PL B1. POLITECHNIKA ŁÓDZKA, Łódź, PL BUP 19/13

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. A61K 9/48 ( ) A61K 9/16 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Sposób wytwarzania otoczek alginianowych na alginianowych sferach komorowych oraz sposób zabezpieczania żywych komórek enkapsulowanych w tych sferach lub regulowania uwalniania substancji aktywnych biologicznie immobilizowanych/enkapsulowanych w tych sferach (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA ŁÓDZKA, Łódź, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 19/13 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/14 (72) Twórca(y) wynalazku: MAREK KOZICKI, Dęblin, PL MAREK KOŁODZIEJCZYK, Łódź, PL LEONARDO ADAMO PAJEWSKI, L'Aquila, IT JANUSZ M. ROSIAK, Łódź, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Ewa Kaczur-Kaczyńska

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania otoczek alginianowych na alginianowych sferach komorowych przeznaczonych do enkapsulacji żywych komórek i immobilizacji/enkapsulacji substancji aktywnych biologicznie oraz sposób zabezpieczania żywych komórek enkapsulowanych w tych sferach lub regulowania uwalniania substancji aktywnych biologicznie immobilizowanych/enkapsulowanych w tych sferach. Znane są sposoby pokrywania matryc zawierających żywe komórki warstwami polimerowymi w celu nadania im odpowiednich właściwości fizyko-chemicznych i poprawienia biokompatybilności. Sposoby te są opisane m. in. w opisach patentowych USA nr , nr , nr , jak również w czasopismach: Science, 210, 908 (1980), Process Biochemistry, 31, 347 (1996), Biotechnology and Bioengineering, 57, 655 (1998), Journal of American Chemical Society, 114, 8311 (1992), International Workshop Bioenkapsulation VI, Barcelona, Hiszpania, T2. 4 (1997), Inżynieria biomateriałów, 7, 8, 11 (1999). Z opisu patentowego US nr , a także z czasopisma Science, 210, 908 (1980) jest znany sposób wytwarzania otoczek na matrycach wykonanych z alginianu. Polega on na polikompleksacji łańcuchów alginianowych poli(l-lizyną). Sposób ten jest stosowany przez wiele laboratoriów. Stosowane są również modyfikacje tego sposobu, które polegają na zastąpieniu poli(l-lizyny) innymi związkami chemicznymi, między innymi dekstranem lub chitozanem (czasopismo Process Biochemistry, 31, 347 (1996)). Z czasopism Biotechnology and Bioengineering, 57, 655 (1998) i Journal of American Chemical Society, 114, 8311 (1992) oraz opisów patentowych USA nr , nr znane jest wytwarzanie półprzepuszczalnych błon polimerowych wokół matryc zawierających żywe komórki. Polega ono na inicjowanej światłem polimeryzacji i sieciowaniu pochodnych akrylowych glikoli polietylenowych na powierzchni mikrokapsułek, na przykład mikrokapsułek alginianowych. Z opisu patentowego PL nr jest znany sposób wytwarzania alginianowych sfer komorowych do enkapsulacji żywych komórek i immobilizacji substancji aktywnych biologicznie, polegający na sporządzeniu roztworu wodnego alginianu sodu, ewentualnie zawierającego chlorek sodu, do którego wprowadza się surfaktant białkowy, następnie tak przygotowana mieszaninę spienia się, po czym spienioną mieszaninę wkrapla się do wodnego roztworu środka sieciującego tak, aby krople spienionej mieszaniny zanurzyły się pod powierzchnią roztworu sieciującego i przebywały w nim nie dłużej niż 1 sekunda. Sposób wytwarzania otoczek alginianowych na alginianowych sferach komorowych przeznaczonych do enkapsulacji żywych komórek i immobilizacji/enkapsulacji substancji aktywnych biologicznie, według wynalazku polega na tym, że alginianowe sfery komorowe zawierające jony Ca +2 Iub Ba +2, wprowadzone w wyniku procesu ich wytwarzania lub w wyniku zanurzenia tych sfer w roztworze chlorku wapnia lub chlorku baru o stężeniu 0,001-0,15 mol/dm 3 w czasie 0,5 sekundy - 5 