dr hab. Mikołaj Olejniczak, prof. UAM Zakład Biochemii 16 grudnia 2018, Poznań

Transkrypt

1 dr hab. Mikołaj Olejniczak, prof. UAM Zakład Biochemii 16 grudnia 2018, Poznań Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Michała Rażewa zatytułowanej Badania strukturalne drożdżowego degradosomu mitochondrialnego mtexo Praca doktorska Pana mgr inż. Michała Rażewa została wykonana pod opieką promotora dr hab. Marcina Nowotnego w Międzynarodowym Instytucie Biologii Molekularnej i Komórkowej w Warszawie. Tematem pracy jest poznanie struktury i funkcji kompleksu mitochondrialnego degradosomu u drożdży Candida albicans. W swoich badaniach Doktorant zastosował metodę rentgenografii strukturalnej do poznania struktury degradosomu mitochondrialnego oraz metody biochemiczne do wyjaśnienia w jaki sposób degradosom oddziałuje z cząsteczkami RNA. W prawie 30-stronicowym wstępie literaturowym Doktorant jasno i kompetentnie wprowadził czytelnika w złożone aspekty struktury i funkcji 3ʹ-5ʹ egzorybonukleaz bakteryjnych oraz eukariotycznych. Szczególnie pomocne było porównanie struktury poszczególnych enzymów i powiązanie różnic strukturalnych z ich funkcją. Ponadto Doktorant w przystępny sposób wyjaśnił różne mechanizmy katalityczne stosowane przez egzorybonukleazy z rodzin RNB, PDX i DEDD. Dla pełnego zrozumienia mechanizmów degradacji RNA wyjaśnił również sposoby działania bakteryjnych oraz eukariotycznych helikaz RNA. W ostatniej części opisał specyfikę degradacji RNA w mitochondriach drożdżowych wynikającą m.in. z faktu, że mitochondrialne RNA u drożdży nie posiadają 3ʹ-końcowej sekwencji polia. Ponadto przybliżył stan wiedzy na temat budowy i funkcji mitochondrialnego degradosomu drożdży. Tym samym wstęp literaturowy jest doskonałym wprowadzeniem do tematyki pracy oraz precyzyjnym uzasadnieniem dużego znaczenia celu badań Doktoranta jakim było poznanie mechanizmu współdziałania egzorybonukleazy i helikazy w kompleksie degradosomu mitochondrialnego.

2 Opis materiałów i metod stosowanych w pracy jest dokładny i napisany przejrzyście, przez co może być bardzo pomocny dla innych osób zamierzających stosować te same lub podobne metody w swojej pracy badawczej. Bardzo ważną i pracochłonną częścią badań Doktoranta było opracowanie warunków otrzymywania oraz krystalizacji obu białek wchodzących w skład degradosomu mitochondrialnego drożdży, czyli egzorybonukleazy Dss1 oraz helikazy Suv3. Ponieważ wcześniejsze próby rekonstytucji degradosomu z obu białek produkowanych w Saccharomyces cerevisiae nie zakończyły się powodzeniem Doktorant wybrał drożdże Candida glabrata do swoich badań ze względu na dużą wydajność rekonstytucji kompleksu. Doktorant nie wyjaśnił jednak jakie inne gatunki drożdży były stosowane do porównania wydajności rekonstytucji degradosomu i pod jakimi względami różniły się od C. glabrata jako źródło obu komponentów degradosomu mitochondrialnego. Obie podjednostki degradosomu były otrzymywane przez nadekspresję w bakteriach Escherichia coli w fuzji z białkiem MBP, które było po oczyszczeniu odcinane przy pomocy proteazy TEV. Doktorant wykazał zależną od ATP aktywność rekonstytuowanego kompleksu w degradacji jednoniciowego RNA, co potwierdza prawidłowe funkcjonowanie otrzymanego kompleksu. Próby krystalizacji kompleksu okazały się dużym wyzwaniem w związku z obecnością regionów nieustrukturyzowanych w obu białkach. Aby zaprojektować odpowiednie konstrukty do krystalizacji Doktorant określił obecność regionów nieustrukturyzowanych za pomocą analizy informatycznej oraz częściowej hydrolizy trypsyną. Wyniki tych badań pozwoliły mu na zaprojektowanie szeregu konstruktów pozbawionych niestabilnych regionów na N końcu białka Dss1 oraz na N lub C końcu białka Suv3. Badania aktywności kompleksów złożonych z tych wariantów pozwoliły na wybranie do krystalizacji pochodnej białka Dss1 pozbawionej 69 reszt aminokwasowych na N końcu oraz zawierającej mutację D477N w miejscu aktywnym. Doktorantowi udało się rozwiązać strukturę tego białka w wersji selenometioninowej. Badania Pana mgr inż. Michała Rażewa pozwoliły na ukazanie unikalnych cech struktury nukleazy Dss1 z C. glabrata. Oprócz rdzeniowej domeny katalitycznej RNB, w której kanale Doktorant zidentyfikował krótką cząsteczkę RNA, posiada ona także domenę uskrzydlonej helisy (WH) zawierającą dodatnio naładowane reszty

