu mieszanki dla niemowląt do symulowania funkcjonalnych właściwości oligosacharydów z ludzkiego mleka przez zwiększanie wytwarzania octanu i zmniejszanie wytwarzania maślanu, by uzyskać profil krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych u niemowląt karmionych mieszanką podobny do profilu u niemowląt karmionych piersią oraz przez zmniejszanie szybkości i stopnia fermentacji prebiotyków w jelicie niemowląt karmionych mieszanką. [0017] Niniejszy wynalazek wskazuje również mieszankę dla 1 niemowląt zawierającą PDX i GOS, w której całkowita ilość PDX i GOS w mieszance dla niemowląt wynosi pomiędzy 1,0 g/l i,0 g/l, podawanej codziennie. [0018] PDX można stosować w wytwarzaniu mieszanki dla niemowląt dla zwiększenia populacji i gatunków korzystnych bakterii u niemowląt karmionych mieszanką. [0019] PDX można stosować w wytwarzaniu mieszanki dla niemowląt dla wytworzenia profilu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) u niemowląt karmionych mieszanką podobnego do profilu u niemowląt karmionych piersią. W 2 szczególności PDX może spowodować zwiększony poziom octanu i zmniejszony maślanu w profilu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych. [00] PDX można stosować w wytwarzaniu mieszanki dla niemowląt dla zmniejszenia szybkości i stopnia fermentacji

9 9 prebiotyków w jelicie niemowlęcia karmionego mieszanką. Bardziej szczegółowo wynalazek powoduje zmniejszenie całkowitego wytwarzania gazu oraz wytwarzania ditlenku węgla w jelicie niemowlęcia. [0021] Do kilku stwierdzonych korzyści osiągniętych przez niniejszy wynalazek należy dobra tolerancja przez niemowlęta i symulowanie funkcjonalnych właściwości oligosacharydów z ludzkiego mleka u niemowląt, takich jak zwiększona populacja i gatunki korzystnych bakterii w jelicie niemowlęcia, optymalizacja charakterystyk kału i wytwarzanie profilu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podobnego do profilu u niemowląt karmionych piersią. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW [0022] Dla pełniejszego zrozumienia niniejszego wynalazku 1 odsyła się teraz do następujących opisów rozpatrywanych wraz z towarzyszącymi im rysunkami. [0023] Rysunek 1 ilustruje wytwarzanie całości krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas fermentacji GOS, LOS, PDX2 i FOS. [0024] Rysunek 2 ilustruje zmiany ph podczas fermentacji GOS, LOS, PDX2 i FOS. [002] Rysunek 3 ilustruje względny udział wytwarzania kwasu octowego w fermentacji GOS, LOS, PDX2 i FOS. [0026] Rysunek 4 ilustruje względny udział wytwarzania kwasu 2 propionowego w fermentacji GOS, LOS, PDX2 i FOS. [0027] Rysunek ilustruje względny udział wytwarzania kwasu masłowego w fermentacji GOS, LOS, PDX2 i FOS. [0028] Rysunek 6 ilustruje względne udziały kwasów octowego, propionowego, masłowego i wytwarzanie całości

10 krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w fermentacji GOS, LOS, PDX2 i FOS. [0029] Rysunek 7 ilustruje wytwarzanie całości krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas fermentacji różnych kombinacji prebiotycznych węglowodanów. [0030] Rysunek 8 ilustruje zmiany ph podczas fermentacji różnych kombinacji prebiotycznych węglowodanów. [0031] Rysunek 9 ilustruje wytwarzanie całości krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas fermentacji różnych kombinacji PDX i GOS. [0032] Rysunek ilustruje stężenie kwasu octowego wytwarzanego podczas fermentacji różnych kombinacji PDX i GOS. [0033] Rysunek 11 ilustruje stężenia kwasu propionowego 1 wytwarzanego podczas fermentacji różnych kombinacji PDX i GOS. [0034] Rysunek 12 ilustruje stężenie kwasu masłowego wytwarzanego podczas fermentacji różnych kombinacji PDX i GOS. [003] Rysunek 13 ilustruje wytwarzanie gazów jako sumaryczną objętość podczas fermentacji GOS, LOS, PDX2 i FOS. [0036] Rysunek 14 ilustruje wytwarzanie gazów jako stężenie ditlenku węgla podczas fermentacji GOS, LOS, PDX2 i FOS. [0037] Rysunek 1 ilustruje wytwarzanie gazów jako stężenie 2 wodoru podczas fermentacji GOS, LOS, PDX2 i FOS. [0038] Rysunek 16 ilustruje wytwarzanie gazów jako stężenie disiarczku wodoru podczas fermentacji GOS, LOS, PDX2 i FOS.

11 11 [0039] Rysunek 17 jest podsumowaniem prebiotycznego działania ludzkiego mleka, FOS, LOS, GOS, PDX i różnych ich kombinacji na mikroflorę kału. SZCZEGÓŁOWY OPIS KORZYSTNYCH POSTACI REALIZACJI [0040] Obecnie zostaną szczegółowo przedstawione postacie realizacji wynalazku, z których jeden lub kilka przykładów podaje się poniżej. Każdy przykład podaje się jako wyjaśnienie wynalazku, a nie jako ograniczenie wynalazku. Faktycznie będzie oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie, że można dokonywać różnych modyfikacji i zmian w niniejszym wynalazku bez wychodzenia poza zakres tego wynalazku. Przykładowo, cechy zilustrowane lub opisane jako część pewnej postaci realizacji można zastosować w innej postaci realizacji uzyskując następną postać realizacji. 1 [0041] Tak więc zamiarem jest, by niniejszy wynalazek obejmował takie modyfikacje i zmiany jakie wchodzą w zakres załączonych zastrzeżeń patentowych. Inne przedmioty, cechy i aspekty niniejszego wynalazku ujawnia się lub są oczywiste z poniższego szczegółowego opisu. Specjaliści w tej dziedzinie powinni mieć świadomość tego, że niniejsza dyskusja jest tylko opisem przykładowej postaci realizacji i jej zamiarem nie jest ograniczanie szerszych aspektów niniejszego wynalazku. Definicje 2 [0042] Stosowany w niniejszym opisie termin prebiotyk oznacza nietrawiony składnik pokarmowy, który korzystnie wpływa na gospodarza przez selektywne pobudzanie wzrostu i/lub aktywności jednej lub ograniczonej liczby bakterii w okrężnicy, które mogą polepszyć zdrowie gospodarza.

