PODSTAWY BIOINFORMATYKI WYKŁAD 2 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW

Transkrypt

1 PODSTAWY BIOINFORMATYKI WYKŁAD 2 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW

2 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW 1. Sekwencjonowanie genomów 2. Automatyzacja sekwencjonowania (human) Genomes project Bull Genomes project

3 SEKWENCJONOWANIE Czym jest sekwencjonowanie DNA? STARSZE METODY Sangera (terminacji łańcucha / dideoksy) Maxama-Gilberta (chemicznej degradacji) Pirosekwencjonowanie METODA NGS

4 METODA SANGERA Frederick Sanger 2 nagrody Nobla Laboratory of Molecular Biology, Cambridge UK 1970-te metoda sekwencjonowania metoda terminacji łańcucha

5 METODA SANGERA starter Matryca w postaci jednoniciowego DNA wektory Substraty: datp, dctp, dgtp, dttp + ddatp, ddctp, ddgtp, ddttp (brak grupy 3 -hydroksylowej) Cząsteczki zakończone A

6 METODA SANGERA Elektroforeza + detektor floerescencji

7 SEKWENCJONOWANIE AUTOMATYCZNE Sekwencjonowanie cykliczne automatyzacja procesu sekwencjonowania Sekwenatory DNA 384 próbki DNA, 24 analizy / doba Termostabilne polimerazy DNA (PCR) Dwuniciowy DNA Niewielka ilość DNA (klonowanie) 1 starter

8 METODA MAXAMA GILBERTA 4 oddzielne reakcje sekwencjonowania

9 PIROSEKWENCJONOWANIE Rejestrowanie kolejności dodawania datp, dctp, dgtp, dttp Prosta automatyzacja

10 FARMAT ZAPISU SEKWENCJI - FASTA >Bos taurus natural resistance-associated macrophage protein (NRAMP1) gene, partial sequence TGAGAACGCTGGAGACTTCCTGAGGTCTTTCAGGATGCACCG GATCATGCGGGATCTCACCAGCCTGGGGAGGGAGGGAGGTC TGAGAACGCTGGAGACTTCCTGAGGTCTATCAGGATGCACCG GATCATGCGGGATCTCACCAGCCTGGGGAGGGAGGGAGGTC TGAGAACGCTGGAGACTTCCTGAGGTCCTCAGGATGCACCG GATCATGCGGGATCTCACCAGCCTGGGGAGGGAGGGAGGTC

11 PROJEKT POZNANIA GENOMU CZŁOWIEKA HISTORIA początek projektu 15 lat $ rozpoczęcie badań przez NIH James Watson Francis Collins

12 PROJEKT POZNANIA GENOMU CZŁOWIEKA HISTORIA inne instytuty i firmy Chiny, Francja, Niemcy, Japonia, W. Brytania Celera Genomics $ wyścig Craig Venter Francis Collins Celera NIH whole genome shotgun klasyczne

13 PROJEKT POZNANIA GENOMU CZŁOWIEKA HISTORIA ukończenie prac nad ogólną sekwencją publikacje Celera NIH

14 SEKWENCJONOWANIE CAŁYCH GENOMÓW 1. Metoda tradycyjna BAC-to-BAC 1980 Map based sequencing 2. Metoda shotgun 1997 Whole genome shotgun sequencing

15 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW SHOTGUN:BAC-to-BAC BAC-to-BAC SHOTGUN Fragmentacja DNA: 150 kbp Fragmentacja DNA: 2 kbp Konstrukcja bibliotek BAC Konstrukcja bibliotek plazmidowych Konstrukcja ramowej mapy kolejność fragmentów BAC

16 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW SHOTGUN:BAC-to-BAC BAC-to-BAC SHOTGUN Fragmentacja BAC DNA konstrukcja bibliotek M13 Sekwencjonowanie bibliotek M13 Sekwencjonowanie bibliotek plazmidowych Łączenie sekwencji Łączenie sekwencji

17 PROJEKT POZNANIA GENOMU CZŁOWIEKA

18 SEKWENCJONOWANIE CAŁYCH GENOMÓW 1. Metoda tradycyjna BAC-to-BAC 1980 Map based sequencing 2. Metoda shotgun 1997 Whole genome shotgun sequencing 3. Metoda nowej generacji ~2007 Next generation sequencing

19 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW NEXT GENERATION METODA NOWEJ GENERACJI Sekwencjonowanie bardzo krótkich fragmentów bp DNA unieruchomione na płytce Szybkie Tanie Platformy: Ilumina/Solexa, 454 technology, SOLiD