minut, umieszcza się w roztworze alginianu sodu o stężeniu powyżej 0,1%, ale nie większym niż 3%, ewentualnie zawierającym chlorek sodu w ilości nie większej niż 0,9% wagowych w stosunku do masy roztworu, na czas 0,5 sekundy - 3 minuty, a następnie przenosi się je do wody lub do wodnego roztworu chlorku sodu o stężeniu nie większym niż 0,9%, intensywnie miesza w czasie 5 sekund - 2 minuty, ewentualnie następnie sfery komorowe zanurza się w roztworze chlorku wapnia lub chlorku baru, o stężeniu 0,001-0,15 mol/dm 3 na czas 0,5 sekundy - 1 minuta. Procedurę opisaną powyżej ewentualnie powtarza się co najmniej jednokrotnie. Sposób zabezpieczania żywych komórek enkapsulowanych w alginianowych sferach komorowych lub regulowania uwalniania substancji aktywnych biologicznie immobilizowanych/enkapsulowanych w tych sferach, według wynalazku polega na tym, że alginianowe sfery komorowe, zawierające enkapsulowane żywe komórki lub immobilizowane/enkapsulowane substancje aktywne biologicznie, zawierające dodatkowo jony Ca +2 Iub Ba +2 wprowadzone w procesie wytwarzania sfer komorowych lub w wyniku zanurzenia tych sfer w roztworze chlorku wapnia lub chlorku baru o stężeniu 0, ,15 mol/dm 3 w czasie 0,5 sekundy - 5 minut, umieszcza się w roztworze alginianu sodu o stężeniu powyżej 0,1%, ale nie większym niż 3%, ewentualnie zawierającym chlorek sodu w ilości nie większej niż 0,9% wagowych w stosunku do masy roztworu, na czas 0,5 sekundy - 3 minuty, a następnie przenosi się je do wody lub do wodnego roztworu chlorku sodu o stężeniu nie większym niż 0,9%, intensywnie miesza w czasie 5 sekund - 2 minuty, po czym ewentualnie zanurza w roztworze chlorku wapnia lub chlorku baru, o stężeniu 0,001-0,15 mol/dm 3 na czas 0,5 sekundy - 1 minuta, przy czym powyższą procedurę ewentualnie powtarza się co najmniej jednokrotnie i korzystnie sfery zanurza się następnie w roztworze polimeru syntetycznego w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w roztwo-

3 PL B1 3 rze polimetakrylanu metylu w acetonie, o stężeniu 0,1-15% na czas 0,5-10 sekund lub natryskuje tym roztworem w czasie 0,5-10 sekund i płucze w wodzie, przy czym procedurę zanurzenia w roztworze polimeru syntetycznego lub natryskiwania tym roztworem ewentualnie powtarza się co najmniej jednokrotnie. Doboru optymalnej grubości otoczek alginianowych i ich ilości dokonuje się w drodze zanurzenia sfer alginianowych, zawierających enkapsulowaną krew lub krwinki czerwone, otoczonych jedną oraz kilkoma otoczkami alginianowymi, w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w acetonie, na czas 1 sekunda - 2 minuty i następnie pomiaru hemolizy krwinek czerwonych w zależności od czasu kontaktu z rozpuszczalnikiem, grubości otoczki i ich ilości. Pomiaru hemolizy krwinek czerwonych dokonuje się przy użyciu mikroskopu lub w drodze pomiarów spektrofotometrycznych absorbancji hemoglobiny. Sposobem według wynalazku otrzymuje się otoczki alginianowe bezpośrednio przylegające do alginianowych sfer komorowych, charakteryzujące się jednakową grubością w całej objętości ze względu na fakt, że powstają one w procesie homogenicznego sieciowania łańcuchów alginianowych na powierzchni alginianowych sfer komorowych przez dyfundujące z wnętrza i powierzchni alginianowych sfer komorowych jony metali Ca +2 lub Ba +2 do roztworu alginianu sodu, w którym sfery komorowe są zanurzone. Grubość otoczki alginianowej na sferze komorowej zależy od czasu kontaktu sfery komorowej z roztworem alginianu sodu, od stężenia alginianu sodu jak i od stężenia jonów Ca +2 lub Ba +2 w sferze komorowej. Całkowita grubość otoczek alginianowych na sferze komorowej jest sumą grubości otoczek wytworzonych na sferach komorowych. Otoczki alginianowe wzmacniają alginianowe sfery komorowe, jak również chronią enkapsulowane w tych