12 12 [0043] Termin probiotyk oznacza mikroorganizm o niskiej lub niewykazujący żadnej patogeniczności, który wywiera korzystne skutki na zdrowie gospodarza. [0044] Stosowany w niniejszym opisie termin niemowlę oznacza człowieka w wieku poniżej około jednego roku. [004] Terapeutycznie skuteczna ilość, stosowana w niniejszym zgłoszeniu, oznacza ilość zapewniającą prebiotyczny skutek u osobnika. [0046] Termin symulujący, stosowany w niniejszym opisie, oznacza mający lub przybierający formę albo wygląd symptomatycznego podobieństwa lub mający albo wytwarzający symptomatyczne podobieństwo. [0047] Terminy funkcjonalne właściwości oznaczają nieodłączną własność lub charakterystykę powodującą, że coś 1 się wydarza. Przykłady funkcjonalnych właściwości oligosacharydów ludzkiego mleka w niniejszym wynalazku obejmują wzrost populacji i gatunków korzystnych bakterii, wytwarzanie profilu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych o dużej zawartości kwasu octowego i małej kwasu masłowego oraz powodowanie niskiej szybkości i małego stopnia fermentacji prebiotyków w jelicie. [0048] Stosowany w niniejszym opisie termin mieszanka dla niemowląt oznacza kompozycję spełniającą wymagania żywieniowe niemowlęcia dzięki temu, że jest ona substytutem 2 ludzkiego mleka. W Stanach Zjednoczonych zawartość mieszanki dla niemowląt wyznaczają przepisy federalne podane w rozdziałach 0, 6 i 7 dokumentu 21 C.R.F. Te przepisy definiują ilości makroskładnika odżywczego, witaminy,

13 13 minerału i innych składników w celu stymulowania żywieniowych i innych właściwości ludzkiego mleka z piersi. Wynalazek [0049] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem odkryto nowe zastosowanie PDX w wytwarzaniu mieszanki dla niemowląt symulującej funkcjonalne właściwości oligosacharydów z ludzkiego mleka u niemowląt karmionych mieszanką. Podawanie PDX zapewnia korzystny wpływ na populację i gatunki probiotyków, wytwarza profil krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, który jest podobny do profilu niemowląt karmionych piersią i jest fizycznie dobrze tolerowany przez niemowlęta. [000] PDX jest nietrawionym węglowodanem, który syntezowano z losowo sieciowanej glukozy i sorbitolu. Nie jest on 1 trawiony w górnym odcinku przewodu żołądkowo-jelitowego i jest tylko częściowo fermentowany w dolnym odcinku przewodu żołądkowo-jelitowego, co sprawia, że jest korzystnym składnikiem dla stanu zdrowotnego układu trawiennego. Fizjologiczne korzyści związane z PDX obejmują zwiększoną masę kału, zmniejszony czas przechodzenia, niższe ph kału i obniżone stężenie gnilnych substancji w okrężnicy. U dorosłych wykazano również, że przyjęcie PDX pomaga w promocji i przyroście korzystnych bakterii w jelicie i wytwarzaniu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych. 2 [001] PDX zidentyfikowano jako prebiotyczną substancję dla dorosłych w oparciu o jej działanie w przewodzie żołądkowojelitowym. Zgłoszenie patentowe St. Zjedn. Ameryki nr na rzecz Mayra-Makinena i innych dotyczy na przykład kompozycji, która obejmuje probiotyk i jeden lub

14 14 więcej prebiotyków, gdzie prebiotyk może być GOS, palatinozooligosacharydem, oligosacharydem sojowym, gencjooligosacharydem, ksylooligomerami, niedegradowaną skrobią, laktosacharozą, LOS, laktitolem, maltitolem lub PDX. Podobnie, patent St. Zjedn. Ameryki nr na rzecz Kana dotyczy ciekłego pokarmu zawierającego PDX i oligosacharydy, który jest użyteczny w leczeniu zaparć. [002] PDX nie zidentyfikowano jednak jako prebiotyk, który zapewnia korzyści niniejszego wynalazku i może być podawany niemowlętom. Dobrze wiadomo, że mikroflora jelitowa niemowląt jest daleko mniej rozwinięta niż ma to miejsce w przypadku osoby dorosłej. Podczas gdy mikroflora dorosłego człowieka składa się z ponad 13 mikroorganizmów i blisko 00 gatunków, mikroflora niemowlęcia zawiera tylko ułamek tych 1 mikroorganizmów zarówno względem liczby niemianowanej [ang. absolute number], jak i różnorodności gatunkowej. Ponieważ bakteryjne populacje i gatunki różnią się tak ogromnie pomiędzy jelitem niemowlęcia i jelitem dorosłego, nie można przyjąć, że prebiotyczna substancja, która ma korzystne działanie u dorosłych, będzie miała również korzystne działanie u niemowląt. [003] U dorosłych wykazano, że przyjęcie PDX zwiększa wytwarzanie octanu i maślanu. Ponieważ maślan nie występuje w znacznych ilościach u niemowląt karmionych piersią i 2 kojarzono go ze szkodliwym działaniem, jeśli był wytwarzany w znaczących ilościach w jelicie niemowlęcia, PDX nie uważa się ogólnie za odpowiedni składnik w pokarmie niemowląt w oparciu o obserwowane działania w układzie żołądkowo-jelitowym dorosłego. Tak oto zadziwiające i nieoczekiwane było to, że

