Polimorfizm oksydacji leków Ostateczne unieczynnienie leku w ponad 95% z następuje udziałem cytochromu P-450. Cytochrom P-450

Transkrypt

1 Polimorfizm oksydacji leków Ostateczne unieczynnienie leku w ponad 95% z następuje udziałem cytochromu P-450 Cytochrom P Hemoproteina o aktywności monooksygenazy - Pełni rolę końcowej oksydazy łańcucha przekazu elektronów - Obecny w retikulum endoplazmatycznym gładkim oraz w mitochondriach - Produkty są hydrofilne, co ułatwia ich usuwanie z organizmu - Najwięcej jest go w wątrobie i rdzeniu nadnerczy - Wiele izoenzymów oksydacja leków nasercowych, psychotropowych, pochodnych morfiny - Bierze udział w metabolizmie amfetaminy (oksydacyjna deaminacja) oraz detoksykacji alkoholowej (obok dehydrogenazy alkoholowej) - liczba alleli 80, część alleli powiązano z tempem metabolizmu poszczególnych leków - Aktywność można oceniać przez genotypowanie lub fenotypowanie RH + O 2 + NADPH + H + ROH + H 2 O + NADP +

2 Izoenzymy CYP450 i ich polimorfizmy

3 przeciętnie metabolizujący Lek metabolizowany zgodnie z oczekiwaniami wolno metabolizujący Prowadzi do gromadzenia się leku w organizmie, często powyżej zakresu terapeutycznego Gen posiada mutacje zmniejszające aktywność przynajmniej jednej kopii genu szybko metabolizujący Nie osiągają stężeń terapeutycznych, za to produkt metabolizmu leku może być toksyczny dla organizmu

4 CYP2D6 Katalizuje oksydacje ponad 40 istotnych klinicznie leków: psychotropowych, beta-blokerów, pochodnych morfiny i innych Obecnie znanych jest ok. 80 alleli, wiele prowadzi do fenotypu o wolniejszym metabolizmie Duże zróżnicowanie etniczne: populacja kaukaska 7% słabych metabolizerów pozostałe rasy 1-2% we wschodniej Afryce nawet 30% populacji ma fenotyp ultra-szybko metabolizujących (amplifikacja genu)

5 Polimorfizm CYP2D6 osoby powoli metabolizujące - wzrost toksyczności -sparteina (zwiększone skurcze macicy) -flekainid (arytmie komorowe) -propafenon (skurcz oskrzeli i toksyczne działanie na ośrodkowy układ nerw.) -nortryptylina (spadek ciśnienia krwi i splątanie) -brak działania opioidów - tramadolu i kodeiny osoby szybko metabolizujące wzrost toksyczności -kodeina (depresja ośrodka oddechowego) -enkainid (arytmie komorowe) -utrata działania nortryptyliny i propafenonu

6 Farmakodynamika Polimorfizm transporterów oraz receptorów leków Udział czynnika farmakodynamicznego w farmakogenetyce mniejszy niż farmakokinetycznego istnieje wiele różnic międzygatunkowych w metabolizmie leku, ale wiele podobieństw w receptorach

7 Polimorfizm transporterów leków wystepujących w przewodzie pokarmowym, wątrobie, nerkach oraz mózgu: transportery ABC (ATP-binding transporters) białka MRP (multidrug resistance-associated protein) glikoproteina P (P-gp) produkt genu MDR (multidrug response) Pacjenci z padaczką odporną na farmakoterapię wykazują podwyższoną ekspresję P-gp i białek MRP co prowadzi do szybszego usuwania leku z rejonu działania (astrocyty, endotelialne naczynia włosowate, neurony)

8

9 Entuzjazm

10 HapMap (The Haplotype Genetic Map) katalog częstych haplotypów Haplotyp grupa wariantów genetycznych położonych blisko w genomie i dziedziczonych łącznie. CardioGene projekt, którego celem jest zidentyfikownie genetycznych markerów nawrotów zwężania naczyń krwionośnych w miejscu koronerografii (in-stent restenosis)

11

12 Realizm

13

14 Metody detekcji SNP Identyfikacja nowych polimorfizmów Poszukiwanie mutacji w oparciu o konformację jednoniciowego DNA (ang. single-strand conformation polymorphism analysis)

15 Metody wykorzystujące różnice w konformacji dwuniciowego DNA Elektroforeza wykrywająca różnice w konformacji CSGE (ang. conformationsensitive gel electrophoresis) Jedna nieprawidłowo sparowana zasada powoduje zmiany w konformacji podwójnej helisy, które wpływają na migrację w żelu. Homodupleksy (wszystkie zasady prawidłowo sparowane) i heterodupleksy (obecność nieprawidłowo sparowanych zasad) charakteryzują się odmienną ruchliwością w żelu. Łagodnie denaturujące warunki zwiększają tendencję do tworzenia form posiadających zgięcie o odmiennej ruchliwości elektroforetycznej w stosunku do homodupleksów.