sferach żywe komórki przed bezpośrednim, krótkotrwałym kontaktem z toksycznymi związkami chemicznymi, na przykład przed rozpuszczalnikami stosowanymi do wytwarzania syntetycznych otoczek na powierzchni otoczek alginianowych. Ponadto, służą one do regulowania uwalniania substancji czynnych biologicznie immobilizowanych lub enkasulowanych odpowiednio w ścianach komór lub w komorach alginianowych sfer komorowych. Jednocześnie otoczki alginianowe wytwarzane według wynalazku na sferach komorowych są półprzepuszczalnymi błonami nie blokującymi dyfuzji małocząsteczkowych związków chemicznych, którymi mogą być na przykład związki odżywiające enkapsulowane w sferach komorowych komórki czy gazy niezbędne do funkcjonowania tych komórek. Sposobem według wynalazku uzyskuje się również syntetyczne otoczki na powierzchni sfer komorowych z otoczkami alginianowymi. Ich cechy fizyczne jak grubość czy gęstość sieci polimerowej zależą od stężenia polimeru stosowanego do wytwarzania otoczki, jego ciężaru cząsteczkowego i czasu wytwarzania otoczki. Otoczki syntetyczne wzmacniają dodatkowo sfery komorowe z otoczkami alginianowymi i służą do regulacji dyfuzji związków przenikających do wnętrza, jak i na zewnątrz sfer komorowych. Mogą również zabezpieczać enkapsulowane w sferach komorowych żywe komórki przed działaniem niekorzystnych czynników zewnętrznych, w tym przed działaniem składników układu immunologicznego w przypadku, gdy takie struktury z komórkami stosowane byłyby jako tak zwane hybrydowe organy. Przedmiot wynalazku ilustrują poniższe przykłady z powołaniem się na rysunek, na którym fig. 1 przedstawia alginianowe sfery komorowe bez otoczki alginianowej, z jedną i dwoma otoczkami ochronnymi, fig. 2 - alginianowe sfery komorowe bez otoczki alginianowej i z jedną otoczką alginianową, dodatkowo zawierające pełną krew króliczą po 1,5 minuty traktowania acetonem, fig. 3 - sfery komorowe z otoczkami alginianowymi otoczone dodatkowo warstwą polimetakrylanu metylu. P r z y k ł a d I Sporządzono roztwór 15 g alginianu sodu w 1 I wody i dodano do niego 10 g albuminy wołowej, 15 ml tego roztworu spieniano przepuszczając przez niego powietrze. Spienioną mieszaninę wkraplano następnie do roztworu chlorku wapnia o stężeniu 0,15 mol/dm 3 używając do tego celu igły o średnicy 0,6 mm, przy czym podczas tej czynności mieszano roztwór sieciujący. Powstałe sfery komorowe przebywały pod powierzchnią roztworu sieciującego przez 5 minut. Otrzymane w ten sposób sfery komorowe zanurzono w wodnym roztworze alginianu sodu o stężeniu alginianu sodu 3% wagowych w stosunku do masy roztworu. Po 3 minutach sfery komorowe przeniesiono do wody dejonizowanej, gdzie intensywnie mieszano je przez 2 minuty. Następnie, przeniesiono je do roztworu chlorku wapnia o stężeniu 0,15 mol/dm 3 na czas 1 minuty. Otrzymano w ten sposób aiginianowe sfery komorowe, z których każda otoczona była przylegającą do niej jedną otoczką alginianową o grubości 0,45 mm. P r z y k ł a d II Wytworzono 15 sfer komorowych wraz z otoczkami alginianowymi postępując jak w przykładzie I. W celu utworzenia drugiej otoczki, sfery komorowe z jedną otoczką umieszczono w roztworze alginianu sodu o stężeniu 3% wagowych w stosunku do masy roztworu. Po 3 minutach sfery komorowe