15 1 PDX był faktycznie metabolizowany głównie do octanu i propionianu, przy małym tworzeniu się maślanu. Zatem, PDX nie tylko wykazywał pozytywny wpływ na populację i gatunki korzystnych bakterii w przewodzie pokarmowym niemowlęcia, ale PDX wytwarzał także profil krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, który był bardzo podobny do profilu niemowląt karmionych piersią oraz byłby niezwykle dobrze tolerowany przez niemowlęta. [004] Jeden szczególny odnośnik dotyczący PDX w kontekście podawania niemowlętom faktycznie wskazuje coś przeciwnego do niniejszego wynalazku. W zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki nr na rzecz Rautonena twierdzi się, że PDX może stymulować układ immunologiczny niemowląt. W tym zgłoszeniu Zgłaszający ujawnia jednak, że PDX faktycznie 1 obniża populację Bifidobacteria w jelicie niemowlęcia (zgłoszenie Rautonena, paragraf 0074). Zgłaszający uzasadnia ten rezultat stwierdzając, że duża ilość Bifidobacteria może powodować również mniej pożądane fizjologiczne skutki, takie jak jelitowe choroby bakteryjne i immunosupresję. (Zgłoszenie Rautonena, paragraf 0069). [00] Ponieważ odnośnik wskazuje, że PDX faktycznie obniża populację Bifidobacteria w jelicie niemowlęcia, jest to w bezpośrednim konflikcie z nauczaniem z niniejszego zgłoszenia. Dodatkowo, odnośnik nie wykazuje, że PDX zwiększa 2 wytwarzanie octanu, zmniejsza wytwarzanie maślanu lub zmniejsza szybkość fermentacji prebiotyków w jelicie niemowlęcia. [006] Zgodnie z zastosowaniem niniejszego wynalazku niemowlęciu należy podawać terapeutycznie skuteczną ilość PDX

16 16 w celu symulowania funkcjonalnych właściwości oligosacharydów ludzkiego mleka. Terapeutycznie skuteczna ilość PDX może wynosić pomiędzy 1,0 g/l i,0 g/l, do codziennego podawania. W innej postaci realizacji terapeutycznie skuteczna ilość PDX może wynosić pomiędzy 2,0 g/l i 8,0 g/l, do codziennego podawania. [007] PDX jest dostępny w handlu z wielu źródeł. STA-LITE PDX, na przykład, jest dostępny w -funtowych torbach z Honeyville Grain, Inc., mieszczącej się w Salt Lake City, UT. Alternatywnie, Litesse Ultra PDX jest dostępny w handlu z Danisco Sweeteners, Ltd., mieszczącej się w Wielkiej Brytanii. [008] PDX dobrze nadaje się do włączenia do mieszanki dla niemowląt, gdyż zawiera tylko 1 cal/g, w porównaniu do 4 1 cal/g dla typowych prebiotyków. Jest on również dobrze rozpuszczalny i neutralny w smaku. Dlatego jego dodanie do mieszanki dla niemowląt nie zmieniłoby fizycznej lub smakowej charakterystyki kompozycji. [009] Zgodnie z zastosowaniem wynalazku PDX dodaje się do mieszanki dla niemowląt, którą ma się następnie karmić niemowlęta. [0060] Mieszanka dla niemowląt do zastosowania w niniejszym wynalazku jest korzystnie kompletna w sensie odżywczym i zawiera zwykle odpowiednie rodzaje i ilości lipidów, 2 węglowodanów, białek, witamin i minerałów. Ilość lipidów lub tłuszczy zwykle może wynosić od około 3 do około 7 g/0 kcal. Ilość białek zwykle może wynosić od około 1 do około g/0 kcal. Ilość węglowodanów zwykle może wynosić od około 8 do około 12 g/0 kcal. Źródła białek mogą być jakiekolwiek

17 17 stosowane w tej dziedzinie, na przykład beztłuszczowe mleko, białko z serwatki, kazeina, białko kazeinowe, białko sojowe, białko hydrolizowane, aminokwasy i tym podobne. Źródła węglowodanów mogą być jakiekolwiek stosowane w tej dziedzinie, na przykład laktoza, glukoza, proszek z syropu kukurydzianego, maltodekstryny, sacharoza, skrobia, proszek z syropu ryżowego i tym podobne. Źródła lipidów mogą być jakiekolwiek stosowane w tej dziedzinie, na przykład oleje roślinne takie jak olej palmowy, olej sojowy, oleina palmowa, olej kokosowy, olej zawierający triglicerydy o średniej długości łańcucha, wysoce oleinowy olej słonecznikowy, wysoce oleinowy olej szafranowy i tym podobne. [0061] Dogodnie można stosować e dostępne w handlu mieszanki dla niemowląt. Enfalac, Enfamil, mieszankę dla wcześniaków 1 Enfamil, Enfamil z żelazem, Lactofree, Nutramigen, Pregestimil lub ProSobee (dostępny z Mead Johnson & Company, Evansville, IN, U.S.A.), na przykład, można uzupełniać odpowiednimi ilościami PDX i stosować w praktyce tego wynalazku. [0062] W postaci realizacji zastosowania niniejszego wynalazku należy podawać PDX w połączeniu z innym prebiotykiem. Wybrany prebiotyk może być dowolnym prebiotykiem znanym w tej dziedzinie. Przykłady prebiotyków obejmują, lecz nie ograniczają się do nich: FOS, inulinę, 2 glukooligosacharyd, GOS, izomaltooligosacharyd, ksylooligosacharyd, oligosacharydy sojowe, chitooligosacharyd, gencjooligosacharyd, mannooligosacharyd, LOS, laktosacharozę, rafinozę, arabinooligosacharyd, glukany, siallilooligosacharyd i fukooligosacharyd.