16 Typ dziki Sekwencja badana 5 -TCCAGGG AGGTCCC TCC?GGG AGG?CCC TCCAGGG AGGTCCC TCCTGGG AGGACCC -5 Denaturacja 95 C Annealing 68 C Homodupleksy 5 -TCCAGGG AGGTCCC TCCTGGG AGGACCC -5 Heterodupleksy 5 -TCCAGGG AGGACCC TCCTGGG AGGTCCC -5

17 Cztery warianty sekwencji 5 TCCNGGG TCCAGGG AGGTCCC TCCTGGG AGGACCC TCCCGGG AGGGCCC TCCGGGG AGGCCCC -5 Denaturacja 95 C Annealing 68 C 5 -TCCAGGG AGGTCCC TCCTGGG AGGACCC TCCCGGG AGGGCCC TCCGGGG AGGCCCC -5 Homo dupleksy 5 -TCCAGGG AGGACCC TCCAGGG AGGCCCC TCCTGGG AGGTCCC TCCGGGG AGGTCCC TCCAGGG AGGGCCC TCCGGGG AGGGCCC TCCCGGG AGGTCCC TCCCGGG AGGCCCC -5 Hetero dupleksy 5 -TCCTGGG AGGGCCC TCCCGGG AGGACCC TCCTGGG AGGCCCC TCCGGGG AGGACCC -5

18 Cztery produkty PCR - homodupleksy 6 próbek zawierających homo- i heterodupleksy, Próbki otrzymano mieszając parami produkty PCR

19 12 heterodupleksów otrzymanych przez asymetryczny PCR

20 1. Amplifikacja fragmentu DNA zawierającego polimorfizm 2. Utworzenie heterodupleksu 3. Elektroforeza w odpowiednich warunkach COL1A1

21 Metody wykorzystujące różnice w konformacji dwuniciowego DNA c.d. Elektroforeza w gradiencie denaturującym Metoda podobna do poprzedniej, ale wymaga zastosowania żelu poliakrylamidowego o wzrastającym gradiencie denaturującym (formamid i mocznik). Zalety dokładność, niski koszt Wady trudności w optymalizacji, mała wydajność HPLC w warunkach denaturujących Analiza ruchliwości różnych heterodupleksów z zastosowaniem chromatografii w lekko denaturujących warunkach. 1. Próba badana jest hybrydyzowana z DNA typu dzikiego mieszanina hetero- i homodupleksów 2. Chromatografia w temperaturze częściowo denaturującej heterodupleksy

22 Wykrywanie nieprawidłowo sparowanych nukleotydów dzięki ich podatności na trawienie przez enzymy lub inne substancje chemiczne

23 Dimery naftyrydyny Detekcja plazmonowy rezonans powierzchniowy

24 Sekwencjonowanie metoda dla laboratoriów bogatych i wyposażonych w odpowiedni sprzęt. - metoda skuteczna, ale droga - dlatego też najpierw poszukuje się cząsteczek DNA, które potencjalnie mogą się różnić, a następnie takie wyselekcjonowane cząsteczki DNA poddaje się sekwencjonowaniu.

25 Sekwencjonowanie na dużą skalę sequencing system 454 Genome Sequencer FLX System

26 Sekwencjonowanie na dużą skalę sequencing system 454 GS Junior System Targeted Resequencing High sensitivity amplicon sequencing Perform ultra-deep sequencing of amplicons (PCR products) with the GS Junior System. Generating an average of 100,000 high quality reads per run, the system is ideally suited for detecting low level variants (<1% frequency) in pooled amplicon samples, such as viral or human DNA. For many targeted sequencing projects, dozens or hundreds of amplicons can be tiled across genomic regions of interest (i.e. disease-associated regions) and sequenced together.

27 Sekwencjonowanie na dużą skalę sequencing system 454 idea działania. Przygotowanie matrycy Ligacja adaptorów Przyłączanie do kulek magnetycznych PCR emulsyjny Pirosekwencjonowanie każdej kulki osobno (sekwencjonowanie do tys. kulek jednocześnie). Analiza wyników

28 Metody wykrywania znanych polimorfizmów wykorzystujące elektroforezę żelową PCR-RFLP Detekcja mutacji punktowej w 12 kodonie onkogenu K-ras aktywacja onkogenu, wykrywana jako brak miejsca cięcia dla enzymu MvaI. Występowanie tej mutacji stwierdzono u przynajmniej 75% chorych na nowotwór trzustki.