3 aminokwasowe, a także podwójną domenę helisa-skręt-helisa (HTH), która także zawiera na swojej powierzchni reszty arginin i lizyn. W strukturze przestrzennej białka domena HTH oddziałuje z C-końcową domeną S1 tworząc pierścień, który jest kontynuacją kanału wiążącego RNA domeny RNB. Natomiast na C-końcu enzym ten posiada również unikalną strukturę β-beczki podobną do struktury domen wiążących RNA helikaz związanych z egzosomem eukariotycznym. Tym samym unikalne domeny rybonukleazy Dss1 opisane przez Doktoranta wprowadzają do jej struktury potencjalne miejsca wiązania cząsteczek RNA, które mogłyby wpływać na specyficzność substratową lub inne funkcje tego enzymu. Niemniej wymagające były prace mające na celu ustalenie warunków krystalizacji kompleksu pomiędzy Cg-Dss D477N a skróconym wariantem helikazy Suv Ustalenie optymalnej pary cząsteczek do badań wymagało rekonstytucji kompleksu złożonego z różnych składowych a następnie ich krystalizacji i doprowadziło do uzyskania kryształów jedynie dla jednego wariantu. Kryształy, które uzyskano początkowo nie pozwalały jednak na uzyskanie odpowiednich danych dyfrakcyjnych. Dopiero krystalizacja w zmienionych warunkach, w obecności dwuniciowej cząsteczki RNA z jednoniciowym nawisem, oraz zastosowanie helikalnej metody zbierania danych dyfrakcyjnych pozwoliła na rozwiązanie struktury kompleksu. Trudności eksperymentalne, które zostały pokonane przez Doktoranta bardzo dobrze świadczą o jego samodzielności, pomysłowości i pracowitości. Rozwiązanie struktury degradosomu pozwoliło na stwierdzenie, że domeny WH i HTH nukleazy Dss1 są zaangażowane w oddziaływania z helikazą Suv3 i przez to nie uczestniczą w wiązaniu RNA. Największa powierzchnia wiązania znajduje się pomiędzy domeną HTH Dss1 a domeną RecA1 Suv3, oraz mniejsza pomiędzy domeną WH Dss1 a NTD helikazy. Ponadto struktura Dss1 w kompleksie jest podobna jak w wolnej cząsteczce, natomiast struktura Suv3 ma inną orientację domeny NTD niż w ludzkiej helikazie Suv3. Znaczenie głównej powierzchni oddziaływania potwierdziły mutacje wybranych reszt aminokwasowych z tego regionu, które prowadziły do obniżenia aktywności enzymatycznej degradosomu. Dodatkowo przeprowadzono analizę obliczeniową powierzchni oddziaływania. Na stronie 98 autor zauważa, że wskaźnik G p-value wskazuje, iż hydrofobowość tego oddziaływania. Czy autor miał na myśli