18 18 [0063] W szczególnej postaci realizacji zastosowania niniejszego wynalazku należy podawać PDX w połączeniu z GOS. GOS jest mieszaniną oligosacharydów składającą się z D- glukozy i D-galaktozy. Czasami określa się ją jako transgalakto-oligosacharyd. Jest on wytwarzany z D-laktozy przez β-galaktozydazę, którą można uzyskać z Aspergillus oryzae. Sugerowano, że GOS zwiększa absorpcję wapnia i zapobiega zanikowi kości u dorosłych. GOS zidentyfikowano jako prebiotyk, który jest użyteczny do podawania niemowlętom w zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki nr na rzecz Bindelsa i innych. [0064] W tej postaci realizacji zastosowania niniejszego wynalazku należy podawać PDX i GOS w stosunku PDX do GOS pomiędzy 9:1 i 1:9. W innej postaci realizacji stosunek 1 PDX:GOS może być pomiędzy :1 i 1:. W jeszcze innej postaci realizacji stosunek PDX:GOS może być pomiędzy 1:3 i 3:1. W szczególnej postaci realizacji stosunek PDX:GOS może być około :. W innej szczególnej postaci realizacji stosunek PDX:GOS może być około 8:2. [006] Terapeutycznie skuteczna ilość kombinacji PDX:GOS może być pomiędzy 1,0 g/l i,0 g/l do codziennego podawania. W innej postaci realizacji terapeutycznie skuteczna ilość kombinacji PDX:GOS może być pomiędzy 2,0 g/l i 8,0 g/l do codziennego podawania. W szczególnej postaci realizacji 2 terapeutycznie skuteczna ilość kombinacji PDX:GOS może być pomiędzy 2 g/l PDX i 2 g/l GOS do codziennego podawania. [0066] W innej specyficznej postaci realizacji zastosowania niniejszego wynalazku należy podawać PDX w połączeniu z LOS. LOS jest semisyntetycznym disacharydem utworzonym z D-

19 19 galaktozy i D-fruktozy połączonych wiązaniem β-glukozydowym. Jest on odporny na hydrolizę przez ludzkie enzymy trawienne, lecz ulega fermentacji w jelicie cienkim. Jest on dobrze rozpuszczalny i ma słodki smak. LOS zidentyfikowano jako prebiotyk, który jest użyteczny do podawania niemowlętom w zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki nr na rzecz Bindelsa i innych. LOS jest dostępny w handlu z wielu źródeł. [0067] W tej postaci realizacji zastosowania niniejszego wynalazku należy podawać PDX i LOS w stosunku pomiędzy około 9:1 i 1:9. W innej postaci realizacji stosunek PDX do LOS może być pomiędzy około :1 i 1:. W jeszcze innej postaci realizacji stosunek PDX do LOS może być pomiędzy około 3:1 i 1:3. W szczególnej postaci realizacji stosunek PDX do LOS 1 może być około :. W innej szczególnej postaci realizacji stosunek PDX do LOS może być około 8:2. [0068] Terapeutycznie skuteczna ilość kombinacji PDX:LOS może być pomiędzy około 1,0 g/l i,0 g/l do codziennego podawania. W innej postaci realizacji terapeutycznie skuteczna ilość kombinacji PDX:LOS może być pomiędzy około 2,0 g/l i 8,0 g/l do codziennego podawania. W szczególnej postaci realizacji terapeutycznie skuteczna ilość kombinacji PDX:LOS może być około 2 g/l PDX i 2 g/l LOS do codziennego podawania. 2 [0069] W jeszcze innej postaci realizacji zastosowania niniejszego wynalazku należy podawać PDX w kombinacji z zarówno GOS, jak i LOS. W tej postaci realizacji kombinację PDX:GOS:LOS można podawać w stosunku około 0:33:17. Alternatywnie, stosunek kombinacji PDX:GOS:LOS może wynosić

20 około 1:1:1. W szczególnej postaci realizacji stosunek PDX:GOS:LOS może wynosić około 1:1,:1. [0070] Terapeutycznie skuteczna ilość kombinacji PDX:GOS:LOS może być pomiędzy około 1,0 g/l i,0 g/l do codziennego podawania. W innej postaci realizacji terapeutycznie skuteczna ilość kombinacji PDX:GOS:LOS może być pomiędzy około 2,0 g/l i 8,0 g/l do codziennego podawania. W postaci realizacji terapeutycznie skuteczna ilość kombinacji PDX:GOS:LOS może wynosić około 2,0 g/l PDX, 2,0 g/l GOS i 2,0 g/l LOS do codziennego podawania. W szczególnej postaci realizacji terapeutycznie skuteczna ilość kombinacji PDX:GOS:LOS może wynosić około 2 g/l PDX, 1,32 g/l GOS i 2,6 g/l LOS do codziennego podawania. W innej postaci realizacji terapeutycznie skuteczna ilość kombinacji PDX:GOS:LOS może 1 wynosić około 4 g/l PDX, 2,64 g/l GOS i 3,6 g/l LOS do codziennego podawania. [0071] W pewnej postaci realizacji wynalazku PDX można połączyć z jednym lub z wieloma probiotykami do podawania niemowlęciu. Dowolny probiotyk znany w tej dziedzinie jest do zaakceptowania w tej postaci realizacji. W szczególnej postaci realizacji probiotyk wybiera się z grupy obejmującej Bifidobacterium spp. lub Lactobacillus spp. W postaci realizacji probiotykiem jest Lactobacillus rhamnosus GG (LGG). W innej postaci realizacji probiotykiem jest 2 Bifidobacterium lactis. W specyficznej postaci realizacji probiotykiem jest Bifidobacterium lactis Bb-12, dostępny z Chr. Hansen Biosystems, mieszczącym się w Milwaukee, WI. [0072] W innych postaciach realizacji zastosowania niniejszego wynalazku mieszanka dla niemowląt może zawierać