29 Ligacja oligonukleotydów (ang. oligonucleotides ligation assay genotyping OLA) - metoda jest szybka, specyficzna, czuła - OLA wymaga trzech oligonukleotydów: 1. specyficznego dla allelu typu dzikiego 2. specyficznego dla allelu zmutowanego 3. sonda wspólna dla obu alleli - Strategia Oli połączenie dwóch oligonukleotydów (sondy wspólnej dla obu alleili i jednego oligonukleotydu specyficznego) przez ligazę pod warunkiem, że uległy one hybrydyzacji z matrycą - Specyficzność ligacji wynika z trzech czynników: 1. oligonukleotydy hybrydyzują do sekwencji komplementarnych 2. oligonukleotydy muszą przyłączyć się do matrycy dokładnie jeden za drugim 3. w miejscu połączenia oligonukleotydów muszą one być idealnie komplementarne do matrycy.

30 Metody o dużej wydajności nie wykorzystujące elektroforezy żelowej 1. Metody wykorzystujące FRET (ang. Fluorescence resonance energy transfer) FRET

31 Analiza TaqMan (ang. TaqMan Allelic Discrimination assay) Wykorzystuje 5 nukleazową aktywnośćtaq polimerazy do detekcji sygnału fluorescencyjnego powstającego w czasie lub po PCR Dwie sondy TaqMan różniące się w miejscu polimorficznym posiadające na 5 końcu znacznik reporterowy i na 3 końcu znacznik wyciszający Jeśli sondy są nienaruszone fluorescencja jest wyciszana Podczas annealingu sondy hybrydyzują do matrycy, podczas etapu wydłużania starterów znacznik reporterowy jest uwalniany przez 5 nukleazową aktywność Taq polimerazy wzrost fluorescencji charakterystycznej dla danego znacznika reporterowego Wynik pomiar intensywności sygnału fluorescencyjnego właściwego dla dwóch różnych znaczników reporterowych po zakończeniu PCR

32

33 Molecular beacons MB to sondy oligonukleotydowe posiadające na swych końcach wzajemnie komplementarne fragmenty flankujące segment komplementarny do sekwencji docelowej zawierającej miejsce polimorficzne Na przeciwległych końcach sondy znajdują się znaczniki donorowe i akceptorowe Jeśli sonda nie hybrydyzuje do sekwencji docelowej przyjmuje strukturę spinki do włosów, znaczniki są blisko siebie sygnał nie powstaje Kiedy sonda hybrydyzuje, znaczniki są odseparowane i następuje gwałtowny wzrost sygnału fluorescencyjnego

34 - Istota metody hybrydy posiadające nie wszystkie sparowane zasady dysocjują w temperaturach niższych niż hybrydy o pełnej komplementarności - W teście, w tej samej reakcji PCR stosuje się dwie sondy jedną komplementarną do sekwencji typu dzikiego, drugą do zmutowanej - Te dwie sondy są znakowane różnymi znacznikami fluorescencyjnymi

35 Test intruza (ang. Invader assay) - Pozwala wykrywać SNP bez stosowania PCR - Wymaga zastosowania dwóch sond sygnałowych homologicznej do sekwencji typu dzikiego i zmutowanej oraz sondy intruza, hybrydyzującej powyżej sond sygnałowych - Istota metody: jeśli dwa hybrydyzujące z tą samą nicią oligonukleotydy nakładają się przynajmniej 1 nukleotydem powstaje struktura rozpoznawana i trawiona przez enzym Cleavase - Brak idealnego sparowania powyżej miejsca cięcia powoduje powstanie struktury, która nie jest rozpoznawana przez enzym -Sonda sygnałowa posiada FLAP ze nacznikiem reporterowym, jego sygnał jest wyciszany przez drugi znacznik znajdujący się w części zlokalizowanej po drugiej stronie miejsca cięcia - Przecięta sonda dysocjuje i przyłącza się następna amplifikacja sygnału

36 Serial invasive signal amplification reaction (SISAR)

37 Ligacja znakowanych oligonukleotydów DOL (dye-labeled oligonucleotide ligation) Łączy metody OLA i FRET Wymaga starterów PCR o wysokich temperaturach topnienia oraz trzech znakowanych sond ligacyjnych o niskich temperaturach topnienia Jedna z sond jest wspólna dla typu dzikiego i zmutowanego, posiada na 5 końcu znacznik donorowy, ta sonda kończy się tuż powyżej miejsca polimorficznego Dwie pozostałe sondy są specyficzne dla dzikiego lub zmutowanego allelu i mają na końcach 5 nukleotyd polimorficzny, natomiast na końcach 3 różne znaczniki akceptorowe Pierwsza część reakcji PCR odbywa się wysokich temperaturach, amplifikowana jest odpowiednia ilość produktu, a sondy ligacyjne nie są w stanie hybrydyzować W drugim etapie temperatura jest niższa i następuje ligacja sondy wspólnej z odpowiednią sondą specyficzną dla danego allelu sygnał fluorescencyjny