4 stabilność termodynamiczną oddziaływania? Co ciekawe spośród unikalnych domen nukleazy Dss1 tylko domena β-beczki może wiązać RNA w kanale nukleazy, natomiast w domenach WH oraz HTH reszty aminokwasów dodatnich skierowane są w sposób uniemożliwiający ich udział w wiązaniu RNA. Ponadto analiza struktury kompleksu pozwoliła na zaproponowanie, ze długość cząsteczki RNA wiążącej się w kanale degradosomu wynosi ok 18 nt. Podobną długość produktu degradacji wskazały również badania biochemiczne wykonane przez Doktoranta. W obszernej dyskusji pracy Doktorant omówił zarówno badania własne jak i współpracowników w celu przedstawienia modelu działania degradosomu mitochondrialnego C. glabrata. Istotną część dyskusji stanowią porównania poszczególnych domen kompleksu z cząsteczkami homologicznymi. Wyniki tych analiz pozwoliły m.in. na wskazanie, że główną rolę w wiązaniu RNA oraz wprowadzaniu do kanału wiążącego RNA nukleazy Dss1 ma helikaza Suv3. Dla ilustracji możliwych sposobów wiązania RNA do degradosomu zabrakło mi jednak rysunku pokazującego potencjał elektrostatyczny na powierzchni całego degradosomu, chociaż pokazane w pracy rysunki ukazujące potencjał na powierzchni poszczególnych domen też są bardzo pomocne. Ponadto Doktorant omówił możliwy mechanizm rozwijania dupleksów RNA przez tę helikazę. Chciałbym poprosić Doktoranta o przedyskutowanie w czasie obrony jakie może być znaczenie biologiczne domen nieuporządkowanych, które zostały usunięte w celu krystalizacji? Czy regiony te są zachowane ewolucyjnie, czy też specyficzne dla C. glabrata? Drugie pytanie dotyczy tego, że o ile struktura wariantu Dss1 została rozwiązana zarówno w kompleksie jak i osobno to strukturę helikazy Suv3 znamy tylko w kompleksie. Czy próbowano uzyskać strukturę helikazy Suv3 osobno, lecz zakończyło się to niepowodzeniem, czy też tej próby nie podejmowano? Drobne uwagi dotyczące żargonu: wyrażano, m.in. na str. 49, zamiast prowadzono nadekspresję ; w warunku m.in. na str. 70, zamiast w warunkach lub przy stężeniu. Na stronie 95 naprzemiennie są używane jednoliterowe i trójliterowe kody aminokwasów. Podsumowując, Pan mgr inż. Michał Rażew dokonał ogromnej pracy związanej z projektowaniem, sprawdzaniem właściwości biochemicznych oraz próbami krystalizacji

5 szeregu wariantów obu białek tworzących degradosom mitochondrialny u drożdży C. glabrata. Dzięki temu udało mu się opisać strukturę degradosomu mitochondrialnego drożdży Candida glabrata oraz we współpracy z innymi osobami wyjaśnić mechanizm jego oddziaływań z degradowanymi cząsteczkami RNA. Warto podkreślić, że badania wykonane w pracy doktorskiej zaowocowały m.in. publikacją w czasopiśmie Nature Communications, w której Doktorant jest pierwszym współautorem. Przedstawiona mi do oceny praca Pana mgr inż. Michała Rażewa spełnia wszystkie wymagania stawiane rozprawom doktorskim. W związku z powyższym zwracam się do Rady Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk w Warszawie o nadanie Panu mgr Michałowi Rażewowi stopnia doktora nauk biologicznych w dyscyplinie biochemia. Ponadto ze względu na bardzo wysoką wartość naukową wyników pracy wnioskuję o wyróżnienie rozprawy doktorskiej.