21 21 inne aktywne czynniki, takie jak długołańcuchowe wielonienasycone kwasy tłuszczowe (LCPUFA). Odpowiednie długołańcuchowe wielonienasycone kwasy tłuszczowe obejmują, lecz nie są ograniczone do nich: kwas α-linolowy, kwas γ linolowy, kwas linolowy, kwas linolenowy, kwas eikozapentaenowy (EPA), kwas arachidonowy (ARA) i dokozaheksaenowy (DHA). W postaci realizacji PDX należy podawać w kombinacji z DHA. W innej postaci realizacji należy podawać PDX w kombinacji z ARA. W jeszcze innej postaci realizacji należy podawać PDX w kombinacji z zarówno DHA, jak i ARA. Dostępną w handlu mieszankę dla niemowląt, która zawiera DHA, ARA lub ich kombinację można uzupełniać PDX i stosować w niniejszym wynalazku. Enfamil LIPIL, na przykład, który zawiera skuteczne ilości DHA i ARA, jest 1 dostępny w handlu i można go uzupełniać LGG i stosować w niniejszym wynalazku. [0073] W pewnej postaci realizacji zarówno DHA, jak i ARA należy podawać w kombinacji z PDX. W tej postaci realizacji wagowy stosunek ARA:DHA wynosi zwykle od około 1:3 do około 9:1. Alternatywnie, stosunek ten może wynosić od około 1:2 do około 4:1. W jeszcze innej alternatywie stosunek może wynosić od około 2:3 do około 2:1. W pewnej szczególnej postaci realizacji ten stosunek wynosi około 2:1. [0074] Skuteczna ilość DHA w postaci realizacji niniejszego 2 wynalazku wynosi zwykle od około 3 mg na kg wagi ciała na dzień do około mg na kg wagi ciała na dzień. W pewnej postaci realizacji wynalazku ilość wynosi od około 6 mg na kg wagi ciała na dzień do około 0 mg na kg wagi ciała na dzień. W innej postaci realizacji ilość wynosi od około mg

22 22 na kg wagi ciała na dzień do około 60 mg na kg wagi ciała na dzień. W jeszcze innej postaci realizacji ta ilość wynosi od około 1 mg na kg wagi ciała na dzień do około 30 mg na kg wagi ciała na dzień. [007] Skuteczna ilość ARA w postaci realizacji niniejszego wynalazku wynosi zwykle od około mg na kg wagi ciała na dzień do około mg na kg wagi ciała na dzień. W pewnej postaci realizacji tego wynalazku ilość zmienia się od około mg na kg wagi ciała na dzień do około 1 mg na kg wagi ciała na dzień. W innej postaci realizacji ilość zmienia się od około 1 mg na kg wagi ciała na dzień do około 90 mg na kg wagi ciała na dzień. W jeszcze innej postaci realizacji ilość zmienia się od około mg na kg wagi ciała na dzień do około 60 mg na kg wagi ciała na dzień. 1 [0076] Ilość DHA w mieszankach dla niemowląt do zastosowania w niniejszym wynalazku zmienia się zwykle od około mg/0 kcal do około 80 mg/0 kcal. W pewnej postaci realizacji niniejszego wynalazku zmienia się ona od około mg/0 kcal do około 0 mg/0 kcal i w innej postaci realizacji od około 1 mg/0 kcal do około mg/0 kcal. W szczególnej postaci realizacji niniejszego wynalazku ilość DHA wynosi około 17 mg/0 kcal. [0077] Ilość ARA w mieszankach dla niemowląt do zastosowania w niniejszym wynalazku zmienia się zwykle od około mg/0 2 kcal do około 0 mg/0 kcal. W pewnej postaci realizacji niniejszego wynalazku ilość ARA zmienia się od około 1 mg/0 kcal do około 70 mg/0 kcal. W innej postaci realizacji ilość ARA zmienia się od około mg/0 kcal do

23 23 około 40 mg/0 kcal. W szczególnej postaci realizacji niniejszego wynalazku ilość ARA wynosi około 34 mg/0 kcal. [0078] Mieszankę dla niemowląt uzupełnioną olejami zawierającymi DHA i ARA do zastosowania z niniejszym wynalazkiem można sporządzić stosując standardowe techniki znane w tej dziedzinie. Można je dodawać do mieszanki, na przykład, przez zastąpienie równoważnej ilości oleju, takiego jak wysoce olejowy olej słonecznikowy, zwykle obecny w mieszance. Jako inny przykład, można dodać do mieszanki oleje zawierające DHA i ARA przez zastąpienie równoważnej ilości reszty całkowitej mieszaniny tłuszczy zwykle obecnej w mieszance bez DHA i ARA. [0079] Źródłem DHA i ARA może być dowolne źródło znane w tej dziedzinie. W postaci realizacji niniejszego wynalazku 1 źródłami DHA i ARA są oleje pozyskiwane z organizmów jednokomórkowych, o których mowa w patentach St. Zjedn. Ameryki nr ; 0 16 i Niniejszy wynalazek nie jest jednak ograniczony tylko do takich olejów. DHA i ARA mogą być w naturalnej lub rafinowanej postaci. [0080] W pewnej postaci realizacji źródłem DHA i ARA jest zasadniczo wolny kwas eikozapentaenowy (EPA). W pewnej postaci realizacji niniejszego wynalazku mieszanka dla niemowląt zawiera, na przykład, mniej niż około 16 mg EPA/0 kcal; w innej postaci realizacji mniej niż około mg 2 EPA/0 kcal, a w jeszcze innej postaci realizacji mniej niż około mg EPA/0 kcal. Pewna szczególna postać realizacji zasadniczo nie zawiera EPA. Inna postać realizacji nie zawiera EPA, tak że nie występują nawet śladowe ilości EPA w mieszance.