4 4 PL B1 umieszczono w wodzie dejonizowanej i intensywnie mieszano je przez 2 minuty. Następnie, przeniesiono je do roztworu chlorku wapnia o stężeniu 0,15 mol/dm 3 na czas 1 minuty. Sumaryczna grubość otrzymanych w ten sposób dwóch otoczek wynosiła 0,70 mm. W celu wytworzenia na sferach komorowych trzeciej otoczki alginianowej powtórzono procedurę wytwarzania otoczki alginianowej. Całkowita grubość trzech otoczek alginianowych wytworzonych na każdej ze sfer komorowych wynosiła 1,2 mm. P r z y k ł a d III Wytworzono 15 sfer komorowych, przy czym 5 bez otoczek alginianowych, 5 z jedną otoczką alginianową i 5 z dwoma otoczkami alginianowymi, postępując jak w przykładach I i II, przy czym wyjściowy roztwór alginianu sodu zawierał dodatkowo chlorek sodu w ilości 0,9% wagowych w stosunku do masy roztworu. Ponadto, w procesie wytwarzania otoczek alginianowych zamiast wody dejonizowanej użyto roztwór chlorku sodu o zawartości 0,9% wagowych w stosunku do masy roztworu. Dodatkowo, do 15 ml wyjściowego roztworu alginianu sodu dodano 60 μl pełnej krwi króliczej. W ten sposób uzyskano sfery komorowe z enkapsulowaną krwią króliczą dodatkowo otoczone otoczkami alginianowymi. Następnie, sfery komorowe z krwią króliczą umieszczono w acetonie na czas 2 minut. Po tym czasie wyjmowano je i oceniano stopień hemolizy krwinek czerwonych w drodze obserwacji z użyciem transmisyjnego mikroskopu optycznego. Oceniono, że po 2 minutach kontaktu sfer komorowych z acetonem hemolizie uległo: a) 0% krwinek czerwonych, w przypadku sfer komorowych otoczonych dwoma otoczkami alginianowymi, b) około 10% krwinek czerwonych, w przypadku sfer komorowych otoczonych jedną otoczką oclironną, c) ponad 50% krwinek czerwonych, w przypadku sfer komorowych bez otoczek ochronnych. P r z y k ł a d IV Wytworzono po 30 sfer komorowych z enkapsulowaną krwią króliczą, z jedną i dwoma otoczkami alginianowymi, postępując jak przykładzie III. Sfery komorowe z jedną i dwoma otoczkami umieszczono w osobnych zlewkach zawierających po 50 ml acetonu. Następnie, wyjmowano z acetonu po kilka sfer komorowych i mierzono strefę hemolizy enkapsulowanych krwinek czerwonych za pomocą wykalibrowanego mikrometru okularowego w mikroskopie optycznym. Na podstawie pomiarów określono minimalną grubość otoczki alginianowej na sferze komorowej, która zabezpieczała enkapsulowane żywe komórki przed działaniem rozpuszczalnika. I tak, jedna otoczka alginianowa o grubości 0,45 mm zabezpiecza żywe komórki przed kontaktem z rozpuszczalnikiem przez okres około 2 minut. Dwie otoczki alginianowe o łącznej grubości 0,7 mm zabezpieczają żywe komórki przed kontaktem z rozpuszczalnikiem przez okres około 2,5 minuty. P r z y k ł a d V Sporządzono roztwór 15 g alginianu sodu w 1 I wody. Odmierzono dwie objętości tego roztworu po 100 ml. Do jednej z nich dodano 1 g albuminy, a do drugiej 1 g albuminy i 0,003 g błękitu metylenowego. Następnie, z każdego roztworu wytworzono po 15 sfer komorowych, bez otoczki alginianowej, z jedną i dwoma otoczkami alginianowymi, postępując jak w przykładach I i II. Wytworzone struktury z immobilizowaną albuminą, bądź błękitem metylenowym umieszczono w osobnych zlewkach zawierających po 200 ml wody dejonizowanej. Następnie, mierzono w czasie absorbancję roztworów i określano maksymalne ilości albuminy, bądź błękitu metylenowego uwolnionych ze sfer komorowych bez otoczek alginianowych, jak i pokrytych otoczkami alginianowymi. Określono również czas trwania tego procesu. Stwierdzono, że po 50 godzinach pomiarów uwolniło się ze sfer komorowych: a) 85% immobilizowanej albuminy - ze sfer komorowych bez otoczek alginianowych, b) 65% immobilizowanej albuminy - ze sfer komorowych z jedną otoczką alginianową, c) 45% immobilizowanej albuminy - ze sfer komorowych z dwoma otoczkami alginianowymi. Natomiast po 133 godzinach pomiarów uwolniło się ze sfer komorowych: a) 98% immobilizowanego błękitu metylenowego - ze sfer komorowych bez otoczek alginianowych, b) 90% immobilizowanego błękitu metylenowego - ze sfer komorowych z jedną otoczką alginianową, c) 80% immobilizowanego błękitu metylenowego - ze sfer komorowych z dwoma otoczkami alginianowymi. Pomiary prowadzone w dłuższym czasie niż podano wyżej nie wykazały dalszego uwalniania substancji aktywnych ze sfer komorowych i sfer komorowych otoczonych otoczkami alginianowymi.