20 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW NEXT GENERATION PORÓWNANIE METOD dł. szybkość koszt łańcucha DNA dni/1gbp 1000 bp Tradycyjna, 1970 r bp $ 454, 2004/2005 r bp $ Solexa, 2006 r bp $ Solid, 2007 r. 50 bp $

21 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW NEXT GENERATION KOSZT/CZAS ZSEKWENCJONOWANIA CAŁEGO GENOMU CZŁOWIEKA Projekt poznania genomu człowieka ~ 13 lat ~ $ Technologia NGS ~ kilka dni ~ $ Copyright 2017, Copyright J. Szyda 2014, & Joanna M. Mielczarek Szyda

22 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW NEXT GENERATION

23 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW NEXT GENERATION

24 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW NEXT GENERATION Illumina - Sequencing by Synthesis (SBS)

25 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW NEXT GENERATION 454 Mardis 2008

26 FARMAT ZAPISU SEKWENCJI - 2:N:0: CTATTACACGCCCCCGAAGCTCTAGCGGGTGTTCTCACGCAC + 2:N:0: AGTGTATTACTGTCTTTGCACTCTTTAATCCTAGGTGACTTTTG +?@@ADDDDHDBFHCEHIIBHEHEEHEH>BF?EFHCHFGFGFHH

27 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW NEXT GENERATION 2011 Nature special issue of nature on sequencing

28 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW 1000 GENOMES human 1000 GENOMES PROJECT ( technologie nowej generacji - obniżenie kosztów i duża szybkość sekwencjonowania zsekwencjonowanie wielu genomów ludzkich scharakteryzowanie zmienności genetycznej człowieka na podstawie sekwencji DNA

29 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW 1000 GENOMES human 1000 GENOMES PROJECT ( dane ogólnodostępne do badań 2535 osób, 26 populacji ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp/

30 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW 1000 GENOMES human 1000 GENOMES PROJECT ( The 1000 Genomes Project Consortium (2012) An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes. Nature 491:

31 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW 1000 GENOMES bovine 1000 GENOMES PROJECT ( The 1000 Bull Genomes Project - Run 5 July 2015 Ben Hayes, Hans Daetwyler, Amanda Chamberlain, Phil Bowman

32 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW 1000 GENOMES bovine 1000 GENOMES PROJECT ( Run 5 Sequences Breed Taurus Taurus Breed Indicus Holstein(BW,RW) 450 Beef Crosses 5 UgandaAdmixed 26 Simmental Fleckvieh Pezzata Rossa 274 Piedmontese 5 IranAdmixed 9 Angus (B,R) 157 Angler 5 Korean 9 Brown Swiss (incl. Braunvieh) 131 Hinterwalder 3 JapanNative 8 Jersey 66 Vorderwalder 3 Brahman 7 Beef Composites 64 Eringer 2 Gir 6 Danish Red 44 Galloway 2 Nelore 5 Gelbvieh 41 Unknown 2 Dehong 2 Hereford 41 Scottish Highland 2 Dengchuan 2 Charolais 39 Romagnola 2 Fujian 2 Limousin 31 Stabilizer 2 Guanling 2 Beef Booster 29 Tyrolean Grey 2 Hasake 2 Montbeliarde 28 Salers 1 Liping 2 Dairy-Beef Crosses 27 Luxi 2 AyrshireFinnish 25 Menggu 2 Normande 24 Taurus 1577 Nanyang 2 NorwegianRed 24 Taurus Indicus 1682 Qinchuan 2 Guernsey 20 Wenling 2 Swedish Red 16 Yanbian 2 Belgian Blue 10 Dabieshan 2 Marchigiana 8 Xizang Sequenced Animals (1577 Taurus, 115 Indicus) ~55 Breeds Bos Taurus, Bos Indicus, mixtures Dairy, Beef, Dual Purpose, Crosses, Composites, Native breeds

33 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW 1000 GENOMES bovine 1000 GENOMES PROJECT ( Results 1000Bulls 5 Run 5 Taurus only 39.7 million filtered variants ~ 34 breeds 38.1 million SNP, 1.7 million indel Run 5 Taurus Indicus 67.3 million filtered variants ~ 55 breeds 64.8 million SNP, 2.5 million indel

34 SEKWENCJONOWANIE GENOMÓW 1000 GENOMES bovine 1000 GENOMES PROJECT ( Results 1000Bulls 5

35 PODSTAWY BIOINFORMATYKI