24 24 [0081] Mieszankę dla niemowląt zgodną z niniejszym wynalazkiem można sporządzić stosując dowolny sposób znany w tej dziedzinie. W pewnej postaci realizacji PDX dostarcza się w formie proszku. Można go mieszać z wodą i z innymi składnikami mieszanek dla niemowląt w zbiorniku mieszania. Jeśli GOS i/lub LOS są zawarte w mieszance dla niemowląt, to można je dostarczać w formie proszku lub płynu. Mieszaninę można następnie pasteryzować, homogenizować i suszyć rozpryskowo, by wytworzyć gotowy proszek lub puszkować i przekształcać, by wytworzyć ciekły produkt. [0082] W niniejszym wynalazku niemowlę jest karmione mieszanką. W pewnej postaci realizacji niemowlę jest karmione mieszanką od narodzin. W innej postaci realizacji niemowlę karmi się piersią od narodzin aż do czasu krótszego niż jeden 1 rok, a potem karmi się mieszanką, kiedy to zaczyna się uzupełnianie PDX. [0083] Oligosacharydy ludzkiego mleka mogą zwiększać populację i gatunki korzystnych bakterii w przewodzie pokarmowym, mają profil krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych o dużej zawartości octanu i bardzo małej zawartości maślanu i ulegają powolnej fermentacji unikając wytwarzania nadmiaru gazów. Jak wynika z przykładów, podawanie PDX, samego lub w kombinacji z innymi prebiotykami, można stosować w celu zwiększania populacji i gatunków 2 korzystnych bakterii w przewodzie pokarmowym, może korzystnie przesunąć wytwarzanie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w kierunku większego wytwarzania octanu i propionianu, ograniczając w ten sposób wytwarzanie maślanu i może spowolnić szybkość fermentacji w jelicie, tak że ogranicza

25 2 się wytwarzanie gazu minimalizując dyskomfort niemowlęcia. Tak oto, podawanie PDX, samego lub w kombinacji z innymi prebiotykami, może symulować funkcjonalne właściwości oligosacharydów ludzkiego mleka u niemowląt karmionych mieszanką. [0084] Następujące przykłady opisują różne postacie realizacji niniejszego wynalazku. Inne postacie realizacji objęte zakresem zastrzeżeń patentowych zawartych w niniejszym zgłoszeniu będą oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie po analizie opisu lub zastosowania w praktyce wynalazku ujawnionego w niniejszym zgłoszeniu. Zamiarem jest, aby opis wraz z przykładami były traktowane jedynie jako przykładowy, przy czym zakres wynalazku określają zastrzeżenia patentowe następujące po przykładach. W przykładach wszystkie 1 zawartości procentowe podaje się wagowo, chyba, że wskazano inaczej. Przykład 1 [008] Ten przykład ilustruje model fermentacji kałowej in vitro wykorzystywany w niniejszym wynalazku. Model fermentacji kałowej in vitro naśladuje działanie okrężniczej mikrobioty niemowląt [ang. colon microbiota of infants]. Podczas fermentacji węglowodany są konsumowane i wytwarzają się krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe i gazy. Po fermentacji można wykonywać analizę wpływu prebiotyków na populację i 2 gatunki obecnych mikroorganizmów. [0086] Poszczególne węglowodany, które zbadano, przedstawia się tabeli 1.

26 26 Tabela 1: Poszczególne węglowodany GOS: Vivinal GOS: Deb. Nr Składniki Borculo Domo; otrzymano 09/17/02; czystość 9,1% LOS: Morinaga bezwodnik laktulozy: MLC-A(F), seria nr FRDL0926; Morinaga Milk Industry Co. Ltd; otrzymano /4/02; czystość 97% PDX: Sta-Lite III PDX: seria nr DZ2K031913; A.E. Staley FOS: Raftiloza P9 Fruktooligosacharydy: seria nr PCAB022B02; Raffinerie Notre-Dame/Orafti SA; otrzymano 9/6/02; czystość 9,1 % PDX2: Litesse Ultra PDX: polimer oo dużej masie cząsteczkowej, maks MW; Danisco; seria nr V360I INU: Raftiline HP: długołańcuchowa inulina DP 23 (seria nr: hptoh11oh1; Orafti B.V.; otrzymano październik 02; D.S. 96,9%, Inulina 99,9%, Sacharoza + Fruktoza + Glukoza 0,1 %). [0087] Próbki kału pobrano od zdrowych niemowląt w wieku 2,- 13 miesięcy. Prowadzono pięć eksperymentalnych grup stosując różne kombinacje prebiotycznych węglowodanów w każdej grupie fermentacyjnej. W badaniu brało udział dwanaścioro dzieci w grupie 1 i 2 fermentacji, 17 dzieci w grupie 3 fermentacji, 19 dzieci w grupie 4 fermentacji i 23 dzieci w grupie fermentacji. W grupach 1-3 tylko pięcioro dzieci było w stanie oddać akceptowalną próbkę. Dzieci biorące udział w pierwszej fermentacji były w wieku 4, 4, 4, 6, 6, 6, 8, 8, 9, 9, 9 i miesięcy, w drugiej fermentacji w wieku 3, 4, 6, 6, 6, 7, 8, 9,,, 12 i 13 miesięcy i w trzeciej fermentacji

27 27 w wieku 2, 2,, 3, 4, 4, 4, 4,,,, 6, 6, 6, 9, 9,, i 11 miesięcy. Dzieci, których próbki stosowano w fermentacji, były w wieku grupa 1: 1, 6, 8, 9, 9, 9 miesięcy; grupa 2: 4, 8,, 12, 13 miesięcy i grupa 3: 2,,, 6,, 11 miesięcy. W grupie 4 fermentacji dzieci (z których jedno dziecko dwukrotnie) było w stanie oddać akceptowalną próbkę. Dawcy do grupy 4 fermentacji byli w wieku 2, 2,, 4,, 7, 9, 9,, 11 i 1 miesięcy. W grupie fermentacji dwanaścioro dzieci było w stanie oddać próbki, z których wybrano czworo najmłodszych dawców. Tak oto, dawcy byli w wieku, 6, 6, i 6, miesięcy. [0088] Fermentację kałową in vitro przeprowadzono zgodnie z metodą Karppinena. Karppinen S., i inni, In Vitro Fermentation of Polysaccharides of Rye, Wheat, and Oat Brans 1 and Inulin by Human Faecal Bacteria, J. Sci. Food Agric. 80: (00). [0089] W niniejszym badaniu odważano 0 mg próbek węglowodanów do 0 ml butelek i uwadniano stosując 2 ml buforu węglanowo-fosforanowego o ph 6,9. Próbki trzymano przez noc w warunkach beztlenowych w temperaturze C aż do wytworzenia inokulum. Zawiesinę kału (12,%, ciężar/objętość) wytworzono w ściśle beztlenowych warunkach w tym samym buforze zbierając świeży kał niemowląt. Osiem ml zawiesiny dozowano do próbek substratu i zamknięto butelki w beztlenowej komorze uzyskując finalne % stężenie zawiesiny 2 kału (ciężar/objętość). Próbki inkubowano w temperaturze 37 C przez 1, 2, 4, 8 lub 24 godziny. 0 godzinowe próbki sporządzono podobnie w probówkach wirówkowych i szybko zamrożono stosując ciekły azot. Wszystkie eksperymenty