5 PL B1 5 P r z y k ł a d VI Sporządzono 30 sfer komorowych z jedną otoczką alginianową immobilizowaną gamma- -globuliną postępując jak w przykładzie V, przy czym do odmierzonej objętości 100 ml roztworu wyjściowego alginianu sodu dodano 1 g gamma-globuliny. Następnie, 20 sfer komorowych z jedną otoczką alginianową i immobilizowaną gamma-globuliną zanurzono na 10 sekund w 15% roztworze polimetakrylanu metylu w acetonie (ciężar cząsteczkowy polimetakrylanu metylu wynosił 300 kda). Po czasie 10 sekund przeniesiono sfery komorowe do zlewki z wodą i intensywnie mieszano przez 1 minutę. W ten sposób na każdej ze sfer komorowych z jedną otoczką alginianową wytworzono jedną otoczkę z polimetakrylanu metylu. Następnie, powtórzono procedurę wytwarzania otoczki z polimetakrylanu metylu dla partii 10 sfer komorowych z jedną otoczką alginianową i jedną otoczką syntetyczną, uzyskując w ten sposób po dwie otoczki syntetyczne na sferach komorowych z jedną otoczką alginianową. Następnie, partię sfer komorowych z jedną otoczką alginianową i dwie partie sfer komorowych z jedną otoczką alginianową i otoczkami syntetycznymi zanurzono w osobnych zlewkach zawierających po 100 ml wody dejonizowanej i wykonano pomiary spektrofotometryczne zmiany stężenia gamma-globuliny w czasie. Stwierdzono, że po czasie 167 godzin uwolniło się ze sfer komorowych z jedną otoczką alginianową 65% gamma-globuliny, podczas gdy ze sfer dodatkowo otoczonych jedną otoczką z polimetakrylanu metylu uwolniło się 35% gamma-globuliny, a ze sfer komorowych otoczonych dodatkowo dwoma otoczkami z polimetakrylanu metylu uwolniło się około 28% gamma-globuliny. Poniższa tablica 1 podaje wartości całkowitej grubości otoczek alginianowych w zależności od czasu wytwarzania otoczki i ilości otoczek na sferach komorowych, tablica 2 - wielkości obszaru hemolizy krwinek czerwonych w zależności od czasu kontaktu z acetonem alginianowych sfer komorowych pokrytych otoczkami alginianowymi, tablica 3 - wartości ilości uwolnionego barwnika, błękitu metylenowego i albuminy ze sfer komorowych pokrytych otoczkami alginianowymi. T a b l i c a 1 Czas formowania otoczki [mm] Całkowita grubość otoczki [mm] Ilość otoczek alginianowych na sferze komorowej 3 0, , ,20 3 T a b l i c a 2 Ilość otoczek alginianowych na sferze komorowej Czas kontaktu kapsułki z acetonem [s] Obszar hemolizy krwinek czerwonych [%]

6 6 PL B1 Czas badania kinetyki uwalniania związku ze sfer komorowych otoczonych otoczkami alginianowymi [min] T a b l i c a 3 Albumina Ilość uwolnionego związku enkapsulowanego w sferach komorowych [%] Ilość otoczek alginianowych na sferach komorowych Błękit metylenowy Na figurze 1 rysunku przedstawiono widok spod mikroskopu optycznego alginianowych sfer komorowych bez otoczki alginianowej, z jedną i dwoma otoczkami ochronnymi. Jak widać na fig. 2 rysunku, przedstawiającym alginianowe sfery komorowe zawierające pełną krew króliczą (po lewej bez otoczki ochronnej, po prawej z jedną otoczką ochronną), po zanurzeniu w acetonie na okres 1,5 minuty, część krwinek czerwonych krwi enkapsulowanej w sferze komorowej bez otoczki alginianowej uległa hemolizie, zaś krwinki czerwone krwi enkapsulowanej w alginianowej sferze komorowej z jedną otoczką alginianową nie uległy hemolizie. Figura 3 przedstawia widok przez lupę optyczną alginianowych sfer komorowych z otoczką alginianową i pokrytych warstwą polimetakrylanu metylu poprzez zanurzenie w 15% roztworze polimetakrylanu metylu w acetonie i wysuszenie w temperaturze pokojowej. Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania otoczek alginianowych na alginianowych sferach komorowych przeznaczonych do enkapsulacji żywych komórek i immobilizacji/enkapsulacji substancji aktywnych biologicznie, znamienny tym, że alginianowe sfery komoro we zawierające jony Ca +2 lub Ba +2, wprowadzone w wyniku procesu ich wytwarzania lub w wyniku zanurzenia tych sfer w roztworze chlorku wapnia lub chlorku baru o stężeniu 0,001-0,15 mol/dm 3 w czasie 0,5 sekundy - 5 minut, umieszcza się w roztworze alginianu sodu stężeniu powyżej 0,1%, ale nie większym niż 3%, ewentualnie zawierającym chlorek sodu w ilości nie większej niż 0,9% wagowych w stosunku do masy roztworu, na czas 0,5 sekundy - 3 minuty, a następnie przenosi się je do wody lub do wodnego roztworu chlorku sodu o stężeniu nie większym niż 0,9%, intensywnie miesza w czasie 5 sekund - 2 minuty, ewentualnie następnie sfery komorowe zanurza się w roztworze chlorku wapnia lub chlorku baru o stężeniu 0,001-0,15 mol/dm 3 na czas 0,5 sekundy - 1 minuta, przy czym opisaną powyżej procedurę ewentualnie powtarza się co najmniej jednokrotnie. 2. Sposób zabezpieczania żywych komórek enkapsulowanych w alginianowych sferach komorowych lub regulowania uwalniania substancji aktywnych biologicznie immobilizowanych/enkapsulowanych w tych sferach, znamienny tym, że alginianowe sfery komorowe, zawierające enkapsulowane żywe komórki lub immobilizowane/enkapsulowane substancje aktywne biologicznie, zawierające dodatkowo jony Ca +2 Iub Ba +2 wprowadzone w procesie wytwarzania sfer komorowych lub w wyniku

7 PL B1 7 zanurzenia tych sfer w roztworze chlorku wapnia lub chlorku baru, o stężeniu 0,001-0,15 mol/dm 3 w czasie 0,5 sekundy - 5 minut, umieszcza się w roztworze alginianu sodu o stężeniu powyżej 0,1%, ale nie większym niż 3%, ewentualnie zawierającym chlorek sodu w ilości nie większej niż 0,9% wagowych w stosunku do masy roztworu, na czas 0,5 sekundy - 3 minuty, a następnie, przenosi się je do wody lub do wodnego roztworu chlorku sodu o stężeniu nie większym niż 0,9%, intensywnie miesza w czasie 5 sekund - 2 minuty, po czym ewentualnie zanurza w roztworze chlorku wapnia lub chlorku baru o stężeniu 0,001-0,15 mol/dm 3 na czas 0,5 sekundy - 1 minuta, przy czym powyższą procedurę ewentualnie powtarza się co najmniej jednokrotnie i korzystnie sfery zanurza się następnie w roztworze polimeru syntetycznego w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w roztworze polimetakrylanu metylu w acetonie, o stężeniu 0,1-15% na czas 0,5-10 sekund lub natryskuje tym roztworem w czasie 0,5-10 sekund i płucze w wodzie, przy czym procedurę zanurzenia w roztworze polimeru syntetycznego lub natryskiwania tym roztworem ewentualnie powtarza się co najmniej jednokrotnie. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że doboru optymalnej grubości otoczek alginianowych i ich ilości dokonuje się w drodze zanurzenia sfer alginianowych, zawierających enkapsulowaną krew lub krwinki czerwone, otoczonych jedną oraz kilkoma otoczkami alginianowymi, w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie acetonie, na czas 1 sekunda - 2 minuty i następnie pomiaru obszaru hemolizy krwinek czerwonych w zależności od czasu kontaktu z rozpuszczalnikiem, grubości otoczki i ich ilości. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że pomiaru obszaru hemolizy krwinek czerwonych dokonuje się przy użyciu mikroskopu lub w drodze pomiarów spektrofotometrycznych absorbancji hemoglobiny.

8 8 PL B1 Rysunki Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)