38 ASO

39 ASO

40 Microarray, Chip DNA, mikropanel Silikonowe płytki o powierzchni 2 cm 2 lub mniejszej, z gęsto rozmieszczonymi w znanym porządku oligonukleotydami 10 6 ASO na 2 cm 2 Testowany DNA jest amplifikowany w reakcji PCR i jednocześnie znakowany fluorescencyjnie, a następnie nanoszony na powierzchnię płytki. Każdy oligonukleotyd na chipie działa jak sonda specyficzna dla allelu. Jeśli dana sonda jest w pełni komplementarna do testowanego DNA, to hybrydyzuje bardziej wydajnie i sygnał fluorescencyjny powstający w danym miejscu jest silniejszy niż tam, gdzie znajdują się oligonukleotydy nie w pełni komplementarne Microarray zawiera dziesiatki, a nawet setki sond do detekcji każdego SNP Sygnały fluorescencyjne są mierzone przez skanery o wysokiej rozdzielczości

41 The Colors of a Microarray In this schematic: GREEN represents Control DNA RED represents Sample DNA YELLOW represents a combination of Control and Sample DNA, where both hybridized equally to the target DNA. BLACK represents areas where neither the Control nor Sample DNA hybridized to the target DNA.

42 Dynamiczna hybrydyzacja specyficzna dla allelu (ang. Dynamic allele-specific hybridization DASH) Hybrydyzacja zachodzi w roztworze na przykład na płytce titracyjnej, jest wykrywana za pomocą znacznika fluorescencyjnego, który wiąże się tylko z dwuniciowym DNA sygnał jest emitowany tylko wtedy, gdy zachodzi hybrydyzacja Początkowo warunki (temperatura) pozwalają na hybrydyzację nawet wówczas, gdy w hybrydach istnieją pojedyncze niesparowane zasady badany DNA i oligonukleotydy hybrydyzują niezależnie od tego, który allel występuje w badanym DNA Allele można rozróżnić podnosząc temperaturę hybrydy z niesparowanymi zasadami są mniej stabilne niż pełne hybrydy i rozpadają się w niższej temperaturze Temperatura rozpadu hybrydy (zanik sygnału) mówi o tym jaki allel znajduje się w badanym DNA.

43 DASH A well functioning DASH assay will produce the following results: The blue line is for a homozygous match, the purple line for a heterozygote, and the yellow line is for a homozygous mismatch.

44 Wydłużanie startera specyficzne dla allelu Stosuje się dwa startery łączące się do sekwencji powyżej SNP, posiadające na 3 końcu nukleotyd komplementarny do odróżniającego allele. Tylko całkowicie komplementarny starter jest wydłużany

45 Wydłużanie jednonukleotydowe z detekcją fluorescencyjną Starter do sekwencjonowania jest projektowany tak, aby kończył się bezpośrednio powyżej miejsca polimorficznego W obecności dideoksynukleotydów znakowanych różnymi znacznikami fluorescencyjnymi do startera przyłączany jest dideoksynukleotyd specyficzny dla danego allelu

46 Minisequencing-arrayed primer extension (APEX) Wykrywanie 3 SNP: SNP1 A/G SNP2 G/C SNP3 C/T Array of arrays

47 Wbudowywanie nukleotydu specyficzne dla allelu Pyrosequencing Wykrywa nukleotyd wbudowany de novo w oparciu o specyficzną matrycę. Idea metody wbudowaniu nukleotydu towarzyszy uwolnienie reszty pirofosforanowej, która jest włączana do ATP, ATP stymuluje lucyferazę, jej aktywacja powoduje emisję światła.

48 Polymerase catalyzes incorporation of nucleotide(s) into a nucleic acid chain. A PPi molecule(s) is released. (a and c) The PPi is converted to ATP by ATP sulfurylase using adenosine phosphosulfate (APS) as substrate and (b) the PPi molecule is converted to ATP by phosphopyruvate dikinase (PPDK) using phosphoenol pyruvate (PEP) as substrate (developed by Hitachi). Generated ATP is subsequently sensed by luciferase and proportional amount of light is produced when luciferin is oxidized. Unreacted nucleotide is either removed by washing (a and b) or enzymatically (c) to allow iterative addition of nucleotides.