28 28 fermentacyjne zawierały próby kontrolne kału bez dodanych węglowodanów. [0090] Fermentację zakończono przez usunięcie butelek z łaźni wodnej i umieszczenie ich na lodzie; wyjątkowo przed pomiarem gazów próbki trzymano w temperaturze pokojowej do bezpośredniego pobierania próbek. Mierzono objętość gazu i próbkę gazu ( ml) wstrzyknięto do przepłukanej azotem butelki. Butelkę umieszczono na lodzie po pobraniu próbki. Próbkę fermentacyjną przeniesiono do probówki wirówkowej, zmierzono ph i pobrano próbkę (2 ml) z zawiesiny do analizy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i szybko zamrożono w ciekłym azocie. Przykład 2 [0091] Ten przykład ilustruje materiały i metody konieczne do 1 określenia skuteczności polidekstrozy jako prebiotyku dla niemowląt karmionych mieszanką. W szczególności, ten przykład ilustruje materiały i metody konieczne do analizy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i gazów. [0092] Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe ekstrahowano eterem (di)etylowym i analizowano przy pomocy chromatografii gazowej, jak opisano przez Karppinena i innych, Karppinen S., i inni, In Vitro Fermentation of Polysaccharides of Rye, Wheat, and Oat Brans and Inulin by Human Faecal Bacteria, J. Sci. Food Agric. 80: (00). Gazy (wodór, ditlenek 2 węgla, metan, disiarczek wodoru i tlen jako kontrola jakości) analizowano izotermicznie w temperaturze 30 C przy pomocy chromatografii gazowej stosując statyczną technikę headspace zgodnie z Karppinenem i innymi.

29 29 Przykład 3 [0093] Ten przykład ilustruje wpływ PDX na profil in vitro krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych wytwarzany przez mikrobiotę okrężnicy niemowlęcia. Rysunki 1 i 2 pokazują, że szybkość fermentacji różni się między różnymi prebiotykami. Wytwarzanie całości krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (sumy kwasów octowego, propionowego i masłowego) jest przedstawione na rysunku 1. Spadek ph, przedstawiony na rysunku 2, wskazuje również na wytwarzanie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych. [0094] Jak wynika z rysunków, PDX2 jest węglowodanem ulegającym powolnej fermentacji, podczas gdy FOS, GOS i LOS ulegały szybkiej i pełnej fermentacji. Szybkość fermentacji PDX2 była porównywalna do zbożowych włókien pokarmowych. PDX2 1 fermentował nie tylko z najniższą początkową szybkością, ale i stopień fermentacji był tylko nieznacznie powyżej wartości dla próby kontrolnej kału. Natomiast szybkość fermentacji FOS była tak duża, że zanikał on prawie całkowicie w ciągu pierwszych punktów czasowych pobierania próbek i wytwarzał największą ilość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych wśród zbadanych prebiotyków. [009] Jak pokazano na rysunkach 3-, fermentacja PDX2 prowadzi do największego wytwarzania propionianu i najmniejszego wytwarzania maślanu po 24 godzinach. Octanu 2 ciągle wytwarzano najwięcej z krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas fermentacji PDX, chociaż początkowa szybkość była znacznie mniejsza niż dla innych substratów. Początkowa szybkość wytwarzania propionianu z PDX2 była podobna do wartości dla innych substratów, ale wyższe poziomy

30 30 stwierdzono pod koniec fermentacji. Natomiast fermentacja FOS, GOS i LOS wykazywała zwiększone stężenia octanu i maślanu oraz zmniejszone stężenie propionianu. W rezultacie połączony względny udział octanu i propionianu był znacznie większy dla PDX2 niż dla FOS, LOS lub GOS. Te wyniki można także stwierdzić na rysunku 6. Te wyniki dowodzą, że PDX2 był substratem wytwarzającym najmniej maślanu i jedynym substratem zwiększającym względny udział propionianu. [0096] Te wyniki są zgodne z badaniem in vitro, które przeprowadzili Wang, X. & Gibson, G.R., Effects of the In Vitro Fermentation of Oligofructose and Inulin by Bacteria Growing in the Human Large Intestine, J. Appl. Bacteriol. 7: (1993), w którym wykorzystano zawiesinę kału od dorosłych dawców do fermentacji różnych węglowodanów. Nie 1 wykazano jednak większego wytwarzania propionianu z PDX in vitro w klinicznej próbie in vivo z dorosłymi Chińczykami, Jie, Z. i inni, Studies on the Effects of Polydextrose Intake on Physiological Functions in Chinese People, Am. J. Clin. Nutr. 72:3-09 (00), w których trzy różne stężenia PDX mogły zwiększać poziomy maślanu i octanu, lecz nie udział propionianu. Większe wytwarzanie maślanu z GOS i FOS wykazano również u szczurów kojarzonych z ludzką florą kałową (Djouzi, Z. i inni, Compared Effects of Three Oligosacchardies on Metabolism of Intestinal Microflora in Rats Inoculated with a 2 Human Faecal Flora, Br. J. Nutr. 78: (1997). Przykład 4 [0097] Ten przykład ilustruje wpływ kombinacji prebiotyków na szybkość fermentacji in vitro z udziałem mikrobioty okrężniczej niemowląt. Wybrano różne kombinacje

31 31 prebiotycznych węglowodanów dla osiągnięcia pożądanej szybkości mikrobiologicznej fermentacji in vitro. W tym przykładzie porównywano kombinacje substratów ze względu na ich szybkość fermentacji (wytwarzanie całości krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych) i zmiany ph, jak pokazano na rysunkach 7-8. [0098] Dodanie PDX do preparatu GOS zwolniło szybkość fermentacji kombinacji, mierzoną przez wytwarzanie całości krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (rys. 7). Podobnie, dodanie PDX do preparatu LOS zwolniło szybkość fermentacji kombinacji. Dodanie PDX do LOS lub GOS również prowadziło do bardziej umiarkowanego spadku ph, jak pokazano na rysunku 8. Ta mniejsza szybkość zakwaszania zawartości stolca może prowadzić do mniejszego podrażnienia nabłonka jelita lub 1 obszaru odbytu, zwiększając tolerancję niemowlęcia. Wolniejsze obniżanie ph przez PDX jest zgodne z wolniejszym wytwarzaniem krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych i całkowitą szybkością fermentacji in vitro w porównaniu do GOS i LOS. Te rezultaty dowodzą, że PDX można stosować do spowolnienia szybkości fermentacji mieszanin PDX i tradycyjnych prebiotyków, takich jak GOS lub LOS. [0099] Zbadano również wpływ stosunku PDX:GOS na wytwarzanie całości krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, octanu, propionianu i maślanu (rysunki 9-12). Rysunek 9 wykazuje, że 2 stosunek PDX:GOS wynoszący 8:2 prowadził do mniejszej szybkości wytwarzania całości krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych niż miało to miejsce w przypadku stosunku PDX:GOS wynoszącego :. Rysunek 9 potwierdza, że stosunek PDX:GOS wynoszący 8:2 wytwarzał mniej całości

32 32 krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych niż stosunek : lub 1:9. Tak oto, te rezultaty wykazują, że większa ilość PDX w mieszaninie PDX:GOS prowadzi do mniejszej szybkości fermentacji in vitro. Dodanie PDX do GOS powodowało również tendencję do zmniejszania szybkości wytwarzania octanu i maślanu, lecz miało mały wpływ na całkowitą szybkość i końcowe wytwarzanie propionianu. Przykład [00] Ten przykład ilustruje wpływ PDX na wytwarzanie in vitro gazu przez mikrobiotę okrężnicy niemowląt. Całkowite wytwarzanie gazu, przedstawione na rysunku 13 i mierzone jako całkowita objętość na butelkę fermentacyjną, było w przybliżeniu jednakowe dla GOS, LOS i FOS. Natomiast PDX prowadzi do mniejszego całkowitego wytwarzania gazu podczas 1 fermentacji przez bakteryjną mikrobiotę kałową niemowląt. Mniejsze całkowite wytwarzanie gazu obserwowane dla PDX wskazuje również na to, że ulega on wolniejszej fermentacji niż inne badane prebiotyki. [01] Oprócz całkowitego wytwarzania gazu wytwarzanie ditlenku węgla jest ważną miarą tolerancji niemowląt na prebiotyki żywieniowe. Głównym produktem gazowym wszystkich badanych prebiotyków był ditlenek węgla. Był on wytwarzany w 3- i krotnie większych ilościach, niż odpowiednio wodór lub disiarczek wodoru. 2 [02] Wytwarzanie ditlenku węgla było ogólnie najmniejsze dla PDX w porównaniu z FOS, GOS i LOS (rys. 14). Ditlenek węgla był głównym gazem wytwarzanym podczas fermentacji FOS, GOS i LOS, wykazując maksymalne poziomy pomiędzy μmol. Natomiast PDX wykazywał dużo mniejsze poziomy

33 33 wytwarzania ditlenku węgla (0 μmol). Wytwarzanie wodoru z PDX przez kałową mikrobiotę niemowląt było mniejsze (około jednej trzeciej) niż wytwarzanie ditlenku węgla i znacznie mniejsze niż poziomy wodoru wytwarzanego z FOS, GOS LOS (Rysunek 1). Tworzenie disiarczku wodoru z PDX było 1:44 w porównaniu z tworzeniem ditlenku węgla i maksymalne wytwarzanie disiarczku wodoru było w przybliżeniu na tym samym poziomie stężenia dla wszystkich testowych prebiotyków (Rysunek 16). Większy udział tworzenia ditlenku węgla w porównaniu z tworzeniem wodoru (00-krotmie) i metanu (- krotnie) wykazali również Wang i Gibson. Wang, X. & Gibson, G.R., Effects of the In Vitro Fermentation of Oligofructose and Inulin by Bacteria Growing in the Human Large Intestine, J. Appl. Bacteriol. 7: (1993). Ponieważ nie 1 obserwowano metanogenezy w niniejszym badaniu, to disiarczek wodoru tworzył się przypuszczalnie z pierwotnego wodoru. Levitt i inni, Gas Metabolism in the Large Intestine, CRC Press, Boca Raton (199). Możliwe jest, że nie wykryto wodoru z powodu jego dalszego metabolizmu do wtórnego gazu, disiarczku wodoru, w późnych punktach czasowych. Przykład 6 [03] Ten przykład ilustruje materiały i metody konieczne do określenia wpływu PDX na populację i gatunki mikrobioty okrężnicy niemowląt. Pokrótce, przykład wykorzystuje model 2 jelita niemowlęcia do oceny pewnych prebiotycznych związków. Wykorzystywany model jelita niemowlęcia in vitro, oparty na modelu dorosłego, zawierał dwa 0 ml szklane naczynia połączone szeregowo, przedstawiające bliższe i dalsze obszary okrężnicy niemowlęcia. Przepływ zasilający regulowano z